CN117223534A - 一种用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，包括以下方法中的一种或几种组合：根据生长阶段对温度进行调控；施加土壤改良剂修复土壤生态环境；选择嫁接苗、栽种；施肥管理；对互为授粉树品种的S基因处理；授粉。本发明针对高寒旱地区气候条件恶劣、土壤生态环境退化、种植的甜樱桃产量低、优良品质退化等问题，选用优良抗逆砧木嫁接优质品种，同时采用节能型日光温室栽培、授粉品种筛选、S基因处理、田间水肥管理等方法提高寒旱地区甜樱桃坐果率，可以获得品质优良、产量高的甜樱桃。
Description
技术领域
本发明属于栽培技术领域，尤其涉及一种用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法。
背景技术
大樱桃又名欧洲甜樱桃、车厘子，本发明中简称为甜樱桃，是既不抗寒也不耐热的温带落叶果树，其果个大、果实艳丽、口感好、具有极高的经济价值，在高寒旱地区，由于低温、气候干旱等特点，导致樱桃的花期授粉限制，另外，甜樱桃有配子体自交不亲和现象，其坐果率极大降低，易浸染和积累多种病毒，即使少部分品种具有自花结实的能力，花期易受倒春寒、晚霜、低温、降雨、干热风等气候的影响，造成花器冻害、发育不良或影响昆虫授粉，在幼树阶段(童期)甜樱桃越冬抗寒性较差，树木成活率较低。加之种植者在高额的利益诱惑下，盲目引种以及缺乏科学管理，授粉树搭配不当甚至没有搭配授粉树，导致授粉受精不良或不坐果。高旱地区雨水蒸发量高于降雨量，导致土壤严重盐渍化，影响樱桃树体营养吸收与碳水化合物积累。
发明内容
本发明针对高寒旱地区气候条件恶劣、土壤生态环境退化、种植的甜樱桃产量低、优良品质退化等问题，提供了一种用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，包括以下方法中的一种或几种组合：
(1)根据生长阶段对温度进行调控；
(2)施加土壤改良剂修复土壤生态环境；
(3)选择嫁接苗、栽种；
(4)施肥管理；
(5)对互为授粉树品种的S基因处理；
(6)授粉。
采取上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法可以提高寒旱地区甜樱桃坐果率，获得品质优良、产量高的甜樱桃。
进一步，利用温室对甜樱桃全年温度进行调控，调控方法包括：除休眠期外，年均温度超过10℃；萌芽至开花期，白天温度18-20℃，夜间5-7℃，地温10℃；花期，白天温度16-18℃，夜间8-10℃，地温15-17℃；果实膨大期，白天温度为23-25℃，夜间15℃，地温20℃；果实成熟期，白天温度为25-26℃，夜间17℃，地温20℃；采收后，白天温度为20-25℃，夜间18-20℃，地温20℃；休眠期，温度控制0-7.2℃，累计1500小时，使其完成休眠。
采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述温度方案调控，可以保障寒旱地区甜樱桃完成强制休眠、解除休眠、花芽萌动、开花需要的最佳温度范围和该温度下的时长控制，可以促进寒旱地区甜樱桃花粉萌发、花粉管的发育，保障果实品质和花芽分化质量。
进一步，在栽培甜樱桃前，土壤要深松，打破梨底层，平整完土地后施入土壤改良剂，改良土层厚度为40cm-50cm；所述的土壤改良剂包括土壤调理剂、微生物菌剂与生物刺激素。
采取上述技术方案的有益效果包括：土壤有机质含量快速提升，盐渍化土壤得以改善，土壤变得更加蓬松，土壤团粒结构得以形成，土壤保肥效果好。
进一步，苗木所用的砧木采用的由组培扩繁得到的吉塞拉12(Gisela12)无毒樱桃苗，通过培育得到的两年生大苗；选择晚熟品种“科迪亚”与“雷洁娜”作为互为授粉树的甜樱桃品种，嫁接Gisela12砧木后经过两个生长季发育的苗木移栽至温室中，并进行一年缓苗养树；将苗木移栽入设施温室中，每个温室栽植两个品种，行距4m，株距1.5m，亩栽甜樱桃树111株；栽培比例1:1，两品种进行隔行栽植。
采取上述技术方案的有益效果包括：选用优良抗逆砧木嫁接优质品种，有利于提高甜樱桃坐果率。本发明通过资料调研结合实地筛选方法筛选出了“科迪亚”与“雷洁娜”作为授粉品种，可以提高甜樱桃坐果率。
进一步，施肥管理包括基肥管理和追肥管理。
进一步，基肥管理包括以下步骤：基肥施用生物质腐殖酸有机肥2-5吨/亩和配合施用平衡复合肥(N:P:K＝15:15:15)10-20公斤/亩。
进一步，追肥管理包括以下步骤：以滴灌形式施用氨基酸水溶肥与硼肥的混合溶液，硼肥的添加量为11g/L；在开花期前7-10天进行滴灌，每7-10d滴灌一次，每次滴灌肥水量为5L/亩，共滴灌4-6次。
采取上述技术方案的有益效果包括：氨基酸水溶肥为酸性肥料，可随水滴灌，能够降低根际土壤pH值，降低盐碱。促使幼苗快速发根，增强作物抗逆性，促进植物生长，增加种实蛋白质含量；有效替代氮肥，且磷钾丰富，营养平衡，能够为甜樱桃树体有效利用，使树体营养分配均衡，提高了甜樱桃的成花质量，有利于提高坐果率和果品质量。氨基酸水溶肥配施的硼肥作为微量元素肥，是作物开花和生长点生长所必需的元素，配施适宜量的硼肥，有利于甜樱桃花粉管伸长，提高花朵授粉率，硼肥有利于提高甜樱桃植株和花的抗逆性，避免因外界因素造成出花不齐、弱花畸形花的现象，进而提高了甜樱桃的成花质量和坐果率。氨基酸水溶肥和硼肥配合使用，可以促使幼苗快速发根，增强作物抗逆性，促进植物生长，增加种实蛋白质含量，提高坐果率、作物产量及改善果实品质等作用。
进一步，对互为授粉树品种的S基因处理包括以下步骤：在盛花期花瓣展开度达30％时进行S基因处理；
S基因处理方法包括(a)至(c)中的一种或几种：
(a)针对含有相同S基因的不同S基因型的互为授粉树品种，将其相同S基因沉默；
(b)针对含有相同S基因的不同S基因型的互为授粉树品种，将其相同S基因沉默并且不同S基因过表达的双重处理；
(c)针对含有相同S基因的不同S基因型的互为授粉树品种，将其不同S基因过表达。
进一步，对“科迪亚”和“雷洁娜”中S型基因的处理，含有的相同S基因为S3；将S3基因沉默包括以下步骤：
(a)构建pTRV2-S3载体：以花柱头cDNA为模板，以TTTTGGGAAAGTGAATGG序列为正向引物，以CGTTAGGATGTGCTGGAT序列为反向引物，采用PCR扩增，得到S3基因，将S3基因与T载体连接获得重组T载体，以重组T载体为模板设计带有pTRV2载体序列的引物序列，引物序列以AATTCTCTAGAAGGCCTCCATGGG序列为正向引物，以GCGTGAGCTCGGTACCG序列为反向引物，扩增后的片段与BamH I酶切过pTRV2载体连接，获得pTRV2-S3载体，连接体系为S3基因片段1.5uL、pTRV2载体1uL和One Step Seamless Cloning Kit 2.5uL的混合物，连接步骤在50℃条件下反应40min，进一步转化大肠杆菌；
(b)制备农杆菌侵染液：将转化大杆菌的pTRV2-S3载体提取质粒，取农杆菌感受态细胞100μL，加入1μg pTRV2-S3质粒DNA或pTRV1质粒DNA，混匀后冰上放置30min，加入液氮速冻1min，立即转入37℃水浴5min，取出样品后冰浴2min，加入不含抗生素的液体培养基，于28℃培养；离心，重悬细胞，涂布于含有抗生素的固体培养基上，28℃培养；待长出单菌落后，挑取单克隆于含有抗生素的液体培养基中培养，鉴定阳性克隆，保存；将阳性克隆的菌液活化、用侵染缓冲液重悬，并用侵染缓冲液调节OD600值为0.8-1.0，分别得到含pTRV2-S3的农杆菌重悬液和含pTRV1载体的农杆菌重悬液，上述侵染缓冲液为包含10mM氯化镁(MgCl2)、10mM pH为5.6-5.8的吗啉乙磺酸(MES)、150μM乙酰丁香酮(AS)的蒸馏水溶液；上述液体培养基和固体培养基均为LB培养基；
(c)将含pTRV2-S3的农杆菌重悬液与含pTRV1的农杆菌重悬液按1:1体积混合，作为侵染液，将侵染液涂抹花柱头或喷施花柱头，每个柱头使用50ul侵染液。
进一步，，对“科迪亚”和“雷洁娜”中S型基因的处理，含有的不同基因为S1和S6；对S1基因和/或S6基因过表达包括以下步骤：
(a)构建pRI101-S1和/或pRI101-S6：以花柱头cDNA为模板，以GTAATTGCAACGGGTCAAAATATGAG序列为正向引物，以ACAACTCAGTATTAGTTGCTGGATCA序列为反向引物,采用PCR扩增，得到S1基因，将S1基因与T载体连接获得重组T载体，以重组T载体为模板设计带有pRI101载体序列的引物序列，引物序列以CCCCGGGGGTACCG序列为正向引物，以CTCGCCCTTGCTCACCATG序列为反向引物，扩增后的片段与BamHI酶切过pRI101载体连接，获得pRI101-S1载体；和/或，以CTATGGCCAAGTAATTATTCAAACC序列为正向引物，以TTGTATCATTGCCACTTTCCACG序列为反向引物，采用PCR扩增，得到S6基因，将S6基因与T载体连接获得重组T载体，以重组T载体为模板设计带有pRI101载体序列的引物序列，引物序列以CCCCGGGGGTACCG序列为正向引物，以CTCGCCCTTGCTCACCATG序列为反向引物，扩增后的片段与BamHI酶切过pRI101载体连接，获得pRI101-S6载体，连接体系为S1或S6基因片段1.5uL，pRI101载体1uL，One Step Seamless Cloning Kit 2.5uL，连接步骤在50℃条件下反应40min，进一步转化大肠杆菌；
(b)制备重组质粒的农杆菌侵染液：将转化大杆菌的pRI 101-S1和/或pRI 101-S6载体提取质粒，取农杆菌感受态细胞100μL，加入1μg pRI 101-S1质粒DNA和/或pRI 101-S6质粒DNA，混匀后冰上放置30min，放入液氮速冻1min，立即转入37℃水浴5min，取出样品后冰浴2min，加入不含抗生素的液体培养基，于28℃培养；离心，重悬细胞，涂布于含有抗生素的固体培养基上，28℃培养；待长出单菌落后，挑取单克隆于含有抗生素的液体培养基中培养，鉴定阳性克隆，保存；将阳性克隆的菌液活化、用侵染缓冲液重悬，并用侵染缓冲液调节OD600值为0.8-1.0，得到重悬液；上述侵染缓冲液为包含10mM氯化镁(MgC l2)、10mM pH为5.6-5.8的吗啉乙磺酸(MES)、150μM乙酰丁香酮(AS)的蒸馏水溶液；上述液体培养基和固体培养基均为LB培养基；
(c)将步骤(b)获得的重悬液作为侵染液涂抹花柱头或用喷施花柱头，每个柱头使用50u l侵染液。
采取上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法可以提高坐果率。
进一步，授粉包括以下步骤：在樱桃初花期有5％的花朵开放时放蜂，落花末期95％花开时停止放蜂；授粉采用中蜂、意蜂、壁蜂和熊蜂中的一种或多种蜂进行授粉；对温度进行控制，授粉蜂的活动下限温度为10-13℃，上限温度30-42℃。
采取上述技术方案的有益效果包括：节约大量的授粉人工，提高甜樱桃坐果率和产量、减少人工管理成本。选用的中蜂、意蜂、壁蜂中的一种或几种组合，活动温度范围较宽，保证整个花期均能进行蜜蜂授粉活动，甜樱桃在花期充分授粉，授粉效率高。
进一步，还包括甜樱桃果树的常规管理。
附图说明
图1为实时荧光PCR分析沉默S3基因后甜樱桃基因表达的结果。
图2为实时荧光PCR分析过表达S1和S6基因后甜樱桃基因表达的结果。
图3为沉默S3基因与过表达S1基因处理的“科迪亚”和“雷洁娜”株系花柱头的S基因表达情况。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下面通过具体实施例进行介绍：
实施例1
(1)在高寒旱地区，建设温室对甜樱桃全年温度进行调控。年均温度超过10℃，萌芽至开花期白天温度18-20℃，夜间5-7℃，地温10℃；花期白天温度16-18℃，夜间8-10℃，地温15-17℃；果实膨大期白天温度为23-25℃，夜间15℃，地温20℃；果实成熟期白天温度为25-26℃，夜间17℃，地温20℃；采收后7月-10月底白天温度为20-25℃，夜间18-20℃，地温20℃。休眠期11月至下一年1月中旬，温度控制0-7.2℃，累计1500小时，使其完成休眠。
(2)在栽培甜樱桃前，土壤要深松，打破梨底层，平整完土地后施入土壤改良剂修复土壤生态环境，改良土层厚度为40cm-50cm；所述的土壤改良剂包括土壤调理剂、微生物菌剂与生物刺激素，土壤改良剂组成成分及使用方法采用发明专利CN 111635763B(授权公告号)。
(3)获得嫁接苗：苗木所用的砧木采用的由组培扩繁得到的Gisela12无毒樱桃苗，通过培育得到的两年生大苗；选择晚熟品种“科迪亚”与“雷洁娜”作为互为授粉树的甜樱桃品种，嫁接Gisela12砧木后经过两个生长季发育的苗木移栽至温室中，并进行一年缓苗养树。
(4)栽种：将苗木移栽入设施温室中，每个温室栽植两个品种，行距4m，株距1.5m，亩栽甜樱桃树111株；栽培比例1:1，两品种进行隔行栽植。
(5)温室内的基肥管理：基肥施用生物质腐殖酸有机肥2-5吨/亩和配合施用平衡复合肥(N:P:K＝15:15:15)10-20公斤/亩。
(6)对甜樱桃追肥，以滴灌形式施用氨基酸水溶肥与硼肥(B)混合溶液：
氨基酸水溶肥原液的制备：
a.将屠宰场下脚料，如猪内脏、肉屑、肉皮、肉渣、鸡架、鸡胸等，倒入粉碎机中粉碎，粉碎粒径为10-20mm的小碎块；
b.粉碎后的小碎块物料通过输送机将物料输送至高温灭菌罐中进行高温灭菌消毒处理，灭菌条件为：140-180℃，保持压力(0.3-0.5Mpa)30分钟；
c.灭菌后的物料经过泄压后温度降至100℃左右，除油、除渣，通过输送泵将物料通过管道输送至发酵罐。发酵罐内的物料通过夹套冷却水循环的方式，将物料降温并保持在30-55℃，将光合菌和乳酸菌按1:1比例加入物料进行发酵，16-17小时左右，所述光合菌浓度6*106个/L，乳酸菌浓度4.5*106个/L，菌液占废水总体积的0.02％。通过发酵将物料分解成氨基酸小肽，以确保物料达到最佳的后续生产状态；发酵后的物料输送至固液分离机进行固液分离处理。
上述氨基酸水溶肥原液主要成份及含量包括：肽含量157.9g/L、腐殖酸54.8g/L、游离L-酪氨酸0.42g/L、游离丙氨酸3.64g/L、游离天冬氨酸0.62g/L、游离丙氨酸3.64g/L、游离丝氨酸0.94g/L、游离亮氨酸2.60g/L、游离异亮氨酸0.73g/L、游离甘氨酸1.25g/L、游离精氨酸0.21g/L、游离组氨酸0.62g/L、游离缬氨酸1.14g/L、游离胱氨酸0.10g/L、游离脯氨酸0.31g/L、游离苏氨酸0.62g/L、游离苯丙氨酸1.04g/L、游离蛋氨酸0.83g/L、游离谷氨酸0.21g/L、游离赖氨酸1.46g/L等；氮以总氮计38.4g/L，磷以P2O5计120.4g/L，钾以K2O计115.1g/L；有机质193g/L，镁0.3g/L，钙1.5g/L。
硼肥主要成分为四水八硼酸钠(Na2B8O13·4H2O)粉剂。
使用时，将氨基酸水溶肥原液用水稀释300-500倍，形成氨基酸水溶肥溶液。制备氨基酸水溶肥和硼肥的混合液，混合液中硼肥的添加量为11g/L，以混合液作为滴灌溶液，在开花期前7-10天进行滴灌，每7-10d滴灌一次，每次滴灌肥水量为5L/亩，共滴灌4-6次。
(7)对互为授粉树品种中的S基因处理：首先，制备侵染溶液；其次，在盛花期花瓣展开度达30％左右时，使用侵染液涂抹花柱头或用喷雾器喷施花柱头，每个柱头涂抹50uL侵染液，涂抹方法采用毛笔或棉棒蘸取侵染液轻轻涂抹。
侵染溶液制备方法包括以下步骤：
①构建重组载体pTRV2-S3、pRI101-S1和pRI101-S6；pTRV2-S3为携带有S3基因的pTRV2载体，pRI101-S1为携带有S1基因的pRI101，pRI101-S6为携带有S6基因的pRI101载体；
②重组载体农杆菌侵染液制备：分别将重组载体质粒转化农杆菌感受态，鉴定阳性克隆后，将含有目的基因的农杆菌菌液进行-20℃保存备用。
③将含有目的基因农杆菌菌液活化，分别获得含pTRV2-S3的农杆菌、含pTRV1载体的农杆菌、含pRI 101-S1的农杆菌、含pRI 101-S6的农杆菌的菌液；将菌液离心，并利用侵染缓冲液悬浮，OD600为0.8-1.0，作为悬浮液；
配制侵染液：
沉默S3基因的侵染液：将含pTRV2-S3的农杆菌重悬液与含pTRV1载体的农杆菌重悬液按照体积比1:1的比例混合，得到沉默S3基因侵染液。
过表达S1的侵染液：含pRI 101-S1的农杆菌重悬液。
过表达S6的侵染液：含pRI 101-S6的农杆菌重悬液。
过表达S1和S6的侵染液：含pRI 101-S1的农杆菌重悬液和含pRI 101-S6的农杆菌重悬液的混合液。
沉默S3基因同时过表达S1基因的侵染液：将沉默S3基因侵染液与过表达S1基因侵染液按体积比1:1混合均匀。
(8)授粉：在樱桃初花期有5％的花朵开放时，将蜂箱搬入果园开始放蜂，至落花末期95％花开时停止放蜂，授粉采用中蜂、意蜂、壁蜂和熊蜂中的一种或多种蜂进行授粉；对温度进行控制，授粉蜂的活动下限温度为10-13℃，上限温度30-42℃。
(9)对果树后续常规管理。
若未经特殊说明，本发明中的实验材料均可以通过常规方法制备或市购获得。若未经特殊说明，本发明中采用的实验方法均为本领域的常规实验方法。
实施例2甜樱桃设施栽植方案的细化，其余步骤同实施例1
(1)栽植品种布局
苗木所用的砧木采用的由组培扩繁得到的Gisela12无毒樱桃苗，通过培育得到的两年生大苗，是在生产季风速较大、干旱少雨、土壤偏碱性的特点地区的优选国际优良砧木品种。通过资料调研结合实地筛选方法筛选出品质优异的互为授粉树的甜樱桃品种，晚熟品种选择“科迪亚”与“雷洁娜”，花粉量为1627.2-1953.9粒/花药，花粉萌发率为18.5-21.7％，坐果率为21.9-23.2％。将筛选的互为授粉树的晚熟品种“科迪亚”与“雷洁娜”分别栽植在不同的设施温室中，每个温室中栽植两个品种，行距4m，株距1.5m，亩栽甜樱桃树111株，栽培比例1:1，两品种进行隔行栽植。
(2)设施温室特性
温室的规格：宽25米，脊高6米，边高1.5-2.5米，长度可达300米。
对温室内的温度进行调控，调控方法为：年均温度超过10-12℃，萌芽至开花期白天温度18-20℃，夜间5-7℃，地温10℃；花期白天温度16-18℃，夜间8-10℃，地温15-17℃；果实膨大期白天温度为23-25℃，夜间15℃，地温20℃；果实成熟期白天温度为25-26℃，夜间17℃，地温20℃；采收后7月-10月底白天温度为20-25℃，夜间18-20℃，地温20℃。休眠期11月至下一年1月中旬，温度控制0-7.2℃，累计1500小时，使其完成休眠。
对光照进行调控，调控方法为：由于甜樱桃是喜光性较强的树种，所以全年日照时间要求在2600-2800小时，太阳总辐射量为470.96KJ/cm2。
对水进行调控，调控方法为：由于甜樱桃对水分条件非常敏感，所以适宜在年降水量为600-700mm范围种植。
对肥进行调控，调控方法为：每年施肥量需要有一定要求，氮肥为4.11-5.24kg/亩，随着树龄增长，可适当增施氮肥；磷肥为2.24-4.49kg/亩；钾肥为1.87-3.37kg/亩。
对气进行调控，调控方法为：通有一定量的二氧化碳气肥有助于甜樱桃进行光合作用，积累碳水化合物，果实鲜艳品质好；此外各生长发育阶段空气相对湿度需要满足一定要求，如萌芽至开花期空气相对湿度为80％，花期空气相对湿度为40-50％，果实膨大期空气相对湿度为60％，果实成熟期空气相对湿度为50％，采收后空气相对湿度为60％。
(3)高寒旱地区设施栽培土壤修复
在栽培甜樱桃前，将土地进行平整、旋耕、整平、深松与耙平，打破梨底层并清除上茬作物残体、秸秆等地面附着物及其他废弃物。平整完土地后施入土壤改良剂修复土壤生态环境，改良土层厚度为40cm-50cm。
所述的土壤改良剂(也可以称作土壤改良配方，补充使用量)包括土壤调理剂、微生物菌剂与生物刺激素，土壤改良剂购自北京四良科技有限公司。其组成成分及使用方法参照发明专利CN 111635763B(授权公告号)。在已公开的发明专利中，土壤改良剂原本能够增加苹果的次生代谢水平提高果品的外观成色和风味。但进一步研究，本发明意外发现，将土壤改良剂可以用于甜樱桃的土壤改良中提高甜樱桃的坐果率。在其他条件相同的情况下，采用土壤改良剂可以将甜樱桃的坐果率提高12.5％。
实施例3制备氨基酸水溶肥原液的步骤细化，其余步骤同实施例1
氨基酸水溶肥为动物源氨基酸水溶肥，主要成分为小分子多肽产品，在低温条件下可以克服常规氮元素转化成蛋白质进程慢的问题，可以快速进行蛋白质的转化，增强作物的苗期抗性，促进生根和保存花果具有积极作用。
氨基酸水溶肥原液的制备方法包括以下步骤：
(1)将屠宰场下脚料，如猪内脏、肉屑、肉皮、肉渣、鸡架、鸡胸等，倒入粉碎机中粉碎，粉碎粒径为10-20mm的小碎块；
(2)粉碎后的小碎块物料通过输送机将物料输送至高温灭菌罐中进行高温灭菌消毒处理，灭菌条件为：140-180℃，保持压力(0.3-0.5Mpa)30分钟；
(3)灭菌后的物料经过泄压后温度降至100℃左右，除油、除渣，通过输送泵将物料通过管道输送至发酵罐。发酵罐内的物料通过夹套冷却水循环的方式，将物料降温并保持在30-55℃，将光合菌和乳酸菌按1:1比例加入物料进行发酵，16-17小时左右，所述光合菌浓度6*106个/L，乳酸菌浓度4.5*106个/L，菌液占废水总体积的0.02％。通过发酵将物料分解成氨基酸小肽，以确保物料达到最佳的后续生产状态；发酵后的物料输送至固液分离机进行固液分离处理。
(4)将固液分离出的混合液体中加入微量元素，微量元素包括铁、锰、锌、铜、硼、钼等元素，各元素质量总和占水溶肥的配比为100g/L，这些微量元素含量占比符合标准《含氨基酸水溶肥料》(NY1429-2010)，螯合制成氨基酸微量元素水溶肥，然后通过自动计量包装系统打包成成品袋装水溶肥。
采用上述方法制备的氨基酸水溶肥原液主要成份及含量包括：肽含量157.9g/L、腐殖酸54.8g/L、游离L-酪氨酸0.42g/L、游离丙氨酸3.64g/L、游离天冬氨酸0.62g/L、游离丙氨酸3.64g/L、游离丝氨酸0.94g/L、游离亮氨酸2.60g/L、游离异亮氨酸0.73g/L、游离甘氨酸1.25g/L、游离精氨酸0.21g/L、游离组氨酸0.62g/L、游离缬氨酸1.14g/L、游离胱氨酸0.10g/L、游离脯氨酸0.31g/L、游离苏氨酸0.62g/L、游离苯丙氨酸1.04g/L、游离蛋氨酸0.83g/L、游离谷氨酸0.21g/L、游离赖氨酸1.46g/L等18种游离氨基酸；氮以总氮计38.4g/L，磷以P2O5计120.4g/L，钾以K2O计115.1g/L；有机质193g/L，镁0.3g/L，钙1.5g/L。
氨基酸水溶肥可高效替代氮肥，且磷钾丰富，营养平衡；水不溶物0.35％(滤径50-70μm)，不堵毛管，适宜田间肥水一体化管理与营养补充，pH为4.48的酸性肥料，可随水滴灌，能够降低根际土壤pH值，降低盐碱。氨基酸水溶肥促使幼苗快速发根，增强作物抗逆性，促进植物生长，增加种实蛋白质含量，提高坐果率、作物产量及改善果实品质等作用。
实施例4田间授粉与肥水管理的细化，其余步骤同实施例1
基肥管理：基肥施用生物质腐殖酸有机肥2-5吨/亩和平衡复合肥(N:P:K＝15:15:15)10-20公斤/亩。生物质腐殖酸有机肥购自甘肃苏地肥业有限公司，平衡复合肥购自湖北新洋丰肥业股份有限公司。
在甜樱桃追肥期，以滴灌形式施用氨基酸水溶肥与硼肥(B)混合溶液。硼肥主要成分为四水八硼酸钠(Na2B8O13·4H2O)粉剂。使用时，将氨基酸水溶肥原液用水稀释300-500倍，形成氨基酸水溶肥溶液。制备氨基酸水溶肥和硼肥的混合液，混合液中硼肥的添加量为11g/L，以混合液作为滴灌溶液，在开花期前7-10天进行滴灌，每7-10d滴灌一次，每次滴灌肥水量为5L/亩，共滴灌4-6次。
授粉采用中蜂、意蜂、壁蜂和熊蜂中的一种蜂进行授粉，在樱桃初花期(有5％的花朵开放)将蜂箱搬入果园，落花末期(95％花开后)时停止放蜂。对温度进行控制，授粉蜂的活动下限温度为10-13℃，上限温度30-42℃。
为了验证使用动物源氨基酸水溶肥对成花的影响，设置处理组和对照组；各处理组均施有氨基酸水溶肥和硼肥的混合液，但各处理组中硼肥的量不同。处理1中每次硼肥45g/亩；处理2中每次硼肥50g/亩；处理3中每次硼肥55g/亩；处理4中每次硼肥60g/亩。对照组施氨基酸水溶肥不加硼肥。除了施肥种类外，其他条件均保持一致，条件参照实施例1，光照20000-30000Lx、在不同树龄和物候期补施的氮磷钾和施肥量以及管理等都相同。
将筛选出的互为授粉树的甜樱桃种植。在盛花期，分别调查各不同品种果枝上花芽中的花密度；于盛花期调查各接穗/砧木不同部位、不同类型果枝上花的花器发育情况，统计完全花、畸形花和退化花的花朵比率，分析施肥种类对花器官发育影响。使用含动物源氨基酸水溶肥的肥料对甜樱桃的成花影响的分析结果如表1和表2所示。结果显示施用含氨基酸水溶肥的肥料后影响了“科迪亚”、“雷洁娜”甜樱桃的花密度和花器质量，从表1和表2中可以看出，各处理组花密度明显比对照组花密度大、成花量多。
从表1表2可以看出，处理组1至处理组4的完全花比率显著高于对照组，处理组1至处理组4的畸形花比率和退化花比率比未施用硼肥的对照组显著低。可见，采用硼肥与氨基酸水溶肥配合使用对“科迪亚”、“雷洁娜”的花芽质量都有显著效果。尤其是，氨基酸水溶肥配施硼肥55g/亩随水滴灌根际土壤中，使根际环境中营养成分能够为甜樱桃树体有效利用，树体营养分配均衡，提高了甜樱桃的成花质量，有利于提高坐果率和果品质量。解决了处于恶劣环境的高寒旱地区甜樱桃成功授粉障碍导致坐果率低的问题。
表1含氨基酸水溶肥的肥料施用后甜樱桃的成花情况(一)
表2含氨基酸水溶肥的肥料施用后甜樱桃的成花情况(二)
实验一S型基因处理对甜樱桃授粉坐果影响
自交不亲和机制主要是由位于S位点的花柱S基因和花粉S基因相互作用，并最终导致花柱S基因产物(S-RNase)降解自身花粉管RNA，使自体花粉管停止伸长而不能完成受精，因此，不同S型基因是授粉成功或提高授粉效率的重要因素之一，本发明将互为授粉树甜樱桃品种中相同S基因沉默和/或不同S基因过表达，来提高甜樱桃的授粉效率和坐果率，以期提高甜樱桃优异品种产量。各授粉树品种S基因型见下表3，互为授粉树的“科迪亚”和“雷洁娜”相同的基因为S3(GenBank:EU253960.1),不同的基因为S1(GenBank:HQ913630.1)和S6(GenBank:FJ543099.1)。因此，我们选择沉默S3，过表达S1和S6。S1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，S3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，S6基因的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
表3互为授粉树的各品种S基因型情况
甜樱桃的栽植方案、肥水管理参照实施例1至实施例3。
对“科迪亚”和“雷洁娜”中S型基因的处理
1、准备实验材料
(1)pTRV1空载、pTRV2空载、pRI101空载均购自HonorGene；含pTRV1空载的大肠杆菌由pTRV1质粒转化大肠杆菌获得；含pTRV2空载的大肠杆菌由pTRV2质粒转化大肠杆菌获得；含pRI101空载的大肠杆菌由pRI101质粒直接转化大肠杆菌获得。
(2)构建pTRV2-S3，包括以下步骤：
a、获得S3基因的PCR扩增产物
设计目的基因(S3基因)的扩增引物，扩增S3基因的正向引物序列F(5'-3')为TTTTGGGAAAGTGAATGG(SEQ ID NO:4)，扩增S3基因的反向引物R(5'-3')为CGTTAGGATGTGCTGGAT(SEQ ID NO:5),由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增体系：5×KAPA H i Fi Buffer 10μL，10mM KAPA dNTP Mix 1.5μL，用于扩增S3基因上、下游引物各1.5μL，花柱头模板DNA 2μL，1U/μL KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase 1μL，MgCl21μL，ddH2O补充至体积50μL。PCR扩增试剂购自Thermo公司。PCR扩增程序：95℃预变性3min；98℃变性20s，退火(54℃)15s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
b、先将S3基因与T载体连接获得重组T载体，应用碱裂解法提取重组T载体。以重组T载体为模板设计带有pTRV2载体序列的引物序列，引物序列以AATTCTCTAGAAGGCCTCCATGGG(SEQ ID NO:6)序列为正向引物，以GCGTGAGCTCGGTACCG(SEQ ID NO:7)序列为反向引物，扩增后的片段与BamHI酶切过pTRV2载体连接，获得pTRV2-S3载体。连接体系如下：在微量离心管中依次加入，目的片段(S3基因)1.5μL，载体1μL，One Step Seamless Cloning Kit2.5uL，连接使用的试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。混匀后，连接在控温50℃反应40min，转化大肠杆菌，大肠杆菌感受态购置北京全式金生物技术有限公司，转化步骤按照说明书执行。进行菌落PCR鉴定，挑取阳性菌落摇菌，使用EasyPure Plasmid MiniPrepKit试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取质粒，经酶切和测序验证正确，得到重组的沉默S3基因载体，即pTRV2-S3。
(3)构建pRI101-S1，包括以下步骤：
a、获得S1基因的PCR扩增产物
设计S1基因扩增引物，扩增S1基因的正向引物F(5'-3'):GTAATTGCAACGGGTCAAAATATGAG(SEQ ID NO:8),扩增S1基因的反向引物R(5'-3'):ACAACTCAGTATTAGTTGCTGGATCA(SEQ ID NO:9)，由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增体系：5×KAPA HiFi Buffer 10μL，10mM KAPA dNTP Mix 1.5μL，用于扩增S1基因上、下游引物各1.5μL，花柱头模板cDNA 2μL，1U/μL KAPAHiFi HotStart DNA Polymerase 1μL，MgCl21μL，ddH2O补充至体积50μL。PCR扩增程序：95℃预变性3min；98℃变性20s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
b、先将S1基因与T载体连接获得重组T载体，应用碱裂解法提取重组T载体。以重组T载体为模板设计带有pRI101载体序列的引物序列，引物序列以CCCCGGGGGTACCG(SEQ IDNO:10)序列为正向引物，以CTCGCCCTTGCTCACCATG(SEQ ID NO:11)序列为反向引物，扩增后的片段与BamHI酶切过pRI101载体连接，获得pRI101-S1载体。连接体系如下：在微量离心管中依次加入：目的片段(S1基因)1.5μL，pRI101载体1μL，One Step Seamless Cloning Kit2.5uL，混匀后，连接在控温50℃反应40min，转化大肠杆菌，进行菌落PCR鉴定，挑取阳性菌落摇菌，使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit试剂盒提取质粒，经酶切和测序验证正确，得到重组的过表达S1基因载体，即pRI101-S1。
(4)构建pRI101-S6，包括以下步骤：
a、设计S6扩增引物，扩增S6基因的正向引物F(5'-3'):CTATGGCCAAGTAATTATTCAAACC(SEQ ID NO:12)，扩增S6基因的反向引物R(5'-3')为TTGTATCATTGCCACTTTCCACG(SEQ ID NO:13)，由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增体系：5×KAPA HiFi Buffer 10μL，10mM KAPA dNTP Mix 1.5μL，用于扩增S6基因上、下游引物各1.5μL，花柱头模板DNA 2μL，1U/μL KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase 1μL，MgCl21μL，ddH2O补充至体积50μL。PCR扩增程序：95℃预变性3min；98℃变性20s，54℃退火15s，72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
b、先将S6基因与T载体连接获得重组T载体，应用碱裂解法提取重组T载体。以重组T载体为模板设计带有pRI101载体序列的引物序列，引物序列以CCCCGGGGGTACCG(SEQ IDNO:10)序列为正向引物，以CTCGCCCTTGCTCACCATG(SEQ ID NO:11)序列为反向引物，扩增后的片段与BamHI酶切过pRI101载体连接，获得pRI101-S6载体。连接体系如下：在微量离心管中依次加入：目的片段(S6基因)1.5μL，pRI101载体1μL，One Step Seamless Cloning Kit2.5uL，混匀后，连接在控温50℃反应40min，转化大肠杆菌，进行菌落PCR鉴定，挑取阳性菌落摇菌，使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit试剂盒提取质粒，经酶切和测序验证正确，得到重组的过表达S6基因载体，即pRI101-S6。
(5)重组质粒的农杆菌侵染液制备方法包括以下步骤：
a、取100μL农杆菌感受态细胞(农杆菌EHA105感受态，购自上海唯地生物技术有限公司)，加入1μg构建好的带有目的基因的质粒DNA混匀后冰上放置30min，放入液氮速冻1min，立即转入37℃水浴5min，取出样品后冰浴2min，加入1mL不含抗生素的液体LB液体培养基，于28℃恒温摇床中180rpm振荡培养约3h；
b、在1000rpm条件下瞬时离心30s，吸取200μL LB重悬细胞，涂布于含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的固体LB培养板上，置于28℃恒温培养箱中倒置培养2d；
c、阳性克隆获取与保存。待长出单菌落后，挑取单克隆于含有卡那霉素(100μg/mL)和利福平(50μg/mL)的液体LB培养基中生长，以菌液为模板进行PCR扩增，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定阳性克隆，将含有目的基因的菌液进行-20℃保存备用。
d、含有目的基因农杆菌菌液活化。挑取将步骤c中含有目的基因保存菌液划线在含有抗生素固体LB培养基上，抗生素为卡那霉素(100μg/mL)和利福平(50μg/mL)；挑取培养板上的单菌落分别接种至添加卡那霉素(100μg/mL)和利福平(50μg/mL)的液体LB培养基中，培养12-16h，至菌液呈桔黄色，作为活化的菌液用于下一步骤；
参照上述方法分别获得以下菌株的单菌落：含pTRV2-S3的农杆菌、含pTRV2的农杆菌、含pTRV1载体的农杆菌、含pRI 101-S1的农杆菌、含pRI 101-S6的农杆菌、含pRI 101的农杆菌；
e、获取重悬液：将上述活化的菌液分装至灭菌后的50mL离心管中，离心(4000g，15min，20℃)，收集菌体，用侵染缓冲液溶液调至OD600值为1.0-2.0，得到重悬液；
f、将步骤e中的重悬液于室温12000rpm离心10min，收集菌体并用侵染缓冲液悬浮，检测OD600为0.8-1.0。
上述步骤中，侵染缓冲液包括10mM MgC l2,10mM吗啉乙磺酸MES(pH＝5.6-5.8),150μM AS(乙酰丁香酮)。
2、实验方法
以互为授粉树品种“科迪亚”、“雷洁娜”为例，“科迪亚”S基因型为S3S6，“雷洁娜”S基因型为S1 S3，将都含有S3基因花瓣开始展开但花粉散开前进行沉默，将含有不同S基因(例如，S1或S6基因)进行过表达。
实验方法包括以下步骤：
(1)挑取划线后的单菌落分别接种至含有卡那霉素和利福平的液体LB培养基中(卡那霉素100μg/mL，利福平50μg/mL)，培养12-16h，至菌液呈桔黄色；
(2)将上述菌液分装至灭菌后的50mL离心管中，离心(4000g，15min，20℃)收集菌体，用侵染缓冲液溶液调至OD600值为0.8-1.0，得到重悬液；
(3)侵染处理
各组均在花瓣开始展开但花粉散开前(在盛花期花瓣展开度达30％左右)，使用侵染液涂抹花柱头或用喷雾器喷施花柱头，每个柱头涂抹50u l侵染液，涂抹方法采用毛笔或棉棒蘸取侵染液轻轻涂抹。
基因沉默组(沉默S3基因)：将含pTRV2-S3的农杆菌重悬液培养至OD600为0.8-1.0；将含pTRV2-S3的农杆菌重悬液与含pTRV1载体的农杆菌重悬液(OD600为0.8-1.0)按照体积比1:1的比例混合，得到沉默S3基因侵染液；使用沉默S3基因侵染液涂抹花柱头或用喷雾器喷施花柱头。
TRV空载侵染组：将含pTRV2载体的农杆菌重悬液培养至OD600为0.8-1.0；将含pTRV2的农杆菌重悬液与含pTRV1载体的农杆菌重悬液(OD600为0.8-1.0)按照体积比1:1的比例混合，得到TRV空载侵染液；使用TRV空载侵染液涂抹花柱头或用喷雾器喷施花柱头。
过表达S1组：将含pRI 101-S1的农杆菌重悬液培养至OD600为0.8-1.0，即为过表达S1基因侵染液；使用过表达S1基因侵染液涂抹花柱头或用喷雾器喷施花柱头。
过表达S6组：将含pRI 101-S6的农杆菌重悬液培养至OD600为0.8-1.0，即为过表达S6基因侵染液；使用过表达S6基因侵染液涂抹花柱头或用喷雾器喷施花柱头。
pRI 101空载组:将含pRI 101农杆菌重悬液培养至OD600为0.8-1.0，即为pRI 101空载侵染液；使用pRI 101空载农杆菌侵染液涂抹花柱头或用喷雾器喷施花柱头。
沉默S3基因同时过表达S1基因组：将沉默S3基因侵染液与过表达S1基因侵染液按体积比1:1混合均匀，得到S1S3混合液，并将S1S3混合液涂抹花柱头或用喷雾器喷施花柱头。
过表达S1和S6基因组：将过表达S1基因侵染液与过表达S6基因侵染液按体积比1:1混合均匀，得到S1S6混合液，并将S1S6混合液涂抹花柱头或用喷雾器喷施花柱头。
空载侵染组：将TRV空载侵染组的侵染液与pRI 101空载组的侵染液按1:1体积比混合均匀，得到混合侵染液，并将混合侵染液涂抹花柱头或用喷雾器喷施花柱头。
(4)花粉采集与处理：三月中下旬至四月上旬，每品种采集铃铛期花蕾300朵，人工剥取花药，使用烘箱20℃-25℃恒温烘干24h后进行反复碾压或研磨，获得干燥花粉。花粉以用时现碾为宜，短时不用的花粉可置于4℃干燥环境中暂存。
去雄与套袋：选择花蕾数量与生长状况适宜的枝条，摘除已经开放的花，去雄后套袋。
人工授粉：用橡皮和粘有双面胶的铅笔等工具蘸取花粉点授在花的柱头上，人工授粉完成后套袋。人工授粉后，统计坐果率，用于分析操纵S基因后的甜樱桃坐果情况，大田管理中授粉采用蜂媒，以减少人工成本。
坐果率＝人工授粉两周后坐果数/人工授粉处理花朵总数×100％。
(5)PCR验证
在步骤(3)侵染处理后48h，收集花柱头样品进行PCR验证处理的S基因表达，PCR验证处理的S基因表达反应体系及条件如下：将对照组WT(未侵染)、空载侵染组、基因沉默组和基因过表达组进行实时荧光PCR(Real Time PCR)，检测各处理组处理的S基因表达情况，Real Time PCR为20μL体系，甜樱桃花柱头模板cDNA取1uL，采用的荧光染料为SYBR MasterMix(Taraka，具体用量见药品说明书)，将混合好的PCR体系置于定量PCR仪(ABI 7500Real-Time PCR System)中，其使用条件为：95℃30s；95℃5s，60℃34s进行40个循环；随后95℃15s，60℃1min，95℃15s。每个反应进行三次重复。
实验结果如图1至图3所示。
图1中，WT代表对照组；TRV代表空载侵染组；TRV-S3代表沉默S3；字母后边的品种表示对该品种进行相应的处理；#后的数字表示检测样品的编号。例如：TRV-S3科迪亚#2表示对科迪亚的#2样品进行S3基因沉默处理。
由图1可知，通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术沉默“科迪亚”和“雷洁娜”株系的S3基因，对照组WT、空载侵染组TRV科迪亚#1、TRV科迪亚#2、TRV雷洁娜#2、TRV雷洁娜#3相对表达水平在7.2-8.4之间，基因沉默组TRV-S3科迪亚#2、TRV-S3科迪亚#3、TRV-S3雷洁娜#1、TRV-S3雷洁娜#2在2.3-3.2之间，表达量抑制了2.3-3.7倍，沉默花柱头S3基因后，S3基因表达效果明显降低了。
图2中，WT代表对照组；pRI101代表表达空载pRI101；pRI101-目的基因代表表达与pRI101相连的目的基因；字母后边的品种表示对该品种进行相应的处理；#后的数字表示检测样品的编号；深色代表检测S1基因的表达，浅色代表检测S6基因的表达。例如：pRI101-目的基因科迪亚#2表示对科迪亚#2样品过表达目的基因，即一个株系同时过表达S1基因和过表达S6基因；pRI101-目的基因科迪亚#3表示对科迪亚#3样品过表达目的基因，即一个株系同时过表达S1基因和过表达S6基因；pRI101-目的基因雷洁娜#1表示对雷洁娜#1样品过表达目的基因，即一个株系同时过表达S1基因和过表达S6基因；pRI101-目的基因雷洁娜#2表示对雷洁娜#2样品过表达目的基因，即一个株系同时过表达S1基因和过表达S6基因。
由图2可知，通过瞬时过表达“科迪亚”和“雷洁娜”株系的S1基因，对照组WT、pRI101科迪亚#1、pRI101科迪亚#2、pRI101雷洁娜#2、pRI101雷洁娜#3花柱头S1基因相对表达水平为9.6-11.2之间，S6基因相对表达水平为6.9-8.8之间，过表达组(pRI101-目的基因S1)在16.9-19.2之间，表达量为对照组的1.5-2倍，过表达组(pRI 101-目的基因S6)在14.5-16.8之间，表达量为对照组的1.6-2.4倍，S1和S6基因表达明显上调，说明花柱头侵染有显著效果。
图3中，WT代表对照组；TRV:OE代表空载对照组(即空载侵染同时空载pRI 101组)，采用含有pTRV1+pTRV2空载和pRI 101空载农杆菌菌液同时处理；TRVS3:OES1代表沉默S3同时过表达S1；字母后边的品种表示对该品种进行相应的处理；#后的数字表示检测样品的编号；深色代表检测S3基因的表达，浅色代表检测S1基因的表达。例如：TRVS3:OES1雷洁娜#1表示对雷洁娜#1样品过表达S1同时沉默S3。
对“科迪亚”和“雷洁娜”株系花柱头既沉默相同基因S3同时过表达不同基因S1(TRVS3:OES1)的双基因处理后，“科迪亚”和“雷洁娜”株系花柱头S3和S1的基因表达情况如图3所示。对照组和空载对照组“科迪亚”和“雷洁娜”株系花柱头S3基因表达在7.3-8.4之间，S1基因表达为9.2-10.6之间，沉默S3过表达S1处理组“科迪亚”和“雷洁娜”株系花柱头S3基因表达为4.7-5.9，S1基因表达水平在15.4-17.2之间，处理组株系S3和S1基因水平有显著下调和上调变化，双基因处理甜樱桃花柱头后，其基因表达水平有明显改变。
3、实验设计互为授粉树的S基因处理对坐果率影响
参照实施例方法设置不同实验组。
对于母本×父本；WT：未处理组；处理1：空载侵染；处理2：沉默S基因；处理3：过表达S基因；处理4：TRVS相同基因:OES不同基因(沉默相同S基因同时过表达不同S基因)。
对于科迪亚×雷洁娜，处理1为空载侵染(空载指的是pTRV2+pTRV1同时pRI 101)，处理2为沉默S3，处理3为过表达S1，处理4为沉默S3同时过表达S1。
对于雷洁娜×科迪亚，处理1为空载侵染(空载指的是pTRV2+pTRV1同时pRI 101)，处理2为沉默S3，处理3为过表达S1，处理4为沉默S3同时过表达S1。
4、实验结果
收集对“科迪亚”与“雷洁娜”S基因各处理后花粉，人工授粉分析各组合品种坐果率(见表4)。
表4授粉树组合中各处理组品种杂交组合坐果率情况
根据表4数据可知，具有一个相同S基因(S3)的授粉树“科迪亚”与“雷洁娜”组合，进行不同处理，即对照组WT、处理1、处理2、处理3、处理4。对于科迪亚×雷洁娜，对照组WT与处理1下的授粉组合坐果率在23.3-23.5％，基本没有差异；当沉默相同S基因(处理2)，坐果率显著提高(达到41.7％)，是WT和处理1的1.77-1.79倍；过表达不同S基因处理(处理3)，“科迪亚”、“雷洁娜”坐果率也都有一定程度的提高(坐果率为32.1％)，但沉默处理组效果更好；沉默与过表达S基因的双重处理(处理4)坐果率可以达到67.3％，此处理株系的坐果率是未处理(WT)和空载侵染株系的2.87-2.89倍，因此，沉默与过表达S基因的双重处理相比其他处理方式可以显著提高坐果率。对于雷洁娜×科迪亚也能获得与上述一致的结论。
因此，可以通过以下途径来提高甜樱桃坐果率：
(a)针对含有相同S基因的不同S基因型的互为授粉树品种，可将其相同S基因沉默；
(b)针对含有相同S基因的不同S基因型的互为授粉树品种，可将其相同S基因沉默，不同S基因过表达的双重处理；
(c)针对含有相同S基因的不同S基因型的互为授粉树品种，可将其不同S基因过表达。
其中，途径(b)途径效果最好。具体方法可以根据实际生产条件选择。
综上所述，本发明可以通过以下方法来提高寒旱地区甜樱桃坐果率：
(1)采用温室栽培甜樱桃，能够按照市场需求时期进行合理安排种植时间、花期处理等；精准调节温度等条件，实现全年高产、精准管控；有效避免高寒旱地区恶劣的气候条件影响甜樱桃坐果率的问题。
(2)本发明中的动物源氨基酸水溶肥对花芽质量都有显著有益效果。施有硼肥的氨基酸水溶肥的处理组比仅施氨基酸水溶肥的对照组花器官发育好，适宜的硼肥量，更有利于甜樱桃花器官发育，随着硼肥量的增加，花密度和完全花比率呈现先增加后下降现象，处理组的花密度明显比对照组花密度大、成花量多。处理组的完全花比率显著高于对照组，畸形花比率和退化花比率比未施用硼肥的氨基酸水溶肥的对照组显著低。本发明提供的氨基酸水溶肥为酸性肥料，可随水滴灌，能够降低根际土壤pH值，降低盐碱。促使幼苗快速发根，增强作物抗逆性，促进植物生长，增加种实蛋白质含量；有效替代氮肥，且磷钾丰富，营养平衡，能够为甜樱桃树体有效利用，使树体营养分配均衡，提高了甜樱桃的成花质量，有利于提高坐果率和果品质量。本发明氨基酸水溶肥配施的硼肥作为微量元素肥，是作物开花和生长点生长所必需的元素，配施适宜量的硼肥，有利于甜樱桃花粉管伸长，提高花朵授粉率；硼肥促进维管束发达，平衡水分与养分均衡吸收，提高肥料有效利用，以促进器官发育；有利于提高甜樱桃植株和花的抗逆性，避免因外界因素造成出花不齐、弱花畸形花的现象，进而提高了甜樱桃的成花质量和坐果率。
(3)S基因处理
沉默互为授粉树品种中相同S基因后，坐果率显著提高，“科迪亚”与“雷洁娜”杂交组合的坐果率可以达到41.7-46.1％。抑制相同S基因表达时更有利于甜樱桃授粉坐果。过表达授粉品种“科迪亚”与“雷洁娜”中不同S基因后，坐果率有一定程度的提高，可以达到32.1-38.8％。过表达不同S基因时也有利于甜樱桃授粉坐果。沉默相同S基因的处理，坐果提高的效果好于过表达不同S基因的处理。对于具有不同S基因型互为授粉品种“科迪亚”与“雷洁娜”，沉默相同S基因与过表达不同S基因的双重处理4坐果率显著提高，分别达到67.3-69.5％，此处理株系的坐果率是未处理(WT)的2.8倍左右，是沉默相同S基因处理2的1.5-1.7倍。沉默相同S基因与过表达不同S基因的双重处理坐果率提高效果最佳。
(4)选择花期一致的互为授粉甜樱桃树组合通过蜜蜂和熊蜂授粉，节约大量的授粉人工，提高甜樱桃坐果率和产量、减少人工管理成本。
Claims (10)
1.一种用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，其特征在于，包括以下方法中的一种或几种组合：
(1)根据生长阶段对温度进行调控；
(2)施加土壤改良剂修复土壤生态环境；
(3)选择嫁接苗、栽种；
(4)施肥管理；
(5)对互为授粉树品种的S基因处理；
(6)授粉。
2.根据权利要求1所述用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，其特征在于，利用温室对甜樱桃全年温度进行调控，调控方法包括：除休眠期外，年均温度超过10℃；萌芽至开花期，白天温度18-20℃，夜间5-7℃，地温10℃；花期，白天温度16-18℃，夜间8-10℃，地温15-17℃；果实膨大期，白天温度为23-25℃，夜间15℃，地温20℃；果实成熟期，白天温度为25-26℃，夜间17℃，地温20℃；采收后，白天温度为20-25℃，夜间18-20℃，地温20℃；休眠期，温度控制0-7.2℃，累计1500小时，使其完成休眠。
3.根据权利要求1或2所述用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，其特征在于，在栽培甜樱桃前，土壤要深松，打破梨底层，平整完土地后施入土壤改良剂，改良土层厚度为40cm-50cm；所述的土壤改良剂包括土壤调理剂、微生物菌剂与生物刺激素。
4.根据权利要求1或2所述用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，其特征在于，苗木所用的砧木采用的由组培扩繁得到的Gisela12无毒樱桃苗，通过培育得到的两年生大苗；选择晚熟品种“科迪亚”与“雷洁娜”作为互为授粉树的甜樱桃品种，嫁接Gisela12砧木后经过两个生长季发育的苗木移栽至温室中，并进行一年缓苗养树；将苗木移栽入设施温室中，每个温室栽植两个品种，行距4m，株距1.5m，亩栽甜樱桃树111株；栽培比例1:1，两品种进行隔行栽植。
5.根据权利要求1或2所述用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，其特征在于，施肥管理包括基肥管理和追肥管理；基肥管理包括以下步骤：基肥施用生物质腐殖酸有机肥2-5吨/亩和配合施用平衡复合肥10-20公斤/亩；追肥管理包括以下步骤：以滴灌形式施用氨基酸水溶肥与硼肥的混合溶液，硼肥的添加量为11g/L；在开花期前7-10天进行滴灌，每7-10d滴灌一次，每次滴灌肥水量为5L/亩，共滴灌4-6次。
6.根据权利要求1或2所述用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，其特征在于，对互为授粉树品种的S基因处理包括以下步骤：在盛花期花瓣展开度达30％时进行S基因处理；
S基因处理方法包括(a)至(c)中的一种或几种：
(a)针对含有相同S基因的不同S基因型的互为授粉树品种，将其相同S基因沉默；
(b)针对含有相同S基因的不同S基因型的互为授粉树品种，将其相同S基因沉默并且不同S基因过表达的双重处理；
(c)针对含有相同S基因的不同S基因型的互为授粉树品种，将其不同S基因过表达。
7.根据权利要求6所述用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，其特征在于，“科迪亚”和“雷洁娜”含有的相同S基因为S3；将S3基因沉默包括以下步骤：
(a)构建pTRV2-S3载体：以花柱头cDNA为模板，以TTTTGGGAAAGTGAATGG序列为正向引物，以CGTTAGGATGTGCTGGAT序列为反向引物，采用PCR扩增，得到S3基因，将S3基因与T载体连接获得重组T载体，以重组T载体为模板设计带有pTRV2载体序列的引物序列，引物序列以AATTCTCTAGAAGGCCTCCATGGG序列为正向引物，以GCGTGAGCTCGGTACCG序列为反向引物，扩增后的片段与BamHI酶切过pTRV2载体连接，获得pTRV2-S3载体，连接体系为S3基因片段1.5uL、pTRV2载体1uL和One Step Seamless Cloning Kit 2.5uL的混合物，连接步骤在50℃条件下反应40min，进一步转化大肠杆菌；
(b)制备农杆菌侵染液：将转化大杆菌的pTRV2-S3载体提取质粒，取农杆菌感受态细胞100μL，加入1μg pTRV2-S3质粒DNA或pTRV1质粒DNA，混匀后冰上放置30min，加入液氮速冻1min，立即转入37℃水浴5min，取出样品后冰浴2min，加入不含抗生素的液体培养基，于28℃培养；离心，重悬细胞，涂布于含有抗生素的固体培养基上，28℃培养；待长出单菌落后，挑取单克隆于含有抗生素的液体培养基中培养，鉴定阳性克隆，保存；将阳性克隆的菌液活化、用侵染缓冲液重悬，并用侵染缓冲液调节OD600值为0.8-1.0，分别得到含pTRV2-S3的农杆菌重悬液和含pTRV1载体的农杆菌重悬液，上述侵染缓冲液为包含10mM氯化镁(MgCl2)、10mM pH为5.6-5.8的吗啉乙磺酸(MES)、150μM乙酰丁香酮(AS)的蒸馏水溶液；上述液体培养基和固体培养基均为LB培养基；
(c)将含pTRV2-S3的农杆菌重悬液与含pTRV1的农杆菌重悬液按1:1体积混合，作为侵染液，将侵染液涂抹花柱头或喷施花柱头，每个柱头使用50ul侵染液。
8.根据权利要求6所述用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，其特征在于，“科迪亚”和“雷洁娜”含有的不同S基因为S1和S6；对S1基因和/或S6基因过表达包括以下步骤：
(a)构建pRI 101-S1和/或pRI 101-S6：以花柱头cDNA为模板，以GTAATTGCAACGGGTCAAAATATGAG序列为正向引物，以ACAACTCAGTATTAGTTGCTGGATCA序列为反向引物,采用PCR扩增，得到S1基因，将S1基因与T载体连接获得重组T载体，以重组T载体为模板设计带有pRI 101载体序列的引物序列，引物序列以CCCCGGGGGTACCG序列为正向引物，以CTCGCCCTTGCTCACCATG序列为反向引物，扩增后的片段与BamHI酶切过pRI 101载体连接，获得pRI 101-S1载体；和/或，以CTATGGCCAAGTAATTATTCAAACC序列为正向引物，以TTGTATCATTGCCACTTTCCACG序列为反向引物，采用PCR扩增，得到S6基因，将S6基因与T载体连接获得重组T载体，以重组T载体为模板设计带有pRI 101载体序列的引物序列，引物序列以CCCCGGGGGTACCG序列为正向引物，以CTCGCCCTTGCTCACCATG序列为反向引物，扩增后的片段与BamHI酶切过pRI 101载体连接，获得pRI 101-S6载体，连接体系为S1或S6基因片段1.5uL，pRI 101载体1uL，One Step Seamless Cloning Kit 2.5uL，连接步骤在50℃条件下反应40min，进一步转化大肠杆菌；
(b)制备重组质粒的农杆菌侵染液：将转化大杆菌的pRI 101-S1和/或pRI 101-S6载体提取质粒，取农杆菌感受态细胞100μl，加入1μg pRI 101-S1质粒DNA和/或pRI 101-S6质粒DNA，混匀后冰上放置30min，放入液氮速冻1min，立即转入37℃水浴5min，取出样品后冰浴2min，加入不含抗生素的液体培养基，于28℃培养；离心，重悬细胞，涂布于含有抗生素的固体培养基上，28℃培养；待长出单菌落后，挑取单克隆于含有抗生素的液体培养基中培养，鉴定阳性克隆，保存；将阳性克隆的菌液活化、用侵染缓冲液重悬，并用侵染缓冲液调节OD600值为0.8-1.0，得到重悬液；上述侵染缓冲液为包含10mM氯化镁(MgCl2)、10mM pH为5.6-5.8的吗啉乙磺酸(MES)、150μM乙酰丁香酮(AS)的蒸馏水溶液；上述液体培养基和固体培养基均为LB培养基；
(c)将步骤(b)获得的重悬液作为侵染液涂抹花柱头或用喷施花柱头，每个柱头使用50u l侵染液。
9.根据权利要求1或2所述用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，其特征在于，授粉包括以下步骤：在樱桃初花期有5％的花朵开放时放蜂，落花末期95％花开时停止放蜂；授粉采用中蜂、意蜂、壁蜂和熊蜂中的一种或多种蜂进行授粉；对温度进行控制，授粉蜂的活动下限温度为10-13℃，上限温度30-42℃。
10.根据权利要求1或2所述用于提高寒旱地区甜樱桃坐果率的方法，其特征在于，还包括甜樱桃果树的常规管理。
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Cited By (1)
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| CN117457066A (zh) * | 2023-12-26 | 2024-01-26 | 山东科技大学 | 一种省域尺度的冬小麦籽粒蛋白质含量预测方法 |
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