KR20110028719A

KR20110028719A - 벼 유래 징크핑거 단백질 오에스지에프투, 오에스지에프투 유전자, 재조합벡터, 형질전환체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20110028719A
Application number: KR1020090086284A
Authority: KR
Inventors: 이정숙; 윤인선; 이강섭; 윤웅한
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2009-09-14
Filing date: 2009-09-14
Publication date: 2011-03-22
Also published as: KR101166706B1

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산서열을 포함하는 징크핑거 단백질 및 서열번호 1의 아미노산서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 서열번호 2의 염기서열중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 염기서열로 표시되는 DNA 분자, 재조합벡터, 식물형질전환체 및 이의 제조방법을 제공한다.

벼, CCCH type zinc finger 유전자, 형질전환체, 내염성, 왜소화, dwarf, 등숙지연

Description

벼 유래 징크핑거 단백질 오에스지에프투, 오에스지에프투 유전자, 재조합벡터, 형질전환체 및 이의 제조방법{A rice zinc finger protein OsZF2, OsZF2 gene, recombinant vector, transgenic plant, and its preparation method}

본 발명은 벼에서 분리된 징크핑거 단백질, 유전자, 재조합 벡터, 형질전환체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 벼에서 저온과 염 처리시 특이적으로 발현이 유도되는 징크핑거 유전자를 분리하고 유전자 기능 확인을 위하여 상기 유전자를 벼에 과다발현 시킨 형질전환체의 분석 결과 내염성 조건에서 생육상태가 대조구에 비해 우량하고 영양생장기에는 형질전환벼의 신장이 작은 왜소화 현상을 보이며 이에 따라 출수가 지연되고 등숙기에는 신장의 차이는 없으나 출수지연에 따른 등숙지연을 보임에 따라 벼에서 환경스트레스와 발달단계에 관여하여 내염성 및 기타 환경저항성 작물개발에 직접, 간접적으로 이용할 수 있는 징크핑거 단백질, 유전자, 재조합 벡터, 형질전환체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

벼에서 저온스트레스는 온대성 기후에서 급격한 기상이변과 고랭지 지역 등 에서 벼 생산과 직결되는 주요한 자연재해 중의 하나로서 유묘기 내냉성 및 수잉기 내냉성은 벼 육종의 중요한 목표중의 하나이다. 일반적으로 한발, 고염 및 저온과 같은 환경 스트레스는 공통적인 대응 메카니즘이 있는 것으로 알려져 있으며, 다양한 환경스트레스간에 유전자 발현을 공통적으로 조절하는 신호전달 경로가 있는 것으로 보고되고 있다 (Rabbani et al. Plant Physiol. 2003 133:1755). 식물체가 이러한 스트레스에 노출이 되면 많은 유전자의 발현이 유도되어 세포 손상을 보호하거나 신호전달에 관련된 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려졌다 (Yamaguchi-Shinozaki et al. Annu Rev Plant Biol 2006 57:781). 애기장대에서는 스트레스에 의해 유도되는 유전자들이 많이 알려져 있으며 대표적인 내재해성 유전자로서 CBF/DREB는 AP2/ERF 그룹의 전사인자로서 저온에 의해 발현이 유도되며 과발현 형질전환체는 내냉성 뿐만 아니라 내염, 내건성을 나타내는 것으로 보고되었다 (Maruyama et al. Plant J 2004 38:982). 스트레스 신호전달에 관련된 AP2/ERF 전사인자에 관한 연구뿐만 아니라 bZIP 단백질, NAC domain 단백질, 징크핑거 단백질 등이 또한 스트레스 내성을 증진 시키는 전사인자로서 알려져 있으며 벼에서 저온처리에 의해 발현이 유도되는 OsCOIN 유전자는 RING 징크핑거 단백질로서 프롤린(proline) 함량을 증가시켜 저온, 건조, 염해 등에 저항성을 증진시키는 것으로 알려 졌다 (Liu et al. Planta 2007 226:1007).

징크핑거 단백질은 아연 이온과 결합하는 아미노산의 배열에 따라 여러 그룹으로 나뉘며 전사인자로서 역할을 수행하거나 단백질 등 다른 분자와의 상호작용에 의해 세포내에서 중요한 생물학적 과정을 수행한다. 현재까지 식물체에서 알려진 징크핑거 그룹은 RING-finger, ERF, WRKY, DOF, LIM등이 알려져 있으며 대부분은 DNA-결합 전사인자로서 역할을 하거나 단백질-단백질 상호작용에 의해 유전자발현을 조절하는 것으로 그 기능이 알려져 있다 (Wang et al. BMC Genomics 2008 9:44). CCCH type 징크핑거 단백질은 사람과 효모에 이르기까지 많은 그룹을 차지하고 있으며 단백질 도메인 구성 및 유전자구조에 따라 여러 가지 subfamily로 나뉘어져 있다. CCCH type 징크핑거 단백질은 동물에서는 RNA 프로세싱과 관련된 RNA 결합 단백질로 추측되며 단백질 안정화와 초기 배 발달에서 암컷의 수정 능력과 세포의 운명에 관여 하는 등 그 기능이 많이 알려 졌으나 식물체에서는 일부분만 그 기능이 알려져 있다 (Addepalli et al. FEBS Lett 2008 582:2577). 애기장대에서 알려진 PEI1은 배아 특이 CCCH 징크핑거 단백질로써 배발생(embryogenesis)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌으며 (Li et al. 1998), 벼에서 분리된 OsDOS는 핵에 위치하는 단백질로써 발달 단계 시그널에 관여하여 낙엽(leaf senescence)을 지연시키는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Kong et al. Plant Physiol 2006 141:1376).

이와 같은 연구결과에도 불구하고 아직 저온 유도 및 내염성 등의 재해저항성을 증진시키면서, 식물발달과 관련된 왜소화 현상을 동시에 보여주는 신규한 기능의 유전자는 많이 알려져 있지 않아 환경저항성 작물개발에 직접, 간접적으로 이용할 수 있으며 또한 식물 발달과 생육에 관련되어 특정 농업 형질과 관련된 기술의 개발에 유용한 이들 기능 단백질 및 유전자의 개발은 절실하게 요구되고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같이 종래 기술이 가지는 이러한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 저온 및 염에 의해 그 발현이 유도되며, 작물 발달의 조절에 관여할 수 있어 새로운 식물형질전환체의 제조에 유용한 징크핑거 단백질을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 저온 및 염에 의해 그 발현이 유도되며, 작물 발달의 조절에 관여할 수 있어 새로운 식물형질전환체의 제조에 유용한 DNA 분자를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터 및 이를 숙주세포에 형질전환시키고, 동 형질전환체를 식물체에 적용하여 얻어지는 식물형질전환체 및 이의 제조방법을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) 서열번호 1의 아미노산서열을 포함하는 징크핑거 단백질.

(2) 서열번호 1의 아미노산서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자.

(3) 징크핑거 단백질을 암호화하며, 이하의 서열군에 의해 선택되는 폴리뉴 클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 또는 단리된 DNA 분자：

a) 서열번호 2의 염기서열중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열,

b) a)의 DNA에 대하여 전장에 걸쳐 70％ 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열, 혹은

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오티드 서열에 스트린전트한 조건하에 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및

d) a), b) 또는 c) 서열과 상보적인 서열 또는 RNA 서열.

(4) 제 2항 또는 제 3항 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터.

(5) 제 4항 기재의 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포.

(6) 제 5항에 있어서, 숙주세포는 아그로박테리움 속균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.

(7) 제 5항 기재의 세포로 형질전환시켜 얻을 수 있는 식물형질전환체.

(8) 제 6항에 있어서, 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 식물형질전환체.

(9) 제 4항 기재의 재조합벡터를 식물체 세포내로 도입시켜 내염성 증진 및 발달이 조절된 식물체의 제조방법.

상기 실시 예에서 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 저온과 염 처리에 특이적으로 발현이 유도되고 캘러스와 이삭에서 발현이 증진되는 벼 OsZF2 유전자를 분리하였다. 상기유전자는 CCCH type의 징크핑거 모티프를 함유하는 단백질을 코딩하는 유전자로서 상기 유전자를 형질전환에 의해 벼에 과다발현 시킨 형질전환체는 내염성을 증진시키고 영양생장기에는 신장이 왜소화하고 출수가 지연되며 등숙기에는 초장이 회복되는 현상을 확인하였다. 본 발명은 OsZF2 징크핑거 단백질 유전자가 환경스트레스와 식물발달에 관여함을 보여줌으로써 유전자 도입에 의해 새로운 형질을 보유한 작물 개발에 이용될 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 징크핑거 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 징크핑거 단백질(OsZF2라 명명)은 벼에서 분리되어지고, 식물체 내에서 저온 및 염에 의해 그 발현이 유도되며, 작물 발달의 조절에 관여한다.

본 발명은 또한 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 상기 DNA 분자의 예로 서열번호 2의 염기서열 중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 DNA 분자를 들 수 있다. 본 발명에서는 상기 서열번호 2의 염기서열 중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 DNA 분자와 실질적으로 동일한 염기서열을 포함한다.

서열번호 2에 나타나는 염기서열중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 염기서열과 「실질적으로 동일한 염기 서열」로서는, 서열번호 2에 나타나는 염기 서열중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 염기서열과 약 70%이상, 바람직하게는 약 80%이상, 한 층 더 바람직하게는 약 90%이상, 특히 바람직하게는 약 95%이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상의 상동성을 가지는 염기서열 등을 들 수 있다.

서열번호 2에 나타난 염기 서열중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 염기서열과 실질적으로 동일한 염기 서열은 징크핑거 단백질의 발현을 유도하는 능력을 가지는 것이다. 그러한 능력은 성질적으로(예, 생리학적으로, 또는 약리학적으로) 동질인 것을 나타내지만, 발현 유도의 정도 또는 단백질의 분자량 등의 양적 요소에는 다소의 차이, 예를 들면, 활성에 대해서는, 약 0.01~100배, 바람직하게는 약 0.1~10배, 보다 바람직하게는 0.5~2배의 범위내의 오차를 허용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 DNA 분자로서는, 예를 들면, 서열번호 2에 나타나는 염기서열중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 염기서열을 함유 하는 DNA 분자, 혹은 실질적으로 동일한 염기 서열을 가지는 DNA 분자와 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈 하는 염기서열을 포함한다. 서열번호 2에 나타나는 염기 서열중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 염기서열과 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈 할 수 있는 DNA 분자로서는, 예를 들면, 서열번호 2에 나타나는 염기서열중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 염기서열의 상보적인 서열과 약 50%이상, 바람직하게는 약 60%이상, 한층 더 바람직하게는 약 70%이상, 특히 바람직하게는 약 80%이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성을 가지는 염기서열을 함유 하는 DNA 분자 등이 이용된다. 하이브리다이제이션은 자체 공지의 방법 혹은 거기에 준하는 방법, 예를 들면, 모리큘라클로닝(Molecular Cloning) 제2판(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)에 기재된 방법 등에 따라서 행할 수 있다. 또, 시판되는 라이 브러리를 사용하는 경우, 하이브리다이제이션은 첨부된 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다. 하이브리다이제이션은 바람직하게는 스트린전트한 조건에 따라 행할 수 있다. 스트린전트한 조건이란, 예를 들면, 나트륨 농도가 약 19~40 mM, 바람직하게는 약 19~20 mM으로, 온도가 약 50~70℃, 바람직하게는 약 60~65℃의 조건을 나타낸다. 특히, 나트륨 농도가 약 19 mM로 온도가 약 65℃의 경우가 바람직하다.

형질전환과정은 식물체의 형질전환체 제조공정에서 통상적으로 사용되는 어떠한 시스템도 이용되어질 수 있다. 이러한 기술로서는 특히 이들에 한정되지 않지만 칼슘/폴리에틸렌 글리콜법을 이용한 원형질체의 형질전환법, 전기 천공법 및 미량주사법 또는 (코팅된)입자 충격투입법 등이 있다.

이와 같은 소위 직접 유전자 형질전환법 이외에도 바이러스 벡터(예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)로부터 얻음) 및 박테리아 벡터(예를 들면, 아그로박테리움속으로부터 얻음) 등의 벡터를 포함하는 형질전환 시스템이 널리 이용될 수 있다. 또 선택 및/또는 스크리닝후, 형질전환된 원형질체, 세포 또는 식물부분을 공지의 방법에 따라 완전한 식물로 재생시킬 수 있다(Horsch, R. b. et al., 1985). 형질전환법 및/또는 재생기술의 선택은 본 발명에서 중요한 것은 아니다.

벼를 포함한 단자엽 작물의 형질전환 및 재생은 표준공정은 아니나, 최근의 과학적 진보에 따라 원리적으로 단자엽 식물도 형질전환이 가능하며 형질전환 세포로부터 생식 능력이 있는 트랜스제닉 식물이 재생될 수 있음이 밝혀졌다. 이들 식물에 유전물질을 도입시키는 효과적인 방법과 더불어 이들 식물의 재생 조직배양 시스템의 개발로 형질전환은 더욱 용이하게 되었다. 최근에 단자엽 식물의 형질전환을 위하여 채택되는 방법은 체외 배양체 또는 현탁세포의 미량투사 충격투입법 및 직접적 유전자 흡수법 또는 원형질체의 전기 천공법 등이다. 또한 이들 방법은 쌍자엽 식물의 형질전환 및 재생에도 적용될 수 있다.

종자에서 특정한 목적으로 사용하기 위하여 재조합 유전자를 높게 또는 적절한 수준으로 발현시키는 것으로 이미 공지된 조절서열이 본 발명에서도 사용될 수 있다. 이와 같은 조절서열은 식물 또는 식물 바이러스로부터 얻어지거나 또는 화학적 방법으로 합성될 수 있다. 이러한 조절서열은 종자에서 전사를 지휘하는 프로모터를 들 수 있다. 발현율을 높이기 위한 프로모터로서는 특히 이들에 한정되지 않지만 종자-특이 유전자의 프로모터, 특히 브라시카 나퍼스의 CruA 프로모터와 같은 저장 단백질 유전자의 프로모터(Ryan et al., 1989) 또는 구조적 발현 유전자의 프로모터 예컨대 CaMV(Cauliflower Mosaic Virus)의 35S 프로모터(Guilley et al., 1982) 등이 있다. 다른 조절서열은 종결서열 및 폴리아데닐화 시그날 그리고 식물에서 이와 같은 기능을 하는 모든 서열 등이 여기에 포함될 수 있다. 구체적인 예로서는 아그로박테리움 투마파시엔의 노팔린 신타아제 유전자의 3'측위 영역 또는 브라시카 나퍼스의 CurA유전자의 3'측위 영역 등이 있다. 또한 조절서열에서는 CaMV의 35S프로모터에서 발견되는 것과 같은 인핸서서열, AIMV(Alfalfa Mosaic Virus) RNA4의 리더 서열과 같은 mRNA안정화 서열(Brederode et al., 1980)또는 이와 같은 기능을 하는 기타 서열 등이 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 적합한 유전자 구성체의 모든 부분(프로모터, 조절서열, 안 정화서열, 시그날 서열 또는 종결서열)은 필요하다면 공지 기술을 사용하여 이들의 조절 특성이 변하도록 변이 될 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

실시예 1: OsZF2 유전자의 아미노산서열 및 단백질의 구조적 특징

저온처리 cDNA 은행으로부터 분리된 EST를 이용하여 reverse Northern hybridization 방법을 이용하여 저온에 특이적으로 반응하는 다수의 유전자를 분리하였다. 그중 LS333으로 최초에 명명된 유전자는 NCBI의 BlastX program을 이용하여 분석한 결과 CCCH type 징크핑거 단백질을 암호화하는 유전자로 밝혀짐에 따라 OsZF2 (Oryza sativa Zinc Finger 2)로 명명하였다. 완전 염기서열을 결정한 결과 polyA를 함유하며 크기는 1220bp 로 구성되어 있고 단백질을 암호화 하는 부위는 57bp부터 821bp로서 ORF는 255개 아미노산으로 구성된 28.3 kD의 단백질을 암호화하였다 (도 1a). OsZF2는 단일 엑손으로 구성되어 있으며 염색체 5번 (LOC_Os05g45020)에 위치해 있다. NCBI의 BlastX 상동성 결과 OsZF2는 2개의 CCCH type 징크핑거 모티프를 함유하고 있으며 C-X₁₀-C-X₅-C-X₃-H와 C-X₅-C-X₄-C-X₃-H로 이루어져 있다. 첫 번째 징크핑거 모티프의 앞 부위에 2개의 시스테인과 2개의 히스티딘 아미노산으로 구성된 C-X₅-H-X₄-C-X₃-H 서열이 존재하며 이러한 CHCH consensus 모티프는 아직 동정되지 않은 독특한 징크핑거 도메인으로 보고되어 있다. OsZF2는 징크핑거 도메인 부위에서 상동성 분석 결과 애기장대의 PEI1 단백질과 63%, leaf senescence를 지연시키는 OsDOS 단백질과는 70%의 동질성을 보이고 있다(도 1b). OsZF2 유전자는 NCBI GenBank에 EU847521로 등록되었다.

실시예 2: OsZF2 유전자의 발현양상 분석

수경 재배한 벼 유묘에서 RNA를 추출, 전기영동으로 분리하여 나일론막(nylon membrane)에 블롯팅(blotting) 한 후 ³²P로 표지한 OsZF2 (LS333) cDNA를 이용하여 Northern hybridization을 수행하였다. OsZF2 유전자의 발현을 분석하기 위해, 2주간 키운 벼 유묘에서 ABA (100uM: A), 저온 (4℃: S), 저온과 ABA 동시처리 (cold/ABA: A/S), NaCl (100mM: T) 처리 후 RNA를 분리하였다. OsZF2 유전자의 발현양상을 보여주는 노던블롯 분석 결과, 저온 처리에 의해 이 유전자의 발현이 약하게 유도되고 ABA와 저온 동시처리 시 그리고 염 스트레스에 의해서 발현이 유도됨에 따라 외부 환경스트레스에 의해 특이적으로 발현하는 유전자로 확인되었다 (도 2a). 저온처리 시간에 따른 OsZF2유전자 발현을 분석한 결과 기저수준에서는 발현이 아주 약하며 저온처리 6시간부터 발현이 유도되어 12시간 까지는 발현이 증가되며 그 후 발현이 다소 감소하며 저온 처리 후 3일간 정상 온도에서 키운 후에는 기저수준으로 되돌아감에 따라 저온에서 특이적으로 발현하는 유전자로 확인되었다. 조직부위별 OsZF2 유전자 발현을 확인하기 위하여 뿌리 (R)와 캘러스 (C) 상태에서 RNA를 분리하고, 수잉기 (D1)에 잎 (L)과 이삭 (SP), 출수기 (D2) 에 잎 (L)과 이삭 (P)을 무 처리 와 저온처리 한 후 RNA를 분리하여 Northern hybridization을 수행하였다 (도 2b). OsZF2 유전자는 캘러스상태에서 발현이 가장 강하고 뿌리와 잎에서는 유전자 발현을 검출하기 어려웠으며 출수기 (D2)의 이삭에서는 발현이 증가 되었으며 수잉기 (D1)에는 저온처리 이삭에서 발현이 유도되었다. 결론적으로 OsZF2 유전자는 유묘 상태에서 저온과 염에 의해 발현이 유도되고 기저수준에서의 발현은 극히 미약하여 대부분의 조직에서는 검출이 안 되었으나 캘러스와 이삭에서는 발현이 증가되며 수잉기 저온처리 이삭에서 발현이 유도되는 유전자이다.

실시예 3: OsZF2 유전자 과발현 형질전환용 벡터 제작 및 벼 형질전환

OsZF2 유전자를 벼에서 과발현 시키기 위하여 CaMV35S 프로모터를 사용하였고 형질전환체 선발은 하이그로 마이신 항생제 저항성 유전자를 사용하여 벼 형질전환용 벡터를 작성하였다. 먼저 OsZF2 유전자를 클로닝하기 위하여 pBluescript 벡터에 삽입된 LS333 유전자를 BamHI과 KpnI으로 절단하여 1.2kb 크기의 밴드를 분리한 후 pCAMBIA1300 유래의 식물발현 벡터의 35S 프로모터와 Nos 터미네이터 사이의 BamHI과 KpnI위치에 삽입하여 구축된 벡터를 pCAM333이라 명명하였다 (도 3). pCAM333 운반체를 아그로박테리움에 도입한 후 낙동벼를 이용하여 배상체 캘러스를 유기하여 공동배양 하였다. 선발된 캘러스는 cefotaxime과 hygromycin이 첨가된 배지에 치상하여 재분화를 유도하였으며 재분화된 식물체는 순화과정을 거쳐 온실에 서 재배되었다.

실시예 4: OsZF2 과다발현 homozygous 형질전환체 선발

재분화된 형질전환체에서 OsZF2 유전자가 벼 염색체에 삽입된 것을 확인하기 위하여 OsZF2 유전자에서 유전자 특이 포워드 프라이머(forward primer)를 제작하고 Nos 터미네이터 부위에서 리버스 프라이머(reverse primer)를 작성하여 PCR 분석을 실시하여 벼에 내재적으로 존재하는 유전자와 구별하였다. 벼 형질전환체 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 PCR 검정을 한 결과 대조구인 낙동벼에서는 유전자 단편이 증폭되지 않았으나 형질전환체에서는 positive control로 사용된 pCAM333과 같이 모두 650bp 크기의 OsZF2 유전자 단편이 증폭된 것을 확인되었다 (도 4). 도입 유전자에 대한 homozygous 계통을 선발하기 위하여 40립 이상의 T2 종자를 하이그로마이신 저항성을 검정한 결과 낙동벼의 경우 발아는 하였으나 거의 자라지 못하고 형질전환체는 정상적으로 자라는 것을 관찰할 수 있었다(도 4). 검정한 계통 중에서 치상한 40립의 종자 모두 저항성을 나타내어 정상적으로 자라는 homozygous 계통을 선발하였다.

실시예 5: OsZF2 형질전환체의 발현 분석

선발된 T2 형질전환벼에서 OsZF2 유전자가 항상성 있게 과발현 되는 지를 확인하기 위하여 total RNA를 분리하여 OsZF2 유전자를 프로브로 하여 노던 분석을 하였다. 대조구에서는 발현이 되지 않았으나 CaMV35S 프로모터와 융합되어 도입된 OsZF2 유전자는 형질전환체에서 발현이 되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

실시예 6: OsZF2 과발현 형질전환체의 내염성 증진 효과

OsZF2 과발현 형질전환벼에서 OsZF2 유전자 발현이 강하게 나타난 LS333-8 계통에서 homozygous 라인을 선발하여 스트레스 저항성을 검정하기 위하여 MS 배지와 100mM NaCl을 함유한 MS 배지에서 일주일간 생육시킨 후 23개체의 총 중량과 지상부 잎과 뿌리의 길이를 각각 측정하여 평균값을 구하였다 (도 6). 무처리 상태에서 OsZF2 과발현 형질전환벼와 대조구인 낙동벼에서 생육과 중량의 차이는 크게 없으나 100mM NaCl을 함유한 배지에서는 OsZF2 과발현 형질전환벼가 낙동벼보다 생육이 양호한 것으로 나타나 상기 결과는 OsZF2가 과발현된 형질전환 벼의 내염성이 증진되었음을 증명한 것이다. 징크핑거단백질 유전자는 스트레스내성을 증가시키는 전사인자로 알려져 있으므로 OsZF2도 저온과 염에 의해 발현이 유도되는 유전자로서 환경스트레스에 관련되어 있음을 시사한다.

실시예 6: OsZF2 형질전환체의 표현형 분석

GMO 포장에 이식하기 위하여 형질전환 벼와 대조구인 낙동벼를 모판에서 4주 간 생육을 시켰으며 유묘기 성장에는 35S:OsZF2 형질전환 벼와 대조구인 낙동벼 두 품종 간에 별다른 차이가 없었다. 그러나 이앙 후 8주후까지 35S:OsZF2 형질전환체는 생육이 지연되어 왜소화 현상을 보여주며 또한 출수도 낙동벼 보다 열흘 정도 지연되는 현상을 나타내었다 (도 7). 그러나 출수 후 등숙기에는 낙동벼와 비슷한 초장을 유지하며 생육지연과 관련하여 등숙시기도 낙동벼와 비교하여 지연되는 것을 관찰할 수 있었다. Kong 등 (2006)이 보고한 벼에서 분리된 OsDOS 유전자는 OsZF2와 같이 2개의 CCCH type의 징크핑거 도메인을 함유하고 있는 유전자로서 잎과 이삭에서 발현이 높으며 leaf senescence를 지연시키는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 이는 OsZF2 유전자가 잎에서 발현이 되지 않고 이삭에서 발현이 증가하는 것과는 약간 다른 양상을 보여주고 있으나 왜소화 현상을 보이는 성장 지연과 이에 따른 출수지연 및 등숙 지연 등 징크핑거 단백질로써 성장 발달에 영향을 주는 것으로 확인된다.

상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1a는 OsZF2를 암호화 하는 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열 분석결과.

도 1b는 OsZF2의 징크핑거 도메인 상동성 부위 분석결과.

도 2a는 OsZF2 유전자의 저온 및 염 처리 시 유도 발현양상을 보여주는 노던 블롯 분석 결과 사진.

도 2b는 OsZF2 유전자의 캘러스와 이삭에서 발현을 보여주는 노던 블롯 분석 결과 사진.

도 3은 OsZF2 유전자 벼 과발현 형질전환용 운반체 모식도.

도 4는 OsZF2 형질전환체 확인을 하기 위한 PCR 증폭 단편 전기영동 사진 및 형질전환체의 하이그로마이신 저항성 결과 사진.

도 5는 OsZF2 과발현 형질전환체 노던 블롯 분석 결과 사진.

도 6은 OsZF2 과발현 형질전환벼의 내염성 증진을 보여주는 지상부 잎 길이 및 총 중량 그래프 및 사진.

도 7은 OsZF2 유전자 과발현 형질전환벼의 왜소화 현상과 등숙지연 사진.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> A zinc finger protein, a gene encoding the protein, and its transgenic plant comprising the same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 255 <212> PRT <213> rice plant <400> 1 Met Ala Ser Arg Glu His Leu Leu Leu Asp Pro Ala Ala Leu Ala Val 1 5 10 15 Ser Trp Ala Asp Pro Ala Ala Val Glu Ile Pro Pro Glu Leu Leu Ala 20 25 30 Ala Leu Gly Glu Tyr Leu Ser Ala Arg Arg Ser Asp Gly Glu Ala Glu 35 40 45 Ala Asp Ala Glu Ala Glu Ala Asp Asp Glu Phe Met Met Tyr Glu Phe 50 55 60 Lys Val Arg Arg Cys Ala Arg Ala Arg Ser His Asp Trp Thr Ala Cys 65 70 75 80 Pro Tyr Ala His Pro Gly Glu Ala Ala Arg Arg Arg Asp Pro Arg Arg 85 90 95 Val Ala Tyr Thr Gly Glu Pro Cys Pro Asp Phe Arg Arg Arg Pro Gly 100 105 110 Ala Ala Cys Pro Arg Gly Ser Thr Cys Pro Phe Ala His Gly Thr Phe 115 120 125 Glu Leu Trp Leu His Pro Ser Arg Tyr Arg Thr Arg Pro Cys Arg Ala 130 135 140 Gly Val Ala Cys Arg Arg Arg Val Cys Phe Phe Ala His Thr Ala Gly 145 150 155 160 Glu Leu Arg Ala Gly Ser Lys Glu Asp Ser Pro Leu Ser Leu Ser Pro 165 170 175 Lys Ser Thr Leu Ala Ser Leu Trp Glu Ser Pro Pro Val Ser Pro Val 180 185 190 Glu Gly Arg Arg Trp Val Asp Gly Ile Asp Glu Cys Asp Ala Asp Ala 195 200 205 Glu Met Glu Glu Leu Met Phe Ala Met Arg Glu Leu Gly Leu Arg Lys 210 215 220 Val Arg Pro Ser Ala Ser Ser Val Thr Pro Val Leu Pro Pro Val Thr 225 230 235 240 Asp Glu Asp Gly Pro Asp Phe Gly Trp Val Ser Glu Leu Val Met 245 250 255 <210> 2 <211> 1220 <212> DNA <213> rice plant <400> 2 tttttcttcg gtggtgttgg gagtggacaa ggtagtgtga gtgagtagtg agcaccatgg 60 cgagccgaga gcacctcctg ctcgacccgg cggcgctggc cgtctcttgg gctgaccccg 120 ctgcggtgga gatcccgccc gagctcctcg ccgcgctggg tgagtacctg tccgccaggc 180 gtagcgacgg ggaggccgag gccgacgccg aggcggaggc tgatgatgag ttcatgatgt 240 acgagttcaa ggtgcggcgg tgcgcgcggg cgcggagcca cgactggacg gcgtgcccgt 300 acgcgcaccc tggcgaggcc gcgaggcggc gtgacccgag gcgcgtggcg tacacgggcg 360 agccgtgccc ggacttccgc cgccggccgg gcgccgcgtg cccgaggggc agcacgtgcc 420 cgttcgcgca cggcacgttc gagctctggc tccacccgtc gcgctaccgc acgcggccgt 480 gccgcgcggg cgtcgcgtgc cgccgccgcg tctgcttctt cgcgcacacc gccggcgagc 540 tccgcgccgg gtccaaggaa gactcgccgc tgtcgctctc ccccaagtcg accctggcct 600 ccctctggga gtcgccgccg gtgtcgccgg tggaggggcg gaggtgggtg gacggcatcg 660 atgaatgcga cgcggacgcg gagatggaag agttgatgtt cgcaatgcgg gagctcggcc 720 tccggaaggt gaggccgtcg gcatcgtccg taacgccggt gctaccgccg gtgacggacg 780 aggacgggcc ggatttcggg tgggtgtccg agcttgtgat gtagaagcac ccgacaagct 840 caaagacatc atctctctcg gcggcgacga ttaagatgca gaggcgcctc gcagaacagc 900 ttcattaatt aagttcactt caattcgatg atcatttcgc aaattgcatc attcttctgt 960 acataaacaa atatggtgca agttaatctg aacacagcaa tccgtaactg taagtgtggc 1020 gtgcgtttgc ctgccttttt ttttcgaaaa tcttggggag ctagtagcac ccttgctttt 1080 cgattattat tattattatc taccagtgta gatatggagt gtaatatgct aatagcctct 1140 gcctgtttcg tgatattatc acatttgatg tacttaatta tgctaaattc gatgcttttt 1200 ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1220

Claims

서열번호 1의 아미노산서열을 포함하는 징크핑거 단백질.
서열번호 1의 아미노산서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자.
징크핑거 단백질을 암호화하며, 이하의 서열군에 의해 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 또는 단리된 DNA 분자：

(a) 서열번호 2의 염기서열중 57bp ~ 821bp로 이루어지는 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열,

(b) (a)의 DNA에 대하여 전장에 걸쳐 70％ 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열, 혹은

(c) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드 서열에 스트린전트한 조건하에 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및

(d) (a), (b) 또는 (c) 서열과 상보적인 서열 또는 RNA 서열.
청구항 2 또는 3 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터.
청구항 4 기재의 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 5항에 있어서, 숙주세포는 아그로박테리움 속균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
청구항 5 기재의 세포로 형질전환시켜 얻을 수 있는 식물형질전환체.
제 6항에 있어서, 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 식물형질전환체.
청구항 4 기재의 재조합벡터를 식물체 세포내로 도입시켜 내염성 증진 및 발달이 조절된 식물체의 제조방법.