CN104012523B - 一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法。该方法包括如下步骤：采集完整果实，洗净后用乙醇擦拭表面，再用乙醇浸泡，无菌水冲洗，然后用0.1％升汞浸泡，冲洗后吸干，纵向剖开果荚，取出粉末状种子；将种子投入藻酸钠包埋液，搅拌均匀后将其滴入至钙离子包埋液中，置于室温下凝固成包埋珠；将包埋珠置于PVS2溶液中脱水处理20-160min；放入冷冻管中，并加入PVS2溶液，然后将冷冻管置于液氮中冷冻保存；当需要使用种子时，将冷冻管取出，解冻后除去PVS2溶液，并洗涤；将洗涤后的包埋珠接种到固体VW培养基上培养，使种子萌发，待幼苗长至6-10cm高时可驯化移栽。该方法得到的种子萌发率高，且可节约成本。
Description
技术领域
本发明涉及植物种质资源的超低温保存方法，尤其涉及一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法。
背景技术
白及(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)又名连及草、箬兰、甘根、白根、百笠、白芨、紫蕙，为兰科白及属多年生宿根草本植物，分布于亚洲的缅甸北部经中国至日本和朝鲜半岛一带。白及具有紫色的花序和浓密的叶片，可盆栽观赏或作为地被植物栽培，也可生产鲜切花，具有很好的观赏价值。白及的块茎为常用中药，具有收敛止血、消肿生肌和促进创面愈合的功能，在治疗咳血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、肺结核吐血、溃疡病出血、烧烫伤和皮肤皲裂等方面的疗效显著。近些年，白及的临床应用范围不断拓宽，对治疗食管炎、咳嗽、体表肿瘤、血管瘤、气胸、白带多、鼻窦炎、慢性中耳炎和带状疱疹等方面均有新的突破。此外，白及块茎中含量较高的白及胶可用作高级卷烟烟条粘合剂、裱字画粘合剂、胃镜检查的保护剂和美容面膜等。然而，由于生境的严重破坏及人为的过度采挖，目前白及野生资源数量锐减，不仅无法满足市场需求，其物种生存也受到威胁。
种质保存不仅是经济植物生产种植和育种过程中的重要环节，同时也是对珍稀濒危植物进行保育的基础。建立合适的种质保存方法是对白及进行可持续利用的前提。常用的植物种质资源保存方法主要有建立自然保护区、建立植物种子库以及组培技术离体保存，但三者都有着各自的局限性，无法确保长期稳定地保存种质资源。超低温保存是一种新的种质保存技术，它能使保存材料的生理代谢活动基本处于静止状态，实现种质资源的长期保存。经过多年发展，研究者们建立了分步法、干燥脱水法、包埋脱水法、玻璃化法、小滴玻璃化法，以及包埋玻璃化法等用于植物材料的超低温保存。由于受植物的种属、基因型、抗冻性以及不同器官、组织和细胞的生理状态等因素影响，材料对超低温保存效果影响很大。迄今为止，针对不同的保存目的，人们选用不同的材料类型在多种植物中建立了大量的超低温保存体系。
目前，国内外已先后采用玻璃化法和小滴玻璃化法对白及的未成熟种子、成熟种子，以及整个果实进行了超低温保存的研究。然而，白及的种子非常细小不易操作，而且无胚乳一般需人工无菌萌发。包埋玻璃化法是在玻璃化法和包埋脱水法基础上发展起来的超低温保存植物种质的新技术，具有能同时处理大量材料，处理后恢复生长快，对材料的毒害作用较小及成活率高等优点，对体积细小且依赖人工无菌萌发的兰科植物种子的大规模保存具有明显的优势。但目前关于白及种子的包埋玻璃化超低温保存尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对白及种子体积细小且依赖人工无菌萌发，提出一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法，为白及甚至兰科植物的种质保存提供一种简便又有效的方法。
本发明上述的目的通过如下技术方案实现：一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法，所述方法包括如下步骤：
S1、种子的采集与灭菌：采集成熟未开裂的完整果实，将果实先洗净，再用75％乙醇擦拭表面，接着用75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗2-3次，然后用0.1％升汞浸泡20min，无菌水冲洗4-5次，将果实表面的水分吸干，纵向剖开果荚，取出粉末状种子；
S2、包埋：将粉末状种子投入藻酸钠包埋液，用玻棒搅拌均匀，将含有种子的藻酸钠包埋液滴入至钙离子包埋液中，置于室温下使其充分凝固成包埋珠；
S3、脱水：将上述制得的包埋珠置于PVS2溶液中脱水处理20-160min；
S4、冷冻保存：将脱水后的包埋珠放入冷冻管中，并加入PVS2溶液，然后将含有种子包埋珠的冷冻管置于液氮中冷冻保存；
S5、解冻与洗涤：当需要使用种子时，将冷冻管从液氮中取出，在38℃的水浴中解冻2-4min，解冻完成后除去PVS2溶液，并用洗涤液洗涤3次，每次8-12min；
S6、种子的萌发：将洗涤后的包埋珠接种到固体VW培养基(0.7％琼脂粉)上培养，使种子萌发，待幼苗长至6-10cm高时可驯化移栽。
本发明通过特定的步骤，将白及种子灭菌后先后投入到藻酸钠包埋液和钙离子包埋液中形成种子包埋珠，然后将包埋珠置于高浓度的冷冻保护剂PVS2溶液中利用渗透压进行脱水，随后将脱水后的种子包埋珠与PVS2溶液一起置于液氮中冷冻保存。在PVS2溶液中脱水处理的目的是脱去包埋珠中多余的水分，并使冷冻保护液渗入细胞，当快速降温时冷冻保护剂和种子包埋珠一同进入玻璃化状态而不形成冰晶，从而减轻在超低温保存过程中细胞所受到的伤害，大大提高种子的存活率。然而，PVS2溶液对材料也存在一定的毒性。因此，超低温保存中适当的脱水是成功的关键，在投入液氮快速冷冻前，对材料进行充分脱水可以提高玻璃化的形成能力，减小冷冻对材料的伤害。处理时间太短，达不到预期效果；处理时间太长，又会毒害细胞。
本发明严格控制包埋珠在PVS2溶液中脱水的时间，在保证足够高的成活率的前提下尽量缩短脱水时间。经不断试验发现，包埋后的种子包埋珠在PVS2溶液中脱水20-160min，种子的萌发率随处理时间的延长先增加后降低，脱水处理120min时种子的萌发率达到最高，为81.4％。此外，相比于直接对粉末状的种子进行处理，本发明将种子包埋成包埋珠后进行保存和萌发，一方面易于操作，另一方面若有需要还可对来自同一果实的种子进行分批萌发。而且，种子在包埋前进行了灭菌处理，经超低温保存后可直接接种进行无菌萌发。
在上述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法中，作为优选，步骤S2中所述藻酸钠包埋液的配方为：VW+2％藻酸钠+2.0mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖；所述钙离子包埋液的配方为：0.1mol·L-1CaCl2+2.0mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖。
在上述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法中，作为优选，步骤S2中所述包埋珠的直径为3-6mm，每个包埋珠中含有25-35粒白及种子。
在上述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法中，作为优选，步骤S3、S4中所述PVS2的配方为：VW+30％甘油+15％乙二醇+15％DMSO+0.4mol·L-1蔗糖。
在上述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法中，作为优选，步骤S5中所述洗涤液的配方为：VW+1.2mol·L-1蔗糖。
在上述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法中，作为优选，步骤S6中在培养基培养时培养温度为25±2℃，光照强度为40μmolm-2s-1，光照时间为14h·d-1。
在上述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法中，所述的藻酸钠包埋液、钙离子包埋液、PVS2溶液和洗涤液均经过120-125℃高压灭菌，灭菌时间为15-25min，灭菌前将pH值调至5.8。
进一步优选，所述的藻酸钠包埋液、钙离子包埋液、PVS2溶液和洗涤液均经过121℃高压灭菌20min，灭菌前将溶液的pH值调至5.8。
在上述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法中，所述种子的灭菌、包埋、脱水、冷冻保存、解冻与洗涤，以及种子的萌发过程中均需保持种子处于无菌环境中。
其中，上述所述的百分比为质量体积比，单位：g·mL-1。
与现有技术相比，本发明白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法具有如下优点：
(1)冷冻前，将种子包埋后在PVS2溶液中进行脱水，通过控制脱水的时间可有效地实现白及种子的长期超低温保存，保存后种子的萌发率高，小苗健壮。
(2)种子在包埋前进行了灭菌处理，并在冷冻前处理和冷冻保存过程中处于无菌环境，经超低温保存后可直接接种进行无菌萌发。
(3)相比于直接对粉末状的种子进行处理，将种子包埋成包埋珠后进行脱水、冷冻保存、解冻与洗涤、萌发，更易于操作。
(4)相比于超低温保存整个果实，利用此方法可将同一果实内的种子经超低温保存后分不同批次萌发。白及(兰科植物)的单个果实内具有成千上万粒种子。对于白及(兰科植物)育种工作者来说，挑选杂交果实内的部分种子先进行萌发培养观察，待选定有价值的杂交组合后再决定将超低温保存的其余种子保留培养或去除，可为其节约大量的劳力和场地。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
在下述实施例中所述的藻酸钠包埋液、钙离子包埋液、PVS2和洗涤液均经过121℃高压灭菌20min，灭菌前将pH值调至5.8。所用的工具如培养皿、滤纸、容器、滴管和冷冻管均经121℃高压灭菌，灭菌时间为20min，烘干后使用。
实施例1
采集授粉后150d以上的完整未开裂的白及成熟果实，先用自来水冲洗干净，经75％乙醇擦拭表面后置于超净工作台，然后用75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗2-3次，接着用0.1％升汞浸泡20min，无菌水冲洗4-5次。将灭菌后的果实置于无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干表面水分，纵向剖开果荚，取果荚内粉末状的种子备用。
将粉末状的种子投入藻酸钠包埋液，用玻棒充分搅拌使种子均匀分布于其中，所述藻酸钠包埋液的配方为：VW+2％藻酸钠+2.0mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖；用滴管将含有种子的藻酸钠包埋液滴入钙离子包埋液，所述钙离子包埋液的配方为：0.1mol·L-1CaCl2+2.0mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖；室温下放置使其充分凝固形成直径约5mm的包埋珠，控制种子的数量，使每个包埋珠内约包埋30粒种子，将凝固的包埋珠取出置于垫有无菌滤纸的培养皿上吸干表面溶液。
冷冻前，将包埋珠置于PVS2溶液中脱水处理20min，PVS2溶液的配方为：VW+30％甘油+15％乙二醇+15％DMSO+0.4mol·L-1蔗糖。
将脱水处理后的包埋珠装入2mL规格的冷冻管，每管装10个包埋珠，向冷冻管中加入PVS2溶液使其充分包裹包埋珠，随后盖紧冷冻管盖并迅速置于液氮中冷冻保存。
当需要使用种子时，将冷冻管从液氮中取出，迅速放入38℃水浴中解冻2-4min，解冻完成后迅速除去PVS2溶液，并用洗涤液洗涤3次，每次10min，其中所述洗涤液的配方为：VW+1.2mol·L-1蔗糖。
将洗涤后的包埋珠置于无菌滤纸上吸干表面溶液，然后接种到固体VW培养基(0.7％琼脂粉)上培养，使种子萌发。培养时，培养温度为25±2℃，光照强度为40μmolm-2s-1，光照时间为14h·d-1，待幼苗长至8cm高时可驯化移栽。
实施例2-8
实施例2-8的实施步骤中，在PVS2溶液中脱水时间分别为40min，60min，80min，100min，120min，140min，160min，其它步骤与实施例1相同。
对比例1
未经PVS2溶液脱水处理，直接添加PVS2溶液投入液氮中保存，具体操作步骤如下：
采集授粉后150d以上的完整未开裂的白及成熟果实，先用自来水冲洗干净，经75％乙醇擦拭表面后置于超净工作台，然后用75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗2-3次，接着用0.1％升汞浸泡20min，无菌水冲洗4-5次。将灭菌后的果实置于无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干表面水分，纵向剖开果荚，取果荚内粉末状的种子备用。
将粉末状的种子投入藻酸钠包埋液，用玻棒充分搅拌使种子均匀分布于其中，所述藻酸钠包埋液的配方为：VW+2％藻酸钠+2.0mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖；用滴管将含有种子的藻酸钠包埋液滴入钙离子包埋液，所述钙离子包埋液的配方为：0.1mol·L-1CaCl2+2.0mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖；室温下放置使其充分凝固形成直径约5mm的包埋珠，控制种子的数量，使每个包埋珠内约包埋30粒种子，将凝固的包埋珠取出置于垫有无菌滤纸的培养皿上吸干表面溶液。
将包埋珠装入2mL规格的冷冻管，每管装10个包埋珠，向冷冻管中加入PVS2溶液使其充分包裹包埋珠，随后盖紧冷冻管盖并迅速置于液氮中冷冻保存。
当需要使用种子时，将冷冻管从液氮中取出，迅速放入38℃水浴中解冻2-4min，解冻完成后迅速除去PVS2溶液，并用洗涤液洗涤3次，每次10min，其中所述洗涤液的配方为：VW+1.2mol·L-1蔗糖。
将洗涤后的包埋珠置于无菌滤纸上吸干表面溶液，然后接种到固体VW培养基(0.7％琼脂粉)上培养，使种子萌发。培养时，培养温度为25±2℃，光照强度为40μmolm-2s-1，光照时间为14h·d-1，待幼苗长至8cm高时可驯化移栽。
实施例1-8及对比例1中白及种子的萌发率如表1所示。
表1：实施例1-8及对比例1中白及种子的萌发率
综上所述，本发明将白及种子包埋后在PVS2溶液中进行脱水，通过控制脱水的时间可有效地实现白及种子的长期保存。在PVS2溶液中脱水处理的时间对包埋后白及种子的超低温保存有着直接的影响，处理适宜时长为120min，脱水120min后保存得到的种子萌发率最高；种子在包埋前进行了灭菌处理，并在冷冻前处理和冷冻保存过程中处于无菌环境，经超低温保存后可直接接种进行无菌萌发。相比于直接对粉末状的种子进行处理，将种子包埋成包埋珠后进行脱水、冷冻保存、解冻与洗涤、萌发，更易于操作；相比于超低温保存整个果实，利用此方法可将同一果实内的种子经超低温保存后分不同批次萌发。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (7)
1.一种白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、种子的采集与灭菌：采集成熟未开裂的完整果实，将果实先洗净，再用75％乙醇擦拭表面，接着用75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗2-3次，然后用0.1％升汞浸泡20min，无菌水冲洗4-5次，将果实表面的水分吸干，纵向剖开果荚，取出粉末状种子；
S2、包埋：将粉末状种子投入藻酸钠包埋液，搅拌均匀，将含有种子的藻酸钠包埋液滴入至钙离子包埋液中，置于室温下使其充分凝固成包埋珠；所述藻酸钠包埋液的配方为：VW培养基+2％藻酸钠+2.0mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖；所述钙离子包埋液的配方为：0.1mol·L-1CaCl2+2.0mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖；所述包埋珠的直径为3-6mm，每个包埋珠中含有25-35粒白及种子；
S3、脱水：将上述制得的包埋珠置于PVS2溶液中脱水处理20-160min；
S4、冷冻保存：将脱水后的包埋珠放入冷冻管中，并加入PVS2溶液，然后将含有种子包埋珠的冷冻管置于液氮中冷冻保存；
S5、解冻与洗涤：当需要使用种子时，将冷冻管从液氮中取出，迅速置于38℃的水浴中解冻2-4min，解冻完成后及时除去PVS2溶液，并用洗涤液洗涤3次，每次8-12min；
S6、种子的萌发：将洗涤后的包埋珠接种到添加0.7％琼脂粉的固体VW培养基上培养，使种子萌发，待幼苗长至6-10cm高时可驯化移栽。
2.根据权利要求1所述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S3、S4中所述PVS2的配方为：VW培养基+30％甘油+15％乙二醇+15％DMSO+0.4mol·L-1蔗糖。
3.根据权利要求1所述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S5中所述洗涤液的配方为：VW培养基+1.2mol·L-1蔗糖。
4.根据权利要求1所述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤S6中在培养基培养时培养温度为25±2℃，光照强度为40μmolm-2s-1，光照时间为14h·d-1。
5.根据权利要求1所述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述的藻酸钠包埋液、钙离子包埋液、PVS2溶液和洗涤液均经过120-125℃高压灭菌，灭菌时间为15-25min，灭菌前将溶液的pH值调至5.8。
6.根据权利要求1或5所述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述的藻酸钠包埋液、钙离子包埋液、PVS2溶液和洗涤液均经过121℃高压灭菌，灭菌时间为20min，灭菌前将溶液的pH值调至5.8。
7.根据权利要求1所述白及种子的包埋玻璃化超低温保存方法，其特征在于，所述种子的灭菌、包埋、脱水、冷冻保存、解冻与洗涤，以及种子的萌发过程中均需保持种子处于无菌环境中。
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| PB01 | Publication | ||
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