CN104126570B - 一种当归细胞超低温保存及植株再生的方法 - Google Patents
一种当归细胞超低温保存及植株再生的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种当归细胞超低温保存方法，步骤如下：（1）将生长旺盛的当归悬浮培养细胞装载处理；（2）将装载处理后的当归悬浮培养细胞用玻璃化溶液脱水处理；（3）将脱水处理后的当归悬浮培养细胞迅速投入液氮中进行超低温保存；（4）当需要使用悬浮细胞时，从液氮中取出，解冻，用卸载液卸载20min。本发明还提供超低温保存后的当归细胞的植株再生方法，是将解冻并卸载后的悬浮细胞接种到培养基上光照培养；之后转至成苗培养基中继续培养，培养条件为：光照强度1500LX，光照时间14h/d，培养温度20℃。本发明的方法简单易行，保存成活率高达100%，恢复培养时可快速增殖，并分化出较多的当归幼苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种当归细胞的超低温保存方法及植株再生的方法。
背景技术
当归为伞形科植物当归的干燥根，始载于神农本草经，至今已有2000多年的历史，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效，素有“十方九归”之称，是常用中药之一。当归除做药用外，还可作为保健食品和化妆品，市场对当归的需求量日益增大。药用当归大都来自于栽培品，但是当归对栽培条件要求很苛刻，种植区域狭窄，全国有90%的当归产自甘肃，再加之当归种植中麻口病、早期抽薹、生荒地育苗等难题长期影响着当归的产量和品质，对生态环境的破坏也较严重。因此，加快当归种质资源保存与新品种选育势在必行。当归是三年生植物药材，第一年种子育苗，秋末采挖储藏，第二年将种苗移栽，长成成株，秋末采挖药材，需要留种的植株，待到第三年开花结籽，采收种子。繁育周期长导致当归大田育种进展缓慢，花朵的体积小，去雄十分困难，种子在常温下保存一年后即失去发芽率，这对当归育种和种质资源保存相当不利。因此，采用生物技术进行中药材种质保存、种苗繁殖与新品种选育和活性成分工业化生产，是一条有效可行的途径。
20世纪70年代新发展起来的超低温保存技术，为种质资源保存提供了一条新途经。它是在-80℃（干冰温度）到-196℃（液氮温度）甚至更低温度下保存生物材料。生物材料在超低温条件下，其活细胞内的新陈代谢和生长活动几乎完全停止，处于“生机停顿”的状态，因此能够有效保持生物材料的遗传稳定性和形态发生潜能，是一种可长期保存植物种质的有效方法。与就地保存和迁地保存等传统方法比较，该法具有不受病虫侵害、保存时间长、占用空间小、节省人力物力等优点。目前，在美国国家遗传资源保存中心采用超低温保存技术已成功保存2201个苹果和57个酸樱桃种质材料，最新研究报道表明，保存10年的苹果休眠芽，恢复生长后仍具有90%以上的成活率。现已证明，植物离体材料经超低温保存后，仍能在适宜的条件下迅速大量繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性。目前超低温保存的植物数量不断增加，但多集中于苹果、樱桃、柑橘、香蕉等木本植物以及一些薯类植物。虽然利用超低温保存技术成功保存了以上植物，但这并不意味着以上方法在任何植物物种或品种中都具有通用性。保存的植物不同、组织器官不同（悬浮细胞、愈伤组织、芽尖、茎尖、胚、花粉、种子），其适宜的保存方法都会有所差异，因此，超低温保存时关键就是针对不同植物，选择适宜的组织器官，进而选择适宜的超低温保存程序。
目前现有技术中没有关于当归细胞超低温保存的方法，更没有超低温保存的当归细胞的植株再生方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种当归细胞的超低温保存方法，该方法对所保存的当归细胞伤害小，保存后的细胞存活率高达100%，约7天后就开始恢复生长，并可以分化出形态正常的当归幼苗，本发明还提供超低温保存后的当归细胞的植株再生方法。该发明为当归大规模悬浮培养时种子细胞系的保存提供了技术保证，同时也为当归种质资源的保存和种苗的工厂化繁育以及转基因育种提供了一条有效途径。
本发明提供一种当归细胞的超低温保存方法，步骤如下：
（1）将生长旺盛的当归悬浮培养细胞装载处理；
（2）将装载处理后的当归悬浮培养细胞用玻璃化溶液脱水处理；
（3）将脱水处理后的当归悬浮培养细胞迅速投入液氮中进行超低温保存；
（4）当需要使用悬浮细胞时，从液氮中取出，解冻，用卸载液卸载，卸载一次，卸载20min，所述卸载液的配方为：每升1/2MS培养液附加1.2mol蔗糖；
（5）恢复培养：吸干卸载液，以0.9-1.1cm大小的细胞团块接种于恢复生长培养基中恢复生长，培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d。
作为优选，所述生长旺盛的当归悬浮培养细胞为继代培养15-30d的细胞。
更优选地，所述生长旺盛的当归悬浮培养细胞为继代培养15d的细胞。
作为优选，所述装载处理为在25℃装载处理10min，装载液为按每升计含0.4mol蔗糖和1mol甘油的混合溶液。
作为优选，步骤（2）中所述玻璃化溶液的配方为按每升计含:甘油30g+乙二醇15g+二甲基亚砜15ml+蔗糖13.7g。
作为优选，步骤（2）中所述脱水处理为在0℃脱水处理5-40min。
更优选地，步骤（2）中所述脱水处理为在0℃脱水处理5min。
本发明还提供一种超低温保存后的当归细胞的植株再生方法，步骤如下：
（1）将解冻并卸载后的悬浮细胞接种到固体培养基上光照培养；所述固体培养基的配方为1/2MS+2.0mg/LIBA+3wt%蔗糖+0.7wt%琼脂；
（2）之后转至成苗培养基中继续培养，培养条件为：光照强度1500LX，光照时间14h/d，培养温度20℃。
作为优选，步骤（1）中所述的光照培养的条件为培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d。
作为优选，步骤（2）中所述成苗培养基的配方为：MS+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA+3wt%蔗糖+0.7wt%琼脂。
传统的玻璃化超低温保存程序中常常采用高糖或低温预培养，但大量试验研究结果显示，此种方法对当归悬浮培养细胞的保存效果不佳，保存后的存活率不高。在玻璃化保护液处理之后，通常要更换新的保护液然后投氮，本研究表明，可省去此步骤，直接投氮。在卸载时传统的方法是采用MS+蔗糖1.2mol/L溶液对保存后的材料进行卸载，共2次，每次10分钟，本研究表明，1次即可，共20分钟。此外，试验研究表明，以当归休眠芽作保存材料时，冻存后芽的成活率很低，而且即使成活休眠芽很难进一步生长和繁殖，达不到种质保存的目的。
本发明的方法保存程序简单易行，保存成活率高达100%，而且保存成活的细胞恢复培养时可快速增殖，并分化出较多的当归幼苗。
本发明通过对玻璃化超低温保存过程中处理方法、条件的特殊设计实现了当归悬浮培养细胞的超低温保存，又进一步由超低温保存的细胞再生当归幼苗。该发明为当归大规模悬浮培养时种子细胞系的长期保存提供了技术保证，同时也为当归种质资源的保存和种苗的工厂化繁育以及转基因育种提供了一条有效途径。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为当归悬浮培养细胞玻璃化超低温保存技术流程；
图2为实施例1中恢复生长40天当归细胞的增殖情况；
图3为PVS2处理时间不同时，当归细胞超低温保存后恢复培养增殖情况；其中，A为处理5min；B为处理30min；C为处理50min；
图4为接种细胞团大小不同时，当归细胞超低温保存后恢复培养增殖情况；其中，A为0.9-1.1cm细胞团；B为0.2-0.4cm细胞团；C为铺散细胞；
图5为采用不同年龄培养的当归悬浮培养细胞时，当归细胞超低温保存后恢复培养增殖情况；其中，A为培养5d；B为培养15d；C为培养30d；
图6为超低温保存后当归细胞再生幼苗；其中A为分化15d的幼苗和B为分化35d形态正常的幼苗。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。如无特殊说明，“%”为质量百分比。
实施例1
本发明的当归细胞的超低温保存方法具体步骤如下：
（1）当归悬浮培养细胞的获得：首先将当归种子发芽小苗的茎段或根段灭菌后接种于b(MS+IBA2mg/L+KT0.2mg/L+蔗糖3%)培养基中诱导获得愈伤组织，然后将愈伤组织在a（1/2MS+IBA2mg/L+蔗糖3%）培养基中进行继代培养，直至获得疏松颗粒状愈伤组织。愈伤组织诱导和继代培养条件为23℃黑暗条件。将鲜重2g的当归颗粒状愈伤组织接种在1/2MS（无机盐减半）+2.0mg/LIBA+30g/L蔗糖的液体培养基中，pH为5.8，100ml三角瓶装20ml培养基，接种后细胞在每分钟100rpm的摇床，25℃黑暗条件下培养，每25d继代一次，多次继代培养后获得当归悬浮培养细胞。
（2）装载:取生长旺盛培养（即继代培养15天）的当归悬浮培养细胞，置于装有装载液的冷冻管中，在25℃装载处理10min，装载液按每升计含0.4mol蔗糖和1mol甘油，溶剂为水。
（3）脱水:吸去装载液，向冷冻管中加入玻璃化溶液，在0℃脱水处理5min，玻璃化溶液按每升计含:甘油30g+乙二醇15g+二甲基亚砜15ml+蔗糖13.7g，溶剂为水。
（4）冷冻保存:将脱水处理后的上述冷冻管迅速投入液氮中进行超低温保存。在液氮中保存时间的长短对细胞成活率没有影响，因此，可以实现当归悬浮培养细胞长期保存的目的。
（5）解冻及卸载:当需要使用悬浮细胞时，将冷冻管从液氮中取出，将其迅速放入40℃的水浴中解冻2min，解冻完成后迅速吸去玻璃化溶液，加入卸载液处理20min，卸载液配方：每升1/2MS培养液附加1.2mol蔗糖。
（6）恢复培养：用无菌滤纸吸干卸载液，以0.9-1.1cm大小的细胞团块接种于恢复生长培养基（1/2MS+IBA2mg/L+蔗糖3%）中，培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d，
恢复生长40d的细胞增殖情况见图2。
实施例2有无预培养对细胞超低温保存后恢复培养的影响
（1）当归悬浮培养细胞的获得同实施例1。
（2）预培养：将当归悬浮培养的细胞在含有60g/L蔗糖的MS培养基中高渗预培养2d，或不进行预培养。
（3）装载：将经过预培养和未经过预培养的当归细胞，置于装有装载液的冷冻管中，在25℃装载处理10min，装载液按每升计含0.4mol蔗糖和1mol甘油，溶剂为水。
（4）脱水:吸去装载液，向冷冻管中加入玻璃化溶液，在0℃脱水处理5min，玻璃化溶液按每升计含:甘油30g+乙二醇15g+二甲基亚砜15ml+蔗糖13.7g，溶剂为水。
（5）冷冻保存:将脱水处理后的上述冷冻管迅速投入液氮中进行超低温保存。
（6）解冻及卸载:当需要使用悬浮细胞时，将冷冻管从液氮中取出，将其迅速放入40℃的水浴中进行解冻2min，解冻完成后迅速吸去玻璃化溶液，加入卸载液处理20min，卸载液配方：每升1/2MS培养液附加1.2mol蔗糖。
（7）恢复培养：用无菌滤纸吸干卸载液，以0.9-1.1cm大小的细胞团块接种于恢复生长培养基（1/2MS+IBA2mg/L+蔗糖3%）中，培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d条件下恢复生长。
预培养的目的是提高分裂细胞的比例，减少细胞内自由水含量，增强细胞对低温的抗性。常用的预培养方法有高渗处理和低温锻炼。从表1中可以看出，没有经过预培养的悬浮细胞，恢复生长的状态好，颜色鲜亮、愈伤增殖量多，成活率为100.0%，而经过含有60g/L蔗糖的改良MS培养基培养后，悬浮细胞的成活率却下降到16.7%，恢复生长的状态较差，颜色灰暗、愈伤增殖量少，因此，不进行预培养有利于当归悬浮细胞的超低温保存。
注：-号表示基本没有愈伤增殖量，+号表示有愈伤增殖量且随愈伤增殖量的增多+号也增多，下同。同列内相同字母表示邓肯氏新复极差检验在P=0.05水平上差异不显著，下同。
实施例3PVS2处理时间对细胞超低温保存后恢复培养的影响
（1）当归悬浮培养细胞的获得同实施例1。
（2）装载:取生长旺盛培养（即继代培养15天）的当归悬浮培养细胞，置于装有装载液的冷冻管中，在25℃装载处理10min，装载液按每升计含0.4mol蔗糖和1mol甘油，溶剂为水。
（3）脱水:吸去装载液，向冷冻管中加入玻璃化溶液，在0℃脱水处理5、10、20、30、40和50min，玻璃化溶液按每升计含:甘油30g+乙二醇15g+二甲基亚砜15ml+蔗糖13.7g，溶剂为水。
（4）冷冻保存:将脱水处理后的上述冷冻管迅速投入液氮中进行超低温保存。
（5）解冻及卸载:当需要使用悬浮细胞时，将冷冻管从液氮中取出，将其迅速放入40℃的水浴中进行解冻2min，解冻完成后迅速吸去玻璃化溶液，加入卸载液处理20min，卸载液配方：每升1/2MS培养液附加1.2mol蔗糖。
（6）恢复培养：用无菌滤纸吸干卸载液，以0.9-1.1cm大小的细胞团接种于恢复生长培养基（1/2MS+IBA2mg/L+蔗糖3%）中，培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d，
恢复生长40d的细胞增殖情况见说明书附图3。
PVS2处理的目的是脱去材料中过多的水分，并使冷冻保护液渗入细胞，使材料能够完全达到玻璃化状态，减轻细胞在超低温保存过程中所受的伤害。脱水时间的长短起着至关重要的作用。从表2和图3中可以看出，当归悬浮细胞恢复生长最佳的为PVS2处理5min的材料，其愈伤颜色鲜亮，愈伤增殖量也最高，脱水时间在10min-40min之间，成活率虽高达100%，但随着PVS2脱水时间的延长，化学药剂对细胞的损伤加重，因此恢复生长后愈伤的增殖量也会有所下降。
表2PVS2处理时间对当归细胞超低温保存后恢复培养的影响
实施例4不同接种细胞团大小对细胞超低温保存后恢复培养的影响
（1）当归悬浮培养细胞的获得同实施例1。
（2）装载:取生长旺盛培养（即继代培养15天）的当归悬浮培养细胞，置于装有装载液的冷冻管中，在25℃装载处理10min，装载液按每升计含0.4mol蔗糖和1mol甘油，溶剂为水。
（3）脱水:吸去装载液，向冷冻管中加入玻璃化溶液，在0℃脱水处理5min，玻璃化溶液按每升计含:甘油30g+乙二醇15g+二甲基亚砜15ml+蔗糖13.7g，溶剂为水。
（4）冷冻保存:将脱水处理后的上述冷冻管迅速投入液氮中进行超低温保存。
（5）解冻及卸载:当需要使用悬浮细胞时，将冷冻管从液氮中取出，将其迅速放入40℃的水浴中进行解冻2min，解冻完成后迅速吸去玻璃化溶液，加入卸载液处理20min，卸载液配方：每升1/2MS培养液附加1.2mol蔗糖。
（6）恢复培养：用无菌滤纸吸干卸载液，以0.9-1.1cm、0.5-0.7cm、0.2-0.4cm左右大小的细胞团和铺散成一薄层的细胞接种于恢复生长培养基中，在a（1/2MS+IBA2mg/L+蔗糖3%）培养上，培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d条件下恢复生长40d细胞的增殖情况见表3和图4。
从表3和图4中可以看出，接种细胞团大小不同，当归超低温恢复细胞的细胞愈伤增殖量、成活率也有所不同，随着接种细胞团的增大，细胞成活率升高、愈伤增殖量增加，因此，接种0.9-1.1cm大小的细胞团，有利于细胞的成活和增殖，愈伤增殖量多，色泽鲜艳，状态疏松，成活率达100%。随着接种细胞团的变小，成活率显著降低，铺散成一薄层的细胞成活率仅为5%。其原因可能是接种的细胞团大时，细胞之间相互影响较大，细胞代谢产生的有利于细胞成活和生长的物质较多。
实施例5不同年龄当归悬浮细胞对细胞超低温保存后恢复培养的影响
（1）当归悬浮培养细胞的获得同实施例1。
（2）装载:取继代培养（每隔25d继代一次）5d、10d、15d、20d、25d和30d的当归悬浮培养细胞，置于装有装载液的冷冻管中，在25℃装载处理10min，装载液按每升计含0.4mol蔗糖和1mol甘油，溶剂为水。
（3）脱水:吸去装载液，向冷冻管中加入玻璃化溶液，在0℃脱水处理5min，玻璃化溶液按每升计含:甘油30g+乙二醇15g+二甲基亚砜15ml+蔗糖13.7g，溶剂为水。
(4)冷冻保存:将脱水处理后的上述冷冻管迅速投入液氮中进行超低温保存。
(5)解冻及卸载:当需要使用悬浮细胞时，将冷冻管从液氮中取出，将其迅速放入40℃的水浴中进行解冻2min，解冻完成后迅速吸去玻璃化溶液，加入卸载液处理20min，卸载液配方：每升1/2MS培养液附加1.2mol蔗糖。
(6)恢复培养：用无菌滤纸吸干卸载液，将冷冻过的细胞以0.9-1.1cm大小的团块接种于恢复生长培养基中，在a（1/2MS+IBA2mg/L+蔗糖3%）培养上，培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d条件下恢复生长40d细胞的增殖情况见说明书附图5。
植物细胞的抗冻能力与细胞的年龄和生理状态有密切关系。取不同年龄的当归悬浮细胞为材料，考察了悬浮细胞的培养时间对当归超低温保存后成活率的影响。从表4和图5中可以看出，培养了5d的细胞成活率比较低，仅为16.7%。细胞继续培养，在第15d时成活率为100.0%，且愈伤增殖量最多。但是随着细胞年龄的增加，细胞的愈伤增殖量呈现一个不断下降的趋势，其原因可能是生长了15d的细胞处于直线生长期，细胞的体积小，细胞质浓厚，无液泡，细胞分裂增殖旺盛，类似于分生组织细胞，这个时期的细胞更耐冻。从细胞生长曲线的研究中也印证了这一点，在培养15d左右细胞分裂增殖旺盛，细胞鲜重达到最大。
实施例6
本发明的超低温保存的当归细胞植株再生的方法如下：
(1)将实施例1中解冻并卸载后的悬浮细胞以0.9-1.1cm大小的团块接种到固体培养基上，固体培养基配方：1/2MS+2.0mg/LIBA+3%蔗糖+0.7%琼脂，直接光照培养，培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d，存活率高达100%；
(2)存活的细胞增殖形成疏松的愈伤组织，然后转至成苗培养基，成苗培养基配方：MS+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA+3%蔗糖+0.7%琼脂，即成苗培养基为于MS基本培养基中加入如下物质：BA0.5mg/L（mg/L为BA在培养基中的浓度，下同）、NAA0.1mg/L、3%蔗糖（3%为蔗糖占MS培养基的重量百分数、0.7%琼脂（0.7%为琼脂占MS培养基的重量百分数），光照强度1500LX，光照时间14h/d，培养温度20℃，在此条件下可分化出较多的当归幼苗，平均每克愈伤组织分化出37.5株当归幼苗，幼苗形态正常(见说明书附图6)。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种当归细胞超低温保存方法，其步骤如下：
（1）将生长旺盛的当归悬浮培养细胞装载处理；所述生长旺盛的当归悬浮培养细胞为继代培养15-30d的细胞；
（2）将装载处理后的当归悬浮培养细胞用玻璃化溶液脱水处理；所述脱水处理为在0℃脱水处理5-40min；
（3）将脱水处理后的当归悬浮培养细胞迅速投入液氮中进行超低温保存；
（4）当需要使用悬浮细胞时，从液氮中取出，解冻，用卸载液卸载，卸载一次，卸载20min，所述卸载液的配方为：每升1/2MS培养液附加1.2mol蔗糖；
（5）恢复培养：吸干卸载液，以0.9-1.1cm大小的细胞团块接种于恢复生长培养基中恢复生长，培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生长旺盛的当归悬浮培养细胞为继代培养15d的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述装载处理为在25℃装载处理10min，装载液按每升计含0.4mol蔗糖和1mol甘油的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述玻璃化溶液的配方为按每升计含：甘油30g+乙二醇15g+二甲基亚砜15ml+蔗糖13.7g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述脱水处理为在0℃脱水处理5min。
6.一种超低温保存后的当归细胞的植株再生方法，其步骤如下：
（1）将生长旺盛的当归悬浮培养细胞装载处理；所述生长旺盛的当归悬浮培养细胞为继代培养15-30d的细胞；
（2）将装载处理后的当归悬浮培养细胞用玻璃化溶液脱水处理；所述脱水处理为在0℃脱水处理5-40min；
（3）将脱水处理后的当归悬浮培养细胞迅速投入液氮中进行超低温保存；
（4）当需要使用悬浮细胞时，从液氮中取出，解冻，用卸载液卸载，卸载一次，卸载20min，所述卸载液的配方为：每升1/2MS培养液附加1.2mol蔗糖；
（5）将解冻并卸载后的悬浮细胞接种到固体培养基上光照培养；所述固体培养基的配方为1/2MS+2.0mg/LIBA+3wt%蔗糖+0.7wt%琼脂；
（6）之后转至成苗培养基中继续培养，培养条件为：光照强度1500LX，光照时间14h/d，培养温度20℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的光照培养的条件为培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（6）中所述成苗培养基的配方为：MS+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA+3wt%蔗糖+0.7wt%琼脂。
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| US6753182B1 (en) * | 1995-06-07 | 2004-06-22 | Phyton, Inc. | Cryopreservation of plant cells |
| CN102144633A (zh) * | 2011-03-02 | 2011-08-10 | 上海交通大学 | 大苞鞘石斛原球茎玻璃化超低温保存方法 |
| CN103070163A (zh) * | 2013-01-30 | 2013-05-01 | 云南农业大学 | 云南大百合原生质体超低温保存方法及活性鉴定方法 |
-
2014
- 2014-07-31 CN CN201410369174.5A patent/CN104126570B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张俊莲等.当归愈伤组织低温保存试验.《甘肃农业大学学报》.1996,第31卷(第2期),175-177. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104126570A (zh) | 2014-11-05 |
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