CN112458101B

CN112458101B - 一种鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN112458101B
Application number: CN202011474820.6A
Authority: CN
Inventors: 张新全; 冯光燕; 帅杨; 黄琳凯; 聂刚; 汪霞; 黄婷; 杨忠富; 许肖恒; 王苗利; 刘秋旭; 周冀琼; 焦永娟; 王成
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2040-12-14
Also published as: CN112458101A

Abstract

本发明公开了一种鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125及其表达载体和应用，所述的鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125在鸭茅抗旱性和耐盐性基因工程中的应用，通过将DgZFP125在鸭茅中增强表达，可以提高鸭茅的抗旱性和耐盐性，缩短育种时间，提高育种效率，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。

Description

一种鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125及其表达载体和应用。

背景技术

鸭茅(Dactylis glomerataL.)又名果园草(Orchardgrass)、，属禾本科(Poaceae)早熟禾亚科(Festucoideae)鸭茅属(Dactylis)，是一种世界范围内广泛栽培的多年生冷季型丛生牧草。鸭茅具有生长速度快，生物产量高，糖分含量高，耐荫性强和适应范围广等特点。作为经济价值排名前四的多年生牧草，鸭茅对于世界温带地区草食动物肉类和乳制品生产有重要意义。除作为优良的牧草外，鸭茅也是我国林下草地和人工草地重要的优良混播禾草之一，主要适合于西部退耕还草和草场建设，对退耕还林还草和林-草复合建植等具有重要的积极意义。但鸭茅不耐旱、不耐盐的特性严重限制了其在生产上的运用。虽然针对耐旱和耐盐性状进行了多年的育种研究，但效果甚微。

锌指蛋白是一类具有指状结构域的转录因子。根据半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基的数目和位置可将锌指蛋白分为C2H2、C2HC、C2C2、C2HCC2C2、C2C2C2C2等亚类。DgZFP125是鸭茅中编码C2H2型锌指蛋白的重要基因，具有调控植物的生长发育和胁迫响应的作用，在牧草品质改良方面有重要利用价值。鸭茅是异化授粉牧草，其遗传转化困难，生长周期长，基因功能验证较为滞后，目前为止，对鸭茅DgZFP125的研究还处于空白状态，利用DgZFP125转入鸭茅，提高其抗旱性和耐盐性具有重要理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125，利用转基因技术将DgZFP125在鸭茅中增强表达，可以针对性的提高鸭茅的抗旱性和耐盐性，缩短育种时间，提高育种效率，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125，所述的鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125可编码的蛋白含378个氨基酸。

具体的，所述的鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

另外，以下核苷酸或氨基酸序列也在本发明的保护范围内：

1)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列不同，但是编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；

2)与序列如SEQ ID NO.1所示互补的所示的核苷酸序列；

3)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经取代、缺失或者添加一个/几个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列；

4)与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列同源性≥90％，且功能相同的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125。

所述的表达载体是适用于大肠杆菌中表达的载体。

所述的表达载体是将鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125插入至pMD18-T载体中得到。

具体的，所述的表达载体通过以下方法构建：

以鸭茅参考基因组设计引物，提取鸭茅总RNA，以反转录合成cDNA为模板进行扩增，利用DNAA-TailingKit在目的片段DNA的3’末端添加“A”尾，通过连接酶插入pMD18-T载体中，得到表达载体pMD18T-DgZFP125。

所述的引物为：

DgMYMF:5’-ATGACTTTAATTATTAGATGTGTT-3’；

DgMYMR:5’-TTAATTCAGAAAAATATCATC-3’。

另外，一种针对鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125的超表达载体也在本发明的范围内。

所述的超表达载体通过以下方法构建：以pMD18T-DgZFP125为模板，用引物P1226F和P1254R扩增得到目的基因，将用KpnI-XbaI酶切的目的基因与载体pCAMBIA1300-35进行连接，即得超表达载体。

进一步的，引物P1226F和P1254R为：

P1226F：5’-GGGGTACCATGACTTTAATTATTAGATG-3’；

P1254R：5’GCTCTAGATTAATTCAGAAAAATATCATCT-3’。

在本发明的另一方面，还提供了所述的鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125在鸭茅抗旱性和耐盐性基因工程中的应用，通过将DgZFP125在鸭茅中增强表达，可以提高鸭茅的抗旱性和耐盐性，缩短育种时间，提高育种效率，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。

同理，将针对鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125的超表达载体导入鸭茅，提高鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125的表达，能提高鸭茅的抗旱性和耐盐性。

本发明的有益效果为：

在鸭茅中过表达DgZFP12基因可以提高鸭茅抗旱性和耐盐性，促进其在边际土地或不适宜粮食作物生长的贫瘠地区或者盐碱、干旱地区应用，提高土地使用效率，为家畜饲养提供优质饲草料。

附图说明

图1是本发明DgZFP125因在不同胁迫下的表达；其中柱形图顺序依次为0h，1h，3h，6h，12h，24h；

图2是本发明酵母初步验证DgZFP125因功能；

图3是本发明DgZFP125基因瞬时表达结果；

图4是本发明DgZFP125因克隆结果；

图5是本发明DgZFP125基因阳性质粒鉴定；

图6是本发明转DgZFP125阳性拟南芥筛选；

图7是本发明转DgZFP125拟南芥干旱胁迫实验；A：左边为野生型拟南芥，右边为转DgZFP125拟南芥；B：叶片失水率；C：叶片脯氨酸含量；D：MDA含量；

图8是本发明转DgZFP125拟南芥盐胁迫实验。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125及表达载体的构建

实验材料为鸭茅品种‘宝兴’，种植于四川农业大学温江校区。取其幼嫩叶片为材料提取总RNA。选用天根(北京)生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒进行RNA提取，操作参考内附说明书进行。RNA提取后利用1％琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测，使用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。反转录选用TaKaRa公司的PrimeScript II 1ststrandcDNAsynthesis Kit，操作流程参考内附说明书。

以鸭茅参考基因组为模板，通过序全长设计引物(上游引物：DgMYMF:5’-ATGACTTTAATTATTAGATGTGTT-3’,下游引物：DgMYMR:5’-TTAATTCAGAAAAATATCATC-3’)以cDNA为模板进行扩增，扩增选用TaKaRa公司的PrimeSTAR Max DNA Polymerase试剂盒进行，操作流程参考内附说明书，PCR扩增体系见表1。反应条件为98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃运行10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

表1 PCR扩增体系

紫外灯下切胶，用TaKaRa公司的MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit回收纯化目的片段，具体操作参考内附说明书。用TaKaRa公司的DNAA-TailingKit在目的片段DNA的3’末端添加“A”尾。完成后取上述DNA溶液4μl，加入1μlpMD18-T载体和5μlSolution(含连接酶)混匀，在16℃反应30min。反应完成后将上所述溶液加入100μlDH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃加热45s后，再在冰上放置1min。将转化好的感受态细胞中加入890μlSOC培养基，37℃培养60分钟，涂于含有氨苄(Amp)的LB培养基上倒置过夜培养，培养后挑选单菌落培养并用菌液PCR验证目的片段是否插入成功。能通过菌液PCR扩增得到目的条带进行双端测序，测序引物M13，以验证是否克隆成功。

鸭茅DgZFP125基因片段全长1,134bp，序列如SEQ ID NO.1所示，可编码的蛋白含378个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2 DgZFP125功能分析

1鸭茅胁迫处理

为验证DgZFP125在不同胁迫条件下的表达变化，选取鸭茅品种‘宝兴’在16h(23℃)白天/8h(18℃)黑暗进行砂培。鸭茅幼苗长至3叶到4叶期时分别进行250mMNaCl处理，100μMABA处理，37℃热胁迫，20％聚乙二醇处理(PEG6000)，和200mM碳酸氢钠胁迫处理(NaHCO₃)，分别在0h，1h，3h，6h，12h，24h收集叶片，并于液氮中冷冻，每个样品取3个重复。

使用美基生物(广州)科技有限公司的HiPure Plant RNA Mini Kit试剂盒进行总RNA提取，使用莫纳(广州)生物科技有限公司的MonScript^TMRTIII All-in-One Mix withdsDNase Kit试剂盒进行cDNA合成。荧光定量采用美国Bio-RAD公司的Bio-RAD CFX Connet进行，定量试剂盒选择普迈精医科技(北京)的MonAmp^TM

Green qPCR Mix(NoneROX)试结合进行。定量引物为：

正向引物DgZFP125-F：CACTTTGAGGGCGATTTCAT；

反向引物DgZFP125-R：CGCATCAAAGTTTCGACAGA。

以GAPDH为内参基因，正向引物GAPDH-F：TCTGACCGTTAGACTTGAGAAGG；反向引物：GAPDH-R：CTTGAGCTTACCCTCAGACTCCT，以2^-ΔΔCT法计算基因的表达水平。

如图1所示，荧光定量结果表明，DgZFP125在PEG模拟的干旱胁迫，热胁迫和盐胁迫条件下有较高的表达水平。

2 DgZFP125酵母表达验证

为初步鉴定DgZFP125的功能，选择前期克隆的DgZFP125片段，以Hind III和Xba I为酶切位点进行酶切，采用诺唯赞生物(南京)的ClonExpress Ultra One Step Cloningkit试剂盒将酶切后的片段连入线性化后的pYES2酵母表达质粒。将重组pYES2-DgZFP125质粒通过Carrier DNA(Coolaber,中国)转入酿酒酵母株系(INVScI,MATahis3Δ1 leu2trp1-289 ura3-52/MATαhis3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52)，以空白pYES2质粒为对照。转化后的酵母以含20mg/mL葡萄糖的SC-Ura培养基于28℃培养48h，选取单克隆进行PCR确认，引物为：

正向引物MYM-F：ttggtaccgagctcggatccATGACTTTAATTATTAGATGTGTTAACATGTC；

反向引物MYM-R：acatgatgcggccctctagaTTAATTCAGAAAAATATCATCTAATTCAACA。

选取阳性转化酵母于含2mg/mL半乳糖的液体SC-Ura培养基培养后，150rpm离心后以10的倍数进行稀释。稀释后的酵母悬浮液分别涂布于含有3M山梨醇和1.5M NaCl的SD-Ura培养基上28℃培养。选择未添加山梨醇和NaCl的培养基涂布悬浮液于37℃培养进行热胁迫。

结果表明，DgZFP125可以提高酵母对盐胁迫和山梨醇模拟的干旱胁迫的耐受性(图2)。

3烟草注射及亚细胞定位观察

1)将质粒电击转化农杆菌GV3101，挑单克隆28℃过夜摇菌。

2)将菌液4000rpm离心5min。

3)用侵染液(含10mM MgCl₂，50mM MES(pH5.6)，100uM乙酰丁香酮)悬浮菌体，调节OD值至1-1.5。

4)注射一个月大小的烟草叶片背面，25℃黑暗培养48h。

5)共聚焦观察荧光信号。

通过注射烟草叶片瞬时表达后，在激光共聚焦显微镜下观察DgSPL3荧光发现细胞核核光信号明显，可确定该蛋白定位于细胞核(图3)。

实施例3转入拟南芥及功能

1过表达载体构建

目的基因扩增：根据载体pCAMBIA1300-35S的图谱设计KpnI-XbaI为插入位点并合成引物，引物序列为：

上游引物：P1226F:5’-GGGGTACCATGACTTTAATTATTAGATG-3’(保护碱基-KpnI-扩增引物)；

下游引物：P1254R:5’GCTCTAGATTAATTCAGAAAAATATCATCT-3’(保护碱基-XbaI-扩增引物)，使用高保真酶扩增得到目的片段,扩增体系见表2。

表2 PCR扩增体系

PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸1min10s，30个循环；68℃延伸5min。PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶电泳，电压150V，电泳15min，照相记录电泳结果，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带(图4)。用胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行。

2超表达载体的构建

1)将用KpnI-XbaI酶切的目的基因与同样用KpnI-XbaI酶切的载体1300-35S进行体外连接，连接体系见表3：

表3目的基因与pPic9K重组质粒连接体系

吸打混匀，离心后加入矿物油；16℃连接2h；连接完后放入4℃冰箱中保存过夜。

2)连接产物的转化

a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μl的感受态细胞，放于冰上，预冷10min；

b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μl的感受态细胞(冰上操作)；

c.加入10μl的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；

d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；

e.吸500μl不含Kan+的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；

f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rpm离心5min，弃上清300μl，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Kan+的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；37℃恒温培养箱中培养16～20h。

使用正向引物：H177-1AFX:5’-CGCGAGCAAGGCCGAAGC-3’，反向引物：H177-1R:5’-CATATTTGAAAGTCTTCCCAC-3’进行PCR检测，片段大小约为518bp(图5)。

3拟南芥转化

1)农杆菌转化：-80℃冰箱取出感受态GV3101，冰上解冻2-3min加入3-5ul重组质粒，冰上放置5min。将EP管置于液氮中速冻1min，37℃水浴5min，冰浴2min，加入800ul无抗液体LB培养基，28℃摇床150rpm/min培养3h。8000rpm/min离心1min，弃上清600ul后，悬浮，涂于固体LB培养基上(含50ug/mlKan和50ug/ml利福平)，28℃培养箱倒置培养48h。挑取单克隆，使用基因特异性引物及载体通用引物PCR鉴定(引物序列及PCR程序见转基因植株阳性苗鉴定部分)。

2)拟南芥种植：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合基质(2：1)作为拟南芥种植土壤。选择直径9cm的花盆，每盆播种50-100颗。播种以后浇水并覆膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。拟南芥室生长条件为光照强度为2000-3000lx，光照时间14h/day，湿度40-60％。

3)移栽：播种10-15天，待拟南芥幼苗长至四叶时期开始移栽，每盆4-5棵。

4)去顶：移栽后每3天浇一次水，每两周添加一次营养液，约25-30天后，在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。

5)配制浸染液：在5％的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD＝0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染2-3个花盆(9cm)植株。在浸染之前加入表面活性剂silwet-77至浓度0.05％(500ul/L)。

6)浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中20-30s，同时轻轻旋转。

7)暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。

8)浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。

9)种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。

10)转基因种子筛选：在含有潮霉素抗生素的平板上培养浸染后所得种子。40mg的种子大约200颗于含潮霉素10-50μg/ml的0.5×MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子。成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。

11)转基因植株转土栽培：转基因种子在MS+潮霉素平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。具体方法如下：取阳性植株叶片进行基因组DNA的提取并使用正向引物：H177-1R:5’-ATTTGAAAGTCTTCCCAC-3’反向引物：NOS-R:5’-GATAATCATCGCAAGACCGG-3’进行PCR验证(图6)。PCR扩增体系如表4，PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

表4扩增体系

待T3代转基因植物生长至3对叶时期，分别对拟南芥转基因植株和未转基因野生型拟南芥植株于加入PEG的培养基模拟干旱胁迫处理10天，测定叶片失水率、脯氨酸和MDA含量。

如图7所示，结果表明，转DgZFP125基因的拟南芥抗旱性显著优于野生型拟南芥。

待T3代转基因植物生长至3对叶时期，分别对拟南芥转基因植株和未转基因野生型拟南芥植株于加入250mMNaCl模拟盐胁迫处理14天。

如图8所示，结果表明，转DgZFP125基因的拟南芥耐盐性显著优于野生型拟南芥。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125及其表达载体和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1137

<212> DNA

<213> 鸭茅锌指蛋白基因(DgZFP125)

<400> 1

atgggagaag gcgattcgga cggcggtggc ggcgtcggcg cgagcaaggc cgaagcggcg 60

gcggggcctg cgaggaggga tatcaggcgg tacaagtgcg agttctgcgg cgtcgttcgt 120

tccaagaagc ggctgatccg agaccacgtc cttgaacacc ataaggatga actggatgat 180

ttggatgact acacggaaga cggtggtggt ggtgtgccgc acagagtgac cagccatggt 240

tgcgaggagt gtggcgcgag gttcaggaag cccgcgcatc tgaagcagca tatgcagagc 300

cattcgcccg agaaaccctt tgcctgccat gtagacggtt gccctttcag ctatagcagg 360

aaggaccatt tgaaccgcca tctacttact catcaaggaa aactatttat atgccctgtg 420

gaagaatgca atcgcaagtt cagtaccaag ggtaatatgc agagacatgt tcaggaaatt 480

cataaggata gctatcagtg tggaagcaag aaagagttca tctgtccaga ggatgactgt 540

gggaagactt tcaaatatgc ttccaagtta cagaaacacg aggaatcaca tgtcaaattg 600

gattactctg aagttatctg ctgtgaaccc ggctgtatga agacctttag taacgtggaa 660

tgcctcaagg cacacaacca ttcgtgtcat cgatacgttc agtgtgatgt ctgtggcact 720

aaacagctaa agaagaactt taagcgtcat cagcgaatgc atgatggttc atgtgtcact 780

gagaggatta aatgccactt cgaggactgc aagtgctcat tttcaaagaa atcaaatttg 840

gacaagcaca ttaaggcagt tcatgagcag agcagaccct tcatatgtgg atactctgga 900

tgcggcaaga agttttctta caagcatgtg agggacaatc atgagaaatc tagtgctcat 960

gtgcactttg agggcgattt catggaggct gatgatcaac tacgaccgca tccaggtgga 1020

cgcaagagga aggccatttc tgtcgaaact ttgatgcgaa agagggcagc tgctcctgat 1080

gatgcgcatg cctttgatga tggaactgcg tatctgagat ggcttctgtc agcttga 1137

<210> 2

<211> 378

<212> PRT

<213> 鸭茅锌指蛋白(DgZFP125)

<400> 2

Met Gly Glu Gly Asp Ser Asp Gly Gly Gly Gly Val Gly Ala Ser Lys

1 5 10 15

Ala Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Arg Arg Asp Ile Arg Arg Tyr Lys

20 25 30

Cys Glu Phe Cys Gly Val Val Arg Ser Lys Lys Arg Leu Ile Arg Asp

35 40 45

His Val Leu Glu His His Lys Asp Glu Leu Asp Asp Leu Asp Asp Tyr

50 55 60

Thr Glu Asp Gly Gly Gly Gly Val Pro His Arg Val Thr Ser His Gly

65 70 75 80

Cys Glu Glu Cys Gly Ala Arg Phe Arg Lys Pro Ala His Leu Lys Gln

85 90 95

His Met Gln Ser His Ser Pro Glu Lys Pro Phe Ala Cys His Val Asp

100 105 110

Gly Cys Pro Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Asp His Leu Asn Arg His Leu

115 120 125

Leu Thr His Gln Gly Lys Leu Phe Ile Cys Pro Val Glu Glu Cys Asn

130 135 140

Arg Lys Phe Ser Thr Lys Gly Asn Met Gln Arg His Val Gln Glu Ile

145 150 155 160

His Lys Asp Ser Tyr Gln Cys Gly Ser Lys Lys Glu Phe Ile Cys Pro

165 170 175

Glu Asp Asp Cys Gly Lys Thr Phe Lys Tyr Ala Ser Lys Leu Gln Lys

180 185 190

His Glu Glu Ser His Val Lys Leu Asp Tyr Ser Glu Val Ile Cys Cys

195 200 205

Glu Pro Gly Cys Met Lys Thr Phe Ser Asn Val Glu Cys Leu Lys Ala

210 215 220

His Asn His Ser Cys His Arg Tyr Val Gln Cys Asp Val Cys Gly Thr

225 230 235 240

Lys Gln Leu Lys Lys Asn Phe Lys Arg His Gln Arg Met His Asp Gly

245 250 255

Ser Cys Val Thr Glu Arg Ile Lys Cys His Phe Glu Asp Cys Lys Cys

260 265 270

Ser Phe Ser Lys Lys Ser Asn Leu Asp Lys His Ile Lys Ala Val His

275 280 285

Glu Gln Ser Arg Pro Phe Ile Cys Gly Tyr Ser Gly Cys Gly Lys Lys

290 295 300

Phe Ser Tyr Lys His Val Arg Asp Asn His Glu Lys Ser Ser Ala His

305 310 315 320

Val His Phe Glu Gly Asp Phe Met Glu Ala Asp Asp Gln Leu Arg Pro

325 330 335

His Pro Gly Gly Arg Lys Arg Lys Ala Ile Ser Val Glu Thr Leu Met

340 345 350

Arg Lys Arg Ala Ala Ala Pro Asp Asp Ala His Ala Phe Asp Asp Gly

355 360 365

Thr Ala Tyr Leu Arg Trp Leu Leu Ser Ala

370 375

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgactttaa ttattagatg tgtt 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaattcaga aaaatatcat c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cactttgagg gcgatttcat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcatcaaag tttcgacaga 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctgaccgtt agacttgaga agg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttgagctta ccctcagact cct 23

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttggtaccga gctcggatcc atgactttaa ttattagatg tgttaacatg tc 52

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acatgatgcg gccctctaga ttaattcaga aaaatatcat ctaattcaac a 51

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggggtaccat gactttaatt attagatg 28

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctctagatt aattcagaaa aatatcatct 30

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgcgagcaag gccgaagc 18

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catatttgaa agtcttccca c 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atttgaaagt cttcccac 18

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gataatcatc gcaagaccgg 20

Claims

1.一种鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含权利要求1所述的鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，通过将鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125插入至pMD18-T，得到表达载体pMD18T-DgZFP125。

5.一种针对鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125的超表达载体，其特征在于，以pMD18T-DgZFP125为模板，用引物P1226F和P1254R扩增得到目的基因，将用KpnI-XbaI酶切的目的基因与载体pCAMBIA1300-35进行连接，即得超表达载体；所述引物P1226F和P1254R为：

P1226F：5’-GGGGTACCATGACTTTAATTATTAGATG-3’；

P1254R：5’GCTCTAGATTAATTCAGAAAAATATCATCT-3’。

6.权利要求1所述的鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125在鸭茅抗旱性和耐盐性基因工程中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将DgZFP125在鸭茅中过表达，提高鸭茅的抗旱性和耐盐性。