JP6876193B2 - 胚救助技術による百山祖冷杉の苗を短い時間で得ることが出来る方法 - Google Patents
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Description
百山祖冷杉の植物体における未成熟の球果を収集するステップ(1)と、
未成熟のシードを取って表面滅菌を行うステップ(2)と、
解剖メスで未成熟のシードを切り、未成熟の胚を取って培地に接種して、水平に置き、20±2℃の暗黒条件において3日間培養するステップ(3)と、
暗培養後、胚が発芽するまで、弱光条件(光照射強度20μmol・m−2・s−1、光照射時間12h/d)において培養するステップ(4)と、
胚が発芽した後、正常光照射条件(光照射強度80μmol・m−2・s−1、光照射時間12h/d)において10日間培養してから、苗を胚乳から分離して培地に接種して温度20±2℃、光照射強度80μmol・m−2・s−1、光照射時間12h/dを培養条件として保存するステップ(5)とを含む胚救助技術により百山祖冷杉の苗を短い時間で得ることが出来る方法。
材料:本実例では、百山祖冷杉の未成熟の胚及び胚乳を培養外植体とする。
7月下旬〜8月上旬に、百山祖自然保護区で、表面に種鱗や包鱗が緊密に配列されている百山祖冷杉の緑色未成熟の球果を収集した。密封パックに入れ、4℃の低温で貯蔵しておく。
ピンセットで種鱗とシードを分離し、シードを流水下で3h洗浄し、クリーンベンチにおいて70%のエタノールで30s処理し、無菌水で3〜5回洗浄し、0.1wt%の塩化水銀で10min処理して、無菌水で3〜5回洗浄して無菌濾紙で表面水分を吸いつくした。
洗浄後のシードを滅菌した濾紙の敷かれたシャーレに置き、左手が無菌ピンセットを用いて未成熟のシードを固定し、右手が無菌解剖メスを用いて種皮の縁から0.5mmの箇所にそれぞれスリットカットとクロスカットを行い、ピンセットで種皮を未成熟の胚及びその胚乳から分離した(図1)。未成熟の胚及びその胚乳を取って培地に接種して、水平に置いた。培地は、DCR(Gupta and Durzan medium)を基本培地とし、さらに蔗糖、寒天、加水分解カゼイン等が添加されるものとなり、蔗糖、寒天、加水分解カゼインの濃度は、それぞれ20g/L、8g/L、500mg/Lであり、培地のpHは、5.8であった。
接種後の未成熟の胚及びその胚乳を20±2℃の暗黒条件において3d培養し、光照射強度20μmol・m−2・s−1、光照射時間12h/dという弱光光照射条件において10日培養すると、シードが発芽した。
培養後の未成熟の胚の発芽率が95%以上に達した(図2)。次に苗を胚乳から分離して培地に接種して独立栄養期培養と保存を行い、培地は、DCR(Gupta and Durzan medium)を基本培地とし、さらに蔗糖、寒天、加水分解カゼイン等が添加されるものとなり、蔗糖、寒天、加水分解カゼインの濃度は、それぞれ20g/L、8g/L、500mg/L、培地のpHは、5.8であった。培養条件は、温度20±2℃、光照射強度80μmol・m−2・s−1、光照射時間12h/dであった。15日培養した後の苗は図3に示されており、これから分かるように、本方法により、短時間で多くの百山祖冷杉無菌苗を取得し、絶滅の危険にさらされている植物百山祖冷杉の迅速育成に用いることができる。
Claims (6)
- 7月下旬〜8月上旬の百山祖冷杉の植物体における未成熟の球果を収集するステップ(1)と、
未成熟のシードを取って表面滅菌を行うステップ(2)と、
解剖メスで未成熟のシードを切り、未成熟の胚及びその胚乳を取って培地に接種し、水平置きにして、20±2℃の暗黒条件において3日間培養するステップ(3)と、
暗培養後、胚が発芽するまで、光照射強度が20μmol・m−2・s−1、光照射時間が12h/dの弱光条件において培養するステップ(4)と、
胚が発芽した後、光照射強度が80μmol・m−2・s−1、光照射時間が12h/dの正常光照射条件において10日間培養してから、苗を胚乳から分離して培地に接種して温度20±2℃、光照射強度80μmol・m−2・s−1、光照射時間12h/dを培養条件として保存するステップ(5)と、
を含み、
前記ステップ(3)とステップ(5)では、培地は、DCR(Gupta and Durzan medium)を基本培地とし、蔗糖、寒天、加水分解カゼインを含み、蔗糖、寒天、加水分解カゼインの濃度は、それぞれ20g/L、8g/L、500mg/Lであり、培地のpHは、5.8であることを特徴とする胚救助技術により百山祖冷杉の苗を短い時間で得る方法。 - 前記ステップ(1)では、前記未成熟の球果の形態特徴は、球果が緑色であることとなることを特徴とする請求項1に記載の胚救助技術により百山祖冷杉の苗を短い時間で得る方法。
- 前記ステップ(2)では、前記表面滅菌プロセスは、未成熟のシードを流水下で3h洗浄し、洗浄後にクリーンベンチにおいて70体積%のエタノール水溶液に浸漬して30s振とうさせ、無菌水で1minずつ3回洗浄し、0.1質量%の塩化水銀の水溶液に浸漬して10min振とうさせた後、無菌水で1minずつ5回洗浄し、最後に無菌濾紙でシード表面の過剰な水分を取ることとなることを特徴とする請求項1に記載の胚救助技術により百山祖冷杉の苗を短い時間で得る方法。
- 前記ステップ(3)では、前記未成熟の胚を取る方法は、左手が無菌ピンセットを用いて未成熟のシードを固定し、右手が無菌解剖メスを用いて種皮の縁から0.5mmの箇所にそれぞれスリットカットとクロスカットを行い、ピンセットで種皮を未成熟の胚及びその胚乳から分離することとなることを特徴とする請求項1に記載の胚救助技術により百山祖冷杉の苗を短い時間で得る方法。
- 前記ステップ(4)では、前記胚が発芽する形態的特徴は、幼根又は子葉が胚乳から伸びることとなることを特徴とする請求項1に記載の胚救助技術により百山祖冷杉の苗を短い時間で得る方法。
- 前記ステップ(5)では、前記苗の分離方法は、滅菌した解剖メスで胚乳を縦方向に切った後、苗を胚乳から分離することとなることを特徴とする請求項1に記載の胚救助技術により百山祖冷杉の苗を短い時間で得る方法。
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