CN1217873A - 植物样品的玻璃化冻存方法 - Google Patents

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Abstract

一种植物样品的玻璃化冻存方法,由取材、用保护剂脱水、冷冻、化冻和冻后恢复生长等环节组成。其特征是取材后先进行糖醇类物质的预培养处理,再在保护剂脱水前加入过渡这一环节。采用了淀粉恢复培养。另外,玻璃化保护剂的成分也作了进一步改进。通过本发明,减少了植物样品的玻璃化冻存中的脱水损伤,提高了样品的恢复生长率,扩展了玻璃化法冻存的使用范围和可操作性。

Description

植物样品的玻璃化冻存方法
本发明涉及一种植物细胞、组织和器官的玻璃化液氮冻存方法，属动植物的局部保存范畴。
现有的植物样品玻璃化冻存方法，一般由取材、保护剂脱水、冷冻、化冻和冻后恢复生长等五个环节组成。
在保护剂脱水环节中，用高浓度保护剂直接脱水样品代替两步法的胞外冰晶脱水样品，虽然克服了两步法中程序降温仪使用和机械损伤等不足，但存在以下二个问题：(1)抗脱水力较差的样品，易受到高浓度保护剂的化学损伤和渗透胁迫，存活率较低；(2)体积较大的样品，在内层细胞脱水程度刚合适的条件下，外层细胞已经脱水过头了，引起器官的生物学功能丧失。
在冻后恢复生长这个环节中，一般用正常渗透压固体培养或高渗透压固体培养。前者存在的主要问题是，细胞受水渍化作用，质壁分离复原过快，使细胞受到较大损伤，引起延滞期加长，发白死亡不能生长的细胞团过多。后者存在的主要问题是，细胞质壁分离复原后不能有效生长，扩增的生物量很小，培养物畸形。
目前，整个植物材料的玻璃化法冻存主要是针对园艺植物的茎尖和分生组织而实施的，因此，除了上面提到的脱水和恢复培养中的几个不足之处外，植物样品的玻璃化法冻存还有以下缺点：(1)应用面窄，目前主要是桃、李、苹果和石刁柏等属的茎尖和分生组织；(2)应用于植物悬浮细胞时存活率低，或复活细胞不能再生健康植株；(3)对禾谷作物的幼胚、幼穗和兰科的原球茎未曾有过应用实施。
本发明的目的是减少植物样品玻璃化法冻存的脱水损伤，提高样品的恢复生长率，扩展玻璃化法冻存的适用范围和可操作性。
本发明提供的植物样品玻璃化法冻存方法，由取材、用保护剂脱水、冷冻、化冻和冻后恢复生长等环节组成。其特征是植物样品在取材后先进行0.175～0.5mol/L糖醇类物质的预培养处理，培养时间为1～10天，温度为24～26℃。
为了减少样品的脱水损伤，本发明采用糖醇类物质复合预培养。样品在含0.175～0.25mol/L蔗糖的培养基中培养3～10天，再在含0.3～0.5mol/L山梨醇的养基中培养1～2天。25℃，暗培养。预培养对样品的存活至关重要，不经预培养的样品存活率很低，单预培养效果不及双预培养，双预培养中又以本发明中所描述的组合为佳。分析认为，前一个较长时间的蔗糖预培养能改变细胞的大小，降低胞内冰点，增加细胞壁厚度和柔韧性。后一个较高浓度的山梨醇的较短时间的预培养能降低胞内自由水，使液泡变小，除去渗透敏感细胞。理论上，前者主要是通过改变细胞生长提高抗冻力，而后者主要是调节渗透压提高抗脱水力。本发明中，把这两种预培养组合，得到了较好的效果，说明这两个预培养间有相互作用。
为了减少样品的脱水损伤，本发明还采用了过渡这一环节。取双预培养后的样品，用20～30％PVS2(培养基中含有0.65～0.97mol/L甘油，0.47～0.70mol/L乙二醇，0.38～0.57mol/L二甲亚砜和0.4mol/L蔗糖)过渡不同时间，比较样品冻后的TTC存活率，发现过渡有利于存活率的提高，较佳的过渡时间为22℃下10～20分钟。机理分析表明，过渡处理能增加保护性成分向细胞渗入，减轻细胞在完全浓度玻璃化保护剂下的脱水损伤，促进细胞最终进入玻璃化。由于过渡处理，整个样品的以后脱水过程变得更加均一和可控，这对冻存体积较大的样品是一个非常有利的进步。
为了减少样品在恢复培养时的损伤，提高样品的恢复生长率，本发明采用了淀粉恢复培养基。样品在淀粉培养基上生长效果最好，恢复生长的延滞期较短，为2-4天，细胞一直保持原先色泽，没有一个先黄色褐化的过程。这可能是因为淀粉培养基既提供了合适的渗透平衡条件，又消除了水渍湿润现象。淀粉培养基中淀粉浓度为20～40％，培养时间为25℃ 2～3天。
所用的玻璃化保护剂可以在PVS2上进一步添加5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或用0.4mol/L的海藻糖代替0.4mol/L的蔗糖。冻后细胞的TTC活性可以提高。
由于本发明在抗脱水力提高、脱水损伤降低和恢复生长条件等方面作了较改进，使本发明的合适范围扩展了，不仅包含茎尖和分生组织，而且还包括禾本科作物的悬浮细胞、愈伤组织、幼胚、幼穗以及兰科的原球茎等样品。
本发明的植物样品玻璃化法冻存技术具有以下优点：
(1)样品脱水损伤小。通过糖醇类物质的复合预培养，大大提高了样品的抗脱水能力，从内因上为减轻脱水损伤创造了条件。另外，通过引进过渡这一环节，避免了样品直接接触高浓度保护剂，加强了保护性物质的渗透，从外因上为减轻脱水损伤创造了条件。
(2)样品恢复生长快，恢复生长率高。由于淀粉恢复生长培养基，消除了水渍不利因素，提供了良好的渗透平衡条件，保证了样品能更好恢复生长。又由于样品的脱水损伤在本发明中被减小，样品本身的活性就比以前高，使它们在恢复生长时延滞期短、恢复生长频率高。
(3)方法的适应范围广。由于抗脱水力大大提高，脱水损伤全面减小，恢复生长明显改善，使本发明扩展到多种植物样品时都有旺盛的生命力，显示出较好效果。它适用于园艺植物的茎尖和分生组织，也适用于禾本科作物的悬浮细胞、愈伤组织、幼胚、幼穗以及兰科的原球茎等样品。
实施例1．水稻胚性悬浮细胞，品种02428。(1)取材：指数生长期的细胞。(2)预培养：细胞在含0.175mol/L蔗糖的AA2培养基(2,4-D 2.0mg/L,GA3 0.1mg/L,KT 0.2mg/L)中培养10天(第7天时换液，即先7天后3天)，再在含0.4mol/L山梨醇的AA2培养基中培养1天。(3)过渡：用25％PVS2(培养基中含有0.815mol/L甘油，0.595mol/L乙二醇，0.481mol/L二甲亚砜和0.4mol/L蔗糖)过渡22℃下10～20分钟。(4)脱水：细胞在100％PVS2(AA2培养基中含有3.26mol/L甘油，2.38mol/L乙二醇，1.92mol/L二甲亚砜和0.4mol/L蔗糖)中0℃脱水7.5分钟。(5)冷冻管中，液体和固体的比例为6∶4，既致密细胞体积为40％(PCV=40％)。样品和保护剂总体积为0.75～1.0ml。将冷冻管直接投入液氮，降温速率为200℃/min。(6)取用时，37℃水浴快速化冻，用含1.2mol/L山梨醇的AA2培养基25℃洗涤25分钟，沥干，测定其TTC存活率为45.0±5.0％。(7)恢复培养：冻后细胞先接种在琼脂固化的AA2培养基上，分别含1.2mol/L山梨醇，1.2mol/L蔗糖和20％可溶性淀粉。2天后，转移到正常的固体培养基上。均为暗培养。结果，冻后细胞能在2天内开始生长，复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例2．水稻胚性悬浮细胞，品种世锦8417。冻存过程同实施例1，细胞的TTC存活率为43％。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例3．水稻胚性悬浮细胞，品种中香二号。冻存过程同实施例1，细胞的TTC存活率为33％。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例4．大麦胚性悬浮细胞，品种早熟三号。冻存过程基本同实施例1，所用保护剂用CC培养基(含2.0mg/L2,4-D)配制。细胞的TTC存活率为45％。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例5．胡萝卜胚性悬浮细胞。冻存过程基本同实施例1，所用保护剂用MS培养基(含1.0mg/L 2,4-D)配置。细胞的TTC存活率在60％以上。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例6．大麦幼穗。在添加0.5MOL/L蔗糖的2天预培养后，用玻璃化PVS2保护剂冰浴处理5分钟，直接投入液氮储存。取用时，快速化冻，洗去保护剂后恢复生长，三个品种”81G1”，”戈贝纳”和”旭9”的成活率分别为100％,82.5％和50％。存活幼穗先形成初生愈伤组织并进一步形成胚性愈伤组织，胚性愈伤组织能再生植株。
实施例7．大麦幼胚。在添加0.4MOL/L山梨醇的2天预培养后，其余处理同于实施例6。存活幼胚既能在无激素培养基上萌发成苗，也能在有激素培养基上形成胚性愈伤组织并再生植株。
实施例8．水稻愈伤组织。在添加0.4MOL/L山梨醇的2天预培养后，其余处理同于实施例6。存活愈伤组织能再生植株。
实施例9．铁皮石斛的初生原球茎。种子在含0.5mg/L脱落酸的培养基上萌发3周，先用25％PVS2过渡10分钟(22℃)，再用PVS2脱水15分钟(0℃)，进行冷冻保存。95％的原球茎存活并萌发成苗。实验了几种不同的过渡和脱水时间，上述条件为最佳。
实施例10．水稻胚性悬浮细胞，品种02428。冻存过程同实施例1，当脱水时间为5分钟时，细胞的TTC存活率为39.0±3.7％。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例11．水稻胚性悬浮细胞，品种02428。冻存过程同实施例1，当脱水时间为10分钟时，细胞的TTC存活率为30.2±5.2％。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例12．水稻胚性悬浮细胞，品种02428。冻存过程同实施例1，当玻璃化保护剂中含5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，用0.4mol/L的海藻糖代替0.4mol/L的蔗糖时，细胞的TTC存活率为50％。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例13．水稻胚性悬浮细胞，品种02428。冻存过程同实施例1，当过渡时间为20分钟时，细胞的TTC存活率为20.5±4.4％。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例14．水稻胚性悬浮细胞，品种02428。冻存过程同实施例1，当第二预培养为0.4mol/L山梨醇2天时，细胞的TTC存活率为44.2±6.6％。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例15．水稻胚性悬浮细胞，品种02428。冻存过程同实施例1，当第二预培养为0.8mol/L山梨醇1天时，细胞的TTC存活率为41.1±8.4％。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。
实施例16．铁皮石斛的初生原球茎。基本过程同于实施例9。种子在含0.175mol/L蔗糖的培养基上萌发3周，先用25％PVS2过渡10分钟(22℃)，再用PVS2脱水15分钟(0℃)，进行冷冻保存。12-20％的原球茎存活并萌发成苗。
实施例17．水稻胚性悬浮细胞，品种02428。冻存过程同实施例1，当采用0.4mol/L山梨醇预培养1天时，细胞的TTC存活率为21.3±7.8％。复活细胞能重建胚性悬浮细胞系，也能在分化培养基上再生健康可育植株。

Claims (6)

1．一种植物样品的玻璃化冻存方法，由取材、用保护剂脱水、冷冻、化冻和冻后恢复生长等环节组成。其特征是植物样品在取材后先进行0.175～0.5mol/L糖醇类物质的预培养处理，培养时间为1～10天，温度为24～26℃。
2．根据权利要求1所述的植物样品玻璃化冻存方法，其持征所述预培养处理为双预培养处理，先将样品在蔗糖浓度为0.175～0.25mol/L的培养基中培养3～10天；然后再在含山梨醇浓度为0.3～0.5mol/L的培养基中培养1～2天。
3．根据权利要求1所述的植物样品玻璃化冻存方法，其特征为在保护剂脱水以前进行过渡处理。用20～30％PVS2(培养基中含有0.65～0.97mol/L甘油，0.47～0.70mol/L乙二醇，0.38～0.57mol/L二甲亚砜和0.4mol/L蔗糖)过渡22℃下10～20分钟。
4．根据权利要求1所述的植物样品玻璃化冻存方法，其特征为冻后恢复生长时采用淀粉恢复培养。淀粉浓度为20～40％，培养1～3天。
5．根据权利要求1所述的植物样品玻璃化冻存方法，其特征为脱水采用的玻璃化保护剂为5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),0.4mol/L的海藻糖，3.26mol/L甘油，2.38mol/L乙二醇，1.92mol/L二甲亚砜。
6．根据权利要求1所述的植物样品玻璃化冻存方法，其特征为采用的植物样品为：茎尖，分生组织，禾谷作物的悬浮细胞，愈伤组织，幼胚，幼穗和兰科的原球茎。
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