CN108684657B - 一种降香种子超低温保存方法 - Google Patents

一种降香种子超低温保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降香种子超低温保存方法。具体方法步骤为：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5～8℃处理20～30min，降温至0℃～‑2℃，降温速度为5～10℃/h，再降温至‑5℃～‑8℃，保持温度0.5～1h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。本发明的降香超低温保存方法工艺简单，稳定性可靠，保存后的降香种子发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，试验结果表明超低温保存后降香种子发芽率高达95.72％。本发明能有效的、长期安全的保存降香种子，是降香种质资源长期保存的一种实用新方法。

Description

一种降香种子超低温保存方法
技术领域
本发明涉及种质资源保存技术领域，具体涉及一种降香种子超低温保存方法。
背景技术
自1973年Nag等首次成功地将液氮超低温保存技术运用在胡萝卜悬浮培养细胞上以来，超低温保存技术已成功保存了近300种植物材料。大多数的植物材料在超低温环境中，其细胞的新陈代谢活动都会基本停止，从而使细胞的活力和形态发生的能力能够得到稳定保存。液氮冷冻主要是对植物材料存活率和生理生化指标有影响，从理论上讲，经过液氮处理后再生的植物材料不会发生遗传变异。但是植物材料在超低温保存过程中，除液氮冷冻外，还涉及到预培养、脱水、解冻和恢复培养等，这些过程会给植物材料造成胁迫，增加植物材料的氧化损伤，伤害到植物细胞，从而影响植物材料的再生，并可能对再生植株的遗传稳定性造成一定影响。所以在对植物材料进行超低温长期储藏前，应对超低温冷冻的几个步骤进行优化。
超低温保存植物材料不止是为了获得高存活率，也是为了得到安全、稳定、保真的再生植株，因此对超低温储藏后的遗传稳定性进行研究是非常有必要的。植物材料表型特征评估可能是检测超低温储藏对植株稳定性影响的最简单的方法。大部分研究表明，超低温保存后的材料在形态学方面没有明显的变化。在对超低温保存后的山药种质、橡胶愈伤组织、栓皮栎胚的再生植株中没有发现形态变化，但超低温处理后的杭菊再生苗早期营养生长指标均低于对照。多数研究证明，超低温保存前、后材料的基因组没有发生遗传稳定变异。在对超低温保存前后的五叶草莓、留兰香、人参、杭菊、君迁子等植物种质材料进行基因组遗传稳定性检测时，没有发现基因组改变现象；但在冷杉、木瓜等植物种质材料中却发现其基因组改变的现象。
降香(Dalbergia odoriferaT.Chen)是我国特有濒危药用植物，其种子属于顽拗性种子，我们实验室对降香的种子进行了液氮超低温保存，发现适宜含水量的种子超低温保存后均能发芽，但部分芽不能健康地成苗。推测是因为液氮超低温保存过程中的一系列胁迫对降香苗的生长造成了影响。本研究将优化降香种子的超低温保存步骤，以期获得稳定、保真的降香再生植株。
发明内容
本发明目的在于提供一种降香种子超低温保存方法。该方法能够弥补降香种质资源保存技术的不足，为降香种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。
本发明采取的技术方案如下：
一种降香种子超低温保存方法，包括以下步骤：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5～8℃处理20～30min，降温至0℃～-2℃，降温速度为5～10℃/h，再降温至-5℃～-8℃，保持温度0.5～1h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。
优选的，室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5℃处理30min，降温至0℃，降温速度为5℃/h，然后再降温至-5℃，保持温度1h不变，之后迅速投入液氮进行超低温保存。
优选的，所述的装载液为：含有0.4-0.6mol·L-1蔗糖及2-2.5mol·L-1甘油的MS液体培养基，蒸汽灭菌15-20分钟，室温放置。
优选的，所述的玻璃化保护剂为：含2.25-2.50mol·L-1甘油、2.30-2.42mol·L-1乙二醇、1.92-2.10mol·L-1二甲基亚砜、0.25-0.50mol·L-1海藻糖、0.25-0.50mol·L-1绿藻粉、2-3μmol·L-1白藜芦醇及0.40-0.50mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，蒸汽灭菌15-20分钟，室温放置。
优选的，所述降香种子为4℃保存的含水量为12.5％～13.5％的种子。
优选的，降香种子解冻时将冻存管从液氮中取出，40℃水浴解冻2～5min；1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液和纯净水洗涤；将洗涤后的种子接种到含有0.3mol·L-1蔗糖的1/2MS培养基上，25～28℃条件下发芽培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的技术效果：
1、本发明建立起降香种质资源的超低温保存的技术程序，填补了降香种子超低温保存技术领域的空白；
2、摸索出最适合降香种子的冷冻程序、玻璃化保护剂成分和配比以及解冻时间，各条件协同作用，维持降香种子遗传资源的稳定。
3、本发明的降香玻璃化超低温保存法工艺简单，稳定性可靠，保存后的种子发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，试验结果表明超低温保存后降香种子发芽率高达95.72％。本发明能有效的、长期安全的保存降香种子，是降香种质资源长期保存的一种实用新方法。
附图说明
图1为冷冻处理后再生苗表型特征比较图。
图中，左侧为对照植株，右侧为本发明实施例1经培养后的再生植株。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
一种降香种子超低温保存方法，包括以下步骤：
取存于4℃冰箱中的含水量为13.5％的降香种子，室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5℃处理30min，降温至0℃，降温速度为5℃/h，然后再降温至-5℃，保持温度1h不变，之后迅速投入液氮进行超低温保存。
将冻存管从液氮中取出，40℃水浴解冻5min；用1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液+纯净水洗涤；将洗涤后的种子接种到含有0.3mol·L-1蔗糖的1/2MS培养基上，25～28℃条件下发芽培养。
所述的装载液为：含有0.4mol·L-1蔗糖及2mol·L-1甘油的MS液体培养基，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，室温放置。
所述的玻璃化保护剂为：含2.25mol·L-1甘油、2.30mol·L-1乙二醇、1.92mol·L-1二甲基亚砜、0.50mol·L-1海藻糖、0.25mol·L-1绿藻粉、3μmol·L-1白藜芦醇及0.40mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，室温放置。
实验例2：
一种降香种子超低温保存方法，包括以下步骤：
取存于4℃冰箱中的含水量为13.5％的降香种子，室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5℃处理20min，降温至0℃，降温速度为5℃/h，再降温至-5℃，保持温度0.5h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。
将冻存管从液氮中取出，40℃水浴解冻2min；用1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液+纯净水洗涤；将洗涤后的种子接种到含有0.3mol·L-1蔗糖的1/2MS培养基上，25～28℃条件下发芽培养。
所述的装载液为：含有0.6mol·L-1蔗糖及2.5mol·L-1甘油的MS液体培养基，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，室温放置。
所述的玻璃化保护剂为：含2.25mol·L-1甘油、2.42mol·L-1乙二醇、1.92mol·L-1二甲基亚砜、0.25mol·L-1海藻糖、0.25mol·L-1绿藻粉、2μmol·L-1白藜芦醇及0.40mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，室温放置。
实施例3：
一种降香种子超低温保存方法，包括以下步骤：
取存于4℃冰箱中的含水量为12.5％的降香种子，室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，8℃处理30min，降温至-2℃，降温速度为10℃/h，再降温至-8℃，保持温度1h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。
将冻存管从液氮中取出，40℃水浴解冻2min；用1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液+纯净水洗涤；将洗涤后的种子接种到含有0.3mol·L-1蔗糖的1/2MS培养基上，25～28℃条件下发芽培养。
所述的装载液为：含有0.6mol·L-1蔗糖及2mol·L-1甘油的MS液体培养基，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，室温放置。
所述的玻璃化保护剂为：含2.50mol·L-1甘油、2.30mol·L-1乙二醇、2.10mol·L-1二甲基亚砜、0.50mol·L-1海藻糖、0.50mol·L-1绿藻粉、3μmol·L-1白藜芦醇及0.50mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，室温放置。
实验例1：冷冻程序对发芽率的影响
在实施例1的基础上，设计如下不同冷冻程序，然后分别测定发芽率，结果如表1。
冷冻程序1：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5℃处理30min，降温至0℃，降温速度为5℃/h，再降温至-5℃，保持温度1h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。
冷冻程序2：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5℃处理20min，降温至0℃，降温速度为5℃/h，再降温至-5℃，保持温度0.5h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。
冷冻程序3：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，8℃处理30min，降温至-2℃，降温速度为10℃/h，再降温至-8℃，保持温度1h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。
冷冻程序4：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，8℃处理20min，降温至-2℃，降温速度为5℃/h，再降温至-8℃，保持温度0.5h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。
冷冻程序5：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，0℃处理15min，降温至-5℃，降温速度为3℃/h，再降温至-10℃，保持温度0.2h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。
冷冻程序6：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，12℃处理35min，降温至5℃，降温速度为12℃/h，再降温至-2℃，保持温度2h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。
种子发芽率测定方法：参照《国际种子检验规程》的规定。各试验3个重复，每重复40粒。计算出种子的发芽率＝种子发芽数/实验种子数×100％。
表1冷冻程序对发芽率的影响
Figure BDA0001609981330000061
结果表明：采用本发明冷冻程序，种子发芽率达到85.16％以上，最高可达95.72％，本发明的冷冻程序采用了特定的梯度式的温度变化处理方式，能够防治温度对植物材料造成的胁迫，保护降香种子的遗传资源。
实验例2：玻璃化保护剂对发芽率的影响
在实施例1的基础上，设计如下不同的玻璃化保护剂组分及配比，然后分别测定发芽率，结果如表2。
保护剂1：含2.25mol·L-1甘油、2.30mol·L-1乙二醇、1.92mol·L-1二甲基亚砜、0.50mol·L-1海藻糖、0.25mol·L-1绿藻粉、3μmol·L-1白藜芦醇及0.40mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌15分钟，室温放置。
保护剂2：含2.25mol·L-1甘油、2.42mol·L-1乙二醇、1.92mol·L-1二甲基亚砜、0.25mol·L-1海藻糖、0.25mol·L-1绿藻粉、2μmol·L-1白藜芦醇及0.40mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌20分钟，室温放置。
保护剂3：含2.50mol·L-1甘油、2.30mol·L-1乙二醇、2.10mol·L-1二甲基亚砜、0.50mol·L-1海藻糖、0.50mol·L-1绿藻粉、3μmol·L-1白藜芦醇及0.50mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌15分钟，室温放置。
保护剂4：含2.30mol·L-1甘油、2.35mol·L-1乙二醇、2.00mol·L-1二甲基亚砜、0.30mol·L-1海藻糖、0.35mol·L-1绿藻粉、2μmol·L-1白藜芦醇及0.45mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌15分钟，室温放置。
保护剂5：含2.00mol·L-1甘油、2.2mol·L-1乙二醇、1.80mol·L-1二甲基亚砜、0.20mol·L-1海藻糖、0.20mol·L-1绿藻粉、1μmol·L-1白藜芦醇及0.30mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌15分钟，室温放置。
保护剂6：含3.25mol·L-1甘油、2.52mol·L-1乙二醇、2.30mol·L-1二甲基亚砜、0.80mol·L-1海藻糖、0.80mol·L-1绿藻粉、5μmol·L-1白藜芦醇及0.80mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌15分钟，室温放置。
保护剂7：含2.25mol·L-1甘油、2.30mol·L-1乙二醇、1.92mol·L-1二甲基亚砜及0.40mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，121℃灭菌15分钟，室温放置。
表2玻璃化保护剂对发芽率的影响
Figure BDA0001609981330000071
结果表明：采用本发明玻璃化保护剂处理，种子发芽率达到84.17％以上，最高可达95.72％，而未采用本发明配比(保护剂5、保护剂6)或者采用传统的配方(保护剂7)后种子的发芽率仅为50％-60％左右。
实验例3：解冻时间对发芽率的影响
在实施例1的基础上，设计不同的解冻时间，分别测定不同解冻时间下种子发芽率，结果如表3。
表3解冻时间对发芽率的影响
Figure BDA0001609981330000072
结果表明，40℃水浴解冻2-5min后，种子发芽率高达95.72％，确定不同的解冻时间对种子发芽率产生一定的影响。
实验例4：超低温保存后再生植株形态特征的变化
观察实施例1的再生植株在叶形、叶色、株型和株高上与对照(未经超低温保存的鲜种)是否存在差异。结果见图1。
结果表明：经本发明方法处理后，降香再生植株在叶形、叶色、株型和株高上与对照相比无明显变化。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (5)

1.一种降香种子超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5~8℃处理20~30min，降温至0℃~ -2℃，降温速度为5~10 ℃/h，再降温至-5℃~ -8℃，保持温度0.5~1 h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存；
所述玻璃化保护剂为：含2.25-2.50 mol·L-1甘油、2.30-2.42 mol·L-1乙二醇、1.92-2.10 mol·L-1二甲基亚砜、0.25-0.50 mol·L-1海藻糖、0.25-0.50 mol·L-1绿藻粉、2-3 μmol·L-1白藜芦醇及0.40-0.50 mol·L-1蔗糖的MS液体培养基，蒸汽灭菌15-20分钟，室温放置。
2.根据权利要求1所述的降香种子超低温保存方法，其特征在于，室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5℃处理30 min，降温至 0℃，降温速度为5 ℃/h，然后再降温至 -5℃，保持温度1h不变，之后迅速投入液氮进行超低温保存。
3.根据权利要求1所述的降香种子超低温保存方法，其特征在于，所述装载液为：含有0.4-0.6 mol·L-1蔗糖及2-2.5 mol·L-1甘油的MS液体培养基，蒸汽灭菌15-20分钟，室温放置。
4.根据权利要求1所述的降香种子超低温保存方法，其特征在于，所述降香种子为4 ℃保存的含水量为12.5%～13.5%的种子。
5.根据权利要求1所述的降香种子超低温保存方法，其特征在于，降香种子解冻时将冻存管从液氮中取出，40 ℃水浴解冻2~5 min；用1.2 mol·L-1蔗糖的MS培养液和纯净水洗涤；将洗涤后的种子接种到含有0.3 mol·L-1蔗糖的1/2 MS培养基上，25 ~28 ℃条件下发芽培养。
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