CN113151294B - Wrky53基因在增强植物耐铝性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明适用于植物基因工程领域，提供了一种WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用，其中，WRKY53基因的CDS序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述植物优选为苹果。本发明实施例提供的WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用，是以转基因植株的形式，将WRKY53在待增强植物的植株里过表达，减轻铝胁迫对植物造成的危害，可以短时间内显著增强植物抗铝胁迫的能力，减轻铝胁迫下活性氧对植物的损害，从而缓解植物在铝胁迫环境下导致的产量和品质下降的问题。

Description

WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用。

背景技术

WRKY转录因子家族是一类在植物中非常重要的转录因子家族。在植物的进化历程中，WRKY转录因子因其结构域N-末端具有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名，且能与目标基因启动子发生特异性结合并调控目的基因的表达，进而参与到植物的生命活动进程中。

铝胁迫是指：土壤酸化导致土壤中游离态铝等金属离子含量的增加，而引发铝毒对植物产生毒害作用。高浓度的Al³⁺会造成果树根系中毒，抑制根的生长和吸收养分，引发果树营养障碍、生长发育不良以及果实产量、品质下降等问题。

铝是地壳中最丰富的金属元素，在土壤中普遍存在。当铝以离子形式存在时特别是Al³⁺形式，对生物体具有高度毒性。在土壤pH<5的果园中，铝以Al³⁺的形式释放到土壤溶液中被果树根系吸收。在酸性土壤中，铝毒被认为是限制果树生长发育的最主要因素，高浓度的Al³⁺会造成果树根系中毒，抑制根的生长和吸收养分，引发果树营养障碍、生长发育不良以及果实产量、品质下降等问题。铝毒是酸性土壤中制约作物产量的全球性农业生产问题，它对作物产量的影响仅次于盐胁迫对植物的毒害作用。

最初和最明显的表现是对植物根尖伸长的抑制。植物一般在低浓度Al³⁺下能够正常生长，一旦Al³⁺浓度超过适应范围，植物的根系生长就会受到明显的抑制。 Al³⁺浓度过高直接导致植物根系矮小，受损，发育不良，进而影响植物对水分和矿质营养的吸收。如果长时间暴露在铝毒中，会造成植物根部形态改变，并且A l³⁺与根部细胞内的细胞核相结合，抑制细胞分裂，最终导致根部细胞的死亡。

当植物遭受铝毒侵害时，继根受到毒害后，叶片开始卷曲并老化，叶脉紫红，由叶间开始向中也出现黄化现象，严重时导致叶片坏死，使植株新叶生长受阻，生物量积累减少，并由此引起氧化破坏作用和活性氧类物质的产生，使植株光合能力下降。铝毒侵害严重时，会使植物叶片中叶绿素含量下降，会严重抑制植物叶片的光合作用，增加气孔阻力，降低光合速率，使植物水分利用率下降。铝胁迫条件下，植物叶片叶绿素含量下降，光合能力显著下降，酸性土壤上受到铝胁迫植物的叶绿素含量、蒸腾强度和光合速率均下降。因此，提高栽培植物的抗铝胁迫能力迫在眉睫，这在农业生产上具有极为重要的意义。

在酸性土壤中，当铝以离子形式存在时，对生物体具有高度毒性。目前提高植物抗铝能力的措施主要是农艺措施和生物措施，果园中主要以施用石灰粉等土壤改良剂来改良土壤，提高土壤的pH值抵抗铝胁迫，但是施用石灰粉不作用于土壤深层，修复土壤不彻底，容易造成土壤反复酸化，不是好的解决策略。

生物措施主要是培育抗铝品种，但是存在育种年限较长、育种工作的传承性和延续性较差等问题，利用传统杂交育种的方法进程缓慢，通过常规杂交方法筛选能兼顾抗性和其它优良品质的品种非常困难。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述WRKY53基因的CDS序列如序列表SEQ IDNO:1所示。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述植物为双子叶植物。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述植物为苹果。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述植物为嘎啦苹果。

作为本发明实施例的另一种优选方案，增强植物耐铝性的方法包括以下步骤：

利用WRKY53基因的上游引物和下游引物对WRKY53基因进行单克隆扩增，得到扩增产物；

利用扩增产物构建植物超表达载体；

将植物超表达载体转入至待增强植物的植株中。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述WRKY53基因的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:2～3所示。

作为本发明实施例的另一种优选方案，将植物超表达载体转入至待增强植物的植株中的方法为农杆菌介导法。

本发明实施例提供的WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用，是以转基因植株的形式，将WRKY53在待增强植物的植株里过表达，减轻铝胁迫对植物造成的危害，可以短时间内显著增强植物抗铝胁迫的能力，减轻铝胁迫下活性氧对植物的损害，从而缓解植物在铝胁迫环境下导致的产量和品质下降的问题。本发明可以短时间内显著增强苹果植株的抗铝能力，无需改良土壤能显著增强植物抵御铝胁迫的能力，短时间内减轻铝胁迫对植物造成的氧化伤害，其简单易行，操作简单，稳定性好。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例提供了WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用，具体的，增强植物耐铝性的方法可包括以下步骤：

S1、WRKY53基因的单克隆扩增：

(1)PCR扩增WRKY53基因：

以上游引物F和下游引物R为引物对，用如下表1中的40微升体系对WR KY53基因进行单克隆扩增，得到WRKY53核苷酸双链；其中，WRKY53基因的CDS序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具体为：ATGGATTCTGGTAAGAG CTGGGAGCAGAAGTCACTGGTCAATGAGATCATTGAAGGAATGGAGCTAG CAAAACAGTTGAGGCTATGTCTAAATGCAAAATCGTCAGCAGACACCAAG CAATTTTTAGTGCAGAGGATACTGTCGTCATATGAGAAGGCCCTTCTGATG CTGAAATGTGGCGGTTCGCCACAAAGTCCTATCAGAGCAATTGCTAGCGC GCCGGAGTCGCTAATGTCAGCCAATGAAGGTCCTTGTTGCGTTGACAATAA CAGAAGTCTCCAGGATCATCAGGACCTGACGGCGGTCTCCAAGAAAAGAA AGGAAATGGCCAAATGGACAGAACACGTCACGAGAGTAATCTCTGAGAAT GGGATTGAAGGACCCCATGAAGATGGCCACAGCTGGAGAAAATATGGGC AGAAAGACATCCTAGGAGCCAAACATCCAAGAAGCTATTACAGATGCACG TACCGGAACACGCAAAGTTGTTGGGCTACAAAGCAAGTGCAAAGATCAGA TGAAGACCCCACCGTCTTCGAAATCACATACAAAGGGAAGCATACATGTT CTCATGGCGGCAGTTCAGTTCCACCGCCACCATCACCAGAAAAGCAAGAA CGAAAACGACACAATCATAACAATACTTATCAACAACAGCAGTCTCAAGG AAACCAAATGAGCTTCCCAACTAATCTGAGAGTCAATACTGAGAACTTAG ACGACAGAGAGAACACAGCATCTCCATTCTCTTTTACTTCATCTCCATTCG GAAGTATCAGCGATGACGCCTTCCTATCTTCGATGCTTGATGATCAAAGTC TTTTTGACCATTTCAATCAATCATTGCTGTCTCCAGCCGCAGGCGGATCAA ACTATTACTTTGAGCTGCCCAGCCAGATGAGAAACATTGCAGGAAATGAG CAACGTTCGGAATCTGATATCATCTCAGCCAACAATTCGTCAACCAATTCT CCGATCCCGGACATGGATTTTYCACTGGAGCCAGTGGAACTCGACCCCTAT TTCCCATTTGACTCCCCAGGATTTTTCTTATAA；上游引物F的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，具体为：TCTAGAATGGATTCTGGTAAGAGC；下游引物R的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，具体为：GGATCCTAAG AAAAATCCTGGGGA。

表1

组分	添加量(微升)
		LAtaq酶	0.4
上游引物F	2
		下游引物R	2
dNTP	2
		10×Buffer	4
模板cDNA(WRKY53基因)	4
		H<sub>2</sub>O	25.6
Total	40

(2)将上述PCR扩增得到的WRKY53核苷酸双链用如下表2所示的10微升体系进行连接PMD-19-T(Simple)载体，在16℃下过夜连接，得到连接产物。

表2

组分	添加量(微升)
		PMD-19-T(Simple)载体	0.5
Solution1	5
		回收产物(WRKY53核苷酸双链)	4.5
Total	10

(3)连接产物转化感受态细胞：

将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，立马放到事先准备好的冰上融化，吸取20微升的DH5α感受态细胞于一个灭过菌的1.5mL的离心管中，吸取构建好的连接产物10微升，加入20微升的DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，42℃热激90s，再冰浴2min，在超净工作台中将其加入200微升的LB液体培养基中，37℃，180rpm，1h，在摇菌半个小时时打开超净工作台灭台子，在1 5分钟后，开始烧涂布器，一般烧2-3分钟，放到超净工作台上等待变至室温，在摇菌结束后，取100微升菌液涂LB板(带有抗生素)，开始涂板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到37℃恒温培养箱中培养10～12h，得到菌斑。

(4)挑斑：无菌超净台中，用无菌的枪头吸取100微升LB液体培养基(带有抗生素)，打入0.5mL的无菌离心管中，用10微升的无菌枪头挑取10个上述菌斑(形状比较规则的)，置于LB液体培养基中，吹打几次，盖上盖子，在离心管上做好标记，放入摇床中，37℃，180rpm，4-6h，得到菌液。

(5)菌液鉴定：摇菌结束后用如下表3所示的10微升体系进行PCR鉴定，以上述菌液为模板，引物为载体的上游引物，基因的下游引物按照正常的跑PCR 的流程进行鉴定，以水为阴性对照。跑一个小孔胶，检验菌液的阳性率，挑选阳性鉴定中比较明亮的菌液。

表3

组分	添加量(微升)
		目的载体上游引物F	0.5
目的基因下游引物R	0.5
		菌液	1
Mix(1x)	8
		Total	10

S2、构建植物超表达载体WRKY53-pBI121：

(1)将阳性的菌液提质粒(质粒提取方法根据试剂盒步骤进行)，得到连有WRKY53的PMD-19-T(Simple)载体。

(2)将连有WRKY53的PMD-19-T(Simple)载体和PBI121空载体按照如表4所示的40微升体系进行双酶切，37℃反应2～6h以上，一般酶切3h。

表4

组分	添加量(微升)
		10×buffer	4
根据两种限制性内切酶活性共加入	4
		质粒(WRKY53的PMD-19-T(Simple)载体或PBI121空载体)	20
水	12
		Total	40

(3)目的基因与目的载体的回收和连接：将上述切取目的基因的条带进行胶回收(按试剂盒进行)，同时将目的载体的酶切条带也切下进行胶回收(按试剂盒进行)，然后用如表5所示的10微升体系进行连接。

表5

/>

(4)用如表6所示的体系将上述连接产物转化至DH5α感受态细胞中；

表6

组分	添加量(微升)
		感受态细胞(大肠杆菌DH5α)	20
连接产物	10
		Total	30

然后，将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，立马放到事先准备好的冰上融化，吸取20微升的DH5α感受态细胞于一个灭过菌的1.5mL的离心管中，吸取构建好的连接产物10微升，加入20微升的DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，在超净工作台中将其加入200微升的 LB液体培养基中，37℃，180rpm，1h，在摇菌半个小时时打开超净工作台灭台子，在15分钟后，开始烧涂布器，一般烧2-3分钟，放到超净工作台上等待变至室温，在摇菌结束后，取100微升菌液涂LB板(带有抗生素)，开始涂板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到37℃恒温培养箱中培养10- 12h。

(5)挑斑：无菌超净台中，用无菌的枪头吸取100微升LB液体培养基(带有抗生素)，打入0.5mL的无菌离心管中，用10微升的无菌枪头挑取10个菌斑 (形状比较规则的)，置于LB液体培养基中，吹打几次，盖上盖子，在离心管上做好标记，放入摇床中，37℃，180rpm，4-6h。

(6)菌液鉴定：摇菌结束后用上表3所示的10微升体系进行PCR鉴定，以菌液为模板，引物为载体的上游引物，基因的下游引物按照正常的跑PCR的流程进行鉴定，以水为阴性对照。跑一个小孔胶，检验菌液的阳性率，挑选阳性鉴定中比较明亮的菌液。

(7)将阳性的菌液提质粒(质粒提取方法根据试剂盒步骤进行)，即可得到植物超表达载体WRKY53-pBI121。

S3、利用农杆菌介导法将植物超表达载体WRKY53-pBI121转入GALA-3植株(嘎啦苹果植株)：

(1)将植物超表达载体WRKY53-pBI121转化到农杆菌EHA105中：将EH A105感受态细胞从-80℃冰箱中取出，吸取20微升的EHA105感受态细胞于一个灭过菌的1.5mL的离心管中，吸取超表达载体WRKY53-pBI1215微升，加入 50微升的EHA105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，37℃热激90s，再冰浴2min，在超净工作台中将其加入200微升的LB液体培养基中，37℃，180rp m，4h，在摇菌结束后，取100微升菌液涂LB板(带有抗生素)，开始涂板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到28℃恒温培养箱中培养10- 12h。

(2)农杆菌介导法将表达载体转入GALA-3植株：将获得的农杆菌EHA10 5用YEP培养基培养皿中在摇床中以180rpm，28℃振荡培养50mL，培养4-6小时，直至OD值为0.4-0.6，用离心机以25℃，5000rpm离心5min收集菌体，用葡萄糖液体培养基(MS粉+蔗糖+葡萄糖)将菌液悬浮起来，加入20mg乙酰丁香酮备用。然后，将GALA-3植株从继代培养约30天的试管苗上剪取叶片用于遗传转化，选择试管苗顶部3-4片叶展开的幼嫩叶片，剪去叶尖和叶柄部分，将中间部位剪成3mm宽的叶块，立即置于有农杆菌的液体共培养基中，轻轻晃动，每隔大约2min晃动几次，侵染时间大概8min左右，然后将叶块转移到无菌滤纸上吸干菌液，将表面没有菌液的叶块迅速转移到分装有共培养基的培养皿中。待叶片长出转基因小芽，将小芽用扩繁培养基扩增起来。待小芽长成小苗后，放入生根培养基中生根，得到转基因植株。

实施例2

将上述实施例1得到的两个月大生根的转基因植株和对照未经处理的GALA -3植株在营养液(含0.5M CaCl₂，pH＝4.5)中培养14d后，转移到铝胁迫(5 0μM AlCl3)处理的营养液中进行表型观察，并进行生理数据测定，具体包括以下步骤：

(1)选取24棵两个月大生根的长势一致的转基因植株GALA-3幼苗，分为 3组，每组8棵，对照组为8棵非转基因GALA-3植株。

(2)将灭菌后的蛭石装入的方形育苗盆(长宽为8×8cm，深为10cm)中，四组盛有植株的花盆分别放入30×20cm的托盘中，将上述GALA植株幼苗分别移到花盆中，将托盘中浇入浇营养液(含0.5M CaCl₂，pH＝4.5)，培养7天缓苗。

(3)7天后将营养液换为铝胁迫(50μM AlCl₃，pH＝4.5)处理的营养液，每7天根灌一次，保持植株为持续的铝胁迫，培养21天。

(4)测量处理前和处理21天后每组植株总根长、叶绿素含量、叶片光合速率、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的活性并统计分析，该试验重复三次以上。

结果分析：

在铝胁迫处理21天后，超表达WRKY53转基因GALA-3植株表现出明显的抗铝胁迫能力增强，大大减轻了铝胁迫症状，而对照组的GALA-3植株长势弱，表现出明显的铝胁迫症状。这意味着WRKY53转基因GALA-3植株能明显抵抗铝胁迫带来的影响。

铝胁迫最明显的表现是对植物根尖伸长的抑制，一旦Al³⁺浓度超过适应范围，植物的根系生长就会受到明显的抑制。通过对总根长的测定发现，铝胁迫处理21天后，对照组GALA-3植株的根长为600cm，而超表达WRKY53转基因G ALA-3植株的总根长为660cm，比对照组总根长增加了约10％，说明WRKY53 转基因GALA-3植株有效增加了根的伸长，并且受到的铝胁迫带来根系受损伤的程度明显低于对照组的植株，说明WRKY53转基因GALA-3植株有效的增强了铝胁迫抗性。

叶绿素含量和光合速率是一个重要的指标，在铝胁迫条件下，植物叶片叶绿素含量下降，光合能力显著下降。本实验中铝胁迫处理21天后，对照组GALA- 3叶片内叶绿素含量显著下降，从约37.58mg/g·FW下降到约28.34mg/g·FW，而超表达WRKY53转基因GALA-3植株经铝胁迫处理后，叶片叶绿素含量由38. 30mg/g·FW变为33.25mg/g·FW，叶片内叶绿素含量下降显著受到抑制，维持在正常的范围内。铝胁迫处理21天后，对照组的GALA-3植株光合速率显著下降，从约9.3μmol·m^-2·s^-1下降到约6.4μmol·m^-2·s^-1，而超表达WRKY53转基因GALA- 3植株经铝胁迫处理后，光合速率的降低得到显著缓解，几乎能维持正常的光合作用。可见，转基因WRKY53植株可以有效清除ROS，减缓叶绿素降解，维持铝胁迫下光合作用的正常进行。

铝胁迫下的WRKY53转基因GALA-3植株，经处理21天后发现，平邑甜茶幼苗内抗氧化酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶的活性基本不受影响。即在铝胁迫下，WRKY53转基因GALA-3幼苗植株受氧化损伤的程度明显低于对照组GALA-3植株，上述试验说明WRKY53转基因GALA-3植株能有效清除由铝胁迫引起的活性氧。

综上所述，WRKY53转基因GALA-3植株极大地提高了抵抗铝胁迫的能力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggattctg gtaagagctg ggagcagaag tcactggtca atgagatcat tgaaggaatg 60

gagctagcaa aacagttgag gctatgtcta aatgcaaaat cgtcagcaga caccaagcaa 120

tttttagtgc agaggatact gtcgtcatat gagaaggccc ttctgatgct gaaatgtggc 180

ggttcgccac aaagtcctat cagagcaatt gctagcgcgc cggagtcgct aatgtcagcc 240

aatgaaggtc cttgttgcgt tgacaataac agaagtctcc aggatcatca ggacctgacg 300

gcggtctcca agaaaagaaa ggaaatggcc aaatggacag aacacgtcac gagagtaatc 360

tctgagaatg ggattgaagg accccatgaa gatggccaca gctggagaaa atatgggcag 420

aaagacatcc taggagccaa acatccaaga agctattaca gatgcacgta ccggaacacg 480

caaagttgtt gggctacaaa gcaagtgcaa agatcagatg aagaccccac cgtcttcgaa 540

atcacataca aagggaagca tacatgttct catggcggca gttcagttcc accgccacca 600

tcaccagaaa agcaagaacg aaaacgacac aatcataaca atacttatca acaacagcag 660

tctcaaggaa accaaatgag cttcccaact aatctgagag tcaatactga gaacttagac 720

gacagagaga acacagcatc tccattctct tttacttcat ctccattcgg aagtatcagc 780

gatgacgcct tcctatcttc gatgcttgat gatcaaagtc tttttgacca tttcaatcaa 840

tcattgctgt ctccagccgc aggcggatca aactattact ttgagctgcc cagccagatg 900

agaaacattg caggaaatga gcaacgttcg gaatctgata tcatctcagc caacaattcg 960

tcaaccaatt ctccgatccc ggacatggat tttycactgg agccagtgga actcgacccc 1020

tatttcccat ttgactcccc aggatttttc ttataa 1056

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctagaatgg attctggtaa gagc 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatcctaag aaaaatcctg ggga 24

Claims (5)

1.WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用，其特征在于，所述WRKY53基因的CDS序列如序列表SEQ ID NO:1所示，序列中的Y为C或T；所述植物为苹果。

2.根据权利要求1所述的WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用，其特征在于，所述植物为嘎啦苹果。

3.根据权利要求1~2任一项所述的WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用，其特征在于，增强植物耐铝性的方法包括以下步骤：

利用WRKY53基因的上游引物和下游引物对WRKY53基因进行单克隆扩增，得到扩增产物；

利用扩增产物构建植物超表达载体；

将植物超表达载体转入至待增强植物的植株中。

4.根据权利要求3所述的WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用，其特征在于，所述WRKY53基因的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:2~3所示。

5.根据权利要求4所述的WRKY53基因在增强植物耐铝性中的应用，其特征在于，将植物超表达载体转入至待增强植物的植株中的方法为农杆菌介导法。