CN101401568B - 菊花超低温保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了菊花超低温保藏方法，本发明方法包括步骤：取无菌苗茎尖经预培养后，置于预处理溶液中于室温下处理20-40min，然后转入玻璃化保护剂中在4℃或室温下处理10～20min，再将茎尖转移至装有冰浴预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，投入液氮中保存，即可。经恢复培养后茎尖可直接生长成植株。本发明方法简便易行，稳定可靠，保存后菊花恢复生长状况良好，植株再生率最高的品种可达85％以上。

Description

菊花超低温保存方法

技术领域

本发明涉及一种菊花种质的保存方法，具体的说，涉及一种菊花的超低温保存方法。

背景技术

菊花(chrysanthemum)是世界著名的四大生鲜切花之一，我国有丰富的菊属及其近缘属植物种质资源，这些物种中蕴藏着许多栽培菊花缺乏的优异基因，如抗虫性、抗旱性、耐涝性等，可以用于栽培菊花种质创新，选育优质高抗新品种。其次，菊属及其近缘属植物种类和品种繁多，可进行盆花、切花或地被栽培，广泛用于家庭、会场、街道、广场、企事业单位等的美化装饰，市场价值很高。再者，菊花生产是一个高度劳动密集型产业，产业发展能有效解决农民就业，引导农业产业结构的调整，对增加农业增收和农民收入起到积极作用。最后，菊花种植和园林应用不存在污染，既可美化、彩化和香化环境，又可提高人民的生活质量，具有增强市民生态意识、推动精神文明建设等的综合效益。

面对花卉生产日益市场化、专业化、规模化的趋势，市场需要发生变化势必造成非当家花卉品种资源的人为丧失，不利于花卉种质创新和新品种选育工作的持续发展。另外，由于过去大批农业野生植物资源及品种资源纷纷流向境外，成为国外花卉品种创新的重要基础，这已经是不可挽回的历史。而近年来，随着境外机构对花卉种质资源、优良品种和优异基因进行立法和专利保护措施的不断强化，对我国经济的发展和资源安全提出了更大的挑战。因此，搜集、整理和保存我国主要花卉种质资源的重要性不言而喻。

种质资源的保存广义上有现地保存和异地保存两种。针对菊花是一种自交不亲和的植物资源的特点，一般通过繁种圃或保存圃的田间种植方式来保存。这种保存方式需要通过年复一年的扦插来维持，不仅占用耕地，而且栽培管理中又耗时费力，还存在受干旱、洪涝、低温、热害、病虫害等自然灾害的影响而导致种质毁灭的危险性，不适应于长期保存(Withers L.A.and Engels J.M.M.1990.The test tubegenebank-a safe alternative to field conservation，IBPGR Newsletter forAsia and the Pacific 3，1-2.)。在此背景下，超低温保存被认为是这类植物目前安全、有效、成本效益比合算的基因资源长期保存的最有希望的保存方法。超低温条件下，植物的生理生化活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内(Engelmann F.1997.In vitro conservation methods.In：Callow JA，Ford-Lloyd BV，NewburyHJ(eds)Biotechnology and plant genetic resources.CAB International，Oxford，pp 119-161.)。

现已证明，植物离体材料经超低温保存后，仍能在适宜的条件下迅速大量繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性。它避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。关于植物超低温保存的研究，在进入到上世纪的90年代后，保存技术的多样化与简易化方面不断取得进步，能够保存的植物物种数也在不断地增长，但多数集中在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等薯类植物为主的植物遗传资源的超低温保存(Sakai A andNishiyama Y.1978.Cryopreservation of winter vegetative buds of hardyfruit trees in liquid nitrogen.Hortic Sci 13：225-227.)。目前针对菊花种质资源的超低温保存技术尚未确立。

虽然利用超低温保存技术保存植物遗传资源的实践，在上述物种中有了成功应用的报道，但并不意味着任何植物物种或品种具有通用的方法。因为大多数植物材料如悬浮细胞、愈伤组织、茎尖、芽尖、胚等，含有大量的细胞间水分，对冷冻伤害特别敏感。特别是植物分生组织、芽端的细胞质分布均匀而且稠密，对低温冰冻极为敏感，冰冻过程中的损伤效应特别突出，哪怕是局部的冰冻损伤都会影响冻后的正常分化与再生。同时，分生组织、芽端必须保持结构的完整性才能快速分化。因此，超低温保存面临的课题是尽可能采取更多的、更有效的手段来保证分生组织、芽端在冻存过程中免受损伤。以上特征因物种不同而存在差异。

发明内容

本发明的目的是提供一种菊花超低温保存方法，为菊花的长期保存提供了一种有效的途径。

本发明菊花的超低温保存方法，包括如下步骤：取茎尖经预培养后，置于预处理溶液中于室温下处理20-40min，然后转入玻璃化保护剂中冰浴或常温下处理10～15min，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，每管可装10～15个茎尖，投入液氮中保存即可。

上述茎尖可从组培苗上切下，大小1.5～2mm为宜，切取时选择健壮的无菌苗。预培养可以减少茎尖组织细胞自由水含量，并增加可溶性糖等保护性物质含量，从而提高茎尖抗冻力，减少或避免冷冻伤害，达到提高存活率的目的。预培养培养基可以是含蔗糖、甘露醇、山梨醇等渗透调节剂的培养基。本发明预培养优选使用含0.2-0.4mol·L^-1蔗糖的MS固体培养基，低温暗培养1～5天。更优选使用含0.4mol·L^-1蔗糖的MS固体培养基，4℃下暗培养3d。

由于玻璃化保护剂浓度较高，将茎尖转入玻璃化保护剂中时会使茎尖快速脱水，容易对茎尖造成伤害，因而，需要进行预处理。预处理溶液可以是含有1-3mol·L^-1甘油和0.2-0.6mol·L^-1蔗糖的液体培养基，优选为含有2mol·L^-1甘油和0.4mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基，室温下处理20-30min。

玻璃化保护剂可以为甘油、乙二醇、二甲基亚枫等。优选为含1.63-4.89mol·L^-1甘油、1.61-4.84mol·L^-1乙二醇、1.27-3.81mol·L^-1DMSO和0.3-0.5mol·L^-1蔗糖。更优选为含有3.26mol·L^-1甘油、2.42mol·L^-1乙二醇、1.9mol·L^-1DMSO和0.4mol·L^-1蔗糖的溶液，冰浴或室温下处理15min。

在使用时需要进行恢复培养。具体的方法是，取冷冻管，立即放入40℃水浴中解冻2分钟，茎尖在室温下用含1～2mol·L^-1蔗糖(优选含1.2mol·L^-1蔗糖)的MS培养液洗涤2～3次，每次5～10min，洗涤后的茎尖用滤纸吸干，再经暗培养或弱光培养后再转入常光培养。暗培养或弱光培养所用的培养基可以是含有适量生长激素的MS半固体培养基。优选为含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA3的MS半固体培养基，在此培养基中暗培养3天左右，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中，茎尖可直接长成植株。

若无特别指出，本发明中所涉及的溶液均为水溶液；本发明中涉及到的预冷或冰浴的温度是指4℃。

本发明菊花超低温保存方法简便易行，稳定可靠，保存后菊花恢复生长状况良好，植株再生率高的可达85％以上，但因品种而异，有一定变幅。

附图说明

图1显示的是菊花茎尖超低温保存后植株再生状态；

图2显示的是本发明中不同菊花种质茎尖玻璃化超低温保存再生率，图中，数据棒中不同小写字母表示在p＜0.05水平具有显著差异，数据棒上端的垂直短线为标准误，下图同此。

图3显示的是预培养培养基中蔗糖浓度对菊花超低温保存成活率的影响；

图4显示的是不同预处理时间对菊花超低温保存成活率的影响；

图5显示的是不同的玻璃化处理时间对菊花超低温保存成活率的影响。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1菊花的超低温保藏

材料：

菊花品种：菊科菊属(Dendranthema molifolium)黄花小菊、紫花小菊、切花菊‘神马’(独本菊)，以及近缘的大丽菊属(Dahliapinnata Cav.)大丽菊等4个品种，从上海和杭州花卉市场购买。切取花托繁殖试管苗，获得花托无性繁殖系。

预培养培养基：含0.4mol·L^-1蔗糖的MS固体培养基

预处理溶液：含2mol·L^-1甘油和0.4mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基

玻璃化保护剂：含有3.26mol·L^-1甘油、2.42mol·L^-1乙二醇、1.9mol·L^-1DMSO和0.4mol·L^-1蔗糖

方法：

选取上述菊花品种的健壮组培苗，切取茎尖(1.5～2mm)，于预培养培养基中4℃下暗培养3天，将茎尖在预处理液中室温下浸泡30min，再转移至玻璃化保护剂中4℃下处理15min，再将茎尖转移至装有冰浴预冷(约4℃)的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，每管装10～15个茎尖，投入液氮中保存即可。

再培养及存活率考察

取冷冻管，立即放入40℃水浴中解冻2分钟，茎尖在室温下用含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤3次，每次5～10min，洗涤后的茎尖用滤纸吸干，移至含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA3的MS半固体培养基中，暗培养3天，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中，常规光照培养。

结果表明，茎尖保存后菊花新植株恢复生长状况良好，实验用4个品种黄花小菊、紫花小菊、神马和大丽菊的植株再生率分别为85.7％、71.2％、44.3％和83.2％(见图2)。

实施例2菊花的超低温保藏----预培养培养基中蔗糖浓度对保存效果的影响

实验材料的生理状态对冻后存活率有着显著影响。茎尖通过短期高浓度蔗糖预培养，使组织较缓和地脱去部分水分，同时促使细胞分泌保护物质，有利于冻后存活。一般的操作是切取较大茎尖组织预培养后，再切取适当大小进行超低温保存。本专利实验中，选用材料经切割后易褐化，再经高浓度的蔗糖预培养后，就会造成茎尖组织变软，水渍化，给后面的剥取操作造成很大不便，茎尖也极易受损，并在其后的恢复培养中出现分化困难。故改进为：先在解剖镜下将茎尖仔细逐层剥去外层叶片，直至有1-2片护叶包围茎尖，并切成适当大小(1-3mm)，经预培养后直接进行玻璃化处理。

材料：

菊花品种：菊科菊属黄花小菊品种，从上海市花卉市场购买。切取花托繁殖试管苗，获得花托无性繁殖系。切取花托繁殖试管苗，获得花托无性繁殖系。

预培养培养基：蔗糖浓度富集的MS固体培养基，暗培养

预处理溶液：含2mol·L^-1甘油和0.4mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基

玻璃化保护剂：含有3.26mol·L^-1甘油、2.42mol·L^-1乙二醇、1.9mol·L^-1DMSO和0.4mol·L^-1蔗糖。

方法：

选取上述菊花品种的健壮组培苗，切取茎尖(1.5～3mm)，在蔗糖浓度分别为0.3mol·L^-1、0.4mol·L^-1、0.5mol·L^-1、0.6mol·L^-1的MS培养基中预培养3d，用预处理液处理20min，再经PVS2冰浴处理20min，换上新鲜的PVS2投入液氮，冻存一周后进行恢复培养。

再培养及存活率考察

取冷冻管，立即放入40℃水浴中解冻2分钟，茎尖在室温下用含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤3次，每次5～10min，洗涤后的茎尖用滤纸吸干，移至含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA3的MS半固体培养基中，暗培养3天，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中，常规光照培养。

结果表明，茎尖保存后菊花新植株恢复生长状况随预培养基中附加的蔗糖浓度而异出现显著差异。结果显示：用添加0.4mol·L^-1蔗糖的MS培养基预培养3天，成活率最高达65％；0.3mol·L^-1的蔗糖预培养3天次之，0.5mol·L^-1、0.6mol·L^-1的蔗糖和未加蔗糖预培养的茎尖在冻存后只有20％左右或者更低的成活率(图3)。

实施例3菊花的超低温保藏----预处理时间对保存效果的影响

超低温保存过程中，冰浴条件下用玻璃化试剂处理菊花茎尖20min，可以得到成活茎尖，但处理时间大于20min则不利于茎尖存活和再生。由于玻璃化试剂对茎尖的脱水时间仅为20min，因此脱水这个步骤对于菊花超低温的成功保存至关重要。这个过程对于不同生理状态的茎尖来说，有的茎尖可能20min内脱水已经过多，有的则可能脱水不足，特别是含水量较高的茎尖，最后都会造成茎尖死亡。所以玻璃化之前，适当延长预处理时间，加强对茎尖进行初步脱水是提高菊花超低温保存成活率的一个关键。

材料：

菊花品种：菊科菊属黄花小菊品种，从上海市花卉市场购买。切取花托繁殖试管苗，获得花托无性繁殖系。切取花托繁殖试管苗，获得花托无性繁殖系。

预培养培养基：含0.4mol·L^-1蔗糖的MS固体培养基，暗培养

预处理溶液：含2mol·L^-1甘油和0.4mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基

玻璃化保护剂：含有3.26mol·L^-1甘油、2.42mol·L^-1乙二醇、1.9mol·L^-1DMSO和0.4mol·L^-1蔗糖。

方法：

选取上述菊花品种的健壮组培苗，切取茎尖(1.5～2mm)，于预培养培养基(添加0.4mol·L^-1蔗糖)中4℃下暗培养3天后，将茎尖在预处理液中室温下分别浸泡20min，30min，40min，50min，再转移至玻璃化保护剂中4℃下处理20min，然后将茎尖转移至装有冰浴预冷的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，每管装10～15个茎尖，投入液氮中保存即可。

再培养及存活率考察

取冷冻管，立即放入40℃水浴中解冻2分钟，茎尖在室温下用含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤3次，每次5～10min，洗涤后的茎尖用滤纸吸干，移至含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA3的MS半固体培养基中，暗培养3天，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中，常规光照培养。

结果表明，茎尖保存后菊花新植株恢复生长状况良好，经过30min的预处理，成活率最高达到75％，显著高于其他预处理时间的处理(图4)。

实施例4菊花的超低温保藏----玻璃化处理时间对保存效果的影响

玻璃化试剂可使组织脱去水分，并缓和地渗入组织，在冻存中进入玻璃化状态，有效地保护细胞结构。但由于保护剂成份中含有毒性及导致变异的成分(如二甲基亚砜)，故需严格掌握。在保证有足够高的成活率的前提下，尽量缩短处理时间。

材料：

菊花品种：菊科菊属黄花小菊品种，从上海市花卉市场购买。切取花托繁殖试管苗，获得花托无性繁殖系。切取花托繁殖试管苗，获得花托无性繁殖系。

预培养培养基：含0.4mol·L^-1蔗糖的MS固体培养基，暗培养

预处理溶液：含2mol·L-1甘油和0.4mol·L-1蔗糖的MS液体培养基

玻璃化保护剂：含有3.26mol·L^-1甘油、2.42mol·L^-1乙二醇、1.9mol·L^-1DMSO和0.4mol·L^-1蔗糖。

方法：

选取上述菊花品种的健壮组培苗，切取茎尖(1～3mm)，在蔗糖浓度为0.4mol·L^-1的MS培养基暗环境之下预培养3d，用预处理液处理30min，再经PVS2(0℃)分别处理15min、22min、30min。然后将茎尖转移至装有冰浴预冷的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，每管装10～15个茎尖，投入液氮中保存即可。

再培养及存活率考察

取冷冻管，立即放入40℃水浴中解冻2分钟，茎尖在室温下用含1.2mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤3次，每次5～10min，洗涤后的茎尖用滤纸吸干，移至含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA3的MS半固体培养基中，暗培养3天，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中，常规光照培养。

恢复培养结果表明：在这3种玻璃化处理时间下，玻璃化处理15min成活率最高，达85.7％，显著高于其他玻璃化时间的处理。当处理延长至30min时，成活率降至55.6％(图5)。

Claims (3)

1.菊花超低温保藏方法，包括步骤：取茎尖经预培养后，置于预处理溶液中于室温下处理30min，然后转入玻璃化保护剂中处理15min，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，投入液氮中保存，

其中，所述预培养的方法是将茎尖在含0.4mol·L^-1蔗糖的MS固体培养基，4℃下暗培养3天；

其中，所述预处理溶液为含2mol·L^-1甘油和0.4mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基；

其中，所述玻璃化保护剂含3.26mol·L^-1甘油、2.42mol·L^-1乙二醇、1.9mol·L^-1DMSO和0.4mol·L^-1蔗糖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，经超低温保藏后，取冷冻管放入40℃水浴中解冻2分钟，茎尖在室温下用含1～2mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤2～3次，每次5～10min，洗涤后的茎尖用滤纸吸干，经暗培养或弱光培养后再转入常光培养，即可再生出植株。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，解冻后茎尖的暗培养或弱光培养的方法是在含0.5mg·L^-1BA、0.1mg·L^-1NAA和0.5mg·L^-1GA3的MS半固体培养基中暗培养或弱光培养3天，等茎尖返绿并有萌动迹象时再转入MS固体培养基中常光培养。

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