BRPI0807350A2

BRPI0807350A2 - Receptor de quitocina putativa e métodos para uso do mesmo

Info

Publication number: BRPI0807350A2
Application number: BRPI0807350-3A2A
Authority: BR
Inventors: Prakash Pallathadka Kumar; Mandar Radhakisan Godge
Original assignee: Univ Singapore
Priority date: 2007-02-05
Filing date: 2008-02-05
Publication date: 2014-05-06
Also published as: WO2008097197A1; JP5592652B2; NZ578750A; AU2008212127A1; US20110023187A1; EP2124522B1; AU2008212127B2; US9290777B2; EP2124522A4; JP2010517528A; ATE533353T1; CN101686641B; CN101686641A; EP2124522A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEPTOR DE QUITOCINA PUTATIVA E MÉTODOS PARA USO DO MESMO".

Campo Técnico

A presente invenção refere-se à modulação da expressão de 5 características em plantas, tais como altura da planta, biomassa da planta, desenvolvimento de botão apical, ramificação, fertilidade, florescimento, área da folha, senescência, germinação de semente, produção de semente, peso de semente, desenvolvimento de tronco, produção de grão, número de culti- vos, desenvolvimento de meristema floral e desenvolvimento de raiz. A pre- 10 sente invenção também refere-se a métodos e materiais para a modulação da expressão das características em plantas.

Antecedentes

Técnicas de reprodução de planta tradicionais são conhecidas por resultarem em melhoras em colheitas agrícolas. Estas técnicas tais co- 15 mo reprodução e hibridização seletiva envolvem o cruzamento de genes de- rivados de plantas com diferentes bases genéticas para gerar progênie de várias características. A progênie é selecionada para obter as plantas que expressam as características desejadas e as características deletérias são eliminadas por meio de múltiplos cruzamentos ou autofecundações para e- 20 ventualmente produzir progênie com as características desejadas. Embora métodos de reprodução tradicionais tenham provado serem úteis no realce ou melhora das características de várias colheitas, estes métodos envolvem

o cruzamento de centenas ou milhares de genes em que apenas alguns ge- nes são selecionados quanto às suas características ou traços melhorados. 25 Além disso, estes métodos demoram muitos anos de cruzamento, seleção de várias linhagens de uma grande população de progênie e cruzamento reversível das mesmas para diversas gerações para obter o traço caracterís- tico. Algumas características indesejáveis podem também ser manifestadas nas plantas por que é geralmente difícil selecionar um traço sem afetar ou- 30 tros usando métodos de reprodução tradicionais.

Outra desvantagem na seleção de planta tradicional é que a re- produção é restrita às plantas que são sexualmente compatívele, portanto, métodos de reprodução tradicionais são geralmente limitado pela ausência de diversidade genética no idioplasma de uma espécie particular. Além dis- so, métodos de reprodução tradicionais tenham provado ser bastante inefi- cazes para melhorar muitas características poligênicas tais como resistência aumentada à doença.

Embora tenha havido avanços consideráveis em produções de colheita nos últimos anos, neste contexto permanece uma necessidade de obter melhoras significantes em colheitas de alimento maiores para atender à demanda global. Recentes avanços em biotecnologia de planta envolven- 10 do a expressão de transgene individual em colheitas resultaram em uma in- trodução comercial bem-sucedida de novas características de planta tais como resistência à herbicida, resistência a inseto e resistência a vírus. Entre- tanto, a lista de características de gene individual de valor significante é rela- tivamente pequeno e, portanto, expressão de transgene individual em colhei- 15 tas não é prática para melhora de colheita.

Nos últimos anos, houve tentativas de isolar certos genes em várias espécies de planta que são conhecidos quimicamente modificar a se- qüência de DNA na planta de modo que os efeitos em morfologia de planta podem ser caracterizados, um método conhecido envolve o isolamento do 20 gene S-adenosil-L-homocisteine hidrolase (SAHH), uma enzima-chave que é conhecida por regular a metilação de DNA. Embora certas mudanças morfo- lógicas fossem observadas na planta, nenhuma das características fenotípi- cas provou ter uma vantagem significante em melhora da produção de co- lheita em diferentes plantas. Devido à complexidade da interação entre o 25 gene SAHH e as moléculas a jusante, os mecanismos envolvendo a metila- ção de DNA e expressão de gene são pouco entendidos e métodos existen- tes para melhora de colheita são, portanto, limitados.

Desse modo, existe uma necessidade de fornecer novos méto- dos que superam, ou pelo menos melhoram, uma ou mais das desvantagens descritas acima. Existe uma necessidade de novos métodos para produzir plantas que têm características que são úteis para melhora da colheita e ou- tros usos comerciais e científicos. Sumário Os presentes inventores identificaram um polipeptídeo compre- endendo a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1, que está envolvida na trilha de sinalização de citoquinina em plantas. As citoqui- ninas são fito-hormônios (ou hormônios de planta) que são exercidos em células de planta responsivas para fornecer efeitos bioquímicos e fisiológicos específicos. Fito-hormônios são primeiro reconhecidos por receptores espe- cíficos que iniciam a transdução do sinal hormonal para estimular a resposta celular importante em crescimento e desenvolvimento de planta. Enquanto receptores de hormônio são bem-estudados em muitos eucariotas variando de florescimento de planta ao homem, houve uma ausência de um entendi- mento detalhado de receptores de fito-hormônio. Proteínas de ligação de fito-hormônio foram suspeitas de fornecer candidatos para tais receptores.

Os presentes inventores identificaram um significante aumento em biomassa da planta e produção de colheita, em ambas as espécies mo- nocotiledôneas e dicotiledôneas, quando a expressão do polipeptídeo com- preendendo a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 foi diminuída. Ao contrário, a expressão aumentada do polipeptídeo compreen- dendo a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1, forneceu florescimento precoce em algumas plantas. Portanto, a expressão do poli- peptídeo compreendendo a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 pode ser manipulada para obter as características desejadas que são importantes para melhora de colheita e outros usos comerciais e científi- cos.

Desse modo, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido a método de modular a expressão de pelo menos uma caracterís- tica em uma planta, o método compreendendo a etapa de modulação da expressão de pelo menos um polipeptídeo pela planta, em que o polipeptí- deo é selecionado do grupo que consiste em:

i) um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1;

ii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cido que é selecionada do grupo que consiste em qualquer um ou mais do aminoácido 1 a aminoácido 7, de aminoácido 9 a aminoácido 230, de ami- noácido 1 a aminoácido 58, de aminoácido 77 a aminoácido 485, de amino- ácido 59 a aminoácido 76, de aminoácido 150 a aminoácido 191, de amino- 5 ácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta;

iii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência

de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular sinalização de quitocina na planta; e

iv) um polipeptídeo que consiste em uma seqüência de aminoá- cido de acordo com a SEQ ID NO: 1,

em que a modulação da expressão do polipeptídeo modula a expressão de pelo menos uma característica na planta.

Em uma modalidade, a expressão do polipeptídeo pela planta é modulada introduzindo pelo menos um polinucleotídeo que modula a ex- pressão do polipeptídeo em uma ou mais células da planta.

Em outra modalidade, é fornecido um método como definido a- 20 cima em que a etapa de modulação da expressão do polipeptídeo compre- ende reduzir a expressão do polipeptídeo. A etapa de redução da expressão do polipeptídeo pela planta pode compreender introduzir a uma ou mais cé- lulas da planta um polinucleotídeo que reduz a expressão do polipeptídeo. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste 25 em:

i) um polinucleotídeo antissense que compreende a seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15;

ii) um polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 15 resíduos de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido

nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15;

iii) um polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 15 resíduos de ácido nucleico contíguos de um polinucleotídeo que é com- plementar a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1;

5 iv) um polinucleotídeo de interferência de RNA que compreende

uma seqüência de ácido nucleico compreendendo pelo menos 9 resíduos de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico que é complementar a um polinucleotídeo consistindo na seqüência de ácido nu- cleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; e v) um polinucleotídeo antissense que consiste na seqüência de

ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15.

Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 80% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é ca- 15 paz de modular sinalização de citoquinina na planta. Em outra modalidade, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo me- nos 85% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular sinalização de cito- quinina na planta. Em ainda outra modalidade, o polipeptídeo compreende 20 uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 90% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:

1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta. Em ainda uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende uma seqüência de ami- noácido que tem pelo menos 95% de identidade de seqüência para uma se- quência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta.

Em uma modalidade, é fornecido a método como definido acima em que a etapa de modulação da expressão do polipeptídeo compreende aumentar a expressão do polipeptídeo. A etapa de aumentar a expressão do 30 polipeptídeo pela planta pode compreender introduzir a uma ou mais células da planta um polinucleotídeo que aumenta a expressão do polipeptídeo. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: i) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1,

ii) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compre- ende uma seqüência de aminoácido que é selecionada do grupo que consis-

te em qualquer um ou mais do aminoácido 1 a aminoácido 7, de aminoácido

9 a aminoácido 230, de aminoácido 1 a aminoácido 58, de aminoácido 77 a aminoácido 485, de aminoácido 59 a aminoácido 76, de aminoácido 150 a aminoácido 191, de aminoácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um 10 homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; e

iii) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compre- ende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:

1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta.

Em certas modalidades, o polipeptídeo codificado pelo polinu- cleotídeo na parte ii) compreende um domínio de sinalização intracelular. Em certas modalidades, o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo na parte

ii) compreende um domínio de ligação de citoquinina extracelular.

Em uma modalidade, a pelo menos uma característica em uma

planta é selecionada do grupo que consiste em qualquer uma ou mais de altura da planta, biomassa da planta, desenvolvimento de botão apical, rami- ficação, fertilidade, florescimento, área da folha, senescência, germinação de semente, produção de semente, peso de semente, desenvolvimento de tron- 25 co, produção de grão, número de cultivos, desenvolvimento de meristemaa floral e desenvolvimento de raiz.

Em uma modalidade, a expressão diminuída do polipeptídeo como definido acima induz à mudanças na expressão de características na planta incluindo, porém não limitadas a qualquer uma ou mais de ramifica- 30 ção aumentada, produção de semente aumentada, biomassa da planta au- mentada, produção de grão aumentada, número de cultivos aumentado, á- rea da folha aumentada, germinação de semente retardada, predominância apical diminuída, e florescimento retardado, ou combinações dos mesmos na planta quando comparado a uma planta do mesmo tipo em que a expres- são do polipeptídeo não foi modulada.

Em outra modalidade, o aumento em expressão do polipeptídeo 5 modula pelo menos uma característica selecionada do grupo que consiste em qualquer uma ou mais de florescimento precoce, nanismo, número dimi- nuído de folhas, senescência precoce, germinação de semente precoce, formação retardada e reduzida de folhas de roseta, crescimento de raiz de muda aumentado, ou combinações dos mesmos na planta, com relação a 10 uma planta do mesmo tipo em que a expressão do polipeptídeo não foi mo- dulada.

O aumento em biomassa da planta pode ser útil no aumento da produção e qualidade em vegetais folhosos. A ramificação aumentada e a- cúmulo de biomassa podem também ser úteis em produção de grama de 15 forragem e várias colheitas de cereal. O aumento em biomassa da planta pode resultar em uma abundância de etanol celulósico (tal como bioetanol), que pode ser usado como uma fonte de biocombustível.

O aumento em biomassa da planta é também esperado facilitar administração mais eficiente de fertilizantes de planta. Portanto, o aumento -20 em biomassa da planta pode prevenir problemas ambientais tais como es- corrimentos do fertilizante que podem induzir a uma faixa de problemas am- bientais tais como florescimento de algas.

Além disso, a expressão aumentada do polipeptídeo pode indu- zir ao florescimento precoce em plantas tais como cana-de-açúcar. Isto pode 25 ser útil para cultivos comerciais visto que pode ajudar criadores de planta em práticas de reprodução de planta convencionais. Similarmente, o fenótipo de nanismo como um resultado da expressão aumentada do polipeptídeo pode também ser desejável na geração de plantas ornamentais.

Em um segundo aspecto, é fornecido um polinucleotídeo isolado selecionado do grupo que consiste em:

i) um polinucleotídeo antissense que compreende a seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15, ii) um polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 15 resíduos de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; e

iii) um polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 5 15 resíduos de ácido nucleico contíguos de um polinucleotídeo que é com- plementar a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1;

iv) um polinucleotídeo de interferência de RNA compreendendo

uma seqüência de ácido nucleico que compreende pelo menos 9 resíduos de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; e

v) um polinucleotídeo antissense que consiste na seqüência de

ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15;

em que o polinucleotídeo é capaz de diminuir a expressão de um polipeptí- deo que modula pelo menos uma característica em uma planta, ou

vi) um polinucleotídeo que é complementar a qualquer um de i) a

v), ou

vii) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas

para qualquer um de i) a v).

De acordo com um terceiro aspecto, é fornecido um polinucleotí- deo isolado selecionado do grupo que consiste em:

i) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de ácido

nucleico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1;

ii) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compre- ende uma seqüência de aminoácido que é selecionada do grupo que consis- te em qualquer um ou mais do aminoácido 1 a aminoácido 7, de aminoácido

9 a aminoácido 230, de aminoácido 1 a aminoácido 58, de aminoácido 77 a

aminoácido 485, de aminoácido 59 a aminoácido 76, de aminoácido 150 a aminoácido 191, de aminoácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta;

iii) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compre- ende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de

seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:

1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; e

iv) um polinucleotídeo que consiste em uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1;

em que o polinucleotídeo é capaz de aumentar a expressão de um polipeptí- deo que modula pelo menos uma característica em uma planta, ou

v) um polinucleotídeo que é complementar a qualquer um de i) a

iv); ou

vi) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas pa- ra qualquer um de i) a iv).

De acordo com um quarto aspecto, é fornecido um vetor com-

preendendo um polinucleotídeo de acordo com o segundo ou o terceiro as- pecto.

De acordo com um quinto aspecto, é fornecido uma célula hos- pedeira transformada com um polinucleotídeo de acordo com o segundo ou o terceiro aspecto, ou a vetor de acordo com o quarto aspecto.

De acordo com um sexto aspecto, é fornecido planta compreen- dendo uma célula hospedeira de acordo com o quinto aspecto.

De acordo com um sétimo aspecto, é fornecido um método de produzir planta transgênica compreendendo as etapas de:

a) fornecer um polinucleotídeo que modula a expressão de um

polipeptíeo, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

ii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cido que é selecionada do grupo que consiste em qualquer um ou mais do

aminoácido 1 a aminoácido 7, de aminoácido 9 a aminoácido 230, de ami- noácido 1 a aminoácido 58, de aminoácido 77 a aminoácido 485, de amino- ácido 59 a aminoácido 76, de aminoácido 150 a aminoácido 191, de amino- ácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta;

iii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá-

cido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; e

iv) um polipeptídeo que consiste em uma seqüência de aminoá- cido de acordo com a SEQ ID NO: 1;

b) transformar uma planta, parte da planta ou célula da planta com o polinucleotídeo de etapa (a), e

c) cultivar a planta transformada, parte da planta ou célula da planta para produzira planta transgênica.

Em uma modalidade, o polinucleotídeo na etapa (a) do sétimo

aspecto compreende um polinucleotídeo isolado selecionado do grupo que consiste em:

i) um polinucleotídeo antissense que compreende a seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15,

ii) um polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos

15 resíduos de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; e

iii) um polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 15 resíduos de ácido nucleico contíguos de um polinucleotídeo que é com-

plementar a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1;

iv) um polinucleotídeo de interferência de RNA compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que compreende pelo menos 9 resíduos

de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; e v) um polinucleotídeo antissense que consiste na seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15;

em que o polinucleotídeo é capaz de modular a expressão de um polipeptí- deo que modula pelo menos uma característica em uma planta, ou vi) um polinucleotídeo que é complementar a qualquer um de i) a

v), ou

vii) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas para qualquer um de i) a v).

Em outra modalidade, o polinucleotídeo na etapa (a) do sétimo aspecto compreende um polinucleotídeo isolado selecionado do grupo que consiste em:

i) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1,

9 a aminoácido 230, de aminoácido 1 a aminoácido 58, de aminoácido 77 a aminoácido 485, de aminoácido 59 a aminoácido 76, de aminoácido 150 a aminoácido 191, de aminoácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406

a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta;

seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:

1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; e

iv) um polinucleotídeo que consiste em uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1,

v) um polinucleotídeo que é complementar a qualquer um de i) a

iv), ou vi) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas pa- ra qualquer um de i) a iv).

Em uma modalidade do método de acordo com o sétimo aspec- to, o cultivo na etapa (c) é cultivando planta transformada, parte da planta ou 5 célula da planta sob condições que podem permitir o desenvolvimento da planta transformada, parte da planta ou célula da planta. Em certas modali- dades, a parte da planta é selecionada do grupo que consiste em qualquer uma ou mais de raiz, tronco, folha, botão, flor, broto, semente e galho.

Em uma modalidade, é fornecida a planta de acordo com o sexto aspecto, em que a planta é uma planta monocotiledônea. Em outra modali- dade, é fornecida a planta de acordo com o sexto aspecto, em que a planta é uma planta dicotiledônea.

Em certas modalidades, a planta é selecionada do grupo que consiste em qualquer uma ou mais de aveia, cevada, trigo, centeio, milho, arroz, sorgo, milho miúdo, amaranto, grama-do-reino, grama doce, cana, bambu, grama de forragem, capim diamante e capim turfa.

De acordo com um oitavo aspecto, é fornecido planta transgêni- ca quando produzida pelo método de acordo com o sétimo aspecto, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em qualquer uma ou mais de 20 aveia, cevada, trigo, centeio, milho, arroz, sorgo, milho miúdo, amaranto, grama-do-reino, grama doce, cana, bambu, grama de forragem, capim dia- mante e capim-turfa.

Em uma modalidade, a planta transgênica é capaz de produzir plantas férteis.

De acordo com um nono aspecto, é fornecido uma parte ou uma

semente da planta como definido acima. A parte pode ser selecionada do grupo que consiste em qualquer uma ou mais de raiz, tronco, folha, botão, flor, broto, semente e galho.

De acordo com um décimo aspecto, é fornecido planta ou mate- rial de propagação regenerado da mesma de uma planta como definido aci- ma, ou uma parte ou uma semente como definido acima.

De acordo com um décimo primeiro aspecto, é fornecido uso de uma planta transformada com um polinucleotídeo como definido acima para biomassa da produção da planta. Em certas modalidades, a planta é sele- cionada do grupo que consiste em qualquer uma ou mais de aveia, cevada, trigo, centeio, milho, arroz, sorgo, milho miúdo, amaranto, grama-do-reino, 5 grama doce, cana, bambu, grama de forragem, capim diamante e capim tur- fa.

De acordo com um décimo segundo aspecto, é fornecido uso de acordo com o décimo primeiro aspecto, em que a biomassa da produção da planta é para a produção de biocombustível.

De acordo com um décimo terceito aspecto, é fornecido polipep-

tídeo isolado selecionado do grupo que consiste em:

aminoácido 1 a aminoácido 7, de aminoácido 9 a aminoácido 230, de ami- noácido 1 a aminoácido 58, de aminoácido 77 a aminoácido 485, de amino- ácido 59 a aminoácido 76, de aminoácido 150 a aminoácido 191, de amino- ácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de 20 SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina em uma planta;

iii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular

sinalização de citoquinina em uma planta; e

Definições

As seguintes palavras e termos usados aqui devem ter o signifi- cado indicado: O termo "contíguo" como aqui usado refere-se a uma série con- tínua ou uma não-rompida de resíduos de aminoácido ou resíduos de ácido nucleico presentes em um polipeptídeo ou polinucleotídeo, respectivamente. Por exemplo, "resíduos de aminoácido contíguos" serão entendidos incluir 5 uma seqüência de aminoácido contígua de pelo menos cerca de 4, cerca de

5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 12, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 350 ou cerca de 400, cerca de 450, ou cerca de 485 10 aminoácidos mais ou menos. Similarmente, "resíduos de ácido nucleico con- tíguos" serão entendidos incluir uma seqüência contígua de ácido nucleico de pelo menos cerca de 12, cerca de 15, cerca de 18, cerca de 21, cerca de 24, cerca de 27, cerca de 30, cerca de 36, cerca de 45, cerca de 60, cerca de 75, cerca de 90, cerca de 120, cerca de 150, cerca de 225, cerca de 300, 15 cerca de 450, cerca de 600, cerca de 750, cerca de 900, cerca de 1050, cer- ca de 1200, cerca de 1350, cerca de 1450, cerca de 1550, cerca de 1650, ou cerca de 1775 nucleotídeos mais ou menos.

O termo "sinalização de citoquinina" refere-se às moléculas que propagam um sinal extracelular através da membrana celular para tornar-se 20 um sinal intracelular. Este sinal pode então estimular uma resposta celular. As moléculas de polipeptídeo envolvidas em sinalização de processos de quitocina são tipicamente proteína quinases receptoras e não-receptoras, proteína fosfatases receptoras e não-receptoras, e fatores de transcrição. A sinalização de atividade de quitocina pode ser avaliada avaliando-se os ní- 25 veis de citoquinina expressos em plantas ou avaliando-se a atividade de li- gação entre a citoquinina e as moléculas de polipeptídeo envolvidas nos processos de sinalização de citoquinina.

O termo "hibridização" quando usado com referencia a ácidos nucleicos refere-se ao processo em que dois polinucleotídeos de filamento único ligam-se não-covalentemente para formar um polinucleotídeo de fila- mento duplo estável, o termo "hibridização" pode também referir-se a hibridi- zação de filamento triplo, o polinucleotídeo de filamento duplo ou triplo resul- tante é um "híbrido". A proporção da população de polinucleotídeos que for- ma híbridos estáveis é referida aqui como o "grau de hibridização." Hibridi- zação e a resistência de hibridização (isto é, a intensidade da associação entre os ácidos nucleicos) é dependente de fatores tais como o grau de com- 5 plementaridade entre os ácidos nucleicos, rigorosidade das condições en- volvidas, o ponto de fusão térmica (Tm) do híbrido formado, e a relação G:C dentro dos ácidos nucleicos como descrito em detalhes também abaixo.

O termo "iniciador" como aqui usado refere-se a um polímero de nucleotídeos capaz de agir como um ponto de iniciação de síntese de DNA 10 quando anelado a um padrão de ácido nucleico sob condições em que a sín- tese de um produto de extensão de iniciador é iniciada, isto é, na presença de quatro diferentes trifosfatos de nucleotídeo e uma polimerase em um tampão apropriado (que tipicamente inclui um tampão de pH e cofatores) e em uma temperatura adequada. Os iniciadores usados nas etapas de ampli- 15 ficação da invenção podem ser totalmente complementares ou substancial- mente complementares às sequências-alvo.

Os termos "traço" e "fenótipo" são usados alternadamente e a- brangem qualquer característica, especialmente uma que distingue uma planta da outra. Características exemplares incluem qualquer uma ou mais 20 de altura da planta, biomassa da planta, grau de desenvolvimento de broto apical, grau de ramificação, planta, fertilidade de semente ou pólen, número ou início de florescimento, área da folha, início de senescência, início de ger- minação de semente, produção de semente, peso total ou individual da se- mente, grau de desenvolvimento de tronco, produção de grão, número de 25 cultivos, grau de desenvolvimento de meristemaa floral e grau de desenvol- vimento de raiz.

O termo "transgênico" quando usado em referência a um tecido ou a uma planta refere-se a um tecido ou planta, respectivamente, que com- preende uma ou mais células que contêm um transgene, ou cujo genoma foi 30 alterado pela introdução de um transgene. Células transgênicas, tecidos e plantas podem ser produzidas por diversos métodos incluindo a introdução de um "transgene" compreendendo ácido nucleico (DNA ou RNA) em uma célula-alvo ou integração do transgene em um cromossoma de uma célula- alvo por meio de intervenção humana, tal como pelos métodos descritos a- qui.

A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por 5 exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida a partir da definição da invenção.

A menos que de outro modo especificado, os termos "compre- endendo" e "compreende", e variantes gramaticais dos mesmos, são desti- nados a representar a linguagem "aberta" ou "inclusive" de modo que eles incluam os elementos mencionados, porém também permitam a inclusão de elementos adicionais, não-mencionados.

Como aqui usado, o termo "cerca de", no contexto de concentra- ções de componentes das formulações, tipicamente significa +/- 5% do valor 15 estabelecido, mais tipicamente +/- 4% do valor estabelecido, mais tipicamen- te +/- 3% do valor estabelecido, mais tipicamente, +/- 2% do valor estabele- cido, ainda mais tipicamente +/- 1% do valor estabelecido, e ainda mais tipi- camente +/- 0,5% do valor estabelecido.

Em toda esta descrição, certas modalidades podem ser descri- 20 tas em um formato de faixa. Deve ser entendido que a descrição em formato de faixa é meramente para conveniência e brevidade e não deve ser cons- truída como uma limitação inflexível sobre o escopo das faixas descritas. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada ter to- das as subfaixas possíveis especificamente descritas, bem como valores 25 numéricos individuais dentro daquela faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa tal como de 1 a 6 deve ser considerada ter subfaixas especifica- mente descritas tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1,2,3, 4, 5, e 6. Isto aplica-se independente da amplitude da faixa.

No contexto das faixas que descrevem os resíduos de aminoáci-

do em um polipeptídeo ou resíduos de ácido nucleico em um polinucleotídeo deve ser entendido que a descrição de uma faixa inclui o primeiro e último valores numéricos da faixa. Adicionalmente neste contexto, a descrição de uma faixa não se destina a abranger aminoácido individual ou resíduos de ácido nucleico que incluem-se na faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa, por exemplo "de aminoácido 1 a aminoácido 7", deve ser considerada 5 referir-se a uma seqüência de aminoácido que transpõe e inclui os aminoá- cidos nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7, porém que não se refere a a qualquer um ou mais aminoácidos individuais que se situam dentro daquela faixa, por exemplo, aminoácido 1 apenas, aminoácido 2 apenas, aminoácidos 1 e 2, ou assim em diante.

Descrição Detalhada das Modalidades

As modalidades não-limitantes exemplares de um novo método para modular a expressão de um traço em uma planta, bem como materiais for uso em e produzidos pelo novo método, serão agora descritos.

A presente invenção é baseada na identificação de que o poli- peptídeo compreendendo a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 está envolvido em uma trilha de sinalização de citoquinina em plan- tas.

As citoquininas são uma classe de hormônios de planta que re- gula o crescimento e desenvolvimento da planta de uma variedade de ma- 20 neiras. Elas são ativas na promoção de divisão celular, crescimento e dife- renciação celular e outras funções reguladoras do crescimento em uma plan- ta. As citoquininas são acreditadas por desempenharem um importante pa- pel em todas as fases de desenvolvimento da planta de divisão e aumento celular para a formação de flores e frutos. Por exemplo, as citoquininas são 25 capazes de promover o alongamento de botões e o crescimento de folhas, e de inibir a senilidade, acúmulo de aminoácidos e abertura do estorna.

A estrutura básica de uma citoquinina compreende uma 6-amino purina, da qual o grupo amino é modificado com um substituinte geralmente transportando 5 átomos de carbono. As citoquininas ativas de ocorrência 30 natural em plantas maiores são principalmente derivados de zeatina e iso- pentenil adenina de precursores biossintéticos. Os níveis elevados de cito- quinina estão associados com o desenvolvimento de sementes em plantas maiores, quando este foi demonstrado coincidir com atividade mitótica má- xima no endosperma de sementes de milho em desenvolvimento e outros grãos de cereal.

Os mecanismos moleculares básicos de biossíntese de citoqui- nina e transdrução de sinal tornaram-se claros apenas recentemente. Três membros da família de receptor de citoquinina, que são histidina quinases sensoras, foram identificados e têm funções que são similares às trilhas de transdução de sinal de dois componentes bacterianos envolvendo mecanis- mos fosforeposicionamento. Estes três receptores de citoquinina, AHK2, AHK3 e CRE1/AHK4, mostram um grau elevado de identidade de seqüência, porém cada um tem características de diferenciação e é requerido para per- cepção de citoquinina normal e crescimento da planta. Enquanto análise mu- tacional foi realizada sobre estes três receptores, mutações em qualquer um dos três receptores não resultaram em significante alteração dos fenótipos da planta. Ao contrário, mutações em todos os três receptores (isto é, um mutante triplo) resultaram em plantas nanicas e estéreis. Estes fenótipos não foram observados nos mutantes antissense da presente invenção como descrito abaixo.

Na sinalização de Arabidopsis de trilha de citoquinina, as histidi- 20 na proteína quinases (AHKs) servem como receptores de citoquinina e trans- mitem sinais de AHKs para reguladores de resposta nuclear (ARRs) por meio de proteínas de fosfotransferência de histidina (AHPs). As AHPs mo- vem-se do citoplasma para o núcleo de uma maneira dependente da citoqui- nina e enviam sinais para ARRs no núcleo, que pode ativar ou reprimir a 25 transcrição de genes envolvidos em crescimento e desenvolvimento de plan- ta dentro da célula da planta.

É descrito aqui um polipeptídeo isolado, HOG1 (compreendendo uma seqüência de aminoácido mencionada na SEQ ID NO: 1), purificada da planta Arabidopsis thaliana, que liga-se às citoquininas com alta afinidade. 30 Além disso, os presentes inventores identificaram que a modulação da ex- pressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 modula a sinaliza- ção de trilha de citoquinina em ambas as plantas monocotiledôneas e dicoti- ledôneas, resultando em uma expressão de diferentes características em plantas, a despeito da ausência do domínio de histidina quinase. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo descrito também não possui atividade de SAHH.

5 Em certas modalidades, o polipeptídeo descrito compreende um

domínio de transmembrana.

Desse modo, a presente invenção fornece um método de modu- lar a expressão de pelo menos uma característica em uma planta, compre- endendo uma etapa de modulação da expressão de pelo menos um polipep- 10 tídeo pela planta, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consis- te em:

ii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- 15 cido que é selecionada do grupo que consiste em qualquer um ou mais do

aminoácido 1 a aminoácido 7, de aminoácido 9 a aminoácido 230, de ami- noácido 1 a aminoácido 58, de aminoácido 77 a aminoácido 485, de amino- ácido 59 a aminoácido 76, de aminoácido 150 a aminoácido 191, de amino- ácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de ‘■'20 SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta;

25 sinalização de citoquinina na planta; e

30 A trilha de sinalização de qualquer citoquinina pode ser modula-

da usando o método da presente invenção. Existem mais do que 200 cito- quininas naturais e sintéticas que são conhecidas até hoje (http://www.plant- hormones.info/citoquininas.htm; Arteca1 planta Growth Substances: Princi- pies e Applications, Nova Iorque: Chapman & Hall (1996); Salisbury e Ross, planta Physiology pp. 357-407, 531-548 (1992)). Citoquininas de ocorrência natural exemplares incluem zeatina, quinetina, isopenteniladenina e 6- 5 Benzilaminopurina enquanto fenilureias tais como difenilureia representa uma classe exemplar de citoquininas sintéticas. Formas conjugadas de cito- quininas que podem ser produzidas de diversas maneiras são também co- nhecidas e incluídas denro do escopo da invenção. Por exemplo, glucosí- deos podem ser formados pela ligação de carbono 1 de glicose ao grupo 10 hidroxila sobre a cadeia lateral de zeatina ou o carbono 1 pode ligar-se ao átomo de N da ligação C-N em qualquer posição 7 ou 9 sobre o anel de a- denina.

O método descrito pode também ser aplicado a qualquer planta em que a modulação de uma ou mais características é desejada. O termo 15 "planta" como aqui usado também abrange plantas inteiras, antepassados e progênie das plantas e partes de planta, incluindo sementes, brotos, troncos, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores, e tecidos e órgãos, em que cada dos anteriormente mencionados compreende o polinucleotídeo ou polipeptí- deo da invenção. O termo "planta" também abrange células de planta, cultu- 20 ras de suspensão, tecido de calos, embriões, regiões meristemáticas, game- tófitos, esporófitos, pólen, e microsporos, novamente onde cada dos anteri- ormente mencionados compreendem o polinucleotídeo de interesse.

Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas tais como co- 25 Iheitas para alimentação, gramas, legumes de forragem ou legumes para forragem, plantas ornamentais, árvores, ou arbustos bem como plantas usa- das para biomassa celulósica para etanol (biocombustível) produção sele- cionada da lista compreendendo Acer spp., Actinidia spp., Agropyron spp., Allium spp., Amarantous spp., Ananas comosus, Annona spp., Apium spp., 30 Arabidopsis thaliana, Arachis spp, Artocarpus spp., Aspargo officinalis, Ave- na sativa, Averrhoa carambola, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp., Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna in- dica, Capsicum spp., Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carthamus tincto- rius, Carya spp., Castanea spp., chrysanthemum, Cichorium endivia, Cinna- momum spp., Citnillus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Cola spp., Colocasia esculenta, Corylus spp., Crataegus spp., Cucumis spp., Cu- curbita spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus Ion- gan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Eleusine eoraeana, Eriobotrya japoniea, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Fieus eariea, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp., Gossypi- um hirsutum, HeIianDesse modo spp., Hibiseus spp., Hordeum spp., Ipomo- ea batatas, Juglans spp., Laetuea sativa, Lathyrus spp., Lemna spp., Lens eulinaris, Linum usitatissimum, Litehi ehinensis, Lolium perenne, Lotus spp., Luffa aeutangula, Lupinus spp., Maerotyloma spp., Malpighia emarginata, Malus spp., Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Momordica spp., Mo- rus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Omithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Persea spp., Petroselinum crispum, Petunia hybrida, Phaseolus spp., Phoe- nix spp., Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Po- pulus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, P- yrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ri- bes spp., Rubus spp., Saceharum spp., Sambucus spp., Secale cereale, Se- samum spp., Solanum spp., Sorgo bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triücosecale rimpaui, Triticum spp., Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre outras.

Em uma modalidade, a planta é uma colheita de grão tal como arroz, trigo, milho, soja, milho miúdo, cevada, centeio, aveia, ou sorgo. Em outra modalidade, a planta é uma grama tal como grama-do-reino, grama doce, cana, bambu, grama de forragem, capim diamante e capim turfa. Em 30 ainda outra modalidade, a planta é um vegetal tal como Brassica alboglabra, alcachofra, aspargo, brócolos, Couve-de-Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, eollard greens, linho, cou, e lentilha, ou outras plantas que têm valor comercial ou científico (tal como Arabidopsis thaliana, Petunia hy- brida, crisântemo etc.).

Como descrito abaixo nos Exemplos 1 e 2, os métodos descritos foram demonstrados em ambas as plantas monocotiledôneas e dicotiledô- 5 neas. Portanto, por que a seqüência do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 é al- tamente conservada entre espécies de planta, espera-se que os métodos descritos sejam aplicáveis a plantas tanto monocotiledôneas quanto dicotile- dôneas. Por exemplo, como os métodos descritos foram demonstrados em arroz (Oryza sativa) como descrito no Exemplo 2 abaixo, seria esperado ser 10 aplicável à outras plantas monocotiledôneas, tais como trigo (Triticum aesti- vum) (SEQ ID NO: 7) que tem uma identidade de seqüência de aminoácido de 95% para o arroz (SEQ ID NO: 5). Similarmente, como os métodos des- critos foram demonstrados em Arabidopsis thaliana como descrito no Exem- plo 1 abaixo, seria esperado ser aplicável à outras dicotiledôneas plantas, 15 tais como Petunia hybrida (SEQ ID NO: 13) que têm uma identidade de se- qüência de aminoácido a 88% para Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1), e crisântemo (SEQ ID NO: 9) que tem uma identidade de seqüência de amí- noácido a 92% para Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1).

O termo "expressão" como aqui usado pode referir-se à expres- são de um traço, um gene, ou um produto de gene, incluindo o polipeptídeo codificado, em uma planta.

As características de planta que podem ser moduladas pelo mé- todo descrito incluem, porém não estão limitadas a, altura da planta, bio- massa da planta, desenvolvimento de botão apical, ramificação, fertilidade, 25 florescimento, área da folha, senescência, germinação de semente, produ- ção de semente, peso de semente, desenvolvimento de tronco, produção de grão, número de cultivos, desenvolvimento de meristemaa floral e desenvol- vimento de raiz. De acordo com uma modalidade, a expressão de um traço em uma planta pode ser modulada para exibir ramificação aumentada, pro- 30 dução de semente aumentada, biomassa da planta aumentada, produção de grão aumentada, número de cultivos aumentado, área da folha aumentada, germinação de semente retardada, predominância apical diminuída, flores- cimento retardado, ou combinações dos mesmos, com relação a uma planta do mesmo tipo em que a expressão do polipeptídeo não foi modulada. Em outra modalidade, a expressão de um traço em uma planta pode ser modu- lada para exibir florescimento precoce, nanismo, número diminuído de fo- 5 lhas, senescência precoce, germinação de semente precoce, formação re- tardada e reduzida de folhas de roseta, crescimento de raiz de muda aumen- tado, ou combinações dos mesmos, com relação a uma planta do mesmo tipo em que a expressão do polipeptídeo não foi modulada.

Em particular, produção de semente e biomassa da planta foram 10 significantemente aumentadas em cerca de 2 a cerca de 5 vezes para plan- tas em que a expressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 foi diminuída com relação àquela de uma planta do mesmo tipo sem a expres- são diminuída do polipeptídeo. Dependendo do tipo de planta, a modulação na expressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1, e a extensão 15 da modulação, a produção de semente e biomassa da planta podem respec- tivamente ser esperadas aumentar em cerca de 2 vezes, cerca de 2,5 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 3,5 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 4,5 vezes ou cerca de 5 vezes.

Similarmente, a produção de grão e número de cultivos foram 20 aumentados em cerca de 2 a cerca de 4 vezes para plantas em que a ex- pressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 foi diminuída com relação àquela de uma planta do mesmo tipo sem a expressão diminuída do polipeptídeo. Dependendo do tipo de planta, a modulação na expressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1, e a extensão da modulação, a 25 produção de grão e número de cultivos podem respectivamente ser espera- dos aumentar em cerca de 2 vezes, cerca de 2,5 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 3,5 vezes, ou cerca de 4 vezes.

Em modalidades particulares, a área da folha foi também signifi- cantemente aumentada em cerca de 2 a cerca de 6 vezes para plantas em que a expressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 foi diminuí- da com relação àquela de uma planta do mesmo tipo sem a expressão dimi- nuída do polipeptídeo. Dependendo do tipo de planta, a modulação na ex- pressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1, e a extensão da modulação, a área da folha pode ser esperada aumentar em cerca de 2 ve- zes, cerca de 2,5 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 3,5 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 4,5 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 5,5 vezes, ou cerca de 6 vezes.

Para plantas em que a expressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 foi aumentada, o florescimento foi avançado em cerca de 5 a cerca de 15 dias com relação a uma planta do mesmo tipo sem a ex- pressão aumentada do polipeptídeo. Como descrito acima, a modulação em 10 tempo de florescimento dependerá do tipo de planta, a modulação na ex- pressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1, e a extensão da modulação, porém tipicamente seria avançada em cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, cerca de 8 dias, cerca de 9 dias, cerca de 10 dias, cerca de 11 dias, cerca de 12 dias, cerca de 13 dias, cerca 15 de 14 dias, ou cerca de 15 dias.

Em certas modalidades, a fertilidade das plantas não é modula- da e as plantas transformadas são capazes de produzir cing plantas férteis.

A expressão de um traço pode ser determinada usando vários métodos conhecidos na técnica. Área da folha, por exemplo, pode be deter- minada avaliando-se a relação da área total da folha para a área da folha (LAR), índice da área da folha (LAI) ou área específica da folha (SLA) usan- do as seguintes equações, respectivamente:

LAR(m2g'1 ou m2kg‘1)=(total área da folha)/(peso seco total)

LAI = (área total da folha da colheita )

(área total da terra na qual repousa)

SLA (m2g'1) = (área da folha) / (massa seca da folha)

Alternativamente, a área da folha pode ser medida usando análi- se de imagem com base em computador.

A produção de semente pode também ser medida de diversas maneiras, por exemplo como um aumento ou decréscimo de mil no peso de semente, como um aumento ou decréscimo do número de sementes carre- gadas, como peso total de semente, como tamanho da semente, ou como índice de colheita.

Diferenças em altura da planta pode ser avaliada por medições diretas e comparação com as alturas das plantas de controle não- modificadas.

A biomassa da planta pode ser determinada pesando-se as plantas recentemente colhidas (peso fresco ou peso úmido) ou o peso seco constante. O peso seco pode ser determinado após a secagem da planta colhida ou partes da planta de interesse (por exemplo, folhas, sementes) em 10 um forno de secagem estabelecido em cerca de 80°C durante 2 dias a 7 dias até o peso constante ser registrado (peso seco). Similarmente, o peso da semente ou grão e semente total ou produção de grão por planta ou por área unitária de cultivo (por exemplo, por metro quadrado, acre ou hectare) po- dem ser determinados.

Mudanças em desenvolvimento de broto apical e ramificação

bem como fertilidade, florescimento, e senescência podem ser estimados comparando-se o desenvolvimento das plantas modificadas (por exemplo, geneticamente modificadas como descrito nesta descrição) com a aparência das plantas não-modificadas no mesmo estágio de crescimento.

O número de cultivos (ou número de galhos) por planta pode ser

determinado contando-se uma amostra representativa de plantas desenvol- vidas até todos os cultivos terem se desenvolvido (por exemplo, em cultivars de arroz pode demorar cerca de 2 meses antes do cultivo atingir um número máximo). Estes podem ser comparados ao número de cultivos por planta das plantas não-modificadas.

O desenvolvimento de meristema floral e o desenvolvimento de raiz podem ser examinados tanto no nível macroscópico (por exemplo por observações visuais em estágios comparáveis de desenvolvimento) bem como por microscopia (por exemplo por microscopia de Iuz ou elétron) para diferenças em disposição celular etc.

A expressão de um gene pode ser determinada, por exemplo, medindo-se a produção de níveis de transcrição de RNA mensagei- ro(mRNA). A expressão de um produto de gene de polipeptídeo pode ser determinada, por exemplo, por imunoensaio usando um anticorpo(s) que se liga(m) com o polipeptídeo.

O termo "modular" refere-se a uma mudança na expressão de um traço, um gene, ou um produto de gene, incluindo o polipeptídeo codifi- cado, em uma planta. Tipicamente, a mudança é com relação a uma planta do mesmo tipo em que a expressão do traço, gene ou polipeptídeo não foi modulada. Por exemplo, quando usado com referência a uma expressão de um traço, o termo "modular" pode referir-se à altura da planta aumentada ou diminuída, biomassa da planta aumentada ou diminuída, desenvolvimento de broto apical aumentado ou diminuído, ramificação aumentada ou diminuí- da, fertilidade aumentada ou diminuída, florescimento aumentado ou diminu- ído, área da folha aumentada ou diminuída, senescência precoce ou retar- dada, germinação de semente precoce ou retardada, número de sementes aumentado ou diminuído, produção de semente aumentada ou diminuída, peso de semente aumentado ou diminuído, desenvolvimento de tronco pre- coce ou retardado, desenvolvimento de tronco aumentado ou diminuído, produção de grão aumentada ou diminuída, número de cultivos aumentado ou diminuído, desenvolvimento de meristema floral aumentado ou diminuído, desenvolvimento de meristema floral precoce ou retardado, desenvolvimento de raiz aumentado ou diminuído, desenvolvimento de raiz precoce ou retar- dado, e similares, em uma planta em que a expressão do polipeptídeo foi modulada usando o método descrito com relação a uma planta do mesmo tipo em que a expressão do polipeptídeo não foi modulada. Em uma modali- dade, o traço modulado pode ser ramificação aumentada, produção de se- mente aumentada, biomassa da planta aumentada, produção de grão au- mentada, número de cultivos aumentado, área da folha aumentada, germi- nação de semente retardada, predominância apical diminuída, florescimento retardado, ou combinações dos mesmos, em uma planta em que a expres- são do polipeptídeo foi modulada usando o método descrito com relação a uma planta do mesmo tipo em que a expressão do polipeptídeo não foi mo- dulada. Em outras modalidades, o traço modulado pode ser florescimento precoce, nanismo, número diminuído de folhas, senescência precoce, ger- minação de semente precoce, formação retardada e reduzida de folhas de roseta, crescimento de raiz de muda aumentado, ou combinações dos mes- mos, em uma planta em que a expressão do polipeptídeo foi modulada u- 5 sando o método descrito com relação a uma planta do mesmo tipo em que a expressão do polipeptídeo não foi modulada.

Por "desenvolvimento", entende-se o processo pelo qual a plan- ta ou parte da planta desenvolve-se, por meio de crescimento e diferencia- ção celular, para atingir a maturidade.

Quando usado com referência a uma expressão de um gene ou

produto de gene, o termo "modular" tipicamente refere-se a um aumento ou um decréscimo no nível de expressão. Em algumas modalidades, o decrés- cimo no nível de expressão do gene ou produto de gene inclui completa ini- bição da expressão do gene ou produto de gene. Em certas modalidades, o 15 decréscimo no nível de expressão do gene ou produto de gene não é uma completa inibição da expressão do gene ou produto de gene.

Em algumas modalidades, quando o nível de expressão do po- lipeptídeo HOG1 (SEQ ID NO: 1) é aumentado em cerca de 3 a cerca de 20 vezes quando comparado ao tipo selvagem, o nível de citoquinina é diminuí- 20 do em cerca de 20 a cerca de 85 por cento, cerca de 30 a cerca de 75 por cento, cerca de 40 a cerca de 65 por cento, ou cerca de 50 a cerca de 55 por cento. Este decréscimo em nível de citoquinina pode resultar na modulação da expressão de características tais como germinação avançada da semen- te em cerca de 4 a 5 cerca de dias, retardo de crescimento, e formação e 25 expansão retardada de novas folhas de roseta. Em outras modalidades, quando o nível de expressão do polipeptídeo HOG1 (SEQ ID NO: 1) é dimi- nuído em cerca de 2 a cerca de 10 vezes quando comparado ao tipo selva- gem, o nível de citoquinina é aumentado em cerca de 20 a cerca de 85 por cento, cerca de 30 a cerca de 75 por cento, cerca de 40 a cerca de 65 por 30 cento, ou cerca de 50 a cerca de 55 por cento. Este aumento em nível de citoquinina pode resultar na modulação da expressão de características tais como germinação de semente retardada em cerca de 5 dias. Como pode ser observado a partir dos examples abaixo, a expressão de características está relacionada ao nível de expressão da citoquinina. Métodos para aumentar ou reduzir o nível de expressão do gene ou produto de gene são também des- critos novamente abaixo.

5 Alternativamente, o termo "modular" pode referir-se a uma mu-

dança nas propriedades biológicas ou funcionais de um gene ou um produto de gene, incluindo o polipeptídeo codificado, na planta. Por exemplo, a mo- dulação pode causar uma mudança na afinidade de ligação do polipeptídeo codificado. Em certas modalidades, a modulação não causa uma mudança 10 na seqüência de ácido nucleico do gene ou a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado.

Tipicamente, a expressão de um ou mais características em uma planta é modulada por modulação da expressão de um polipeptídeo com- preendendo a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1. 15 "Polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados alternadamente aqui para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácido (dipeptídeo ou maior) de acordo com a SEQ ID NO: 1 ligada por meio de ligações de peptídeo ou li- gações de peptídeo, e à variantes e análogos sintéticos do mesmo. Desse modo, estes termos incluem polímeros de aminoácido de acordo com a SEQ 20 ID NO: 1 em que um ou mais resíduos de aminoácido é um aminoácido de ocorrência não-natural sintético, tal como um análogo químico de um amino- ácido de ocorrência natural correspondente, bem como os polímeros de a- minoácido de ocorrência natural. Polipeptídeos da presente invenção inclu- em, porém não estão limitados a, produtos naturalmente purificados, produ- 25 tos de procedimentos sintéticos químicos, e produtos produzidos por técni- cas recombinantes de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo, células bacterianas, levedura, planta maior, inseto e de mamí- feros. Os polipeptídeos da invenção podem compreender componentes não- peptídicos, tais como grupos de carboidrato. Carboidratos e outros substitu- 30 intes não-peptídicos podem ser adicionados a um polipeptídeo pela célula em que o polipeptídeo é produzido, e variarão com o tipo de célula. Para polipeptídeos que são preparados recombinantemente, a natureza e exten- I 29

são das modificações em grande parte serão determinados pela capacidade de modificação pós-translacional da célula hospedeira particular e os sinais de modificação que estão presentes na seqüência de aminoácido do poli- peptídeo em questão. Por exemplo, padrões de glicosilação variam entre 5 diferentes tipos de célula hospedeira. Polipeptídeos são definidos aqui, em termos de suas estruturas de cadeia principal de aminoácido; substituintes tais como grupos carboidrato são geralmente não especificados, porém po- dem estar presentes todavia. Além disso, os polipeptídeos da invenção po- dem também incluir um resíduo de metionina modificado inicial, em alguns 10 casos como um resultado de processos mediados pelo hospedeiro. As prote- ínas podem estar presente como proteínas monoméricas ou como proteínas multiméricas, por exemplo, como dímeros (homo ou heterodímeros) ou trí- meros.

Tipicamente, o polipeptídeo, a expressão do qual deve ser mo- 15 dulada na presente invenção, inclui dentro de seu escopo uma variante ou fragmento da mesma, em que a variante ou fragmento tem atividade biológi- ca que é funcionalmente a mesma do polipeptídeo definido na SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, a atividade biológica é ligação de citoquinina e ativi- dade de receptor. A atividade de receptor envolve a propagação de um sinal *■' 20 extracelular através da membrana celular para tornar-se um sinal intracelular que pode iniciar uma ou mais respostas celulares em ligação da citoquinina ao receptor. Métodos para identificar a ligação de citoquinina e atividade de receptor são bem-conhecidos na técnica e são descritos nos Exemplos 1 e 2 abaixo.

25 Os fragmentos podem conter deleções de aminoácido simples

ou múltiplo de terminal do polipeptídeo ou de estiramentos internos da se- qüência de aminoácido primária. Os fragmentos preferivelmente compreen- dem pelo menos n aminoácidos consecutivos da seqüência origem e, de- pendendo da seqüência particular, n é preferivelmente 7 ou mais (por exem- 30 pio, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 ou mais).

Em uma modalidade, n é 7. Em uma modalidade, n é 18.

Em uma modalidade, n é 33.

Em uma modalidade, n é 42.

Em uma modalidade, n é 58.

Em uma modalidade, n é 175.

Em uma modalidade, n é 222.

Em uma modalidade, n é 409.

Tais fragmentos podem ser "livre repouso", isto é, não parte de ou fundido a outros aminoácidos ou polipeptídeos, ou eles podem estar 10 compreendidos dentro de um polipeptídeo maior do qual eles fazem parte ou região. Quando compreendido dentro de um polipeptídeo maior, o fragmento da invenção mais preferivelmente forma uma única região contínua. Adicio- nalmente, diversos fragmentos podem ser compreendidos dentro de um úni- co polipeptídeo maior.

A invenção também inclui equivalentes funcionais de um poli-

peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1. Os fragmentos de polipeptídeo e equivalentes funcionais da invenção retêm a atividade biológica do polipeptídeo origem, isto é, uma ati- vidade de ligação e receptora de citoquinina. Métodos para identificar a ativi- 20 dade de ligação e receptora de citoquinina são bem-conhecidos na técnica e são descritos nos Exemplos 1 e 2 abaixo.

Os polipeptídeos funcionalmente equivalentes da invenção in- cluem polipeptídeos que são homólogos a um polipeptídeo como menciona- do na SEQ ID NO: 1. Dois polipeptídeos são ditos serem "homólogos" se a 25 seqüência de um dos polipeptídeos tem um grau suficientemente elevado de identidade para a seqüência do outro polipeptídeo. As frases "identidade percentual", "% de identidade", "identidade de proteína", "identidade de se- qüência" etc. quando aplicadas às seqüências de polipeptídeo, referem-se à percentagem de pareamentos de resíduos idênticos entre pelo menos duas 30 seqüências de polipeptídeo alinhadas usando um algoritmo padronizado. Um tal algoritmo pode inserir, de um modo padronizado e reproduzível, interva- los nas seqüências que estão sendo comparadas a fim de otimizar o alinha- mento entre duas seqüências, portanto, obter uma comparação mais signifi- cativa das duas seqüências.

A identidade percentual pode ser determinada usando um ou mais algoritmos ou programas de computador conhecidos na técnica ou 5 descritos aqui. Graus de identidade podem ser facilmente calculados por pessoas versadas na técnica (veja, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Bio- computing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; ComputerAnaIysis of Sequence Data, Parte 1, 10 Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nova Jersei, 1994; Se- quence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991).

Métodos de avaliação da identidade de seqüência de proteína são bem-conhecidos na técnica e serão entendidos por aqueles versados na técnica que no presente contexto, a identidade de seqüência é calculada com base de identidade de aminoácido (algumas vezes referida como "ho- mologia rigorosa"). Por exemplo, o Pacote UWGCG fornece o programa BESTFIT que pode ser usado para calcular a identidade de seqüência (por ^ - 20 exemplo usada em suas fixações de parâmetros) (Devereux e outros, (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). Os algoritmos PILEUP e BLAST (Ba- sic Local Alignment Search Tool) podem ser usados para calcular a identi- dade de seqüência ou alinhamento de seqüências (tipicamente em suas fi- xações de parâmetro), por exemplo, como descrito no Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300 e em Altschul, S, F e outros, (1990) J Mol Biol 215:403.

Software para realizar análises BLAST é disponibilizado por di- versas fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD, e na internet em, por exemplo, "www.ncbi.nlm.nih.gov/". Este algoritmo envolve primeiro a identificação de 30 par de seqüência de classificação elevada (HSPs) por identificação de pala- vras curtas de comprimento W na seqüência de indagação que ou compara ou satisfaz algum escore T limítrofe de valor positivo quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de base de dados. T está referido como o limite de escore de palavra vizinha (Altschul e outros, supra). Estes alcances de palavra vizinha iniciais agem como sementes para pesquisas de iniciação para encontrar HSPs contendo-os. Os alcances de 5 palavra são estendidos em ambas as direções ao longo de cada seqüência até o escore de alinhamento cumulativo poder ser aumentado.

Desse modo, a identidade de seqüência, como referida aqui, pode, por exemplo, ser determinada usando BLAST versão 2.1.3 (ou outras versões do mesmo) usando os parâmetros de referência especificados pelo 10 NCBI (o National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matriz; penalidade aberta de inter- valo=11 e penalidade de extensão de intervalo=1].

Em certas modalidades, as fixações de parâmetro dos algorit- mos/programas anteriormente mencionados são usados.

Tipicamente, mais do que 50% de identidade entre dois polipep-

tídeos são considerados ser uma indicação de equivalência funcional, con- tanto que a atividade do polipeptídeo de referência seja mantida. Polipeptí- deos mais preferidos têm graus de identidade maiores do que 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 20 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identi- dade total de seqüência para o aminoácido representado por SEQ ID NO: 1.

Usando http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, foi mostrado que o polipeptídeo de Arabidopsis thaliana HOG1 da invenção (SEQ ID NO: 1) ge- 25 ralmente compartilha cerca de 80 a 95% de identidade de seqüência de a- minoácido para este homólogo em arroz (isto é, o OsCBP) (SEQ ID NO: 5), trigo (SEQ ID NO: 7), crisântemo (SEQ ID NO: 9) e Petunia hybrida (isto é, o PETCBP) (SEQ ID NO: 13). Mais especificamente, o polipeptídeo de Arabi- dopsis thaliana HOG1 (SEQ ID NO: 1) compartilha cerca de 90% de identi- 30 dade de seqüência de aminoácido com seu homólogo em arroz (SEQ ID NO: 5), cerca de 91% de identidade de seqüência de aminoácido com seu homó- logo em trigo (SEQ ID NO: 7), cerca de 92% de identidade de seqüência de aminoácido com seu homólogo em crisântemo (SEQ ID NO: 9), cerca de 88% identidade de seqüência de aminoácido com seu homólogo em Petunia hybrida (SEQ ID NO: 13), cerca de 99% identidade de seqüência de amino- ácido com seu homólogo em Brassica alboglabra (SEQ ID NO: 11), cerca de 5 90% identidade de seqüência de aminoácido com seu homólogo em Sola- num tubérculoosum (SEQ ID NO: 29) e cerca de 89% de identidade de se- qüência de aminoácido com seu homólogo em Lycopersicon esculentum (SEQ ID NO: 27).

Polipeptídeos funcionalmente equivalentes de acordo com a in- 10 venção destinam-se a incluir polipeptídeos em que em uma ou mais posi- ções neste contexto foram inserções, deleções, ou substituições de aminoá- cido, ou conservativos ou não-conservativos, contanto que tais mudanças resultem em uma proteína que retém uma atividade de ligação e receptora de citoquinina do polipeptídeo-origem. Cada destes tipos de mudanças pode 15 ocorrer sozinho, ou em combinação com os outros, uma ou mais vezes em uma determinada seqüência. Tais variantes podem, por exemplo, ser feitas usando os métodos de construção de proteína e mutagênese direcionada ao sítio.

As proteínas de fusão podem também ser construídas para me- k·' 20 Ihorar características da proteína HOG1, e seus homólogos, ou variantes ou fragmentos da mesma. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, podem ser adicionada à termina- ção N da proteína HOG1, e seus homólogos, ou variante ou fragmento da mesma, para melhorar a estabilidade durante a purificação de uma célula 25 hospedeira. Alternativamente, porções de peptídeo podem ser adicionadas ao polipeptídeo para facilitar a purificação. Tais regiões podem ser removi- das antes da preparação final do polipeptídeo. A adição de porções de pep- tídeo para facilitar a manipulação de polipeptídeos são técnicas de rotina bem-conhecidas por aqueles versados na técnica.

30 Os polipeptídeos da invenção podem ser preparados por uma

variedade de métodos, tais como por purificação de uma planta e por méto- dos recombinantes. Polipeptídeos da invenção, particularmente fragmentos de peptídeo curtos, podem também ser produzidos por síntese química tal como por técnicas de síntese de fase líquida ou sólida convencionais (veja, por exemplo, os métodos descritos em Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, III). Alternativamente, peptí- 5 deos podem ser produzidos por digestão de um polipeptídeo da invenção com proteinases tais como endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C e estafilococo V8-protease.

Purificação dos polipeptídeos da invenção pode ser realizada por quaisquer, ou uma combinação de, técnicas tais como cromatografia por 10 exclusão de tamanho, cromatografia de permuta de íon e cromatografia lí- quida de alto desempenho de fase reversa. Detecção in vitro dos polipeptí- deos ou variantes ou fragmentos dos mesmos da presente invenção pode ser obtida usando uma variedade de técnicas incluindo ELISA (ensaio imu- noabsorvente ligado por enzima), western blotting, imunoprecipitação, imu- 15 nofluorescência, cromatografia de camada fina, cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, análise de aminoácido após hidrólise de ácido e por análise espectrométrica de massa de bombardeio de átomo rápido (FAB). Tais técnicas são comumente usadas por aqueles versados na técni- ca.

Usando métodos que são conhecidos na técnica, o polipeptídeo

da invenção (SEQ ID NO: 1) foi mostrado compreender duas assinaturas conservadas de SAHH. Na segunda assinatura de SAHH, três resíduos de glicina conservados representando o domínio de ligação de dinucleotídeo foram identificados. As citoquininas são derivados de nucleotídeo, é previsto 25 que estes resíduos podem formar um domínio de ligação de citoquinina. Os domínios de transmembrana putativa foram também identificados nas posi- ções de aminoácido 1 a 7 (na terminação N), posições 150 a 191 e posições 59 a 76 de SEQ ID NO: 1.

Outros domínios de ligação de citoquinina putativa foram identifi- cados nas posições de aminoácido 9 a 230 (na terminação N), posições 77 a 485 e posições 406 a 438 (na terminação C). Um domínio de ligação de NAD+ putativo foi identificado nas posições de aminoácido 231 a 405. Um domínio intracelular de terminal N foi identificado nas posições de aminoáci- do 1-58.

Em certas modalidades, a expressão do polipeptídeo na planta é modulada introduzindo em uma ou mais células da planta um polinucleotídeo 5 que modula a expressão do polipeptídeo. O polinucleotídeo da presente in- venção pode ser na forma de RNA, tal como mRNA, ou na forma de DNA, incluindo, por exemplo, cDNA e DNA genômico que podem ser obtidos por clonagem ou que podem ser produzidos sínteticamente. O DNA pode ser de filamento duplo ou filamento único. DNA ou RNA de filamento único pode ser 10 o filamento de codificação, também conhecido como o filamento de sentido, ou ele pode ser o filamento de não-codificação, também referido como o fi- lamento antissense como descrito também abaixo.

O polinucleotídeo adequado para uso no método descrito pode compreender nucleotídeos, ou ácidos nucleicos de ribonucleotídeos, deoxiri- bonucleotídeos ou peptídeo (PNAs), que compreendem bases de purina e pirimidina, ou outras bases de nucleotídeo naturais, quimicamente ou bio- quimicamente modificadas, não-naturais, ou derivatizadas. A cadeia principal do polinucleotídeo pode compreender grupos de açúcar e fosfato, como po- dem tipicamente ser encontrados em RNA ou DNA, ou grupos de açúcar ou fosfato modificados ou substituídos. O polinucleotídeo pode também com- preender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos e análogos de nucleotídeo metilados. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes de não-nucleotídeo. Desse modo, os termos nucleosídeo, nucleotídeo, deoxinucleosídeo e deoxinucleotídeo geralmente incluem aná- Iogos tendo alguns aspectos estruturais em comum com um nucleosídeo ou nucleotídeo de ocorrência natural tal que quando incorporados em uma se- qüência de polinucleotídeo, eles permitem a hibridização com uma seqüên- cia de polinucleotídeo de ocorrência natural em solução. Tipicamente, estes análogos são derivados de nucleosídeos e nucleotídeos de ocorrência natu- ral substituindo e/ou modificando a porção de base, a ribose ou o fosfodiés- ter. As mudanças podem ser ajustadas para estabilizar ou desestabilizar a formação de híbrido ou realçar a especificidade de hibridização com uma seqüência de polinucleotídeo de complementaridade.

O polinucleotídeo da invenção também inclui em seu escopo uma variante ou fragmento da seqüência de polinucleotídeo, em que o refe- rido variante ou fragmento codifica um polipeptídeo tendo uma atividade bio- 5 lógica que seja funcionalmente a mesma como o polipeptídeo (ou fragmento deste) codificado pelo polinucleotídeo da invenção, em particular a seqüên- cia de polinucleotídeo definida na SEQ ID NO: 2 em que a referida variante pode estar localizada e isolada usando técnicas padrão em biologia molecu- lar, sem teste e experimentação indevida.

O grau de homologia entre duas seqüências de polinucleotídeo

pode ser determinado por meios de programas de computador conhecidos na técnica tais como intervalo fornecido no pacote de programa GCG (Pro- gram Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, Agosto de 1996, Gene- tics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) 15 (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453) usando, por exemplo, os parâmetros básicos de penalidade de cri- ação de intervalo de 5 e penalidade de largura de intervalo de 0,3. Os homó- logos de moléculas de polinucleotídeo são moléculas de polinucleotídeo que codificam os polipeptídeos que têm substancialmente as mesmas funções e 20 propriedades similares em diferentes espécies, em que os polipeptídeos co- dificados podem compartilhar, em pelo menos regiões, pelo menos 50% de identidade de aminoácido, e sobre as seqüências de aminoácido completas codificadas, pelo menos cerca de 30% de identidade de aminoácido, pelo menos cerca de 40% de identidade de aminoácido, pelo menos cerca de 25 50% de identidade de aminoácido, pelo menos cerca de 60% de identidade de aminoácido, pelo menos cerca de 70% de identidade de aminoácido, pelo menos cerca de 80% de identidade de aminoácido, pelo menos cerca de 90% de identidade de aminoácido ou pelo menos cerca de 95% de identida- de. Os níveis exemplares de identidade de seqüência do polipeptídeo HOG1 30 (SEQ ID NO: 1) com seu homólogo em arroz (SEQ ID NO: 5), trigo (SEQ ID NO: 7), crisântemo (SEQ ID NO: 9) e Petunia hybrida (SEQ ID NO: 13) fo- ram descritas acima. Os homólogos de polinucleotídeo correspondentes po- I 37

dem compartilhar significantemente menos do que 50% de identidade devido à degeneração no código genético, e diferenças no uso de código preferido entre diferentes gêneros e espécies de planta. Por exemplo, usando CLUS- TAL W (1,83), o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo HOG1 (SEQ ID 5 NO: 1) da invenção foi mostrado ter 82% de identidade de seqüência com seu homólogo em arroz (SEQ ID NO: 6), 83% de identidade de seqüência com seu homólogo em trigo (SEQ ID NO: 8), 82% de identidade de seqüên- cia com seu homólogo em crisântemo (SEQ ID NO: 10), 78% de identidade de seqüência com seu homólogo em Petunia hybrida (SEQ ID NO: 14), 98% 10 de identidade de seqüência com seu homólogo em Brassica alboglabra (SEQ ID NO: 12), 79% de identidade de seqüência com seu homólogo em Lycopersicon eseuientum (SEQ ID NO: 28), 80% de identidade de seqüência com seu homólogo em Soianum tubereuioosum (SEQ ID NO: 30) e 78% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo 15 SAHH1 de Nieotiana tabaeum ev. Xanthi (SEQ ID NO: 4).

A molécula de polinucleotídeo pode também incluir em seu es- copo uma variante capaz de hibridizar para as moléculas de polinucleotídeo da invenção, em particular, as seqüências de polinucleotídeos definidas nas SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, e 15 sob condições de rigorosidade baixa, >·' 20 mais preferivelmente, rigorosidade média e ainda mais preferivelmente, rigo- rosidade alta. As condições de hibridização de rigorosidade baixa podem corresponder à hibridização realizada a 50°C em 2 x SSC.

As condições experimentais adequadas para determinar se uma determinada molécula de polinucleotídeo hibridiza para um polinucleotídeo 25 especificado podem envolver a pré-imersão de um filtro contendo uma a- mostra relevante do polinucleotídeo a ser examinado em 5 x SSC durante 10 min, e pré-hibridização do filtro em uma solução de 5 x SSC, 5 x solução de Denhardt1S, 0,5% de SDS e 100 μς/ιηΙ de DNA de esperma de salmon soni- cado desnaturado, seguido por hibridização na mesma solução contendo

32

30 uma concentração de 10 ng/ml de uma sonda rotulada por P-dCTP durante 12 horas em aproximadamente 45°C, de acordo com os métodos de hibridi- zação como descrito em Sambrook e outros (1989; Molecular Cloning, A La- boratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbour1 Nova Iorque).

O filtro é então lavado duas vezes durante 30 minutos em 2 x SSC1 0,5% de SDS pelo menos 55°C (rigorosidade baixa), pelo menos 60°C (rigorosidade média), pelo menos 65°C (rigorosidade média/alta), pelo me- 5 nos 70°C (rigorosidade alta), ou pelo menos 75°C (rigorosidade muito alta). A hibridização pode ser detectada por exposição do filtro a uma película de raios X.

Além disso, existem numerosas condições e fatores, bem- conhecidos por aqueles versados na técnica, que podem ser empregados

para alterar a rigorosidade de hibridização. Por exemplo, o comprimento e natureza (DNA, RNA, composição de base) do polinucleotídeo a ser hibridi- zado para um polinucleotídeo especificado; concentração de sais e outros componentes, tais como a presença ou ausência de formamida, sulfato de dextrano, polietileno glicol etc; e alterar a temperatura da hibridização e/ou 15 etapas de lavagem.

Além disso, é também possível teoricamente predizer se ou não duas determinadas seqüências de polinucleotídeo hibridizarão sob certas condições especificadas. Consequentemente, como uma alternativa para o método empírico descrito acima, a determinação quanto a se uma seqüência 20 de polinucleotídeo variante hibridizará para a molécula de polinucleotídeo definida de acordo com o segundo ou terceiro aspecto, ou mais especifica- mente, o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 ou 15 pode ser com base em um cálculo teórico do Tm (temperatura de fusão) em que duas seqüências de polinucleotídeo heterólogas com seqüências conhecidas hibridizarão sob 25 condições especificadas, tais como temperatura e concentração de sal.

Ao determinar a temperatura de fusão para seqüências de poli- nucleotídeo heterólogas (Tm(hetero)) é necessário primeiro determinar a tempe- ratura de fusão (Tm(homo)) para seqüências de polinucleotídeo homólogas. A temperatura de fusão (Tm(h0mo)) entre dois filamentos de polinucleotídeo 30 completamente complementar (formação homoduplex) pode ser determina- da de acordo com a seguinte fórmula, como descrito em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1995, como: Tm(homo) = 81,5°C + 16,6(log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de forma)- 500/L M = significa a molaridade de cátions monovalentes,

% de GC = % de guanina (G) e citosina (C) de número total de bases na seqüência,

5 % de forma = % de formamida no tampão de hibridização, e

L = o comprimento da seqüência de polinucleotídeo.

Tm determinado pela fórmula acima é o Tm de uma formação homoduplex (Tm(h0mo)) entre dois polinucleotídeos de seqüência completa- mente complementar. Para adaptar o valor de Tm àquele de duas sequên-

cias de polinucleotídeos heterólogas, é suposto que uma diferença de 1% em seqüência de nucleotídeo entre duas seqüências heterólogas se iguale a diminuição de 1°C em Tm. Portanto, o Tm(hetero) para a formação de heterodu- plex é obtido por subtração do % de diferença de homologia entre as se- qüências análogas em questão e a sonda de nucleotídeo descrita acima do 15 Tm(homo)·

Tipicamente, a molécula de polinucleotídeo definida na SEQ ID NO: 2 ou 15 também inclui em seu escopo uma molécula de polinucleotídeo que é um fragmento de oligonucleotídeo do mesmo. Tipicamente, o fragmen- to de oligonucleotídeo é entre cerca de 15 a cerca de 1775 nucleotídeos em ■20 comprimento. Mais tipicamente, o fragmento de oligonucleotídeo é entre cer- ca de 15 a cerca de 1200 nucleotídeos em comprimento. Ainda mais tipica- mente, o fragmento de oligonucleotídeo é entre cerca de 15 a cerca de 700 nucleotídeos em comprimento. Ainda mais tipicamente, o fragmento de oli- gonucleotídeo é entre cerca de 15 a cerca de 200 nucleotídeos em compri- 25 mento. Contudo, ainda mais tipicamente, o fragmento de oligonucleotídeo é entre cerca de 15 a cerca de 75 nucleotídeos em comprimento.

Tipicamente, o fragmento de oligonucleotídeo é entre cerca de 15 a cerca de 1775 de nucleotídeos em comprimento. Mais tipicamente, o fragmento de oligonucleotídeo é entre cerca de 100 a cerca de 1775 nucleo- 30 tídeos em comprimento. Ainda mais tipicamente, o fragmento de oligonu- cleotídeo é entre cerca de 500 a cerca de 1775 nucleotídeos em comprimen- to. Ainda mais tipicamente, o fragmento de oligonucleotídeo é entre cerca de 1000 a cerca de 1775 nucleotídeos em comprimento. Contudo, ainda mais tipicamente, o fragmento de oligonucleotídeo é entre cerca de 1200 a cerca de 1775 nucleotídeos em comprimento.

O termo "complementar" se refere à hibridização ou pareamento 5 de base entre nucleotídeos ou ácido nucleicos, tal como, por exemplo, entre os dois filamentos de uma molécula de DNA de filamento duplo ou entre um iniciador de oligonucleotídeo e um sítio de ligação de iniciador em um ácido nucleico de filamento único a ser sequenciado ou amplificado. Os nucleotí- deos complementares são, geralmente, A e T (ou A e U), ou C e G. Duas

moléculas de RNA ou DNA de filamento único são referidas serem comple- mentares quando os nucleotídeos de um filamento, de modo mais eficiente alinhados e comparados e com inserções ou deleções de nucleotídeo apro- priadas, se emparelham com pelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos do outro filamento, geralmente pelo menos cerca de 90% a 95%, e mais preferi- 15 velmente de cerca de 98 a 100% dos nucleotídeos do outro filamento. Alter- nativamente, a complementaridade existe quando um filamento de RNA ou DNA hibridiza sob condições de hibridização seletiva para seu complemento. Tipicamente, a hibridização seletiva ocorrerá quando houver pelo menos cerca de 65% de complementaridade em um amido de pelo menos 14 a 25 20 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos cerca de 75%, e mais preferivel- mente pelo menos cerca de 90% de complementaridade.

O polipeptídeo e moléculas de polinucleotídeo da presente in- venção são "isolados". O termo "isolado" como aqui usado refere-se à subs- tância que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que 25 normalmente o acompanham em seu estado nativo. Por exemplo, um "poli- nucleotídeo isolado", como usado aqui, se refere a um polinucleotídeo, que foi purificado das seqüências que o flanqueam em um estado de ocorrência natural. A substância "isolada" está ou presente em uma preparação em uma concentração mais elevada do que a substância encontrada por nature- 30 za ou em seu estado de ocorrência natural ou que a substância está presen- te em uma preparação que contém outros materiais com os quais as subs- tâncias não estão associadas por natureza. Em certas modalidades, o polipeptídeo e moléculas de polinu- cleotídeo da presente invenção são moléculas exógenas. O termo "exógeno" quando usado com referência a um polinucleotídeo ou molécula de polipep- tídeo significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo é isolado e/ou derivado 5 da espécie exceto as espécies de célula-alvo, em que o polinucleotídeo ou polipeptídeo deve ser introduzido.

Em uma modalidade, um polinucleotídeo que reduz a expressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 é introduzido na planta de interesse. O polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo inibidor, por exem- 10 pio, um polinucleotídeo de antissense (tal como, RNA de antissense), um constructo de interferência de RNA (tal como siRNA) e um constructo de á- cido nucleico de antissentio catalítico (tal como a ribozima). O polinucleotí- deos pode ser preparado usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, por síntese química, procedimentos de DNA re- 15 combinante ou, no caso de RNA de antissense, por transcrição in vitro ou in vivo quando ligado a um promotor.

Em certas modalidades, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo de antissense. Um "polinucleotídeo de antissense" é uma seqüência de poli- nucleotídeo que é complementar a, e pode, portanto, hibridizar com qualquer ■20 uma ou todas das seqüências de codificação da presente invenção, incluin- do seqüências parciais da mesma.

As moléculas de antissense de tamanho natural podem ser usa- das para este propósito. Alternativamente, os oligonucleotídeos de filamento duplo, de sentido e/ou antissense, ou uma combinação dos mesmos direcio- 25 nados para regiões específicas do RNA codificado por HOG1 podem ser utilizados. O uso de moléculas de oligonucleotídeo para diminuir os níveis de expressão de um gene predeterminado é conhecido na técnica (veja, por exemplo, Hamilton, A.J. and Baulcombe, D. C. (1999), "A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants", Science 30 286:950-952; Waterhouse P.M. e outros (1998) , "Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:13959- 13964; e Publicações de Patente Internacional WO 99/53050, WO 99/49029, WO 99/32619). As moléculas de oligonucleotídeo podem ser fornecidas in situ transformando- se células de planta com um constructo de DNA que, sob transcrição, produz seqüências de RNA de filamento duplo e/ou antissense, que podem ser se- 5 quências de tamanho natural ou parciais. O efeito de silenciamento de gene pode ser realçado por superprodução de ambas seqüências de senso e/ou antissense (que podem ser de tamanho natural ou parciais) de modo que uma quantidade elevada de RNA de filamento duplo seja produzida.

Como descrito acima, as seqüências de constructos de antis- sense podem ser derivadas de várias regiões do gene HOG1. Por exemplo, uma seqüência de antissense pode compreender pelo menos 15, pelo me- nos 20, ou pelo menos 25 resíduos de ácido nucleico contíguos de um poli- nucleotídeo sendo complementar a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1. A seqüência de antissense po- de compreender cerca de 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou 850 resíduos de ácido nucleico contíguos. Qualquer seqüência contígua compreendendo o número desejado de resí- duos pode ser usada. As seqüências contíguas podem ser designadas u- sando qualquer método e algoritmo conhecido na técnica. Como um exem- plo, onde os polinucleotídeos de antissense compreendendo 15 resíduos de ácido nucleico contíguos são desejados, um primeiro polinucleotídeo pode compreender 15 resíduos de ácido nucleico contíguos iniciando na posição 301 de um seqüência de polinucleotídeo e terminando na posição 315 da seqüência de polinucleotídeo, um segundo polinucleotídeo pode compreen- der 15 resíduos de ácido nucleico contíguos iniciando na posição 302 de um seqüência de polinucleotídeo e terminando na posição 316 da seqüência de polinucleotídeo, um terceiro polinucleotídeo pode compreender 15 resíduos de ácido nucleico contíguos iniciando na posição 303 de um seqüência de polinucleotídeo e terminando na posição 317 da seqüência de polinucleotí- deo, e um quarto polinucleotídeo pode compreender 15 resíduos de ácido nucleico contíguos iniciando na posição 304 de um seqüência de polinucleo- tídeo e terminando na posição 318 do seqüência de polinucleotídeo. Os poli- nucleotídeos adicionais compreendendo 15 resíduos de ácido nucleico con- tíguos podem ser obtidos seqüencialmente identificando-se estiramentos de 5 15 resíduos de ácido nucleico contíguo ao longo de uma cadeia de polinu- cleotídeo. Seria óbvio para uma pessoa versada na técnica que seqüências contíguas de outros comprimentos pudessem ser preparadas usando uma estratégia similar.

Em uma modalidade, um primeiro polinucleotídeo de antissense compreendendo 15 resíduos de ácido nucleico contíguos iniciando na posi- ção 271 e terminando na posição 286 da seqüência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 tem a seguinte seqüência de ácido nucleico: CTC GGC GCG GAA GTC (SEQ ID NO: 16). Ao usar a estratégia descrita acima, um segun- do polinucleotídeo de antissense compreendendo 15 resíduos de ácido nu- cleico contíguos iniciando na posição 272 e terminando na posição 287 da seqüência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 tem a seguinte seqüência de ácido nucleico: TCG GCG CGG AAG TCA (SEQ ID NO: 17). Terceiro e quar- to polinucleotídeos de antissense têm as seguintes seqüências de ácido nu- cleico, respectivamente: CGG CGC GGA AGT CAG (SEQ ID NO: 18) e GGC -20 GCG GAA GTC AGA (SEQ ID NO: 19). Os polinucleotídeos de antissense adicionais compreendendo 15 resíduos de ácido nucleico contíguos podem ser obtidos como descrito acima.

Em certas modalidades, o polinucleotídeo de antissense com- preende 15 resíduos de ácido nucleico contíguo. Em modalidades particula- res, o polinucleotídeo antissense compreende pelo menos 100 resíduos de ácido nucleico contíguos.

Os constructos de antissense podem ser designadas para dire- cionar e se ligar às regiões reguladoras da seqüência de nucleotídeo, tais como o promotor, ou às seqüências de codificação (exon) ou não- 30 codificação (intron). Em uma modalidade, os polinucleotídeos de antissense direcionados na SEQ ID NO: 2 são usados, o que resulta na expressão di- minuída do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1. Em uma modalida- de, os polinucleotídeos de antissense de acordo com a SEQ ID NO: 15 (um fragmento de 850 bp de SEQ ID NO: 2 abrangendo dois domínio de assina- tura de SAHH) são usados. Os constructos de antissense da invenção po- dem ser geradas as quais sejam pelo menos substancialmente complemen- 5 tares através de seu comprimento à região do gene HOG1 em questão (SEQ ID NO: 2). A ligação de um constructo de antissense à sua seqüência celular complementar pode interferir com a transcrição, processamento de RNA, transporte, translação e/ou estabilidade de mRNA. Os polinucleotídeos de antissense adequados podem ser preparados por métodos bem-conhecidos 10 por aqueles versados na técnica. Tipicamente, os polinucleotídeos de antis- sense serão sintetizados em sintetizadores automáticos. Os polinucleotídeos de antissense adequados podem incluir modificações designadas para me- lhorar sua liberação nas células, sua estabilidade uma vez dentro de uma célula, e/ou sua ligação a um alvo apropriado. Por exemplo, o polinucleotí- 15 deo de antissense pode ser modificado pela adição de uma ou mais ligações de fosforotioato, ou a inclusão de um ou mais anéis de morfolina na cadeia principal.

Alternativamente, os constructos de RNAi podem ser usados para diminuir a expressão dos polinucleotídeos codificando o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1 de acordo com métodos conhecidos na téc- nica (por exemplo, Fire e outros (1998) Nature 391: 806-811; Hammond, e outros (2001) Nature Rev, Genet. 2: 110-1119; Hammond e outros (2000) Nature 404: 293-296; Bernstein e outros (2001) Nature 409: 363-366; Elba- shir e outros (2001) Nature 411: 494-498; WO 99/49029 e WO 01/70949, as descrições das quais estão incorporadas aqui por referência). RNAi se refere a um meio de silenciamento de gene pós-transcricional seletivo por destrui- ção de mRNA específico por moléculas de RNA interferentes pequenas (siRNA). O siRNA é tipicamente gerado pela clivagem de RNA de filamento duplo, onde um filamento é idêntico à mensagem a ser inativada. As molécu- Ias de RNA de filamento duplo podem ser sintetizadas nas quais um filamen- to é idêntico a uma região específica da transcrição de mRNA e introduzida diretamente. Alternativamente, o DNA de filamento duplo correspondente pode ser empregado, o qual, uma vez apresentado intracelularmente é con- vertido em RNA de filamento duplo. Os métodos para a síntese de moléculas de siRNA adequadas para uso em RNAi e para obter silenciamento de gene pós-transcricional são conhecidos por aqueles versados na técnica. O desti- 5 natário versado apreciará que uma faixa de construções de siRNA adequada capaz de diminuir a expressão do polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 2 pode ser identificada e gerada com base no conhecimento da se- qüência do gene em questão usando procedimentos de rotina conhecidos por aqueles versados na técnica sem experimentação indevida.

10 Aqueles versados na técnica também apreciarão que não há

necessidade de haver necessariamente 100% de pareamento de seqüência de nucleotídeo entre a sequência-alvo e a seqüência de siRNA. A capacida- de de má combinação é amplamente dependente do local da má combina- ção nas seqüências. Em alguns casos, as más combinações de 2 ou 3 nu- 15 cleotídeos podem ser aceitáveis, porém em outros casos uma única má combinação de nucleotídeo é o bastante para negar a eficácia do siRNA. A adequadabilidade de uma molécula de siRNA particular pode ser determina- da usando procedimentos de rotina conhecidos por aqueles versados na técnica sem experimentação indevida. Por exemplo, um polinucleotídeo de k-20 interferência de RNA que compreende uma seqüência de ácido nucleico compreendendo pelo menos 9 resíduos de ácido nucleico contíguos selecio- nados da seqüência de ácido nucleico que é complementar a um polinucleo- tídeo consistindo na seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 2 pode ser usado. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos de 25 interferência de RNA que compreendem uma seqüência de ácido nucleico compreendendo cerca de 9, 10, 11, ou 12 resíduos de ácido nucleico contí- guos, podem ser usados. Qualquer seqüência contígua compreendendo o número de resíduos desejado pode ser usada. As seqüências contíguas po- dem ser designadas usando qualquer método e algoritmo conhecido na téc- 30 nica. Como um exemplo, onde os polinucleotídeos de interferência de RNA compreendendo 9 resíduos de ácido nucleico contíguos são desejados, um primeiro polinucleotídeo pode compreender 9 resíduos de ácido nucleico contíguos iniciando na posição 61 de uma seqüência de polinucleotídeo e terminando na posição 69 da seqüência de polinucleotídeo, um segundo po- linucleotídeo pode compreender 9 resíduos de ácido nucleico contíguos ini- ciando na posição 62 de uma seqüência de polinucleotídeo e terminando na 5 posição 70 da seqüência de polinucleotídeo, um terceiro polinucleotídeo po- de compreender 9 resíduos de ácido nucleico contíguos iniciando na posição 63 de uma seqüência de polinucleotídeo e terminando na posição 71 da se- qüência de polinucleotídeo, e um quarto polinucleotídeo pode compreender

9 resíduos de ácido nucleico contíguos iniciando na posição 64 de uma se- 10 quência de polinucleotídeo e terminando na posição 72 da seqüência de po- linucleotídeo. Os polinucleotídeos adicionais compreendendo 9 resíduos de ácido nucleico contíguos podem ser obtidos seqüencialmente identificando- se como estiramentos de 9 resíduos de ácido nucleico contíguos ao longo da cadeia de polinucleotídeo. Seria óbvio para uma pessoa versada na técnica 15 que as seqüências contíguas de outros comprimentos possam ser prepara- das usando uma estratégia similar.

Em uma modalidade, o primeiro polinucleotídeo de interferência de RNA compreendendo 9 resíduos de ácido nucleico contíguos iniciando na posição 42 e terminando na posição 50 da seqüência de polinucleotídeo de 20 SEQ ID NO: 2 tem a seguinte seqüência: AGA TCC GAA (SEQ ID NO: 20). Ao usar a estratégia descrita acima, um segundo polinucleotídeo de interfe- rência de RNA compreendendo 9 resíduos de ácido nucleico contíguos inici- ando na posição 43 e terminando na posição 51 da seqüência de polinucleo- tídeo de SEQ ID NO: 2 tem a seguinte seqüência: GAT CCG AAA (SEQ ID 25 NO: 21). O terceiro e quarto polinucleotídeo de interferência de RNA têm as seguintes seqüências, respectivamente: ATC CGA AAA (SEQ ID NO: 22) e TCC GAA AAA (SEQ ID NO: 23). Os polinucleotídeos de interferência de RNA adicionais compreendendo 9 resíduos de ácido nucleico contíguos po- dem ser obtidos como descrito acima. Informações adicionais sobre o plane- 30 jamento e uso de siRNA também podem ser encontradas em "The siRNA User Guide," disponibilizado em www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/10- 0/105/sirna.html. Outro meio de diminuir uma expressão dos polinucleotídeos co- dificando o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1 pode ser obtido in- troduzindo-se constructos de ácido nucleico de antissense catalíticos, tais como ribozimas, que são capazes de clivar as transcrições de RNA e, desse 5 modo, prevenir a produção de proteína do tipo selvagem. As ribozimas são direcionadas e anelam-se com uma seqüência particular em virtude de duas regiões de complementaridade de seqüência com o alvo flanqueando o sítio catalítico de ribozima. Após a ligação, a ribozima cliva o alvo de uma manei- ra específica do sítio. O planejamento e teste de ribozimas que especifica- 10 mente reconhecem e clivam as seqüências de interesse pode ser obtido por técnicas bem-conhecidas por aqueles na técnica (por exemplo, Lieber and Strauss, (1995) Mol. Cell. Biol. 15:540-551, a descrição do qual está incorpo- rada aqui por referência).

Em certas modalidades, a diminuição em uma expressão do po- 15 linucleotídeo codificando o polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1 é o resultado da cossupressão. A cossupressão se refere à inibição de um gene endógeno causada pela introdução de um transgene. Tipicamente, a cossu- pressão é observada em plantas transgênicas que foram transformadas com uma ou mais cópias de uma construção de gene que são idênticas a ou ‘ ■ 20 compartilham homologia de seqüência de nucleotídeo com um gene endó- geno. Em algumas destas plantas transformadas, a supressão pode ocorrer para ambos o transgene introduzido bem como o homólogo endógeno, por exemplo, como um resultado da produção fortuita de RNA de antissense, ou devido às interações cromossômicas anômalas entre o transgene introduzi- 25 do e o homólogo endógeno (Hooper, The petunia paradox: added copies of genes have puzzling effects in plants, J. NIH Res- 3:49-54, (1991). Em con- sequencia, ao invés de resultar em um nível aumentado de expressão do transgene introduzido, a cossupressão leva a uma diminuição no nível de expressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1.

30 Como descrito no Exemplo 2, Figuras 9c, 11a, 11b, 11 d, e 11 g, e

Tabela 8 abaixo, algumas das plantas de arroz transgênicas transformadas com os constructos de superexpressão exibiram características que foram vistas em plantas transformadas com construções de antissense como um resultado de cossupressão. Por exemplo, estas plantas de cossupressão exibiram ramificação dos nodos acima do solo dos cultivos principais (que levam a um aumento total significante no número de panículas por planta), e 5 aumentam de 2 a mais de 3 vezes no número médio de sementes e biomas- sa da planta quando comparado ao WT.

Os polinucleotídeos que introduzem uma mutação compreen- dendo inserções, deleções ou substituições de nucleotídeo únicas ou múlti- plas para diminuir uma expressão do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 são também contempladas. As inserções, deleções ou substituições únicas ou múltiplas de nucleotídeo podem ser introduzidas através de re- combinação do sítio de mutação alvo com uma seqüência de nucleotídeo de direcionamento introduzida. Tal seqüência de nucleotídeo introduzida pode, por exemplo, compreender uma seqüência de nucleotídeo a ser introduzido no genoma flanqueado em cada lado por seqüências de nucleotídeo homó- logas às sequências-alvo contíguo em ou localizadas em qualquer lado de um ponto de inserção de mutação desejado. As seqüências de nucleotídeo homólogas às sequências-alvo podem ser isogênicas com as sequências- alvo para de esse modo promover a frequência de recombinação homóloga. As seqüências de nucleotídeo homólogas que não são estrita-

mente isogênicas às sequências-alvo podem também ser usadas. Embora a má combinação entre as seqüências de nucleotídeo homólogas e as se- quências-alvo possa adversamente afetar a frequência de recombinação homóloga, a isogenicidade não é estritamente requerida e homologia subs- 25 tancial pode ser suficiente. Para os propósitos da presente invenção, o nível de homologia entre as seqüências homólogas e as sequências-alvo pode ser pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 95% de iden- tidade, pelo menos cerca de 99% de identidade ou 100% de identidade.

As mutações podem ser introduzidas por técnicas mutagênicas químicas ou físicas, ou usando meios de mutação insercionais tais como transposons ou T-DNA, e ácido nucleico exógeno podem ser introduzidos por meios recombinantes empregando, por exemplo, permeação de célula auxiliada por substância química (usando, por exemplo, cálcio, lítio, PEG), eletroporação, microinjeção, transfecção mediada por lipossoma, bombar- deio de micropartícula (biolisticas), transformação mediada por Agrobacteri- um, infecção de vírus, fusão de protoplasto ou qualquer outro meio apropria- 5 do como são conhecidos na técnica.

A diminuição ou aumento em uma expressão dos polinucleotí- deos codificando o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 pode ser estável ou transitório (por exemplo, somente em estágios de desenvolvimen- to específico ou tecido em uma ou duas gerações), dependendo se a planta 10 foi estavelmente ou transitoriamente transformada. "Estavelmente transfor- mada" se refere à introdução e integração de um ou mais transgenes no ge- noma de uma célula. A transformação estável de uma célula pode ser detec- tada por técnicas que são conhecidas na técnica, por exemplo, por hibridiza- ção de manchamento do Sul de DNA genômico da célula com seqüências 15 de ácido nucleico que sejam capazes de se ligar a um ou mais dos transge- nes, ou pela reação em cadeia de polimerase de DNA genômico da célula para amplificar as seqüências de transgene.

Ao contrário, o termo "transitoriamente transformado" se refere à introdução de um ou mais transgenes em uma célula onde o transgene não ^ 20 integra no genoma da célula transformada. A transformação transitória pode ser detectada, por exemplo, detectando-se a presença de um polipeptídeo codificado por um ou mais dos transgenes usando ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) ou por detecção da atividade da proteína (por e- xemplo, β-glucuronidase) codificada pelo transgene. Desse modo, um trans- 25 formante estável é distinguido do transformante transitório pelo fato de que, considerando que o DNA genômico do transformante estável contém um ou mais transgenes, o DNA genômico do transformante transitório não contém um transgene.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser administrados na 30 forma de um plasmídeo de DNA nu ou em um vetor. Os plasmídeos de DNA nu podem ser introduzidos nas células hospedeiras por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, transdu- ção, fusão de célula, dextrano de DEAE, precipitação de fosfato de cálcio, uso de uma pistola de gene, ou uso de um transportador de vetor de DNA.

Em algumas modalidades preferidas, os polinucleotídeos da in- venção podem ser administrados em um vetor. O vetor pode ser um vetor de plasmídeo, um vetor viral, ou qualquer outro veículo adequado (tal como cosmídeos) adaptado para a inserção de seqüências estrangeiras e introdu- ção em células eucarióticas. Em certas modalidades, o vetor é um vetor de expressão capaz de direcionar a transcrição da seqüência de DNA de uma molécula de polinucleotídeo inibidora da invenção no RNA. Os vetores de expressão virais incluem, por exemplo, vetores com base em vírus epstein- barr, vírus do papiloma bovino, adenovírus e vírus adeno-associado. Em uma modalidade, o vetor é epissômico. O uso de um vetor epissômico ade- quado fornece um meio de manter a molécula de ácido nucleico inibidora em células alvo em número de cópia elevado extra-cromossomicamente desse modo eliminando os efeitos potenciais de integração cromossômica.

Os vetores podem também compreender ácidos nucleicos inclu- indo expressão de elementos de controle, tais como sinais de controle de transcrição/translação, origens de replicação, sinais de poliadenilação, sítios de entrada de ribossoma internos, promotores, realçadores, etc., em que os elementos de controle são operativamente associados com um ácido nuclei- co codificando um produto de gene. Por exemplo, a ligação operativa de uma região de codificação a um promotor permite a transcrição da região de codificação do promotor por um RNA polimerase que especificamente reco- nhece, se liga a e transcreve a região de codificação. Em certas modalida- des, a região de codificação é colocada sob um promotor constitutivo pode- roso, tal como o promotor de vírus mosaico da couve-flor (CaMV) 35S ou o promotor do vírus mosaico de figueira 35S. Outros promotores constitutivos contemplados para uso na presente invenção incluem, porém não estão limi- tados a: promotores de T-DNA manopina sintetase, nopalina sintase (NOS) e octopina sintase (OCS).

Alternativamente, os promotores induzíveis tais como promoto- res induzíveis por tensão (por exemplo, promotores de Iuz elevada, secura, I 51

salinidade ou induzidos por temperatura) podem ser usados. Os promotores induzíveis exemplares incluem os promotores de gene de subunidade pe- quenos de ribulose bisfosfato carboxilase (RuBisCo) ou promotores de gene de clorofila a/b proteína de ligação (CAB) para expressão em tecido fotossin- 5 tético, vários promotores gene de proteína de armazenamento de semente para expressão em sementes, e promotores de gene de glutamina sintetase específica de raiz para expressão no sistema de raiz da planta transformada.

O vetor pode ser um vetor binário. Por exemplo, um sistema de vetor binário de Agrobacterium pode ser usado, que compreende a região de 10 codificação selecionada sob controle de um promotor constitutivo ou induzí- vel como descrito acima, e ligado a um marcador de resistência de fármaco nuclear, tal como resistência a canamicina. Outros sistemas de marcador selecionáveis úteis incluem, porém não estão limitados a: outros genes que conferem resistências ao antibiótico (por exemplo, resistência à higromicina 15 ou bialafos) ou resistência à herbicida (por exemplo, resistência à sulfonilu- reia, fosfinotricina, ou glifosato). Os vetores binários comumente usados in- cluem pBIN19, pPVP e pGreen.

Em algumas modalidades, pode também ser útil remover, adi- cionar ou alterar as porções não-transladadas 5' dos clones para eliminar códons de iniciação de translação alternativa potencialmente inapropriada extra, (isto é, início) ou outras seqüências que podem interferir com ou redu- zir a expressão, no nível de transcrição ou translação. Alternativamente, os sítios de ligação de ribossoma de consenso (veja, por exemplo, Kozak, J Biol. Chem., 266:19867- 19870 (1991)) podem ser inseridos imediatamente a 5' do códon inicial para realçar a expressão. O desejo de (ou necessidade de) tal modificação pode ser empiricamente determinado, e a seleção destes e outros elementos de vetor comuns, são convencionais. Muitas tais se- qüências também podem ser derivadas de vetores comercialmente disponí- veis. (Veja, por exemplo, Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning, Cold S- pring Harbor Laboratory (1989), Sambrook, J. e Russell, D.W. (2001), "Mole- cular Cloning: A Laboratory ManuaP', 3a edição, Cold Spring Harbor Labora- tory Press, e referências citadas aqui e Ausubel e outros (eds) Current Pro- tocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2000)).

O vetor da invenção pode ser introduzido em células alvo usan- do qualquer método adequado conhecido na técnica para introduzir DNA em células, incluindo, porém não limitado a microinjeção, eletroporação, precipi- tação de fosfato de cálcio, liberação mediada por lipossoma, infecção viral, fusão de protoplasto, e absorção mediada por partícula. Opcionalmente, um polinucleotídeo da invenção é coadministrado com uma recombinase, por exemplo, recA, a uma célula-alvo para desse modo realçar a taxa de recom- binação homóloga. A(s) célula(s)-alvo pode(m) já compreender, ou ter(em) sido transformada(s) para compreender sequências-alvo de recombinase adequadas, se requerido. Por exemplo, proteína(s) recombinase pode(m) ser carregada(s) sobre um DNA de direcionamento como descrito na Pat U.S. N0 6.255.113. Para realçar o processo de carregamento, um polinucleo- tídeo da invenção pode conter uma ou mais seqüências de nucleação re- combinogênicas, ou ser revestida com uma proteína recombinase por pré- incubação do polinucleotídeo com uma recombinase, por meio do que a re- combinase é não covalentemente ligada ao polinucleotídeo (Veja, por exem- plo, A. Vergunst e outros (1998), Nucleic Acids Res. 26:2729 e A. Vergunst e P. Hooykaas (1998), Plant Molec. Biol. 38:393 406, Publicações de Patente Internacionais WO 99/25821, WO 99/25840, WO 99/25855, e WO 99/25854 e Pat. U.S. N0S 5.780.296, 6.255.113, e 6.686.515).

As plantas transgênicas com um dos polinucleotídeos da inven- ção podem ser geradas usando métodos de transformação de planta conhe- cidos por aqueles versados na técnica incluindo, porém não limitado a, trans- 25 formação mediada por Agrobacterium, tratamento de cátion ou polietileno glicol de protoplastos, eletroporação, bombardeio de micropartícula, agitação de suspensões de célula em solução com microcontas ou micropartículas revestidas com o DNA de transformação, absorção de DNA direta, absorção de DNA mediada por lipossoma, e similar, com também descrito em uma 30 ampla faixa de textos publicamente disponíveis, tal como: Methods for Plant Molecular Biology" (Weissbach & Weissbach, eds., 1988); Clough, S.J. e Bent, A. F. (1998) "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium- mediated transformation of Arabidopsis thaliana" Plant J. 16, 735-743; "Me- thods in Plant Molecular Biology" (Schuler & Zielinski, eds., 1989); "Plant Mo- lecular Biology Manual" (Gelvin, Schilperoort, Verma, eds., 1993); e "Me- thods in Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual" (Maliga, Klessig, Ca- 5 shmore, Gruissem & Varner, eds., 1994). Veja também Sambrook, J. e ou- tros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Sambrook, J. e Russell, D.W. (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e referências citadas aqui e Ausubel e outros (eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 10 (2000), estas referências sendo incorporadas aqui por referência cruzada.

O método preferido de transformação pode depender da planta a ser transformada. Os vetores de Agrobacterium são geralmente usados para transformar as espécies dicotiledôneas. Para transformação de espécies monocotiledôneas, o bobardeio biolístico com partículas revestidas com 15 DNA de transformação e fibras de silício revestidas com DNA de transforma- ção são geralmente úteis para transformação nuclear. Entretanto, a trans- formação mediada por Agrobacterium de espécies monocotiledôneas, inclu- indo trigo, são agora conhecidas (veja, por exemplo, Publicações de Patente Internacionais WO 97/48814; veja também Hiei, Y. e outros (1994), Plant J.

‘ ■ 20 6(2):271-282 e Publicação de patente Internacional WO 92/06205).

Qualquer célula de planta pode ser transformada usando os mé- todos e materiais da presente invenção para produzir plantas geneticamente modificadas, células de planta, tecido de planta, semente, e similar. As célu- las de planta que foram transformadas podem ser desenvolvidas em plantas 25 de acordo com métodos convencionais como são conhecidos na técnica (Veja, por exemplo, McCormick, S. e outros (1986), Plant Cell Reports 5:81- 84). As plantas resultantes podem ser auto-polinadas, polinadas com o mesmo filamento transformado ou filamentos diferentes ou hibridizadas, e a planta resultante tendo as características desejadas associadas com SEQ ID 30 NO: 1 ou o homólogo deste identificado. Duas ou mais gerações podem ser desenvolvidas para garantir que esta característica fenotípica seja estavel- mente mantida. Alternativamente, em colheitas vegetativamente propaga- das, as plantas mutantes/transgênicas maduras podem ser propagadas por corte ou por técnicas de cultura de tecido para produzir plantas idênticas. A seleção de plantas mutantes/transgênicas pode ser realizada e novas varie- dades podem ser obtidas e propagadas vegetativamente para uso comercial.

5 Partes de planta, incluindo, porém não limitadas a raízes, tron-

cos, folhas, botões, flores, brotos, sementes, tubérculos, frutos e galhos ob- tidos de plantas obtidas pelos métodos da presente invenção são também fornecidas.

As plantas ou partes de planta transformadas pelos métodos da invenção podem ser visualmente identificadas com base na expressão dos traços. Mais preferivelmente, as plantas transformadas ou partes de planta são identificadas usando análise molecular usando sondas de oligonucleotí- deo específicas e/ou amplificação do gene-alvo. O DNA ou RNA da planta- objeto ou parte da planta a ser analisada pode ser extraída por vários méto- dos adequados conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como são descritos em uma ampla faixa de textos bem-conhecidos, incluindo (porém não limitado a) Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Har- bor Laboratory (1989), Sambrook, J. e Russell, D.W. (2001), "Molecular Clo- ning: A Laboratory ManuaF', 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e referências citadas aqui e Ausubel e outros (eds) Current Protocols in Mo- lecular Biology, John Wiley & Sons (2000), incorporados aqui por referência cruzada. Veja também os métodos descritos em Lukowitz, W., Gillmor, C.S. e Scheble, W-R. (2000) "Positional Cloning in Arabidopsis: Why It Feels Go- od to Have a Genome Initiative Working for You" Plant Physiology 123, 795- 805, e referências citadas aqui.

O DNA ou RNA extraído pode ser analisado quanto a presença ou ausência do transgene por qualquer método adequado como conhecido na técnica, e em que o método/estratégia que é empregado pode depender da especificidade desejada, e da disponibilidade de seqüências e/ou enzi- 30 mas adequadas. Por exemplo, o RNA extraído pode ser analisado usando o método TRIzol, e tratando o RNA extraído com DNaseI livres de RNase an- tes de realizar o PCR quantitativo. Os pares de iniciadores adequados para ampliar as porções de HOG1 incluem: PET1: 5'-A(AG) ATGCC(CT) GG(ACT) CT (ACT)ATG(GT)C(ACT)T-3' (SEQ ID NO: 24) e PET2: 5’-TC (AG) A- ACTTGCTCTTGGT(AG)AC(AG)-3' (SEQ ID NO: 25). Outros iniciadores a- 5 dequados ou pares de iniciadores para analisar o gene de HOG1 ou homó- logos dos mesmos podem ser designados com base em SEQ ID NO: 1.

Os métodos e reagentes para uso em uma reação de ampliação de PCR são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Os protoco- los e reagentes adequados amplamente dependerão das circunstâncias in- dividuais. A orientação pode ser obtida de uma variedade de fontes, tais co- mo, por exemplo, Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Sambrook, J. e Russell, D.W. (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manuat', 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e referências citadas aqui e Ausubel e outros (eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2000), incorporados aqui por refe- rência cruzada. Uma pessoa versada na técnica também facilmente aprecia- rá que vários parâmetros da reação de PCR podem ser alterados sem afetar a capacidade de ampliar o produto desejado. Por exemplo, a concentração de Mg2+ e temperaturas empregadas podem ser variadas. Similarmente, a quantidade de DNA genômico usado como um modelo pode também ser variado dependendo da quantidade de DNA disponível.

Outros métodos de análise incluem eletroforese, tais como ele- troforese em gel de poliacrilamida ou agarose, uma técnica comumente usa- da por aqueles versados na técnica para separação de fragmentos de DNA 25 em uma base de tamanho. A concentração de agarose ou poliacrilamida no gel em grande parte determina a capacidade de resolução do gel e a con- centração apropriada de agarose ou poliacrilamida, portanto dependerá do tamanho dos fragmentos de DNA a serem distinguidos.

A detecção e/ou determinação da existência do transgene ou homólogo do mesmo podem ser auxiliadas por análise de computador usan- do qualquer software apropriado. Os pacotes de software adequados para comparação de determinadas seqüências de nucleotídeo são bem- conhecidos na técnica e são facilmente disponíveis.

Abreviações

2iP - 2-isopenteniladenina AHK - Arabidopse Histidina Quinase 5 AHP - Proteínas de Fosfotransferência de Arabidose Histidina AMM - Meio mínimo de asparagina ARR - Reguladores de Resposta de Arabidopse AS - Supressão de Antissense A - Adenosina

BA-BenziIadenina

BLAST - Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento de Local Básico CAB - gene de proteína de ligação de clorofila a/b CaMV - Vírus Mosaico de Couve-flor CRE - Resposta de citoquinina 15 cDNA - ácido deoxirribonucleico complementar DNA - ácido deoxirribonucleico ELISA - ensaio imunossorvente ligado à enzima ETR1, ERS2, ETR2 e EIN4 - receptores de etileno FAB - bombardeio de átomo rápido 20 G- Guanina

GFP - proteína fluorescente verde

HOG 1 - silenciamento de gene 1 dependente de homologia HSPs - par de seqüência de classificação elevada ITC - calorimetria de titulação isotérmica KD - constante de dissociação

KNAT1 - homólogo unido 1 de Arabidopsis thaliana LAI - índice de área da folha LAR - relação de área da folha mRNA - RNA mensageiro 30 NCBI - Centro Nacional para Informação de Biotecnologia NOS - nopalina sintase OCS - octopina sintase i 57

OE - Superexpressão

OsCBP - Proteína de Ligação de citoquinina de Oryza sativa PCR - Reação em cadeia de polimerase PNAs - ácidos nucleicos de peptídeo 5 PETCBP - Proteína de Ligação de citoquinina de Petunia hybrida RNA - ácido ribonucleico RNAi - interferência de RNA RuBisCo - ribulose bisfosfato carboxilase SAH - S-adenosilhomocisteína 10 SAM - S-adenosilmetionina

siRNA - RNA interferente pequeno SSC -1-2 X de cloreto de sódio e citrato de sódio SAHH - S-adenosil-L-homocisteína hidrolase SLA - área da folha específica 15 STM - fator de transcrição sem meristema de Broto T - timina

TDNA - DNA transferido Tm - ponto de fusão térmico U - Uracila WT - tipo selvagem

ZR - ribosídeo de zeatina Breve Descrição dos Desenhos

Os desenhos de acompanhamento ilustram uma modalidade descrita e servem para explicar os princípios da modalidade descrita. Deve ser entendido, entretanto, que os desenhos são designados para propósitos de ilustração somente, e não como uma definição dos limites da invenção.

A Figura 1 mostra os resultados da calorimetria de titulação iso- térmica, localização de H0G1 e análise de expressão. A)Ensaio de ligação de citoquinina foi realizado com ITC. O painel de topo mostra os dados de 30 aquecimento bruto corrigidos para tendência de referência obtida de injeções de 0,1 μΜ de zeatina na célula de amostra contendo 2 μΜ de TAP-HOG1 purificado. O painel do fundo mostra a isoterma de ligação criada por plota- gem das áreas de pico de aquecimento contra uma relação molar de zeatina adicionada ao HOG1. A inserção mostra a proteína de TAP-HOG1 purificada (60 kDa) das plantas transgênicas. B) Ensaio com a citoquinina sintética de- rivada de ureia, tidiazurona realizado como no caso de zeatina. C) A ligação 5 de HOG1-citoquinina é endotérmica com 2:1 de estequiometria. Os valores de KD variaram de 16,9 nM a 20,6 nM para as três citoquininas testadas, isto é, zeatina, benziladenina (BA) e 2-isopenteniladenina (2iP). Os valores de KD para adenina e NAD+ foram 2,1 μΜ e 39,5 μΜ, respectivamente, mos- trando uma especificidade de citoquinina de HOG1. D) Linhagens transgêni- 10 cas expressando proteína de fusão GFP-HOG1 exibiu o mesmo fenótipo como as linhagens de 35S:HOG1 mostrando que a proteína de fusão man- teve sua função. E) Proteína de fusão de GFP-HOG1 foi localizada na mem- brana de plasma. O imageamento de célula de raiz de muda viva foi realiza- do usando microscópio de varredura a laser confocal (Zeiss CLSM 510) com 15 488 nm de laser de argônio em combinação com um aparelho de filtro de passagem de faixa de 505 a 530nm. A inserção mostra, em uma única célu- la, que a proteína está localizada na membrana de plasma. F) A análise de PCR em tempo real quantitativa de expressão de HOG1 mostrou que o gene é constitutivamente expresso em todas as partes da planta examinada.

A Figura 2 mostra a análise de expressão de HOG1 nas linha-

gens de superexpressão e supressão de antissense de Arabidopsis por PCR em tempo real quantitativo. A) Oito linhagens de superexpressão indepen- dentes mostraram aumento de 3 a 20 vezes em níveis de transcrição de HOG1 comparados ao tipo selvagem. Os fenótipos B) e C) das linhagens de 25 superexpressão usados para análise de PCR em tempo real foram unifor- mes a despeito das variações em níveis de transcrição. D) As linhagens de supressão de antissense de HOG1 mostraram diminuição de 2 a 10 vezes nos níveis de expressão das transcrições quando comparados com o tipo selvagem. E) e F) Os fenótipos de tempo de fluorescência das oito linhagens 30 de antissense usadas na análise de expressão foram diretamente relaciona- dos com o nível de supressão de transcrições de HOG1. G), Η), I) e J) Três mudas individuais de linhagem de OE 6 e duas plantas WT foram pulveriza- das em dias alternados com zeatina (0,01 μΜ) durante um período de quatro semanas para ver se a quitocina exogenamente aplicada pode retardar o florescimento nas linhagens OE na mesma idade como o WT. G) As plantas OE pulverizadas com zeatina mostraram bloqueio retardado comparado com 5 linhagens de OE de controle (na zeatina), ao mesmo tempo em que, I) as linhagens de OE de controle bloqueiam em 4 estágios de folha de invólucro.

H) As plantas OE pulverizadas com zeatina mostram bloqueio somente após elas terem alcançado o estágio de 6 a 7 folhas, quase na mesma idade co- mo as plantas WT, mostrando salvamento das linhagens de OE pela citoqui- 10 nina exogenamente aplicada. J) Os indivíduos de controle (sem pulverização de zeatina) da linhagem de OE floriram completamente e se desenvolveu em sua capacidade máxima neste estágio.

Figura 3 mostra os fenótipos de plantas de superexpressão de HOG1 (OE), supressão de antissense (AS) e do tipo selvagem (WT). A) Li- nhagens de OE de HOG1 mostram o florescimento quando elas desenvolve- ram somente quatro folhas de roseta enquanto o WT não iniciou o floresci- mento ainda. B) Linhagens de AS de HOG1 mostram o florescimento retar- dado (14 folhas de estágio no tempo de bloqueio) enquanto o WT teve inflo- rescência bem desenvolvida. C) Comparação de fenótipos em maturidade de linhagens de OE1 WT e AS. Um retardamento de crescimento total das linhagens de OE e fenótipo de ramificação abundante das linhagens de AS em 30 dias após a germinação quando comparado com WT, foi visto. D) Tamanho de folha de roseta aumentado na linhagem de AS comparado com as linhagens de WT e OE. E) O tamanho de síliqua foi aumentado nas Iinha- gens de AS comparado com da linhagem de WT, ao mesmo tempo em que o tamanho foi significantemente reduzido nas linhagens de OE (escala em bar = 1cm). F) A resposta de calos às várias concentrações de citoquinina exógena (zeatina) na presença do ácido indolbutírico de auxina (0,2 pg/ml). O calo das linhagens de AS exibiu um forte fenótipo insensível à citoquinina, isto é, fraca estimulação de proliferação de célula e falta de indução de broto adventício após 3 semanas de cultura. O calo da linhagem de OE respondeu similarmente ao WT, isto é, ambos exibiram desenvolvimento de calo normal e indução de broto adventício, mostrando que HOG1 é um regulador de cito- quinina positivo. G) Quantificação de níveis de citoquinina nas linhagens de OE, WT e AS. As citoquininas endógenas foram quantificadas pelo método de imunoensaio com anticorpo monoclonal iPA e ZR usando kits de detec- 5 ção de adenosina de isopentenila e ribosídeo de zeatina (Sigma). Os valores determinados representam o ± SD médio de três replicações de três extra- ções independentes. As citoquininas medidas são isopenteniladenina (iP), isopenteniladenosina (iPA), zeatina (Z) e ribosídeo de zeatina (ZR). H) En- saio espectrofotométrico de atividade de homocisteína de S-adenosila hidro- 10 Iase (SAHH) das várias linhagens e com a proteína de TAP-HOG1 purifica- da. Nenhuma diferença significante na atividade foi observada em extratos de proteína brutos das linhagens de WT, OE e AS, ao mesmo tempo em que a proteína TAP-HOG1 purificada não tem atividade de SAHH mensurável.

Figura 4 mostra a análise de PCR em tempo real quantitativa de genes responsivos de quitocina selecionados e interação de HOG1-AHP1. As mudas colhidas para extração de RNA antes e após um tratamento de pulso com benziladenina (BA) em 0 μΜ, 0,01 μΜ, 0,1 μΜ, 1 μΜ ou 5 μΜ du- rante vários intervalos de tempo (5 min, 15 min, 30 min e 1h) de três linha- gens de superexpressão (OE1, OE12, OE18) e supressão de antissense (AS1, AS8, AS21) independentes. A aplicação de BA causou um aumento dependente da dose de transcrições de KNAT1 e STM. A) As linhagens de AS mostraram a super-regulação de KNAT1 e STM (genes homeobox en- volvidos na função de meristema), ao mesmo tempo em que as linhagens de OE mostraram a sub-regulação destes dois genes na ausência de BA exó- geno. Com 5 μΜ de BA após 1h, a expressão de KNAT1 e STM mostrou menos do que uma mudança de duas vezes, que é insignificante daquela do WT. B) ARR4 e ARR6 (reguladores de resposta tipo A induzidos por citoqui- ninas) também mostram tendência similar nos níveis de expressão. C) Puri- ficação de complexo de TAP-HOG1. A proteína total extraída de plantas de 35S:TAP-HOG1 (faixa 1) e após a purificação usando colunas de afinidade para rótulos ProtA e CBP, resultou na identificação de aproximadamente 24 kDa de faixa (asterisco) que foi confirmada ser AHP1 por sequenciamento * 61

de terminal de N (faixa 2). Western blot de proteína total sondada com anti- corpo para rótulo de ProtA mostrou a presença de uma faixa de 71 kDa cor- respondendo a TAP-HOG1. D) eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida de purificação de AHP1 recombinante. AHP1 foi expresso com rótulos seis-His

5 e tioredoxina em E. coli. A faixa 1 tem Iisado de célula total e AHP1 purifica- do com os rótulos está na faixa 2. E) A interação de TAP-HOG1 e AHP1 foi realizada com ITC. O painel de topo de E) mostra os dados de aquecimento bruto corrigidos para tendência de referência obtida de injeções de 0,1 μΜ de AHP1 purificado na célula de amostra contendo 2 μΜ de TAP-HOG1 puri- 10 ficado. O painel do fundo mostra a isoterma de ligação criada por plotagem das áreas de pico de aquecimento contra a relação molar de AHP1 adicio- nado a HOG1. A ligação de TAP-HOG1 e AHP1 é endotérmica com um valor de KD de 23,8 nM.

Figura 5 é uma representação esquemática da série de reação 15 de transdução e sinal de citoquinina através de HOG1. O sinal de citoquinina é percebido por HOG1 na membrana de plasma. O dímero de HOG1 inicia uma cascata de sinalização através de AHP1, que pode interagir com ARRs do tipo B (por exemplo, ARR1, ARR2) e ARRs do tipo A (por exemplo, ARR4, ARR5).

-20 Figura 6 mostra o alinhamento de seqüência múltiplo de HOG1

com homólogos. A seqüência de aminoácido deduzida HOG1 (SEQ ID NO:

1) foi alinhada com a seqüência de SAHH de Petunia hybrida (SEQ ID NO: 13), Nicotiana tabacum (SEQ ID NO: 3), Oryza sativa (SEQ ID NO: 5), Triti- cum aestivum (SEQ ID NO: 7), e Homo sapiens (SEQ ID NO: 26). As duas 25 assinaturas conservadas de SAHH estão em negrito. Na 2a assinatura de SAHH, três resíduos de glicina conservados representando o domínio de ligação de dinucleotídeo estão sublinhados. O estiramento de Terminal de N de 7 (posição 1-7 de HOG1) aminoácidos e um estiramento adicional de 41 aminoácidos (posição 150-191 de HOG1) bem como a região de transmem- 30 brana helicoidal em itálico (posição 59-76 de HOG1).

Figura 7 mostra o efeito de aplicação exógena de citoquininas nas linhagens do tipo selvagem (WT), de superexpressão (OE) e de supres- são de antissense (AS) de HOG1. Três mudas individuais de linhagem de OE 6 e linhagem AS 12 foram pulverizadas em dias alternados com zeatina ou quinetina (0,01 μΜ), durante um período de quatro semanas. Duas plan- tas de WT foram similarmente tratadas para comparação. A) e C) Três indi- 5 víduos de linhagem de OE 6 pulverizada com zeatina e quinetina não mos- traram bloqueio quando comparado com a as linhagens de OE de controle no estágio de folha 4 de crescimento. E) As linhagens de OE de controle bloqueiam no estágio de folha 4. B) e D) Três indivíduos da linhagem de OE

6 pulverizados com zeatina e quinetina respectivamente, mostram bloqueio 10 somente após eles terem alcançado o estágio de folha de 6-7. Isto mostra o salvamento parcial das linhagens de OE pelas citoquininas exogenamente aplicadas. F) Os indivíduos de controle da linhagem de OE 6 maduraram neste estágio. G), Η), I), J) e K) As linhagens de AS que receberam os s- prays de citoquinina não mostram qualquer diferença significante no fenótipo 15 quando comparado com as linhagens de AS de controle. Isto mostra que a superexpressão de HOG1 induz ao esgotamento de teor de citoquinina en- dógena (como mostrado na Tabela 1) e, portanto, o fenótipo. (Note que os painéis A, B, E e F estão na Figura 2 principal enquanto os painéis G, Η, I e J, e estes estão incluídos aqui para facilidade de comparação somente).

Figura 8 mostra plantas de Arabídopse transgênica. (a) Mudas

de Arabidopsis thaliana com superexpressão (OE) de HOG1 mostraram blo- queio precoce, porém a supressão de antissense (AS) de H0G1 leva ao flo- rescimento retardado comparado ao controle do tipo selvagem (WT) em cer- ca de 3 semanas, (b) As plantas maduras de duas linhagens transgênicas 25 diferentes cada de OE (0E8, 0E12) e AS (AS8, AS21) comparado com o tipo selvagem (WT) fotografado em 30 dias após a germinação. As flores- cências das linhagens de AS foram abudantemente ramificadas e a biomas- sa foi significantemente mais elevada comparada com as plantas de OE e WT. (c) A área da folha e (d) comprimento da síliqua bem como sementes 30 (inserções no painel f) das linhagens de AS foram significantemente mais elevadas do que de OE e WT. (e) A análise de PCR em tempo real quantita- tiva de níveis de expressão de transcrições de H0G1 nas plantas em (d), (f) A quantificação da área da folha, peso de semente, número de sementes por síliqua e concentração endógeno da adenina de isopentenila de citoquinina mostraram que os valores foram mais elevados em AS seguido pelas linha- gens de WT e OE1 respectivamente.

5 Figura 9 mostra plantas de arroz transgênicas (Oryza sativa ssp.

japonica cv Nipponbare) abrigando o cDNA de HOG1 de Arabidopsis em superexpressão (OE) ou supressão de antissense (AS) induzindo aos níveis de OsCBP modificados, (a) As mudas de linhagens de OE e AS no tempo de iniciação da agricultura levam quatro semanas após a germinação, (b) As 10 plantas maduras das linhagens de OE e AS em cerca de 90 dias após a germinação. As linhagens de AS exibem agricultura abundante e aumento em biomassa, ao mesmo tempo em que as plantas de OE permaneceram anão comparado com WT. (c) As plantas maduras desarraigadas de OE1 WT, AS e cossupressão (CS) mostraram que as plantas de AS e CS tiveram 15 números comparavelmente mais altos de cultivos por planta, (d) As plantas de CS mostraram ramificação dos nodos acima do solo resultando em um aumento total no número de panículas por planta, (e) As panículas das li- nhagens de OE foram significantemente menores comparadas àquelas de outras linhagens, (f) A análise de PCR quantitativa em tempo real de níveis >■20 de expressão de transcrições de OsCBP no WT, níveis de transcrição de Arabidopsis HOG1 introduzido nas linhagens de OE (S-2L, S-9T), redução nos níveis de transcrição de OsCBP endógeno nas linhagens CS (CS-4T, CS-1) e AS (AS-1S-2, AS-4S-2). (g) Quantificação do número de cultivos, panículas, área da folha, peso fresco e número total de sementes por planta 25 mostraram que os parâmetros medidos foram significantemente maiores nas linhagens de AS e CS comparado com WT, que está de acordo com as ob- servações de Arabidopsis.

Figura 10 mostra: (a) alinhamento múltiplo de H0G1 (SEQ ID NO: 1), PETCBP (SEQ ID NO: 13) e OsCBP (SEQ ID NO: 5). PETCBP (SEQ 30 ID NO: 13) e OsCBP (SEQ ID NO: 5) mostraram 88% de identidades. H0G1 (SEQ ID NO: 1) e OsCBP (SEQ ID NO: 5) mostraram 90% de identidade quando comparado com 88% de identidade para PETCBP (SEQ ID NO: 13) e H0G1 (SEQ ID NO: 1). (b) O blasto de genoma de OsCBP mostra sua presença no cromossoma 11 (Os11g0455500), indicando que é uma única cópia no genoma de arroz (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Figura 11 mostra os resultados de ensaio de ligação de citoqui- 5 nina realizado com ITC. O painel de topo mostra os dados de aquecimento bruto corrigidos para tendência de referência obtida de injeções de 0,1 μΜ de benziladenina em uma célula de amostra contendo 2 μΜ de TAP-H0G1 purificado. O painel de fundo mostra a isoterma de ligação criada por plota- gem das áreas de pico de aquecimento contra a relação molar de benzilade- 10 nina adicionada a HOG1.

Figura 12 mostra os fenótipos de plantas de arroz transgênico (Oryza sativa ssp. japonica cv Nipponbaré) com superexpressão (OE) de Arabidopsis HOG1 ou supressão de antissense (AS) de OsCBP induzido por HOG1 de Arabidopsis. (a) A linhagem de OE com efeito de cossupressão 15 (no painel direito, com o controle no esquerdo) mostra o número de cultivos aumentado por planta, (b) As linhagens de AS, do tipo selvagem (WT) e de cossupressão (CS) em maturidade. As linhagens de AS e CS exibem maior número de cultivos (ramificação) por planta comparada à linhagem origem híbrida (WT). (c) Nenhuma diferença significante no tamanho da semente 20 das linhagens de WT e AS. Alguma redução no tamamno da semente é ob- servada em OE quando comparado com WT. (d) e (e) Southern blots das linhagens de OE e AS na geração de T1. (d) 1a faixa é o marcador. As faixas 2 a 11 são independentes das linhagens de OE. A faixa 2 (linhagem OE S1), faixa 5 (linhagem de OE 4) e faixa 8 (linhagem de OE 7) mostram inserções 25 únicas. Faixa 4 (linhagem de OE 3), faixa 7 (linhagem de OE 6), faixa 9 (li- nhagem de OE 9),faixa 10 (linhagem de OE 10) e faixa 11 (linhagem de OE

11) mostram inserções duplas onde as faixas 3 (linhagem de OE 2) e faixa 6 (linhagem de OE 5) mostram três inserções cada. (e)faixa 2 (linhagem de AS1), faixa 3 (linhagem de AS2),faixa 4 (linhagem de AS3) e faixa 6 (linha- 30 gem de AS5) mostram inserções únicas. Faixa 5 (linhagem de AS4) mostra inserção dupla. Para cada faixa, o DNA genômico (6 pg) extraído das folhas que foi digerido com enzimas de EcoRI foi usado. A sonda usada foi DIG rotulado, gene de higromicina fosfotransferase. As manchas foram lavadas em alta rigorosidade antes que os sinais fossem visualizados.

Melhor Modo

Os exemplos não-limitantes da invenção, incluindo o melhor mo- 5 do, e um exemplo comparativo serão também descritos em maiores detalhes por referência para Exemplos específicos, que não devem ser considerados de forma alguma Iimitantes do escopo da invenção.

EXEMPLO 1

O silenciamento de gene dependente de homologia 1 de Arabi- 10 dopsis (HOG1) é um Receptor de citoquinina Putativo MATERIAIS E MÉTODOS Materiais de planta e condições de crescimento

Ecotipo Columbia de Arabidopsis thaliana foi usado neste estu- do. As plantas foram desenvolvidas com 16 h de luz/8 h de escuridão a 15 22°C. Para ensaios de muda, as sementes foram esterilizadas na superfície e estratificadas no escuro a 4°C durante 2 dias e em seguida expostas à Iuz branca (75 pE.m'2.s"1). As mudas foram crescidas a 22°C em meio Murashi- ge-Skoog (MS) com 3% de sacarose e 0,9% de ágar. Para experiência de germinação, as sementes de bateladas específicas foram semeadas em > ■ 20 meio de MS sem sacarose.

Construção de plasmídeo e transformação genética de Arabidopsis

O cDNA de HOG1 de Arabidopsis thaliana de tamanho natural (SEQ ID NO: 2) foi ampliado por estratégia 5' e 3' RACE. O kit de Ampliação de cDNA SMARTTM RACE (Clontech Laboratories) foi usado para identificar 25 as seqüências finais de 5' e 3' cDNA (57 3-RACE) de cDNA. Estes produtos de PCR foram sequenciados. A seqüência parcial e produtos de PCR RACE foram alinhados juntos para obter a seqüência de cDNA de tamanho natural para H0G1 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 2).

O vetor binário de pGreen 0229 (Yu e outros Proc. Natl. Acad. 30 Sc/. USA 101:7827-7832, 2004) foi usado para todos os constructos de transgene. Para supressão de antissense, um fragmento de 850bp de HOG1 abrangendo as duas assinaturas de SAHH (SEQ ID NO: 15) foi usado. A estrutura de leitura aberta completa de cDNA de HOG1 foi usada para o constructo de superexpressão e para a construção de GFP-HOG1.

HOG1 direcionado por TAP foi preparado com rótulos de peptí- deo de ligação de Prot A e calmodulina, com um sítio de clivagem TEV entre 5 os dois rótulos (Forler e outros Nature 21:89-92, 2003). Os constructos foram introduzidos em Arabidopsis thaliana por método de infiltração à vácuo me- diado por Agrobacterium tumefaciens (Hiei e outros supra).

Análise de PCR em tempo Real

O RNA total foi extraído de mudas com o método de TRIzoI (Invi- 10 trogen). O RNA total (0,5 pg) tratado com DNaseI livre de RNase foi usado para cada reação de PCR quantitativa realizada com o kit de RT One-Step (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. PCR quantitativo em tempo real foi realizado usando SYBR green. Os valores de Ct foram norma- lizados contra o valor de Tubulin2 Ct para cálculo de vezes de alteração de 15 acordo com o protocolo do fabricante.

Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)

A afinidade de ligação de citoquinina e análise termodinâmica da interação entre HOG1 e citoquininas foram examinadas por ITC (MCSITC, Microcal, Northampton, USA). Três citoquininas de ocorrência natural (zeati- 20 na, benziladenina e adenina de isopentenila) e tidiazurona (uma citoquinina sintética derivada de ureia) foram usadas. Adicionalmente, a adenosina e NAD foram usados como moléculas de controle para verificar a especificida- de de ligação de HOG1 às citoquininas. Os dados foram analisados por MI- CROCAL ORIGIN versão 2.9 usando o método de mínimos quadrados não- 25 linear, de melhor ajuste para um sítio de ligação. A estequiometria de ligação (n), e a constante de associação (KA) foram calculadas das curvas ajusta- das. Subsequentemente, KD foi calculado como 1/KA. Os dados de aqueci- mento bruto foram corrigidos para tendência de referência obtida de injeções de 0,1 μΜ de AHP1 purificado na célula de amostra contendo 2 μΜ de TAP- 30 HOG1 purificado. As isotermas de ligação foram criadas por plotagem das áreas de pico de aquecimento contra a relação molar de AHP1 adicionado a HOG1. Localização Subcelular de proteína de fusão de GFP-HOG1

As plantas transgênicas expressando construçctos individuais de fusão de 35S:GFP-HOG1 foram selecionadas de acordo com seu fenótipo. As raízes de mudas de 5 dias foram cortadas e montadas em estiramento de 5 meio veículo MS imediatamente antes da microscopia de varredura a laser confocal (Zeiss CLSM 510) com um laser de argônio de 488 nm em combi- nação com um aparelho de filtro de passagem de faixa de 505 a 530 nm. Ensaio de resposta de quitocina de calo

Os segmentos de raiz de muda foram incubados durante 4 dias 10 no meio de indução de calo (meio MS suplementado com 0,5 Mg/ml de ácido 2,4-diclorofenoxiacético e 0,05 pg/ml de quinetina). Os calos resultantes fo- ram incubados no meio de indução de broto (meio MS suplementado com 0,2 pg/ml de ácido indolbutírico e várias concentrações de zeatina) durante 30 dias com subcultura para meio fresco em intervalos de 10 dias de acordo 15 com o método de Inoue e outros (Nature 409:1060-1063, 2001).

Conteúdo de citoquinina e ensaio de enzima SAHH

As citoquininas foram extraídas de plantas totais com 100% de metanol e quantificadas usando kits de detecção de adenosina de isopente- nila e ribosídeo de zeatina (Sigma) como descrito em Yang e outros (FEBS 20 555:291-296, 2003). O ensaio espectrofotométrico de SAHH foi realizado nos extratos de proteína bruta de plantas de bloqueio como descrito em Ro- cha e outros (Plant Cell 17:404-417, 2005).

Expressão de Genes de Resposta de Citoquinina Primária

Para análise de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) de 25 expressão de gene induzível por citoquinina, as sementes foram germinadas em meio MS com 3% (peso/volume) de sacarose e desenvolvidas durante 6 dias. O tratamento de citoquinina foi realizado por incubação das mudas no mesmo meio líquido de MS+sacarose (nenhum ágar) suplementado com 0, 0,01, 0,1, 1 ou 5 μΜ [solubilizado em 0,1% de dimetilsulfóxido (DMSO) e di- 30 luído com o meio MS] durante 5 min, 15 min, 30 min ou 1 h. As mudas de controle foram incubadas com DMSO (0,1%, a concentração usada para dissolver as citoquininas para o tratamento) durante durações corresponden- tes e usada para análise de expressão. Antes da preparação de RNA, as mudas de WT, OE e AS foram reunidas e armazenadas em solução de RNAIater (Qiagen, Valencia, CA). O RNA total foi extraído usando o Mini Kit de planta Rneasy (Qiagen). Os reagentes de RT-PCR SYBRgreen (Applied 5 Biosytroncos) foram usados para sintetizar o cDNA de filamento duplo. O número de transcrições presentes em replicações biológicas cada das mu- das de WT, OE e AS, com ou sem BA e DMSO1 foi determinado de três re- plicações independentes. A indução de dobras das transcrições foi calculada de acordo com as instruções do fabricante (ABI Prism 7700 Sequence De- 10 tection Sytronco1 User Bulletin #2).

Estudos de Interação de TAP-HOG1 e AHP1

O complexo de proteína de TAP-HOG1 foi purificado usando os rótulos de ProtA e CBP como descrito antes em Forler e outros (supra). Para suspender ProtA, contas de IgG Sefarose (Amersham Biosciences #17- 15 0969-01) e para resina de afinidade de Calmodulin de demolição de CBP (Stratagene #214303-52) foram usadas. A proteína purificada foi submetida à SDS-PAGE e manchada para membranas de PVDF para análise de Wes- tern blot usando protocolos padrões. Além disso, a demolição do complexo de HOG1 foi submetida à SDS-PAGE eletroforese, e o sequenciamento de 20 terminal de N foi feito para identificar as faixas proeminentes obtidas. Por que AHP1 foi a faixa de proteína de interação putativa principal, o cDNA pa- ra AHP1 foi clonado de Arabidopsis e AHP1 recombinante foi expresso em BL21 de E. coli com um rótulo de seis-HIS e rótulo de tioredoxina (em um vetor de superexpressão PET32EK/LIC, Novagen). O AHP1 recombinante 25 com os rótulos foi purificado usando coluna de afinidade de HIS-rótulo (Bio- Rad). Os estudos de interação de proteína (HOG1-AHP1) foram realizados por ITC (MCS-ITC, Microcal, Northampton, USA) como descrito acima. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os presentes inventores usaram supressão de antissense e es- tratégias de superexpressão para analisar o envolvimento de HOG1 na sina- lização e regulação de citoquinina de desenvolvimento de planta.

O clone de cDNA de HOG1 (SEQ ID NO: 2) exibiu similaridade de seqüência significante para S-adenosil-L-homocisteína hidrolase (SAHH) de várias espécies de plantas e animais. A comparação com homólogos iso- lados de várias espécies de planta indicou que HOG1 é conservado em di- versas espécies de planta (Figura 6). Em particular, o homólogo em Petunia 5 hybrida (SEQ ID NO: 14) compartilhou 78% de similaridade de seqüência com HOG1, o homólogo em Nicotiana tabacum (SEQ ID NO: 4) compartilhou 78% de similaridade de seqüência com HOG1, o homólogo em Oryza sativa (SEQ ID NO: 6) compartilhou 82% de similaridade de seqüência com HOG1, e o homólogo em Triticum aestivum (SEQ ID NO: 4) compartilhou 83% de 10 similaridade de seqüência com HOG1.

Para examinar a afinidade de ligação de citoquinina de HOG1, a proteína TAP-HOG1 foi purificada de Arabidopsis thaliana transgênico (abri- gando 35S:TAP-HOG1), que foi também usado para estudos de interação de proteína-proteína. A proteína direcionada foi funcional por que as plantas 15 transgênicas mostraram o mesmo fenótipo com aqueles das linhagens de superexpressão de HOG1. A proteína foi purificada usando os rótulos de Proteína A (Prot-A) e CBP (peptídeo de ligação de calmodulina). Após a pu- rificação, a proteína manteve a porção de CBP do rótulo de TAP, resultando em um tamanho de 60 kDa (Figura 1A de inserção), considerando que 20 HOG1 sozinho sem a porção de CBP do rótulo de TAP seria 56 kDa.

(a) Ligações de HOG1 às citoquininas com afinidade elevada

As moléculas de citoquinina se ligam à proteína purificada efici- entemente como indicado por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) de TAP-HOG1 purificado e várias citoquininas. ITC, uma técnica biofísica usada 25 para estudar os cinéticos de ligação de ligante-receptor produz parâmetros termodinâmicos importantes de uma interação, incluindo afinidade de ligação (KA), e, portanto a constante de dissociação (KD), bem como a estequiome- tria de ligação (n).

As moléculas de citoquinina (zeatina, benziladenina e adenina de isopentenila) e tidiazurona (uma molécula derivada de ureia sintética com atividade de citoquinina) foram usadas para os estudos de ligação. A adeni- na e NAD foram usados com controles para determinar a especificidade de ligação de HOG1.

A estequiometria de ligação, como determinado por ITC, mos- trou que dois monômeros de HOG1 ligam uma molécula de citoquinina (es- tequiometria de 2:1) (Figurai A-1C), porém não liga tidiazurona (Figura 1B e 5 1C). Isto mostra a especificidade de HOG1 em ligação de citoquininas.

Como pode ser visto da Figura 1C, a constante de dissociação (KD) variou entre 16,9 a 20,6 nM para as diferentes citoquininas testadas. Além disso, a KD para adenina foi 2,1 μΜ, que sugere uma afinidade signifi- cantemente menor de HOG1 para adenina do que para uma molécula de 10 citoquinina. Isto é de acordo com o fato que a adenina elicia resposta de ci- toquinina somente fraca quando usada em concentrações relativamente ele- vadas em algumas culturas de tecidos.

Uma vez que NAD+ é o cofator conhecido para SAHH, o valor de KD para HOG1 e complexo de NAD+ por ITC foi medido e constatado ser 39,5 μΜ (Figura 1C), o que também sugere que HOG1 é um receptor de ci- toquinina e não é provavelmente uma enzima de SAHH funcional.

(b) HOG1 está localizado na membrana de plasma

Uma pesquisa de domínio para a proteína HOG1 foi conduzida usando o recurso de rede PHDhtm de Columbia University 20 (www.cubic.bioc.columbia.edu). A pesquisa mostrou que a proteína de HOG1 tem uma estrutura do tipo de receptor típica. A Proteína HOG1 tem uma hélice de transmembrana predita (abrangendo 18 aminoácidos de resí- duos 59 a 76 de SEQ ID NO: 1), e o domínio de ligação de citoquinina predi- ta (abrangendo 409 aminoácidos de resíduos 77 a 485 de SEQ ID NO: 1) 25 reside fora da membrana. A proteína também tem um sítio putativo dentro do citoplasma para interação com intermediários de sinalização a jusante, que compreende 58 aminoácidos no terminal de N (de resíduos 1 a 58 de SEQ ID NO: 1).

Para fisicamente determinar a localização subcelular da proteína HOG1, as plantas de Arabidopsis transgênicas expressando fusão de prote- ína fluorescente verde (GFP)-HOGI foram geradas. Das sete linhagens de GFP independentes isoladas, três foram selecionadas para análise. As plan- I 71

tas transgênicas de geração T3 expressando a proteína de fusão de GFP- HOG1 mostraram o mesmo fenótipo como as linhagens de superexpressão de H0G1 (Figura 1D), que indica que a proteína de fusão manteve sua fun- ção.

5 A microscopia de varredura a laser confocal de raízes recente-

mente cortadas das linhagens selecionadas e montadas em veículo MS de meio estiramento mostrou que GFP-HOG1 está localizado na membrana de plasma (Figura 1E), que sugere que H0G1 é um receptor de membrana pa- ra citoquininas. Como controle, um relato anterior para Arabidopsis foi usa- 10 do, onde 35S:GFP foi mostrado ser razoavelmente uniformemente expresso no citoplasma e núcleo (Zhang Plant Cell 17:1306-1316, 2005). Com base na análise de seqüência, uma região de transmembrana helicoidal (abran- gendo 18 aminoácidos) está presente em HOG1 e outros homólogos de planta, porém não no SAHH de ser humano e rato (Figura 6), ambos dos 15 quais são proteínas citoplásmicas (Shu e outros Proc. NatL Acad. Sei. USA 103:19788-19793). Além disso, a enzima de SAHH ativa é esperada ser uma proteína solúvel, em vez de manter a membrana de plasma ligada, por que a enzima está intimamente associada com reações de metilação ocorrendo em vários compartimentos celulares. Portanto, os resultados experimentais >•20 presentes com GFP-HOG1 sugerem que a proteína HOG1 seja o receptor de membrana.

(c) Plantas de superexpressão e supressão de antissense de HOG1 mos- tram fenótipos de oposição

A análise de PCR quantitativa em tempo real indicou que HOG1 25 é constitutivamente expresso em Arabidopsis, com níveis relativamente mais elevados nas folhas e tronco de inflorescência (Figura 1F). Isto sugere que HOG1 possa desempenhar uma função fundamental na regulação de de- senvolvimento de planta.

Para examinar o efeito dos níveis de expressão de HOG1 no 30 crescimento e desenvolvimento de planta, várias linhagens de superexpres- são e supressão de antissense de HOG1 foram geradas. Várias linhagens de superexpressão de HOG1 mostraram um aumento de 3 a 20 vezes em níveis de transcrição de HOG1 quando comparado com tipo selvagem (Figu- ra 2A), ao mesmo tempo em que as linhagens de antissense mostraram uma supressão de 2 a 10 vezes (Figura 2B).

A expressão de transgene afetou todos os estágios de desen- volvimento de planta, e exibiu fenótipos consistentes em várias linhagens transgênicas independentes (Figura 2C, 2D, 2E e 2F). Os fenótipos foram registrados para 28 linhagens de superexpressão transgênicas independen- tes e 21 linhagens de supressão de antissense para fornecer outro suporte cujas alterações foram causadas pelo produto de gene introduzido. A germi- nação de semente ocorreu 4 a 5 dias antes nas linhagens de superexpres- são comparadas com tipo selvagem, e quase 5 dias depois nas linhagens de supressão de antissense comparadas com o tipo selvagem (Tabela 1). To- davia, retardamento de crescimento significante foi observado logo após a germinação das linhagens de superexpressão. A formação e expansão de novas folhas de roseta também foram atrasadas e limitadas durante todo o crescimento vegetativo nas linhagens de superexpressão.

Tabela 1. Germinação de semente. início de florescimento e senescência:

Cinco linhagens independentes foram usadas para cada obser- vação. Para cada linhagem os dados são uma média de três réplicas inde- pendentes. As linhagens antissense mostraram germinação tardia, emer- gência tardia e senescência retardada.

Genótipo da planta Germinação Início de floração/ Senes¬ da semente Emergência (Núme¬ cência (número de ro de folhas de ro¬ (Número dias) seta) de dias) Tipo selvagem 1 8 8 40 2 7 8 40 3 8 8 38 4 9 7 40 5 8 8 40 Média ± Desvio Padrão 8 ±0,19 8 ±0,15 40 ± 0,26 Linhagens antissense AS1 13 14 55 Genótipo da planta Germinação Início de floração/ Senes¬ da semente Emergência (Núme¬ cência (número de ro de folhas de ro¬ (Número dias) seta) de dias) AS8 12 15 53 AS14 13 14 54 AS21 14 14 54 AS19 13 15 53 Média ± Desvio Padrão 13 ±0,21 14 ± 0,11 54 ± 0,33 Linhagens de superexpressão OE1 4 4 30 OE8 4 3 32 OE12 4 3 30 OE18 5 4 28 OE14 4 4 30 Média ± Desvio Padrão 4 ± 0,13 4 ±0,17 30 ± 0,28 As linhagens de supressão antissense não mostraram nenhum

retardo de crescimento de broto a despeito da germinação de semente re- tardada. O início precoce de florescimento foi observado em superexpressão de plantas transgênicas com emergência no estágio de 4 folhas de roseta 5 (Figura 3A, Tabela 1), quando comparado com a Arabidopsis do tipo selva- gem e as linhagens antissense, que tinham pelo menos 8 e 14 folhas, res- pectivamente, no momento da emergência (Figura 3B, Tabela 1).

Após iniciação de florescimento, as linhagens de superexpres- são não mostraram qualquer novo aumento em biomassa de folha e nenhum 10 galho de inflorescência de eixo formou-se mesmo após 30 dias de desenvol- vimento quando a senescência estabeleceu-se para estas linhagens (Figura 3C). Ao contrário, as linhagens antissense mostraram profuso desenvolvi- mento de galhos de inflorescência de eixo e senescência não ficou evidente nestas linhagens durante aquele período (Figura 3C). As linhagens antissen- 15 se também tiveram a maior área da folha (2,94 ± 0,15 cm2 por folha). A área da folha foi significantemente menor nas linhagens de superexpressão (0,38 ± 0,06 cm2) e nas plantas tipo selvagem (1,00 ± 0,06 cm2) (Figura 3D, Tabe- las 2 e 3). A estatura total da planta, tamanho da síliqua e, como um resulta- do, o número e peso de sementes por sílique (Tabelas 2 e 3) foram signifi- cantemente reduzidos nas linhagens de superexpressão, enquanto o com- primento da sílique nas linhagens de supressão antissense foi significante- mente maior do que o do tipo selvagem (Figura 3E). Houve uma correlação 5 positiva entre a área da folha e peso de semente por sílique, bem como a área da folha e número de sementes por sílique nas linhagens transgênicas (Tabela 3).

Tabela 2. Área da folha, peso de semente e número de sementes por síli- que:

Os dados representam a média ± desvio quadrado de três répli-

cas independentes. Cinco linhagens independentes foram usadas em cada caso. As linhagens antissense tiveram um aumento de três vezes em bio- massa da folha e um aumento de duas vezes em produção de semente em comparação ao tipo selvagem.

Genótipo da planta Área da folha Peso de se¬ Número de (cm2) mente por sementes por sílique (mg) sílique Arabdopsis tipo selvagem (WT) 1 1,04 ±0,02 1,13 ± 0,01 35 ±0,01 2 1,01 ±0,01 1,01 ±0,02 30 ± 0,02 3 0,90 ± 0,02 0,90 ± 0,02 26 ±0,01 4 1,07 ±0,02 1,18 ±0,01 32 ±0,01 5 0,98 ±0,01 1,10 ± 0,01 29 ±0,01 Média ± Desvio Padrão 1,00 ±0,07 1,06 ±0,11 30,40 ± 0,36 Linhagens antissense AS1 2,86 ± 0,01 1,79 ±0,01 54 ± 0,02 AS8 3,12 ±0,01 2,40 ± 0,02 63 ± 0,02 AS14 3,01 ± 0,02 1,96 ±0,01 59 ± 0,02 AS21 2,79 ± 0,02 1,96 ±0,01 57 ±0,01 AS19 2,99 ± 0,02 2,00 ±0,02 60 ±0,01 Média ± Desvio Padrão 2,95 ±0,13 2,02 ± 0,22 58,60 ± 0,37 Linhagens de superexpressão OE1 0,33 ± 0,02 0,68 ± 0,02 15 ±0,01 OE8 0,40 ± 0,02 0,72 ±0,01 17 ±0,01 Genótipo da planta Área da folha Peso de se¬ Número de (cm2) mente por sementes por sílique (mg) sílique OE12 0,49 ± 0,02 0,81 ±0,01 19 ±0,02 0E18 0,33 ± 0,02 0,70 ± 0,02 14 ±0,02 0E14 0,40 ± 0,01 0,83 ±0,01 17 ±0,02 Média ± Desvio Padrão 0,39 ± 0,06 0,75 ± 0,07 16,40 ±0,14 Tabela 3. Coeficiente de Correlação de Pearson (r) dos parâmetros que con- tribuem para biomassa e produção de semente:

O coeficiente de correlação foi testado entre: Área da folha (cm2) x peso de semente (mg) por sílique (A); Área da folha (cm2) x número de 5 sementes por sílique (B); e peso de semente por sílique (mg) x número de sementes por sílique (C). Após a análise de correlação, o teste de Student foi realizado. Os valores de teste-t são dados entre parênteses. Os valores 'r' mostram correlação positiva em todos os testes. Com base nisto, é previsto que a supressão antissense de HOG1 induz ao aumento nos parâmetros- 10 chave que contribuem para a biomassa da folha e produção de semente.

Genótipo da planta A B C Tipo selvagem 0,898 (t=2,043) 0,857 (t=2,755) 0,795 (t=3,84) Linhagens antisentido 0,763 (t=2,043) 0,847 (t=2,755) 0,912 (t=3,84) de HOG1 Linhagens de super¬ 0,769 (t=2,078) 0,979 (t=2,878) 0,767 (t=2,269) expressão de HOG1 As linhagens de superexpressão maturaram mais cedo quando

comparadas às plantas do tipo selvagem, as linhagens de superexpressão tendo maturado mais cedo do que as plantas do tipo selvagem aproximada- mente quase uma semana (Figura 3A), enquanto as linhagens de supressão 15 antissense maturaram mais tarde do que o tipo selvagem aproximadamente duas semanas. Além disso, a senescência foi retardada nas linhagens de supressão antissense de HOG1 aproximadamente duas semanas, quando comparadas à Arabidopsis do tipo selvagem (Figura 3C, Tabela 1).

Para estudar o papel de HOG1 como um receptor de citoquinina, culturas de calo de plantas H0G1 transgênicas foram examinadas quanto à sua sensibilidade às citoquininas exógenas similares ao estudo com CRE1 (Inoue e outros, supra). Ao contrário de meristemas apicais de broto em plantas inteiras, culturas de calo têm o potencial para responder às citoquini- nas exógenas fornecidas no meio nutriente e não são dependentes do transporte à longa distância do hormônio como em plantas intactas. Culturas 5 de calo de linhagens de superexpressão de HOG1 e do tipo selvagem exibi- ram proliferação celular normal e indução de broto adventícia (Figura 3F). Ao contrário, calo das linhagens HOG1 antissense exibiu um forte fenótipo in- sensível de citoquinina, a saber, ausência de proliferação celular e falta de indução de broto adventícia em todas as concentrações de zeatina forneci- 10 das (Figura 3F). Estes dados mostram que as funções de HOG1 como um regulador positivo de resposta de citoquinina.

(d) O contraste dos fenótipos de plantas transgênicas está relacionado com os níveis de citoguinina endógena.

Os mutantes de perda de função tripla de receptores de citoqui- 15 nina do tipo AHK causaram um fenótipo oposto (Higuchi e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101:8821-8826, 2004) àquele ser observado com a presente supressão antissense de HOG1. Este fenótipo contraditório pode ser expli- cado pelo impedimento potencial à translocação de citoquinina pela proteína de HOG1 nas linhagens de superexpressão.

O teor endógeno de citoquinina foi determinado para três linha-

gens independentes, cada uma linhagens do tipo selvagem, de superex- pressão e supressão antissense. As concentrações de diferentes citoquini- nas avaliadas foram significantemente reduzidas nas linhagens de superex- pressão em comparação ao tipo selvagem (Fig 3G). Isopentenil adenina é a 25 citoquinina predominante de Arabidopsis, e sua concentração foi reduzida em cerca de 60% nas linhagens de superexpressão em comparação àquela do tipo selvagem (Fig 3G). A maior disponibilidade da proteína nas linhagens de superexpressão pode apresentar um impedimento para o transporte de citoquininas através da membrana de plasma, especialmente por que as ci- 30 toquininas devem ser translocadas das raízes para o meristema do broto apical. Isto induzirá a um fenótipo de perda de função aparente, a saber, a estatura da planta reduzida e a ausência de biomassa vegetativa, como ob- » 77

servado (Figura 3A).

Ao contrário, nas linhagens antissense, a concentração de iso- pentenil adenina foi aumentada em acima de 60% em comparação ao tipo selvagem, que corresponde a um aumento maior do que quatro vezes sobre 5 as linhagens de superexpressão (Figura 3G). Isto resultou no fenótipo opos- to de ramificação profusa e significante ganho de biomassa.

Para testar isto experimentalmente, o efeito de aplicação exóge- na de citoquininas sobre os fenótipos das linhagens transgênicas foi estuda- do. As linhagens de superexpressão recebendo spray de 0,01 μΜ de zeatina 10 ou 0,01 μΜ de quinetina em dias alternados do estágio de muda mostrou emergência no estágio de 6 a 7 folhas quando em comparação às linhagens de superexpressão não tratadas, que emergiram no estágio de 4 folhas (Fi- gura 2G, 2H, 21, 2J e Figura 7). A Arabidopsis do tipo selvagem emergiu em torno do estágio de 8 folhas, indicando que as linhagens de superexpressão 15 foram 'parcialmente resgatadas' pela aplicação exógena de citoquininas.

Além disso, as linhagens de superexpressão antissense não mostraram nenhuma alteração significante em resposta à aplicação exógena de citoquininas (Figura 7), suportando a visão de que o impedimento à trans- locação de citoquinina é provável de ser responsável pelos fenótipos contra- -20 ditórios observados no estudo.

(e) HOG1 purificado não possui atividade de enzima SAHH

Nenhuma diferença significante em atividades de SAHH nos ex- tratos de proteína brutos (Figura 3H) do tipo selvagem (2,92 ± 0,15 nmol/min/mg proteína), antissense (2,84 ± 0,21 nmol/min/mg proteína) e Ii- 25 nhagens de superexpressão (3,02 ±0,19 nmol/min/mg proteína) a despeito da reportagem anterior de que os mutantes de ponto hogl tiveram atividades de SAHH ligeiramente menores nos extratos de proteína brutos (Rocha e outros, Plant Cell 17:404-417, 2005) em comparação àquela do tipo selva- gem. Mais importantemente, os presentes dados mostaram que a proteína 30 TAP-HOG1 purificada não possui atividade de enzima SAHH (Figura 3H). Estes resultados sugerem que a presente proteína HOG1 pode ser um re- ceptor de citoquinina. Além disso, foi explicado em Rocha e outros (supra) que as me- nores diferenças em atividade de SAHH avaliada em extratos de proteína brutos do mutante de ponto (hog1-1) pode ser dependente de alguns outros locos. Adicionalmente, a redução da atividade de SAHH deve induzir a um aumento nos níveis de SAH e um decréscimo na relação de SAM:SAH. En- tretanto, foi mostrado que o homozigoto hog1-1 mostrou insignificante au- mento em níveis de SAH e a mudança na relação de SAM:SAH foi relativa- mente pequena. A hipometilação ampla de genoma mostrada nestes mutan- tes foi também em contraste com a hipometilação de genoma de tabaco em culturas de suspensão induzidas por (S)-9-(2,3-dihidroxipropil)adenina, que ocorreu apenas quando a relação de SAM:SAH diminuiu em 300 vezes com relação ao material não tratado. Estes resultados sugeriram que as proteínas de ligação de citoquinina com similaridade de seqüência para SAHH em plantas podem não ser enzimas SAHH ativas, porém podem em vez disso ser receptores de citoquinina.

(f) HOG1 afeta a expressão de genes de resposta primária de citoquinina.

Embora a resposta de cultura de tecido suporte a visão de que HOG1 é um regulador positivo de resposta de citoquinina, ele envolveu aci- ma de seis semanas de crescimento in vitro, durante aqueles outros proces- 20 sos podem ter também contribuído para o fenótipo. Portanto, a expressão de genes selecionados que são conhecidos estar diretamente induzidos por citoquininas em períodos relativamente curtos foi também examinada (Figura 4A, 4B e Tabela 4). Estes genes incluíram KNAT1 e STM (genes homeobox envolvidos em função de meristema, induzidos em 5 minutos após a aplica- 25 ção de citoquininas exógenas) bem como ARR4, ARR5 e ARR6 (que são os reguladores de resposta do tipo A induzios por citoquininas). Análise de PCR de tempo real quantitativa foi realizada usando RNA de mudas do tipo selva- gem, linhagens de superexpressão de HOG1 e de supresão antissense de HOG1 antes e após um tratamento de pulso com citoquinina (benziladenina, 30 BA, at ΟμΜ, 0,01 μΜ, 0,1 μΜ, 1 μΜ ou 5 μΜ). A extração de RNA foi realiza- da em tecidos colhidos durante diversos intervalos de tempo (5 min, 15 min, 30 min e 1 h). A aplicação de BA causou um aumento dependente da dose de transcrições de KNAT1 e STM1 que foi comensurado com o nível de ex- pressão de HOG1 e as concentrações de citoquinina endógena nas linha- gens (Figura 4A, 4B, Tabela 4). Os níveis de transcrição de KNAT1 e STM foram significantemente superregulados em 6 a 8 vezes mesmo sem trata- 5 mento de BA nas linhagens de supressão antissense de H0G1, ao passo que as linhagens não tratadas de superexpressão mostraram um aumento de 4 a 7 vezes destas transcrições quando em comparação ao tipo selva- gem não tratado (Figura 4A). Entretanto, dentro de 1h após a aplicação de 5 μΜ de BA, as linhagens de superexpressão (por exemplo, 0E1 e 0E12) não 10 mostraram nenhuma diferença significante nos níveis de transcrições de KNAT1 e STM em comparação àquelas das plantas do tipo selvagem não tratadas (Figura 4A, Tabela 4). Isto é consistente com a observação de que esta linhagem tem redução em níveis de citoquinina endógena.

Tabela 4. Análise de PCR de tempo real quantitativa de genes responsivos de selecionada:

RNA de mudas de linhagens do tipo selvagem, de superexpres- são de HOG1 e de supressão antissense antes e após um tratamento de pulso com citoquinina (benziladenina, BA, at ΟμΜ, 0,01 μΜ, 0,1 μΜ, 1μΜ ou 5μΜ). Extração de RNA foi realizada usando tecidos colhidos durante diver- 20 sos intervalos de tempo (5 min, 15 min, 30 min e 1h) de três linhagens de supressão antissense independente (AS1, AS8, AS21) e superexpressão (OE1, OE12, OE18). Os genes analisados incluem KNAT1, STM (genes ho- meobox envolvidos em função de meristema), ARR4, ARR5 e ARR6 (regu- ladores de resposta do tipo A induzidos por citoquininas). A aplicação de BA 25 causou um aumento de transcrições de KNAT1 e STM dependente da dose (as setas próximas aos valores de mudança de duplicação indicam a super- gulação t ou sub-regulação i). ARR1, ARR2 (reguladores de resposta do tipo B), AHK2, AHK3, AHK4 (receptores de citoquinina de histidina quinase) foram também analisados. Entretanto, os dados não são mostrados nesta 30 Tabela por causa destes genes exibiram menos do que mudança de duas vezes em expressão. Gene Concentração Tempo Genótipo/muc ança de du plicação Tipo selvagem AS1 AS8 AS21 OE1 OE12 OE18 KNAT1 0 μΜ 5 min 1 6,12t 7,36t 8,69t 4,914 5,014 7,204 15 min 1 6,12t 7,36t 8,69t 4,914 5,014 7,204 30 min 1 6,12t 7,36t 8,69t 4,914 5,014 7,204 1 h 1 6,12t 7,36T 8,69t 4,914 5,014 7,204 0,01 μΜ 5 min 2,13t 8,12t 9,1 T 10,0lt 4,014 4,874 6,564 15 min 2.67T 8,57t 9,211 10,39t 3,864 4,564 6,324 30 min 2,98t 8,98t 9,86t 10,53t 3,414 4,134 6,134 1 h 3,15t 9,20T 9,98t 11,99t 3,014 3,064 5,984 0,1 μΜ 5 min 3,36t 9,14t 10,12t 11.11T 3,564 3,914 5,894 15 min 3,58T 9,39T 10,32T 11,26t 3,244 3,714 5,724 30 min 3,89t 9,69t 10,57t 11,48t 3,124 3,594 5,364 1 h 3,99t 9,98T 10,99T 11,83t 2,964 3,214 5,014 1,0 μΜ 5 min 4,1T 10,43t 11.01T 11,93t 2,764 3,194 4,364 15 min 4,31T 10,68t 11,43t 12,02t 2,514 3,014 4,214 30 min 4,59t 10,73t 11,69t 12,35t 2,294 2,894 4,014 1 h 4,87t 11,0lt 11.93T 12.76T 2,014 2,164 3,924 5,0 μΜ 5 min 5,52t 10,98T 11,98t 12,43t 2,194 2,874 3,454 15 min 5,69t 11.01T 12,07t 12,54t 2,014 2,624 3,184 30 min 5,89t 11,23t 12,46T 12,87t 1,834 2,494 3,014 1 h 6,04t 11,46t 13,43t 12,96t 1,544 1,834 2,894 Gene Concentração Tempo Genótipo/mudança de du plicação Tipo selvagem AS1 AS8 AS21 OE1 OE12 OE18 ARR4 0 μΜ 5 min 1 3,12t 5,36T 7,69t 5,9U 6,014 8,24 15 min 1 3,12t 5,36t 7,69t 5,914 6,014 8,24 30 min 1 3,12T 5,36t 7,69t 5,914 6,014 8,24 1 h 1 3,12t 5,36t 7,69t 5,914 6,014 8,24 0,01 μΜ 5 min 3,13t 4,12t 6,1T 8,0lt 5,014 5,874 7,564 15 min 3,67T 4,57t 6,41 T 8,39T 4,864 5,564 7,324 30 min 3,98t 4,98T 6,86t 8,53t 4,414 5,134 7,134 1 h 4,15t 5,2t 6,98t 8,99T 4,014 4,064 6,984 0,1 μΜ 5 min 4,36t 5,14T 7,12t 9,11T 4,564 4,914 6,894 15 min 4.58T 5,39t 7,32t 9,26t 4,244 4,714 4,724 30 min 4,89t 5,69t 7.57T 9,48t 4,124 4,594 4,364 1 h 4,99T 5,98t 7,99T 9,83t 3,964 4,214 4,014 1,0 μΜ 5 min 5,1T 6,43t 8,011 9,93t 3,764 4,194 3,364 15 min 5,31 T 6,68t 8,43t 10,02t 3,514 4,014 3,214 30 min 5,59T 6,73T 8,69t 10,35t 3,294 3,894 3,014 1 h 5,87Í 7,01T 8,93T 70,76t 3,014 3,564 2,924 5,0 μΜ 5 min 6,52t 6,98t 8,98t 10,43T 3,194 3,874 2,454 15 min 6,69t 7,01 T 9,07T 10,54t 3,014 3,624 2,184 30 min 6,89t 7,23t 9,46f 10,87T 2,834 3,494 2,014 1 h 7,04t 7,46T 9,63t 10,96t 2,544 2,134 1,894 Gene Concentração Tempo Genótipo/muc ança de du plicação Tipo selvagem AS1 AS8 AS21 OE1 OE12 OE18 STM 0 μΜ 5 min 1 3,01T 5,24t 6,56t 3,564 5,214 6,594 15 min 1 3,0lt 5,24T 6,56t 3,564 5,214 6,594 30 min 1 3,01 T 5,24t 6,56t 3,564 5,214 6,594 1 h 1 3,01í 5,24t 6,56t 3,564 5,214 6,594 0,01 μΜ 5 min 2,45t 3,23t 5,2t 7,11 3,414 4,974 6,234 15 min 2.54T 3,67T 5,58t 7,48t 3,234 4,65 6,024 30 min 3,01T 3,91 T 5,95t 7,69t 3,014 4,314 5,914 1 h 3,2t 4,1T 6,06t 8,05T 2,814 3,964 5,824 0,1 μΜ 5 min 3,56T 4,24T 6,22t 8,211 3,24 3,814 5,794 15 min 3,68t 4,49t 6,39t 8,36t 3,144 3,734 5,614 30 min 3,85t 4,79T 6,63T 8,58t 2,924 3,494 5,344 1 h 3,96t 4,97t 6,94t 8,87t 2,764 3,014 5,014 1,0 μΜ 5 min 4,1 It 5,53t 7,8t 8,89t 2,864 2,894 4,264 15 min 4,36T 5,78t 7,93t 9,02T 2,614 2,564 4,114 30 min 4,69t 5,83t 7,99t 9,25t 2,394 2,874 4,014 1 h 4.97T 6,2lt 8,07t 9,66t 2,114 2,624 3,824 5,0 μΜ 5 min 5,62T 6,01 T 8,46t 9,33t 2,294 2,494 3,354 15 min 5,89t 6,21T 8,63t 9,44t 2,114 2,134 3,284 30 min 5,99t 6,43T 8,73t 9,67t 1,934 2,014 3,014 1 h 6,14t 6,76T 8,99t 9,89t 1,444 1,684 2,794 Gene Concentração Tempo Genótipo/muc ança de du plicação Tipo selvagem AS1 AS8 AS21 OE1 OE12 OE18 ARR5 0 μΜ 5 min 1T 4,11T 6,34t 7,63T 4,66l 6,314 7,494 15 min 1T 4,11T 6,34t 7,63t 4,664 6,314 7,494 30 min 1T 4,11T 6,34t 7,63t 4,664 6,314 7,494 1 h It 4,11T 6,34t 7,63t 4,664 6,314 7,494 0,01 μΜ 5 min 3,55t 4,33T 6,12t 8,2t 4,514 5,874 7,334 15 min 3,64t 4,77t 6,68T 8,58t 4,334 5,554 7,034 30 min 4,11T 5,01 T 6,82t 8,79t 4,114 5,214 6,914 1 h 4,3t 5,1 it 7.16T 9,15t 3,914 4,964 6,634 0,1 μΜ 5 min 4,66t 5,34t 7,32t 9,311 4,14 4,714 6,694 15 min 4,7δΤ 5,59t 7,49t 9,46T 4,044 4,634 6,514 30 min 4,95t 5,89t 7,73t 9,68t 3,94 4,44 6,234 1 h 5,06t 6,07t 8,04t 9,97t 3,674 4,014 6,014 1,0 μΜ 5 min 5,211 6,62T 8,59f 9,99t 3,964 3,994 5,364 15 min 5,46T 6,88T 8,93t 10,12t 3,714 3,464 5,214 30 min 5,79t 6,93T 9,09Í 10,35t 3,494 3,774 5,014 1 h 6.07T 7,311 9.17Ϊ 10,76t 3,214 3,524 4,724 5,0 μΜ 5 min 6,72t 7,01í 9,56t 10,43t 3,194 3,594 4,254 15 min 6,99t 7,31 T 9,73T 10,56t 3,014 3,134 4,184 30 min 7,09v 7,53í 9,83Í 10,711 2,834 34 44 1 h 7,24t 7,86t 10,05T 10,93t 2,544 2,784 3,894 Gene Concentração Tempo Genótipo/mud ança de du plicação Tipo selvagem AS1 AS8 AS21 OE1 OE12 OE18 ARR6 0 μΜ 5 min 1T 4,12t 6,36? 8,63? 5,664 7,014 9,24 15 min It 4,12? 6,36? 8,63? 5,664 7,014 9,24 30 min 1T 4,12t 6,36? 8,63? 5,664 7,014 9,24 1 h 1T 4,12? 6,36? 8,63? 5,664 7,014 9,24 0,01 μΜ 5 min 4,13? 4,12? 7,1? 9,2? 5,514 6,874 8,564 15 min 4,67t 4,57? 7,41? 9,58? 5,334 6,564 8,324 30 min 4,98t 5,98? 7,86? 9,79? 5,114 6,134 8,134 1 h 5,15? 6,2? 7,98? 10,15? 4,914 5,064 7,984 0,1 μΜ 5 min 5,36? 6,14? 8,12? 10,31? 5,14 5,914 7,894 15 min 5,58t 6,39? 8,32? 10,46? 5,044 5,714 5,724 30 min 5,89t 6,69? 8,57? 10,68? 4,94 5,594 5,364 1 h 5,99? 6,98? 8,99? 10,97? 4,674 4,614 5,014 1,0 μΜ 5 min 6,1 T 7,43? 9,01? ---x 4,964 5,194 4,364 o CO CO ---> 15 min 6,31 T 7,68? 9,43? 11,12? 4,714 5,014 4,214 30 min 6,59? 7,73? 9,69? 11,32? 4,494 4,894 4,014 1 h 6,87? 8,01? 9,93? 11,76? 3,214 3,564 3,014 5,0 μΜ 5 min 7,52? 7,98? 9,98? 11,43? 4,194 4,874 3,454 15 min 7,69t 8,01? 10,07? 11,56? 4,014 4,624 3,184 30 min 7,89t 8,23? 10,46? 11,71? 3,834 3,494 3,014 1 h 8,04? 8,46? 10,63? 11,93? 2,144 2,034 2,894 O nível de expressão dos genes examinados foi de 3 a 6 vezes maior nas linhagens de antissense que têm concentração de citoquininas endógenas de cerca de 4 vezes maior. Portanto, a expressão de HOG1 foi mostrada correlacionar-se à resposta de citoquinina nestas plantas. Isto é 5 similar aos relatos anteriores de que ambas as expressões STM e KNAT1 foram significantemente elevadas em plantas de Arabidopsis com biossínte- se de citoquinina elevada causada por superexpressão do gene bacterial ipt (Rupp e outros, Plant J 18:557-563, 1999). Estas observações indicam o envolvimento direto de H0G1 em regulação de respostas de citoquinina du- 10 rante o desenvolvimento da planta.

Adicionalmente, para determinar se os fenótipos das linhagens transgênicas de HOG1 foram associados com a transdução de sinal de cito- quinina, a classe melhor conhecida de genes precoces imediatos induzidos por citoquininas, a saber, genes ARR tipo A - ARR4, ARR5 e ARR6 foram 15 estudados (Figura 4B). Os presentes dados mostraram que estes genes fo- ram super-regulados em minutos após um único tratamento de pulso de ci- toquinina, que é consistente com observações anteriores em Arabidopsis (Brandstatter e Kieber planta Celi 10:1009-1020, 1998; D'Agostino at el plan- ta Physiol 124:1706-1717, 2000; Taniguchi e outros, FEBS Lett. 429:259- •20 262, 1998; To e outros, planta Cell 16:658-671, 2004).

Descobriu-se que as linhagens de HOG1 de superexpressão (por exemplo, OE12), que têm uma redução significante nos níveis de cito- quinina endógena (Figura 3G), mostraram um decréscimo de 3 a 9 vezes nos níveis de expressão dos três genes ARR tipo A. Isto pode ser superado 25 em uma grande extensão por um tratamento de BA (Figura 4B), que é con- sistente com o fluxo reduzido através da trilha de transdução de sinal de ci- toquinina primária. Similarmente, as linhagens de HOG1 antissense (por e- xemplo, AS8) com níveis de citoquinina endógena maiores tiveram um nível correspondentemente maior (um aumento de 4 a 9 vezes) de expressão de 30 ARR (Figura 4B e Tabela 4). Estes dados mostram que os genes de ARR tipo A são a jusante do novo receptor de citoquinina HOG1. Similarmente, ARR6 foi previamente mostrato ser induzido em resposta às citoquininas exógenas em linhagens de superexpressão de CRE1, o que confirmou ARR6 ser um receptor de citoquinina (Hwang e Sheen Nature 413:383-389, 2001).

Além disso, os níveis de transcrição de dois ARRs tipo B (ARR1 5 e ARR2) nestas linhagens transgênicas foram estudados para assegurar que as observações sobre os ARRs tipo A são respostas específicas. ARR1 e ARR2 não foram significantemente afetados pelo tratamento de BA sob as condições experimentais presentes (Tabela 4), que é consistente com resul- tados anteriores (Imamura e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:2691- 10 2696, 1998; Kiba e outros, Plant Cell PhysioL 40:767-771, 1999; Hutchison e outros, Plant Cell 18:3073-3087, 2006).

A fim de excluir o envolvimento de receptores de citoquinina do tipo AHK, a saber, AHK2, AHK3 e CRE1/AHK4, seus níveis de transcrição nas diferentes linhagens transgênicas foram determinados. Nenhuma dife- 15 rença significante foi observada nas linhagens de superexpressão e supres- são de antissense de HOG1 em comparação àquela do tipo selvagem (da- dos não mostrados), mostrando que HOG1 age independentemente destes três receptores de citoquinina conhecidos.

(q) TAP-HOG1 interage com AHP1 Para determinar o complexo de sinalização formado pela proteí-

na HOG1 e também sustentar seu papel como um receptor de citoquinina, proteínas que interagem com HOG1 foram isoladas e identificadas.

Seis linhagens de Arabidopsis transgênicas independentes ex- pressando HOG1 com um rótulo TAP de terminal N (TAP-HOG1) foram ge- 25 radas. Estas plantas tiveram o mesmo fenótipo como as linhagens de super- expressão de HOG1, mostrando que a proteína de fusão é funcional nas plantas. Ensaios destrutivos foram realizados com extrato de proteína total de plantas transgênicas TAP-HOG1 com três semanas de idade. Uma faixa de proteína de 71 kDa foi detectada quando uma análise de immunoblot foi 30 realizada usando anticorpo PAP para detectar a presença da proteína de fusão TAP-HOG1 nestas plantas (Figura 4C). O peso molecular previsto de HOG1 é de 56 kDa e o rótulo é de 15 kDa, desse modo montando na faixa I 87

de proteína de fusão de 71 kDa. O complexo de proteína com TAP-HOG1 foi eluído de extrato de proteína total usando os rótulos e contas de IgG usando o método de Forler e outros, (supra). O complexo de proteína foi submetido à SDS-PAGE e sequenciamento de terminal N da faixa de proteína promi- 5 nente revelou que ele era AHP1. Subsequentemente, o cDNA para AHP1 foi clonado por PCR de Arabidopsis e AHP1 recombinante foi expresso em E. coli (Figura 4D). Foi mostrado, usando ITC, que AHP1 interage diretamente com proteína TAP-H0G1 purificada (Fig 4E). O valor KD de constante de dissociação para o complexo formado por duas proteínas purificadas em ITC 10 foi de 23,8 nM.

Proteínas de Fosfotransferência Histidina de Arabidopsis (AHP1, AHP2, AHP3, AHP4 e AHP5) são os intermediários-chave de sinalização de citoquinina, por que elas funcionam como pontes nucleares citoplásmicas entre os receptores de membrana e os reguladores de resposta nuclear. A 15 demonstração de que elas interagem com AHP1, que é um intermediário- chave de transdução de sinal de citoquinina, também confirmou a função de receptor da proteína H0G1.

Os presentes dados mostram que HOG1 é um novo receptor de citocinina em adição aos receptores da família AHK descritos mais cedo. ■20 Diversos homólogos foram isolados de Brassica albogiabra, crisântemo, a- marantos e arroz. Isto mostra que H0G1 está presente em diversas espé- cies de planta e é importante na regulação de desenvolvimento de planta. A série de reação de transdução de sinal de citocinina descrita acima é uma série de reação de fosforrevezamento similar ao sistema de resposta de dois componentes bacterianos. Isto é compatível com o fato de que citocininas desempenham diversos papéis na regulação de desenvolvimento de planta e a presença de mais do que um tipo de receptores de citocinina pode facili- tar tais funções pleiotrópicas. Um tal fenômeno foi também observado em transdução de sinal de etileno onde mais do que um receptor (por exemplo, ETR1, ERS2, ETR2 e EIN4) está envolvido. Além disso, a expressão consti- tutiva de HOG1 em todas as partes da planta sugere uma papel crucial para a proteína em desenvolvimento de planta. A possibilidade que outros receptores podem existir para citoci- ninas foi realçada com base na observação de que o mutante triplo dos re- ceptores de citocinina de histidina cinase (cre1-12ahk3-3ahk2-2(Col)) produ- ziu plantas, embora tendo fenótipos severamente nanicos e estéreis. Mutan- tes de perda de função nos três receptores de citocinina tipo AHK causaram fenótipos opostos em comparação àqueles observados com a presente su- pressão antissentido do gene HOG1. Os fenótipos contraditórios observados no presente estudo parecem ser o resultado de níveis de citocinina endóge- nos alterados nos brotos. A ligação de alta afinidade de moléculas de citoci- nina pela proteína HOG1 foi indicada por valores KD baixos. Quando o gene foi significantemente superexpresso por duas cópias do promotor forte (pro- motor 35S de vírus de mosaico de couve-flor) usado no presente estudo, o aumento resultante na proteína bem como expressão ectópica levou a uma redução significante em citocininas livres disponíveis (Figura 3G). Isto é pos- sivelmente devido à proteína que age como um impedimento para transpor- tar citocinina através da membrana plasmática. Isto é importante porque o ápice do broto deve receber citocininas do ápice da raiz (que é o sítio primá- rio de biossíntese de citocinina). Isto levou a um fenótipo de perda de função aparente, isto é, estatura da planta reduzida e falta de biomassa vegetativa. Ao contrário, nas plantas de antissentido, existe um aumento

significante em moléculas de citocinina livres disponíveis no meristema api- cal do broto, levando ao fenótipo oposto de ramificação profusa e ganho sig- nificante de biomassa (Figura 3G).

Aplicação da purificação de proteína rótulo TAP em plantas per- 25 mitiu a caracterização de diversos complexos de proteína incluindo a proteí- na de resistência Cf9 em tabaco e proteína de CTR1 em Arabidopsis. O pre- sente estudo identificou fosfotransferência de histidina de Arabidopsis (AHP1) como uma proteína que interage com HOG1, mostrando que AHP1 é um intermediário de sinalização a jusante para HOG1. AHP1 recombinante 30 foi expressa e mostrada interagir diretamente com a proteína TAP-HOG1 purificada. O valor da constante de dissociação para o complexo formado pelas duas proteínas puras em ITC foi 23,8 nM, que fornece importante su- porte para a função do de HOG1.

(h) H0G1 como um novo receptor para série de reação de transdução de sinal de citocinina

Para melhor entender o papel do novo receptor de citocinina 5 H0G1 na mediação de resposta de citocinina, os genes de resposta primária induzidos por citocininas a saber, genes ARR tipo A (isto é ARR4, ARR5 e ARR6) foram analisados. Mudanças nos níveis de expressão dos ARRs fo- ram observadas na Figura 4B e Tabela 4, que em adição ao teor de citocini- na medido em linhagens de superexpressão e antissentido de H0G1 suge- 10 rem que a resposta à citocinina endógena é afetada por HOG1. Isto confirma a proteína HOG1 como um novo receptor e os ARRs comos os membros da cascata de sinalização a jusante da série de reação de transdução de sinal de citocinina de H0G1 junto com AHP1.

Portanto, os presentes dados fornecem uma série de reação de 15 transdução de sinal de citocinina por meio de H0G1 em Arabidopsis em adi- ção ao sistema de dois componentes previamente descrito (Figura 5). É im- portante observar que modificação genética dos receptores de histidina ci- nase relatados mais cedo não foi mostrada afetar o desenvolvimento vegeta- tivo e reprodutivo ao contrário da supressão antissentido de H0G1. Os pre- •20 sentes dados mostram que este receptor servirá como um alvo-chave para melhora biotecnológica de plantas de colheita para produção aumentada de biomassa e grão.

EXEMPLO 2

Aumento de produção de grão e biomassa em arroz por supressão antissen- tido de um gene para um receptor de citocinina putativo MATERIAIS E MÉTODOS Materiais da planta

Para arroz Oryza sativa L. japonica, cultivar Nipponb foram usa- dos. Este é um cultivar comercial que se origina do Japão. Trabalho similar pode também ser realizado com outros cultivares de arroz (subespécies in- dica). Sementes de Arabidopsis thaliana tipo selvagem foram obtidas de LEHLE SEEDS (1102 South Industrial Blvd., Suite D, Round Rock TX 78681 USA).

Cepas bacterianas

A cepa bacteriana usada para clonagem de DNA neste estudo foi Escherichia coli DH5a, que foi cultivada em meio LB líquido (Sambrook e outro, 1989) a 37°C exceto quando indicado de outra maneira. As cepas de Agrobacterium tumefaciens usadas foram GV3101 (Koncz e Schell, 1986). PCR com iniciadores degenerados para clonagem do gene

Após extração de RNA1 transcrição reversa (RT) foi realizada usando transcriptase reversa AMV (vírus de mieloblastose aviária) (AMV-RT, 10 Promega). Os produtos de cDNA foram usados para PCR usando os inicia- dores degenerados PET1: 5'- A(AG)ATGCC(CT)GG(ACT)CT(ACT)ATG(GT)C(ACT)T-3' (SEQ ID NO: 24) e PET2: 5'-TC(AG)AACTTGCTCTTGGT(AG)AC(AG)-3' (SEQ ID NO: 25) para isolar o fragmento parcial de Arabidopsis thaliana e arroz. O fragmento 15 de PCR foi clonado e sequenciado.

Amplificação rápida de extremidades de cDNA 5' e 3'

O Kit de Amplificação de cDNA SMARTTM RACE (Clontech La- boratories) foi usado para identificar as seqüências finais 5'- e 3'-cDNA (57 3'-RACE) de cDNA. Estes produtos de PCR foram sequenciados. A sequên- 20 cia parcial e produtos de PCR RACE foram alinhados juntos para obter a seqüência de cDNA de tamanho natural para Arabidopsis thaliana (HOG1) e arroz (OsCBP).

O constructo de gene usado para transformação de planta medi- ada por Agrobacterium foi o constructo de supressão de gene antissentido (35S:asHOG1). O promotor usado foi o promotor 35S de Vírus Mosaico da Couve-flor (CaMV).

Transformação de planta mediada por Agrobaeterium de arroz

O método de Hiei e outro, (Plant Journal UK Vol. 6, páginas 271-282, 1994) foi usado.

1. Indução de calo de arroz

Sementes de arroz maduras foram esterilizadas na superfície com 70% de etanol durante 1,5 min. Branqueador (20%) foi adicionado com uma gota de Tween-20, em um frasco estéril de 100 ml em um agitador a 120 rpm durante 45 min. Isto foi seguido por enxague das sementes tratadas completamente com água destilada estéril.

As sementes esterilizadas foram colocadas na superfície de 5 meio NBO solidificado de 30 ml com 2,0 mg/l de 2,4-D (meio de indução de calo) em placas Petri plásticas profundas de 9 cm estéreis. As placas foram cobertas com fita e colocadas em uma caixa em uma sala de cultura de teci- do e as sementes de arroz foram deixadas germinar a 25°C na escuridão.

Após 10 dias, os calos derivados do scutellum foram excisados e subcultivados em meio de indução de calo fresco. A subcultura foi realizada a cada 4 semanas até calos embriogênicos, amarelo-claro, de desenvolvi- mento vigoroso serem obtidos.

2. Cocultivo de Aarobacterium com calo de arroz

Plasmídeos binários contendo um constructo antissentido (base- ado em pCAMBIA1301, R. Jefferson, CAMBIA, Austrália) foram introduzidos em cepa AGL1 de A. tumefaciens. A A. tumefaciens foi cultivada em arma- zenagem em meio YEP solidificado com 10 mg/L de rifampicina, 50 mg/L de canamicina e 50 mg/L de higromicina a 28°C durante 48-73 horas. 1 ml da cultura bacteriana foi adicionado a 100 ml de meio AB contendo os mesmos antibióticos seletivos em um frasco de 250 ml a 28°C. As bactérias foram cultivadas para obter uma densidade de OD595 em 0,8-1,0. As bactérias foram coletadas por centrifugação a 4.000 rpm durante 10 min em tempera- tura ambiente. O sobrenadante foi em seguida removido e as bactérias fo- ram lavadas uma vez por ressuspensão do pélete no mesmo volume em meio AMM, e centrifugadas novamente em 4.000 pm durante 10 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado.

As bactérias foram diluídas com meio AMM para uma densidade de OD595 em 0,4 (cerca de: 109 células por ml). Cerca de 20-25 ml das bac- térias diluídas foram usados para inoculação de Agrobacterium em placas 30 Petri plásticas de 9 cm estéreis. Calos embriogênicos, amarelo-claro, de de- senvolvimento vigoroso com o tamanho de cerca de 5 mm em diâmetro fo- ram selecionados e colocados na suspensão bacteriana e imersos durante 30 minutos, com agitação ocasional, em uma tampa de fluxo laminar estéril. Suspensão bacteriana em excesso dos calos foi removida colocando-se os calos em uma almofada de papel de tecido estéril seco. Os calos inoculados foram transferidos (sem enxague) para o meio 2N6-AS em placas Petri plás- 5 ticas de 9 cm estéreis, e incubados a 25°C na escuridão durante 2-3 dias.

3. Seleção e regeneração de transformantes

Os calos cocultivados em um frasco estéril de 100 ml foram cole- tados e lavados com agitação suave usando 50 - 75 ml de água destilada estéril pelo menos 10 vezes. Os calos foram secados em uma almofada de 10 papel de tecido estéril para remover água de superfície em excesso. Os pe- daços de calo foram transferidos em 100 ml de água destilada estéril com 500 mg/l de cefotaxima e 200 mg/l de ampicilina, e agitados durante duas horas em 120 rpm a 25°C. A água foi removida e os pedaços de calo foram manchados e secados em uma almofada de papel estéril. Os pedaços de 15 calo foram transferidos para meio NBO com 2 mg/L de 2.4-D, 250 mg/l de cefotaxima, 200mg/l de ampicilina, e 50 mg/l de higromicina (meio seletivo) em placas Petri de 9 cm estéreis para a seleção de células transformadas. As placas seladas foram incubadas a 25°C na escuridão.

Após uma seleção de 4 semanas, os microcalos resistentes à higromicina putativos foram extraídos de calos cocultivados, transferidos pa- ra o mesmo meio fresco seletivo para confirmação de resistência e prolifera- ção de tecido, e cultivados durante 3 semanas.

Calos resistentes à higromicina em desenvolvimento vigoroso foram transferidos para meio NBO com 1,0 mg/l de 6-BA, 2,0 mg/l de NAA, 25 5,0 mg/l de ABA e 50 mg/l de higromicina (meio de pré-regeneração) e culti- vados a 25°C na escuridão durante 3 semanas. Os calos embriogênicos re- sistentes à higromicina compactos brancos do meio de pré-regeneração fo- ram transferidos para meio NBO com 2,0 mg/l de 6-BA, 1,0 mg/l de IAA, 1,0 mg/l de NAA, 1,0 mg/l de KT e 50 mg/l de higromicina (meio de regenera- 30 ção), e cultivados a 25°C com 14 horas de Iuz (cerca de 2000 lux) e 8 horas de escuridão.

As mudas resistentes à higromicina regeneradas foram transfe- ridas três semanas depois para 100 ml de meio 1/4 MS com 50 mg/l de hi- gromicina (meio de crescimento de muda) em vasos Phytacon para indução de broto e alongamento de raiz. As condições de cultura foram continuadas até as mudas alcançarem o topo dos recipientes. Mudas resistentes à hi- 5 gromicina bem desenvolvidas foram removidas dos vasos de cultura e ime- diatamente colocadas em água de torneira em uma bandeja plástica para remover o meio ligado. As mudas foram transferidas para uma bandeja plás- tica de 54 poços (cerca de 5 cm de diâmetro) contendo meio /4 MS (solu- ção). Cada grupo dado de mudas (linhagem transgênica putativa) foi coloca- 10 do em um poço separado. As mudas foram dirigidas durante 7-10 dias em uma câmara de desenvolvimento em 90% de umidade a 20°C com 14 horas de Iuz (cerca de 400 lux) e 8 horas de escuridão.

As plantas foram transplantadas para o solo em potes e cultiva- das em uma estufa como plantas não transgênicas durante três gerações para obter plantas transgênicas homozigotas.

Métodos Suplementares

Materiais de planta e condições de desenvolvimento

Para Arabidopsis thaliana, o ecotipo Columbia foi usado e as plantas foram cultivadas em 16 horas de Iuz e 8 horas de escuridão a 22°C em câmaras de desenvolvimento. Oryza sativa L. ssp. Japonica, cultivar Nipponb são usados para experimentos de transformação genética de arroz. Construção de plasmídeo e transformação genética de Arabidopsis

cDNA de HOG1 de tamanho natural foi amplificado por estraté- gia RACE 5' e 3'. Vetor binário pGreen 0229 (Yu e outros, supra) foi usado 25 para todos os constructos de transgene. Para supressão antissense, um fragmento de 850 bp de HOG1 abrangendo as duas assinaturas de SAHH foi usado (SEQ ID NO: 15). A estrutura de leitura aberta completa de cDNA de HOG1 foi usada para o constructo de superexpressão (SEQ ID NO: 2). HOG1 rotulado por TAP foi com rótulos de peptídeo de ligação de Prot A e 30 calmodulina com um sítio de clivagem de TEV entre os dois rótulos. Os constructos foram introduzidos em Arabidopsis thaliana por método de imer- são floral mediado por Agrobacterium tumefaciens (Clough, S. e Bent, A. The Plant Journal 16(6):735-743 (1998)).

Análise de PCR quantitativa de tempo real

RNA total foi extraído de mudas de Arabidopsis ou folhas de ar- roz com o método TRIzoI (Invitrogen). RNA total (0,5 pg) tratado com DNaseI 5 livre de RNase foi usado para cada reação de PCR quantitativa realizada com o kit RT de uma etapa (Qiagen) de acordo com as instruções do fabri- cante. PCR de tempo real quantitativa foi realizada usando verde SYBR (Applied Biosytroncos Inc.). Os valores Ct foram normalizados em compara- ção ao valor de Tubulin2 Ct para cálculo de duplicação-mudança de acordo 10 com o protocolo do fabricante.

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC)

Afinidade de ligação de citoquinina e análise termodinâmica da interação entre HOG1 e citoquininas foi examinada por ITC (MCSITC, Micro- cal, Northampton, USA). Proteína de fusão de TAP-HOG1 foi purificada u- 15 sando protocolos publicados (Forler e outros, supra) de plantas Arabidopsis transgênicas abrigando a construção de 35S::TAP-HOG1. 0,01 μΜ de benzi- Iadenina (uma citoquinina de ocorrência natural) e 0,1 μΜ de proteína TAP- HOG1 purificada foram usados para cada ensaio ITC com 25 injeções (cada injeção de 2 μΙ em intervalos de 3 s a 37°C). Os dados foram analisados 20 com MICROCAL ORIGIN versão 2.9 usando o método de mínimos quadra- dos não linear, de melhor ajuste para um sítio de ligação. A estequiometria de ligação (n), e constante de associação (KA) foram calculadas das curvas ajustadas. Subsequentemente, KD foi calculada como 1/KA.

Teorde citoquinina

Citoquininas foram extraídas de plantas inteiras com 100% de

metanol e quantificadas usando kit de detecção de isopentenil adenosina (Sigma) como descrito em Yang e outros, {supra).

Indução de calo de arroz

Sementes de arroz descascadas e esterilizadas na superfície foram induzidas para produção de calo colocando-as em meio NBO suple- mentado com 2 mg/L de 2,4-D (meio de indução de calo) e em seguida incu- bando-as a 25°C durante 30 dias no escuro. Após 30 dias, outra subcultura dos calos emergentes foi feita até calos embriônicos friáveis serem obtidos. Cocultivo de Aarobacterium com calo de arroz

O plasmídeo binário pCAMBIA 1300 contendo o HOG1 de tama- nho natural (orientações de senso ou antissense para superexpressão e su- pressão de antissense, respectivamente) foi introduzido em Agrobacterium tumefaciens AGL1 por eletroporação usando o Porador de Célula GIBCO- BRL. Plasmídeos transformados foram confirmados por digestão de restri- ção. O Agrobacterium abrigando as construções de plasmídeo foi cultivado em meio YEP com 10 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de canamicina e 50 mg/l de higromicina e incubado a 25°C durante 48 h. 1 ml desta cultura de escala pequena foi inoculado em 100 ml de meio líquido AB com os mesmos antibi- óticos de seleção e incubado a 25°C até as culturas alcançarem uma OD595 de 0,8 a 0,9. A cultura foi centrifugada em 4000 rpm durante 10 min. O péle- te bacteriano foi suspenso com meio AMM para uma densidade de OD595 em 0,4. Vinte a 25 ml desta suspensão bacteriana foram vertidos em placas Petri profundas de 9 cm e calos embriogênicos friáveis amarelo-claro de de- senvolvimento vigoroso (cerca de 5 mm em tamanho) foram imersos durante min com agitação ocasional. A suspensão bacteriana em excesso foi re- movida dos calos colocando-a em uma almofada estéril de papel de tecido >'20 seco. Subsequentemente, os calos inoculados foram cultivados em meio 2N6-AS em placas Petri profundas de 9 cm estéreis e incubados a 25°C no escuro durante 2-3 dias.

Seleção e regeneração de transformantes de arroz

Calos cocultivados foram lavados pelo menos dez vezes com 25 agitação suave usando 50-75 ml de água estéril, e secados colocando-se sobre papel de tecido estéril. Pedaços de calo foram transferidos para meio NBO com 2 mg/l de 2,4-D, 250 mg/l de cefotaxima e 50 mg/l de higromicina em placas Petri estéreis para seleção. Após 4 semanas de seleção, microca- Ios resistentes à higromicina foram selecionados como calos transgênicos 30 putativos, excisados do calo cocultivado, transferidos para meio de seleção fresco para outra proliferação, e cultivados durante 3 semanas. Calos resis- tentes à higromicina de desenvolvimento vigoroso foram transferidos para meio NBO com 1 mg/l de BA, 2 mg/l de NAA, 5 mg/l de ABA e 50 mg/l de higromicina (meio de pré-regeneração) e cultivados a 25°C no escuro duran- te 3 semanas. Calos resistentes à higromicina compactos brancos de meio de pré-regeneração foram transferidos para meio NBO com 2 mg/l de BA, 1 5 mg/l de IAA, 1 mg/l de NAA, 1 mg/l de quinetina e 50 mg/l de higromicina (meio de regeneração) e cultivados a 25°C com um fotoperíodo de 14 horas de Iuz (25 pmol/m2/s). Após 3 semanas, as mudas resistentes à higromicina regeneradas, incluindo os calos ligados, foram transferidos para 100 ml de meio !4 MS com 50 mg/l de higromicina (meio de muda) em vasos Phytacon 10 para desenvolvimento de broto e alongamento de raiz. As mudas foram cul- tivadas até elas alcançarem o topo dos recipientes. Cada grupo de mudas foi transferido para uma única poço em uma bandeja plástica de 54 poços con- tendo solução >2 MS. As mudas foram aclimatizadas durante 7-10 dias em uma câmara de desenvolvimento em 90% de umidade relativa a 20°C com 15 um fotoperíodo de 14 horas de Iuz (25 μιηοΙ/ηη2/5). Depois as plantas foram transferidas para o solo em potes.

As plantas de arroz transgênicas obtidas dos calos foram desig- nadas geração TO, sementes obtidas de plantas individuais foram germina- das na presença de higromicina e as plantas sobreviventes foram designa- 20 das geração T1. Sementes das plantas T1 foram novamente submetidas à seleção de higromicina e foram designadas geração T2 no presente estudo. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Análise de PCR de tempo real quantitativa indicou que HOG1 é constitutivamente expresso em Arabidopsis, com níveis relativamente maio- 25 res nas folhas e tronco de inflorescência como descrito no Exemplo 1(c), su- gerindo que HOG1 pode desempenhar um papel fundamental na regulação de desenvolvimento de planta. HOG1 purificado mostrou ligação de alta afi- nidade às moléculas de citoquinina (zeatina, benziladenina e isopentenil a- denina) como descrito no Exemplo 1(a).

A constante de dissociação (KD) para benziladenina foi 20,6 nM

(Figura 11), sugerindo ligação de alta afinidade com a proteína HOG1.

Várias linhagens OE de Arabidopsis de HOG1 mostraram um aumento de 5 a 8 vezes (Figura 8e) em níveis de transcrição de HOG1, en- quanto as linhagens AS de Arabidopsis mostraram uma supressão de 6 a 10 vezes (Figura 8e) quando em comparação ao tipo selvagem. Expressão de transgene significantemente afetou o desenvolvimento da planta e exibiu 5 fenótipos compatíveis em diversas linhagens transgênicas independentes. Os fenótipos foram registrados de 28 linhagens transgênicas de OE inde- pendentes e 21 linhagens AS, indicando que as mudanças foram causadas pelo produto de gene introduzido. Em comparação ao tipo selvagem (WT)1 germinação de semente ocorreu 4 a 5 dias mais cedo nas linhagens OE, e 10 quase 5 dias depois nas linhagens AS (Tabela 5). Entretanto, retardo de de- senvolvimento significante foi perceptível logo após germinação das linha- gens OE enquanto as linhagens AS não mostraram nenhum retardo de de- senvolvimento de broto a despeito de germinação de semente retardada.

A formação e expansão de novas folhas de roseta foram retar- 15 dadas e limitadas em todo desenvolvimento vegetativo nas linhagens OE. Início precoce de florescimento foi observado em plantas OE com disparo no estágio de roseta de 4 folhas (Figura 8a e Tabela 5), quando em compara- ção às linhagens WT e AS, que tiveram pelo menos 8 e 14 folhas, respecti- vamente, no momento de disparo (Figura 8b e Tabela 5).

' 20 Tabela 5. Germinação de semente. início de florescimento e senescência:

Cinco linhagens independentes foram usadas para cada obser-

vação. Para cada linhagem, os dados representam a média de três replica- tas independentes. As linhagens antissense mostraram germinação tardia, disparo tardio e senescência retardada.

Genótipo da Germinação da Início de florescimen¬ Senescência planta semente (nú¬ to/bloqueio (Número (Número de mero de dias) de folhas de roseta) dias) Tipo selvagem 1 8 8 40 2 7 8 40 3 8 8 38 4 9 7 40 5 8 8 40 Genótipo da Germinação da Início de florescimen¬ Senescência planta semente (nú¬ to/bloqueio (Número (Número de mero de dias) de folhas de roseta) dias) Média 8 8 40 Linhagens antissense AS1 13 14 55 AS8 12 15 53 AS14 13 14 54 AS21 14 14 54 AS19 13 15 53 Média 13 14 54 Linhagens de superexpressão OE1 4 4 30 OE8 4 3 32 OE12 4 3 30 OE18 5 4 28 OE14 4 4 30 Média 4 4 30 Após iniciação de florescimento, as linhagens OE não mostra-

ram qualquer outro aumento em biomassa de folha e nenhum galho de inflo- rescência de eixo foi formado mesmo após 30 dias de desenvolvimento quando a senescência estabeleceu-se para estas linhagens (Figura 8b). En- tretanto, as linhagens AS mostraram ramificação profusa de troncos de inflo- rescência (Figura 8b) e senescência retardada. As linhagens AS tiveram a área da folha mais alta (2,9 ± 0,1 cm2 por folha) e foi significantemente me- nor nas linhagens OE (0,4 ± 0,1 cm2) e WT (1,0 ± 0.1 cm2) (Figura 8c e Ta- bela 7). A biomassa total da planta, tamanho da siliqua e como um resultado, o número e peso das sementes por siliqua (Fig 8c, 8d, 8f e Tabela 6) foram reduzidos drasticamente nas linhagens OE, enquanto eles foram significan- temente maiores nas linhagens AS em comparação às WT (Figura 8c, 8d, 8f). As linhagens OE senesceram cerca de 10 dias mais cedo, enquanto as linhagens AS senesceram duas semanas mais tarde do que as WT (Figura 8a, 8b e Tabela 6).

Tabela 6. Área da folha, peso de semente e número de sementes por siliqua: Os dados representam a média ± SD de três replicatas indepen- dentes. Cinco linhagens independentes foram usadas em cada caso. As li- nhagens antissense mostraram um aumento de três vezes em biomassa de folha e um aumento de duas vezes em produção de semente em compara- ção ao tipo selvagem.

Genótipo da planta Área da folha Peso de se¬ Número de (cm2) mente por sementes por sílique (mg) sílique Arabdopsis tipo selvagem (WT) 1 1,04 ±0,02 1,13 ± 0,01 35 ±0,01 2 1,01 ±0,01 1,01 ±0,02 30 ± 0,02 3 0,90 ± 0,02 0,90 ± 0,02 26 ±0,01 4 1,07 ±0,02 1,18 ± 0,01 32 ± 0,01 5 0,98 ±0,01 1,10 ± 0,01 29 ±0,01 Média ± Desvio Padrão 1,00 ±0,07 1,06 ±0,11 30,40 ± 0,36 Linhagens antissense AS1 2,86 ±0,01 1,79 ±0,01 54 ± 0,02 AS8 3,12 ±0,01 2,40 ± 0,02 63 ± 0,02 AS14 3,01 ± 0,02 1,96 ±0,01 59 ± 0,02 AS21 2,79 ± 0,02 1,96 ±0,01 57 ±0,01 AS19 2,99 ± 0,02 2,00 ± 0,02 60 ±0,01 Média ± Desvio Padrão 2,95 ±0,13 2,02 ± 0,22 58,60 ± 0,37 Linhagens de superexpressão OE1 0,33 ± 0,02 0,68 ± 0,02 15 ±0,01 OE8 0,40 ± 0,02 0,72 ±0,01 17 ±0,01 OE12 0,49 ± 0,02 0,81 ±0,01 19 ±0,02 OE18 0,33 ± 0,02 0,70 ± 0,02 14 ±0,02 OE14 0,40 ± 0,01 0,83 ±0,01 17 ±0,02 Média ± Desvio Padrão 0,39 ± 0,06 0,75 ± 0,07 16,40 ±0,14 O teor de citoquinina endógeno foi determinado para três linha-

gens independentes cada de linhagens WT1 OE e AS, por causa da ligação estabelecida entre ramificação e senescência com níveis de citoquinina em plantas. Isopentenil adenina foi a citoquinina predominante e sua concentra- ção foi reduzida em cerca de 60% nas linhagens OE em comparação às WT (Figura 8f). Esta pode ser a principal razão para a biomassa e estatura da planta reduzidas nas linhagens OE observadas nas Figuras 8b e 8a. Ao con- trário, nas linhagens AS, a concentração de isopentenil adenina foi aumen- tada acima de 60% em comparação à WT1 ou cerca de um aumento de qua- 5 tro vezes sobre as linhagens OE (Figura 8f). Isto levou ao fenótipo oposto, a saber, ramificação profusa e ganho significante de biomassa.

Os resultados do presente trabalho de Arabidopsis sugerem que a manipulação genética de HOG1 ou seus ortólogos em espécies de colheita pode fornecer meios para produção realçada. Avaliação quanto aos ortólo- 10 gos de HOG1 em diversas outras espécies foi realizada. cDNAs foram bem- sucedidamente identificados e obtidos de arroz, Brassica alboglabra, crisân- temo e amarantos. cDNA de tamanho natural de OsCBP (Proteína de Liga- ção de Citoquinina de Oryza sativa\ Os11g0455500) foi isolado de arroz (Oryza sativa L. ssp. japonica, cultivar Nipponbare) por PCR de transcrição 15 reversa. A seqüência de aminoácido derivado de OsCBP (SEQ ID NO: 5) mostrou 90% de identidade de seqüência a HOG1 (SEQ ID NO: 1) e parece existir apenas uma cópia do gene em arroz (Figura 10). Devido à similarida- de de seqüência elevada entre HOG1 (SEQ ID NO: 1) e OsCBP (SEQ ID NO: 5), linhagens de arroz transgênicas foram geradas usando cDNA de 20 HOG1 a fim de testar se o traço de realce de produção pode ser obtido em arroz. Por transformação mediada por Agrobacterium, diversas linhagens de arroz independentes foram obtidas e confirmadas serem transgênicas por PCR de tempo real quantitativa e manchas do sul genômicas na geração T1 (Figuras 9, 12d e 12e). Os fenótipos nas linhagens OE e linhagens AS na 25 geração T2 foram compativelmente segregantes com o transgene (linhagens de segregação não sobreviveram à seleção de higromicina). Germinação de sementes T3 no meio de seleção mostrou que diversas das linhagens sele- cionadas foram homozigotas com o transgene (dados não mostrados).

A análise de expressão de OsCBP foi realizada em linhagens OE e AS e na linhagem de origem híbrida (WT). Linhagens de superexpres- são mostraram (Figura 9f) quase um aumento de 5 vezes nos níveis de ex- pressão de HOG1 quando em comparação aos níveis de expressão de OsCBP endógeno na WT. Adicionalmente, a expressão de OsCBP foi redu- zida em seis vezes em algumas das linhagens OE (Figuras 9f), confirmando estas serem linhagens de cossupressão. O fenômeno de cossupressão de genes é bem-conhecido em plantas. Portanto, os fenótipos observados são 5 devido à função do gene introduzido e não quaisquer efeitos não específicos de transformação. Os fenótipos das plantas transgênicas foram compatíveis com os resultados de Arabidopsis.

Nas linhagens OE, não existiu nenhuma mudança significante no número de cultivos por planta quando em comparação à WT (Tabela 8), po- rém muitas das linhagens OE foram significantemente reduzidas em altura e ganho de peso total (Figura 9a, 9b, 9c e Tabela 8). As linhagens OE de arroz mostraram florescimento precoce quando em comparação à WT por 7-10 dias. Ao contrário, as linhagens AS mostraram uma redução de até 6 vezes nos níveis de expressão de OsCBP endógeno e exibiram um aumento signi- ficante no número de cultivos por planta em comparação à linhagem de ori- gem híbrida (Figuras 9b, 9c e 12b). A WT teve 7 a 9 cultivos, enquanto as linhagens AS mostraram entre 18 a 28 cultivos por planta (Tabela 8). Os fe- nótipos das linhagens de cossupressão foram iguais àqueles das linhagens AS (Figuras 9c, 9e, 12a, 12b e Tabela 8). Adicionalmente, as linhagens AS e k - 20 de cossupressão mostraram ramificação dos nodos acima da terra dos culti- vos principais (Figura 12d), levando a um aumento total significante no nú- mero de panículas por planta (Tabela 8). O número médio de sementes e biomassa da planta aumentou em 2- a acima de 3 vezes nas linhagens AS e de cossupressão quando em comparação à WT (Tabela 8). Não existiu ne- nhuma outra mudança principal nos fenótipos das linhagens AS e de cossu- pressão em comparação às plantas WT. O aumento máximo em produção de grão por planta foi acima de duas vezes (variando de 1,5 a 2,7 vezes) maior do que da WT sob as condições de desenvolvimento em estufa. Ge- ralmente, os dados de produção de condições de desenvolvimento em estu- fa para arroz foram menores do que aquele de condições de campo ideais. Portanto, é claro que se a estratégia descrita aqui for usada, ela poderá levar a um aumento significante em produção sob condições de campo. Tabela 7. Coeficiente de correlação de Pearson (r) dos parâmetros contribu- indo para produção de semente e biomassa:

Coeficiente de correlação foi testado entre: Área da folha (cm2) x peso da semente (mg) por siliqua (A); Área da folha (cm2) x número de se- 5 mentes por siliqua (B); e peso da semente por siliqua (mg) x número de se- mentes por siliqua (C). Após a análise de correlação, o teste t de Student foi realizado. Os valores do teste t são dados em colchetes. Os valores 'r' mos- tram correlação positiva em todos os testes. Com base nisto, pode ser predi- to que supressão antissense de HOG1 leva a um aumento nos parâmetros 10 chavez contribuindo para a produção de semente e biomassa da folha.

Genótipo da planta A B C Tipo selvagem 0,898 (t=2,043) 0,857 (t=2,755) 0,795 (t=3,84) Linhagens antisentido 0,763 (t=2,043) 0,847 (t=2,755) 0,912 (t=3,84) de HOG1 Linhagens de super¬ 0,769 (t=2,078) 0,979 (t=2,878) 0,767 (t=2,269) expressão de HOG1 Tabela 8. Quantificação de parâmetros de produção nas plantas de arroz transgênicas de geração T2 abrigando cDNA de HOG1 de Arabidopsis de tamanho natural em orientação de sentido (superexpressão e cossupressão) ou antissense (conduzida por promotor de ubiguitina de arroz) levando à manipulação da expressão de gene de QsCBP endógeno.

As plantas foram agrupadas como 1AIta', 'Média' e 'Baixa' dentro de cada linhagem transgênica com base no número de cultivos por planta. O número total de cultivos, panículas e sementes por planta é apresentado como média ± SD. Apenas os grãos totalmente formados em cada planta 20 foram contados. Os valores de área da folha representam a área de uma única folha. A segunda folha totalmente expandida do segundo cultivo de cada planta foi medida como um parâmetro indicativo. Determinação do pe- so fresco foi para a planta totalmente superenraizada e apenas as plantas selecionadas foram medidas para as diferentes linhagens. Genótipo Culti¬ Panícu- Área da Peso Fres¬ Semen¬ vos/planta las/planta folha (cm2) co/planta tes/planta (g) Tipo Selvagem (Oryza sativa ssp. japonica cv Nipponbare) Planta N0 1 7 8 28 25 139 Planta N0 3 9 9 143 Planta N0 4 9 9 139 Media ± Des¬ 8,3±1,0 8,6±0,5 - - 140±2 vio padrão Linhagens antissense Linha N0 1S-2 Alto Planta N0 3 19 21 32 85 278 Planta N0 12 26 24 151 Planta N015 20 31 155 Media ± Des¬ 21,6±4,0 25,0±5,0 - - 194±72 vio padrão Médio Planta N01 18 36 378 Planta N0 5 14 28 253 Planta N0 9 15 31 155 Media ± Des¬ 15,6±2,0 31,6±4,0 nd nd 2621112 vio padrão Baixo Planta N0 6 11 29 191 Planta N0 8 11 22 251 Planta N0 10 9 16 127 Media ± Des¬ 10,3±1,0 22,3±6,5 nd nd 189,6±62 vio padrão Linha N0 1S-3 Alto Planta N01 21 32 35 89 158 Planta N0 12 23 37 35 89 200 Planta N0 13 28 40 203 Media ± Des¬ 24±3,6 36,3±4,0 - - 187±25 vio padrão Médio Planta N0 9 17 28 156 Genótipo Culti¬ Panícu- Área da Peso Fres¬ Semen¬ vos/planta las/planta folha (cm2) co/planta tes/planta (g) Planta N0 10 18 25 178 Planta N0 15 18 23 258 Media ± Des¬ 17,6±0,5 25,3±2,5 nd nd 197±54 vio padrão Baixo Planta N0 2 14 20 209 Planta N0 3 15 20 114 Planta N0 14 14 25 56 Media ± Des¬ 14,3±0,5 21,6±3,0 nd nd 126±77 vio padrão Linhagens de superexpressão Linha N0 6-3 Planta N0 5 19 25 0 Planta N0 6 13 9 7 20 0 Planta N0 10 18 21 0 Media ± Des¬ 16,6±3,2 18,3±8,3 - - 0 vio padrão Linha N0 3T1 Planta N01 14 15 22 Planta N0 2 16 24 32 Planta N0 3 16 19 32 Media ± Des¬ 15,3±1,0 19,3±4,5 nd nd 18±16 vio padrão Linhagens de cossupressão Linha N0 1-3 Alto Planta N0 2 19 27 40 90 370 Médio Planta N0 1 15 23 256 Planta N0 4 14 32 184 Planta N0 5 14 26 190 Media ± Des¬ 14,3±0,5 27±4,5 nd nd 210±40 vio padrão Alto Planta N0 8 10 17 281 Planta N0 6 12 25 171 Genótipo Culti¬ Panícu- Área da Peso Fres¬ Semen¬ vos/planta las/planta folha (cm2) co/planta tes/planta (g) Planta N0 3 18 29 64 Media ± Des¬ 15±4,2 23,6±6,0 nd nd 1721109 vio padrão Linha N0 4T-3 Alto Planta N0 1 15 22 153 Planta N0 4 18 25 39 89 147 Media ± Des¬ 16,5±2,0 23,5±2,0 - 150+4 vio padrão Médio Planta N0 5 17 23 113 Planta N0 3 13 20 130 Media ± Des¬ 15,0±3,0 21,5±2,0 nd nd 122+12 vio padrão Alto Planta N0 2 12 23 nd nd 131 Os presentes resultados de Arabidopsis e arroz sugerem que

ortólogos de HOG1 podem ser usados para melhora de uma variedade de plantas de colheita. O número de cultivos por planta é um fator essencial que determina a produção nas maiores colheitas de cereal. Portanto, usando este método, existe um potencial para aumentar a produção de colheitas de cereal maiores como arroz, trigo, milho e cevada.

O aumento em biomassa é também um aspecto altamente dese- jável para plantas usadas para produção de etanol celulósico e vegetais fo- Ihosos bem como colheitas de forragem. Adicionalmente, superexpressão HOG1 ou estes ortólogos em espécies ornamentais podem ajudar a induzir o nanismo e florescimento precoce.

Aplicações

Os presentes inventores identificaram um método que tem o po- tencial de modular características em plantas, usando o polinucleotídeo iso- lado de SEQ ID NO: 2. Os métodos descritos aqui são capazes de realçar a produtividade agrícola e produção de grão por área unitária sob cultivo. Os métodos descritos aqui são úteis para realçar a produção de biomassa em grama de forragem, e aumentar a ramificação em vegetais folhosos e folha- gem de plantas. Os polinucleotídeos isolados descritos aqui podem ser ad- ministrados a plantas tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas para produzir plantas com características moduladas úteis para melhora de co- Iheita e outros usos comerciais e científicos.

Em particular, produção de biomassa é uma indústria em desen- volvimento quando o interesse em fontes de combustível sustentáveis está em desenvolvimento. Sem ser ligado pela teoria, é especulado que a abun- dância de biomassa produzida pelos métodos descritos aqui pode ser con- 10 vertida em biocombustível, tais como combustível de gás metílico, bio- metanol ou bioetanol. Por exemplo, álcool pode ser produzido de material celulósico por métodos de hidrólise conhecida, fermentação e distilação. Portanto, o uso de combustível de biomassa é visto como uma fonte de e- nergia renovável considerada por alguns como um método de reduzir emis- 15 sões de gás de estufa e fornecer uma alternativa aos combustíveis de fóssil.

Será evidente que várias outras modificações e adaptações da invenção serão evidentes para a pessoa versada na técnica após leitura da descrição anterior sem afastar-se do espírito e escopo da invenção e pre- tende-se que todas as modificações e adaptações incluam-se no escopo das reivindicações anexas. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Kumar P, National University of Singapore

<120> Receptor de Citocinina Putativa e Métodos para Uso do Mesmo

<130> 10104SG744

<140> US 60/888, 136

<141> 2007-02-05

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 485

<212> PRT

<213> HOGl Arabidopsis thaliana

<400> 1

Met Ala Leu He Val Glu Lys Thr Ser Gly Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1 5 10 15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Leu Glu Leu Ala 20 25 30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro 35 40 45

'20 Ala Gln Pro Phe Lys Gly Ala Arg He Thr Gly Ser Leu His Met Thr 50 55 60

He Gln Thr Ala Val Leu He Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu 65 70 75 80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn He Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala 85 90 95

Ala Ala He Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu 100 105 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly 115 120 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu He Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr 130 135 140

Leu Leu He His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu He Phe Glu Lys Thr 145 150 155

Gly Gln Val Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Pro Glu Phe Gln

165 170 175 Val Leu Ser Ile Ile Lys Glu Gly Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys

180 185 190

His Lys Met Lys Gly Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr

195 200 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Glu Ser Gly Ala Leu Leu

210 215 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp

225 230 235

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala

245 250 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Ile Cys Gly Tyr Gly

260 265 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Met Lys Thr Ala Gly Ala Arg

275 280 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Met Met

290 295 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Ala Asp

305 310 315

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His

325 330 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe

340 345 350

Asn Glu Ile Asp Met Gln Gly Leu Glu Thr Phe Pro Gly Val Lys

355 360 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr

370 375 380

Ser Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly

385 390 395

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn

160

Ile

Tyr

Thr

Phe

Asn

240

Thr

Asp

Val

Glu

Ile

320

Met

Asp

Arg

Lys

Cys

400

Gln 120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

109

405 410 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Ser Ser Gly Lys Tyr 420 425 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala 435 440 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Thr Lys 450 455 460

Asp Gln Ser Asp Tyr Val Ser Ile Pro Ile Glu Gly Pro Tyr Lys Pro 465 470 475 480

Pro His Tyr Arg Tyr 485

<210> 2 <211> 1775

<212> DNA

<213> CDNA de HOGl Arabidopsis thaliana

<4 00> 2

ggccgcggga attcgatttc taccccccct gccccaatct tagatccgaa aaaatggcgt tgatcgttga gaagacgtcg ggtggccgtg agtacaaggt caaggacatg tctcaggccg acttcggtcg tctcgagctc gagctcgccg aagttgagat gccaggactc atggcttgcc gtaccgagtt cggcccagct cagcccttca aaggcgctag aatcaccgga tctctccaca tgacgatcca gaccgccgtc ctcatcgaaa ccctaaccgc cctcggcgcg gaagtcagat ggtgctcctg caacatcttc tcaacccaag accacgccgc cgccgcaatc gcccgtgact ccgccgccgt tttcgcctgg aaaggtgaga cgcttcagga gtactggtgg tgcacggagc gtgctctcga ctggggccca ggtggtggtc cagatctgat cgtcgatgac ggtggcgacg ccacgctttt gatccacgag ggagtgaagg ccgaggagat ctttgagaag acgggtcagg ttcctgatcc cacttccact gacaaccctg agttccagat cgtgctttcg atcatcaagg aaggtctcca ggttgatcct aagaagtacc acaagatgaa ggggagactc gtcggtgtct ctgaggagac caccaccggt gtcaagaggc tttaccagat gcaggaaagt ggagcccttt tgttcccagc cattaacgtc aacgactccg tcaccaagag caagttcgac aacttgtacg gttgccgtca ctctctacct gatggtctca tgagggccac tgatgtcatg atcgccggaa aggttgcggt tatctgtggt tatggtgatg tcggtaaggg ttgtgccgct gccatgaaaa ccgctggtgc tagagtcatt gtgaccgaga tcgaccccat ctgtgcccta caagctatga tggaagggct tcaagttctg acccttgagg atgtcgtctc tgaagctgac atctttgtca 1020 ccaccaccgg taacaaagac atcatcatgg ttgaccacat gaggaagatg aagaacaacg 1080 ctatcgtctg caacattggt cactttgaca acgagattga catgcaagga cttgagacct 1140 tccctggagt gaagcgtatc accatcaagc cccagaccga caggtgggtg ttcccagaca 1200 ccaagtccgg aatcattgtt ttggccgagg gtcgtctcat gaacttgggt tgtgccactg 1260 gtcacccaag tttcgtgatg tcttgctctt tcaccaacca ggtgattgcc cagcttgagc 1320 tttggaacga gaagtcgagc ggtaagtacg agaagaaggt gtacgttcta cccaagcatt 1380 tggatgagaa ggttgcggca cttcacttgg gcaagcttgg agctaagctc actaagctga 1440 caaaggacca atctgactac gtcagcattc caattgaggg accatacaag cctcctcact 1500 acaggtactg agagagagag agagtcgaca aagcggttca ggttcggatc tacttgtggt 1560 tttgtgttgg gttgtggtgg gagagtggaa cagtttgaga tattggtctt ctgatgaagt 1620 tgaccaaata tcagtattaa taagggttat tggcttttga aggttgtgct tggtttctcc 1680 atttttcatg aaacttaaat tagtttttgg tttagtttcc ctcttgattt tattttgtgt 1740 gttctgttta gcgttgtact cttcaaacaa atgag 1775 <210> 3 <211> 485 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum, homólogo de cv. Xanthi (seqüência de aminoá cido)

<400> 3

Met Ala Leu Leu Val Glu Lys Thr Thr Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val 15 10 15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala 20 25 30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro

35 40 45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Lys Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr 50 55 60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu 65 70 75 80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu 100 105 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly 115 120 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr 130 135 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Ala Lys Asn 145 150 155 160

Gly Thr Ile Pro Asp Pro Asn Ser Thr Asp Asn Ala Glu Phe Gln Leu 165 170 175

Val Leu Thr Ile Ile Lys Glu Ser Leu Lys Thr Asp Pro Leu Lys Tyr 180 185 190

Thr Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr 195 200 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Ala Asn Gly Thr Leu Leu Phe 210 215 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn 225 230 235 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr 245 250 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Leu Val Ala Gly Tyr Gly Asp 260 265 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Leu Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val 275 280 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Thr Met Glu 290 295 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Asp Val Asp Ile 305 310 315 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met 325 330 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp 340 345 350 Asn Glu Ile Asp Met Leu Gly Leu Glu Thr Tyr Pro Gly Val Lys Arg 355 360 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr Asn 370 375 380

Ser Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys 385 390 395 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln 405 410 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Ser Ser Gly Lys Tyr 420 425 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala 435 440 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Ser Lys 450 455 460

Asp Gln Ala Asp Tyr Ile Ser Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Pro 465 470 475 480

Ala His Tyr Arg Tyr 485

<210> 4

<211> 1812 <212> DNA

<213> Nicotiana tabacum, homólogo de cv. Xanthi (seqüência de nucleo-

tídeo)

<400> 4

gaagagaaaa aagcctctca aatctcatct ctaaccaccc aatttctcat actcgctcta 60 cccatggctc tattagtcga gaagaccacc tctggccgcg agtacaaggt caaggacatg 120 tctcaggccg atttcggccg gcttgaaatc gagctggccg aagttgaaat gcctggtctc 180 atggcttgtc gtactgaatt tggcccttca cagccattta aaggtgctaa gattactgga 240 tctttacata tgaccattca aactgcagtt ttgattgaaa cccttactgc tttgggtgct 300 gaagttagat ggtgttcttg caacatcttc tccactcaag atcacgccgc tgctgccatt 360 gcacgtgaca gcgccgccgt gttcgcgtgg aagggtgaga ctctgcagga gtattggtgg 420 tgtactgaga gggcacttga ctggggtcca ggtggtgggc ccgacttgat cgtcgacgat 480 10

15

20

25

30

ggtggtgatg ctacactctt gattcatgag ggtgttaagg cagaagaaga gtttgctaag 540 aatgggacaa tcccagatcc taactctacc gataatgctg agtttcagct tgtacttact 600 attattaagg aaagtttgaa gactgatcct ttaaaatata ccaagatgaa ggaaagactc 660 gtcggtgttt ctgaggaaac taccactgga gttaagaggc tttatcagat gcaggctaat 720 ggaactttgc ttttccctgc tattaatgtt aatgattctg ttaccaagag caagttcgac 780 aacttgtacg gatgccgcca ctcactgccc gatggtctca tgagggctac tgatgttatg 840 attgccggaa aggttgccct tgttgctggt tatggagatg tcggcaaggg ttgtgctgct 900 gccttgaaac aagccggtgc ccgtgtgatt gtgaccgaga ttgaccctat ctgtgctctc 960 caggctacca tggaaggcct ccaggtcctt actctagagg atgtcgtttc tgatgttgat 1020 atctttgtca ccacgaccgg taacaaggac attatcatgg ttgaccacat gaggaagatg 1080 aagaacaatg ccattgtttg caacattggt cactttgaca acgaaatcga catgcttggt 1140 ctcgagacct accctggtgt caagaggatc acaattaagc ctcaaaccga cagatgggtc 1200 ttccctgaca ccaacagtgg catcattgtc ttggctgagg gtcgtctcat gaacttggga 1260 tgtgccacag gacaccctag ttttgtgatg tcgtgctcgt tcactaacca agtcattgcc 1320 caactcgagt tgtggaatga aaagagcagt gggaagtatg agaagaaagt gtatgtcttg 1380 ccaaaacacc tcgacgagaa ggttgctgca cttcatctcg gaaagctcgg agccaagctt 1440 accaaacttt cgaaggatca agctgactac attagcgttc cagttgaggg tccttacaag 1500 cctgctcact acaggtactg agcgaaaaca aatcgacaga ggagaacagc attgtcgcgg 1560 catgattgtt ttgcatttaa tactttgatt ttgtttagga tactagtatt ttgaatattg 1620 gtggtgatat atttgggagg aagtggcatg ttttgctgga aaagaaatgg gtcttatttg 1680 aaagtaagac caaaatgtgt tgaataagat tatggttggt ggtgtgatat gatattgtag 1740 taagttagaa ccatttgctt tttggtgtat ggtttttgtt tcaagaaatc aaagcaacac 1800 ttttaccttt tc 1812 <210> 5 <211> 485 <212> PRT <213> Homólogo de Oryza sativa (seqüência de aminoácido), OsCBP <4 00> 5 Met Ala Leu Ser Val Glu Lys Thr Ser Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val 1 5 10 15 Lys Asp Leu Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala 20 25 30 Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Ala Glu Phe Gly Pro 35 40 45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Arg Ile Ser Gly Ser Leu His Met Thr 50 55 60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu 65 70 75 80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala 85 90 95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu 100 105 110

Thr Leu Glu Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Cys Leu Asp Trp Gly 115 120 125

Val Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr 130 135 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Glu Lys Ser 145 150 155 160

Gly Lys Val Pro Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asn Ala Glu Phe Lys Ile 165 170 175

Val Leu Thr Ile Ile Arg Asp Gly Leu Lys Ser Asp Pro Ser Lys Tyr

180 185 190

Arg Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr 195 200 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Glu Thr Gly Ala Leu Leu Phe 210 215 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225 230 235 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr 245 250 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Cys Gly Tyr Gly Asp 260 265 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Leu Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val 275 280 285 Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Leu Met Glu 290 295 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Ala Asp Ile 305 310 315 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

325 330 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp 340 345 350

Asn Glu Ile Asp Met Leu Gly Leu Glu Thr Tyr Pro Gly Val Lys Arg 355 360 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Glu Thr Asn 370 375 380

Thr Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys 385 390 395 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln

405 410 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Lys Glu Lys Ser Thr Gly Lys Tyr 420 425 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala '20 435 440 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Arg Leu Thr Lys Leu Ser Lys 450 455 460

Ser Gln Ala Asp Tyr Ile Ser Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Pro 465 470 475 480

Ala His Tyr Arg Tyr

485

<210> 6 <211> 1458

<212> DNA

<213> Oryza sativa homolog (nucleotide sequence), OsCPB

<4 00> 6

atggcgctct ccgtggagaa gacctcgtcg gggagggagt acaaggtgaa ggacctctcc 60 caggcggact tcggccgcct cgagatcgag ctcgccgagg tcgagatgcc ggggctcatg 120

gcgtgccgcg ccgagttcgg cccctcccag ccgttcaagg gcgcccggat ctccgggtcc 180

ctccacatga ccatccagac cgccgtcctc atcgagaccc tcaccgccct tggcgccgag 240

gtccgctggt gctcctgcaa catcttctcc acgcaggacc acgccgccgc cgccatcgcc 300

5 agggactccg ccgccgtgtt cgcctggaag ggggagaccc tcgaggagta ctggtggtgc 360

accgagcgct gcctcgactg gggcgtcggc ggcggccccg acctcatcgt cgacgacggc 420

ggcgacgcca cgctgctcat ccacgagggc gtcaaggccg aggaggagtt cgagaagtca 480

ggcaaggtcc ccgacccgga gtccaccgac aacgccgagt tcaagatcgt gctcaccatc 540

atccgcgacg gcctcaagtc cgaccccagc aagtaccgca agatgaagga gaggctcgtc 600

ggagtctccg aggagaccac caccggtgtc aagaggctct accagatgca ggagaccggc 660

gccctcctct tccccgccat caacgtcaac gactccgtca ccaagagcaa gtttgacaac 720

ctgtatggtt gccgccactc tctccctgat ggtctcatga gggctaccga tgttatgatc 780

gctggcaagg ttgccgtggt ctgcggttat ggtgatgttg gcaagggctg tgctgctgct 840

ctcaagcagg ctggtgcccg tgtcattgtt actgagattg accccatctg tgccctccag 900

gcccttatgg agggtctcca ggtcctcacc ttggaggatg ttgtctcgga ggctgacatc 960

tttgtgacca ccactggcaa caaggacatc ataatggttg accacatgag gaagatgaag 1020

aacaatgcca tcgtttgcaa cattggtcac tttgacaatg agattgacat gctcggcctt 1080

gagacctacc ctggtgtcaa gcgcatcacc atcaagcctc agaccgaccg ctgggtcttc 1140

cctgagacca acactggcat cattgtcctt gctgagggtc gtctcatgaa ccttgggtgc 1200

gctactggcc accccagttt tgtcatgtcc tgctcattca ctaaccaggt cattgctcag 1260

cttgagctgt ggaaggagaa gagcactggc aagtacgaga agaaggtgta cgttcttccc 1320

aagcacctcg acgagaaggt ggccgccctc cacttgggca agcttggtgc caggctgacc 1380

aagctctcca agtcgcaggc tgactacatc agcgttccag ttgagggtcc ctacaagccc 1440

gcgcactacc ggtactag 1458

<210> 7

<211> 485

<212> PRT

<213> Homólogo de Triticum aestivum (seqüência de aminoácido)

<400> 7

Lys Asp Leu Phe Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Leu Glu Leu Ala 20 25 30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro 35 40 45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Arg Ile Ser Gly Ser Leu His Met Thr 5 50 55 60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu 65 70 75 80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Ser Gln Asp His Ala Ala 85 90 95

10 Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu 100 105 110

Thr Leu Glu Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Cys Leu Asp Trp Gly 115 120 125

Val Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr 15 130 135 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Glu Lys Ser 145 150 155 160

Gly Lys Val Pro Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asn Pro Glu Phe Lys Ile 165 170 175

k'20 Val Leu Thr Ile Ile Arg Asp Gly Leu Lys Thr Asp Ala Ser Lys Tyr 180 185 190

Arg Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr 195 200 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Glu Ser Gly Thr Leu Leu Phe

210 215 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225 230 235 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr 245 250 255

30 Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Cys Gly Tyr Gly Asp 260 265 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Leu Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val 275 280 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Leu Met Glu 290 295 300

Gly Ile Gln Ile Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Ala Asp Ile 305 310 315 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met 325 330 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp 340 345 350

Asn Glu Ile Asp Met Asn Gly Leu Glu Thr Tyr Pro Gly Val Lys Arg 355 360 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Glu Thr Lys 370 375 380

Thr Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys 385 390 395 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln 405 410 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr 420 425 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala 435 440 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Arg Leu Thr Lys Leu Thr Lys 450 455 460

Ser Gln Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Pro Ile Glu Gly Pro Tyr Lys Leu 465 470 475 480

Arg Leu Tyr Arg Tyr 485

<210> 8 <211> 1708

<212> DNA

<213> Homólogo Triticum aestivum (seqüência de nucleotídeo)

<400> 8 120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1708

119

aatccaccaa

aaggtcaagg

gagatgcccg

gcccggatct

accgccctcg

gccgccgccg

gaggagtact

ctcatcgtcg

gaggagttcg

aagatcgtcc

atgaaggaga

cagatgcagg

aagagcaagt

gccactgatg

aagggctgtg

cccatctgtg

gtctctgagg

cacatgagga

atcgacatga

actgaccgtt

ctgatgaacc

aaccaggtta

aaggtgtacg

ctcggcgcca

gagggtcctt

gcctgagcct

ttctattatc

gccttgtgag

tggtttaagt

<210>

<211>

<212>

ccttctccat

acctcttcca

gcctcatggc

ccggctccct

gcgccgaggt

ccatcgcccg

ggtggtgcac

acgacggcgg

agaaatccgg

tcaccatcat

ggctcgtcgg

agtccggcac

ttgacaacct

ttatgatcgc

ccgccgcact

cccttcaggc

ctgacatctt

agatgaagaa

acggccttga

gggtcttccc

ttggatgtgc

ttgctcagct

ttctccccaa

ggctgaccaa

acaagctgcg

gagtcggagc

ttacatgctg

ggttgggaga

gaggaggtgt

9

485

PRT

ggcgctctcc

ggccgacttc

ctgccgcacc

ccacatgacc

ccgctggtgc

cgactccgcg

cgagcgctgc

tgacgccacg

caaggttccc

ccgcgacggg

tgtctccgag

cctcctcttc

ttacggttgc

cggcaaggtc

caagcaggct

cctgatggag

tgtgaccacc

caacgccatt

gacctaccct

cgagaccaag

cactggccac

tgagttgtgg

gcacctcgac

gctcaccaag

gctttaccgg

agcggcacca

tctcttaggc

ggcggcgttt

gcttttcc

gtggagaaga

ggccgcctcg

gagttcggcc

atccagaccg

tcctgcaaca

gccgtcttcg

ctcgactggg

ctgctcatcc

gacccggagt

ctcaagaccg

gagaccacca

cccgccatca

cgtcactcgc

gccgtggtct

ggtgcccgtg

ggtatccaga

accggaaaca

gtctgcaaca

ggtgtcaagc

actggcatca

cccagctttg

aacgagaagg

gagaaggtcg

tcccagtctg

tactagtgtg

acgggaactc

ggaggatttg

gcttttgccc

cctcgtcggg

agctcgagct

cctcgcagcc

ccgtcctcat

tcttctccag

cctggaaggg

gcgtcggcgg

acgagggcgt

ccaccgacaa

acgccagcaa

ccggcgtcaa

acgtcaacga

tccctgatgg

gcggttacgg

tgatcgtgac

tcctcacctt

aggacatcat

ttggtcactt

gcatcaccat

ttgttcttgc

tcatgtcctg

ccagtggcaa

cggccctcca

actacattag

tccagcatga

tatcaactat

ttattatggt

agaaataatg

ccgggagtac

cgccgaggtc

cttcaagggc

cgagaccctc

ccaggaccac

cgagaccctc

cggccccgac

caaggccgag

ccccgagttc

gtaccgcaag

gaggctctac

ctccgtcacc

tcttatgagg

tgatgttggc

agagattgac

ggaggatgtt

catggtcgac

tgacaatgag

caagccccag

tgagggtcgt

ctcattcacc

gtatgagaag

cttgggcaag

catcccaatt

ctagcggctg

cctgtttccc

tatgttttga

gcattattat <213> Homólogo de Crisântemo (seqüência de aminoácido)

<400> 9

Met Ser Leu Thr Val Glu Lys Thr Thr Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val 15 10 15

Lys Asp Met Ser Leu Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Leu Glu Leu Ala 20 25 30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ser Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro 35 40 45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Arg Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr 50 55 60

Ile Gln Thr Gly Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu 65 70 75 80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala 85 90 95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu 100 105 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly 115 120 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr 130 135 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Ala Lys Ser 145 150 155 160

Gly Lys Leu Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Ala Glu Phe Gln Ile 165 170 175

Val Leu Ser Ile Ile Lys Glu Gly Leu Ser Thr Asp Pro Leu Lys Tyr 180 185 190

His Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr 195 200 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Ala Asn Gly Thr Leu Leu Phe 210 215 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr 245 250 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Cys Gly Tyr Gly Asp 260 265 270

5 Val Gly Lys Gly Cys Ala Ser Ala Met Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val 275 280 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Thr Met Glu 290 295 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Ala Asp Ile 10 305 310 315 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp Asp Met 325 330 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp 340 345 350

15 Asn Glu Ile Asp Met Leu Gly Leu Glu Thr Tyr Pro Gly Val Lys Arg 355 360 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Glu Thr Lys 370 375 380

Ser Gly Val Ile Ile Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys k'20 385 390 395 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln 405 410 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Gly Thr Gly Lys Tyr 420 425 430

25 Lys Lys Glu Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala 435 440 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Thr Lys 450 455 460

Asp Gln Ser Asp Tyr Leu Ser Ile Pro Ile Glu Gly Pro Tyr Lys Pro 30 465 470 475 480

Ala Ala Tyr Arg Tyr 485 <210> 10 <211> 1535

<212> DNA

<213> Homólogo de crisântemo

<4 00> 10 gatcagatct caaaacccaa accttaaacc ggccgtgaat acaaggtcaa ggacatgtcc ttagccgagg tcgagatgcc cgggcttatg ccttttaagg gagccagaat cactggatcc attgaaactt tgactgcttt gggtgctgag acccaagacc atgctgctgc agccattgct ggggagactc ttcaggagta ctggtggtgt ggtggtcctg atttgattgt ggatgatggt gtgaaggccg aggaggagtt cgccaagagc aatgctgagt tccagattgt gttgtcgatt aagtaccaca agatgaagga aagactagtt aagaggttgt accaaatgca agccaacggt gattccgtca ccaagagcaa gtttgacaac ggtttgatga gagctactga tgtcatgatc ggagatgttg gaaagggttg tgcttcagcc acagaaattg atcccatctg tgctcttcag ttggaagatg tcgtatccga agctgatatt atcatggttg atgacatgag gaagatgaag tttgacaatg aaatcgacat gcttggtctt atcaagcccc aaaccgacag gtgggtgttc gctgagggta ggctcatgaa cttgggttgt tgctctttca ctaaccaagt gattgctcaa aagtacaaga aggaggtgta tgtgttgccc catcttggaa agcttggagc caagctcact agcattccta ttgaaggtcc ttacaagcct tctgctgttc agcaagactt tgaagaacct <210> 11

(seqüência de nucleotídeo)

atgtctctta ctgtagagaa aaccacctct 60 ttggctgact tcggccgtct cgaactcgag 120 tcctgcagga ccgaattcgg cccttctcag 180 cttcacatga ccatccagac cggtgttctt 240 gttagatggt gctcttgcaa catcttttcg 300 cgtgactctg ctgcggtttt cgcctggaag 360 actgagcgag cacttgactg gggtccaggt 420 ggtgatgcta cgcttttgat ccatgaggga 480 ggtaaattgc ctgaccccac ttccactgac 540 attaaggaag gactttcgac cgacccattg 600 ggtgtctctg aggaaaccac cactggtgtc 660 actttgttgt tccctgccat caatgttaac 720 ttgtatggat gccgtcactc actccctgat 780 gccggaaagg ttgcagtcgt ctgtggttac 840 atgaagcaag ctggtgctcg tgtcattgtg 900 gctaccatgg aaggtctcca agtgctaact 960 tttgttacca ccaccggtaa caaggacatc 1020 aacaatgcca tcgtctgcaa cattggtcac 1080 gagacttacc ctggtgtcaa gagaatcacc 1140 cccgagacca agagtggcgt cattatcttg 1200 gctactggtc accctagttt cgtgatgtct 1260 cttgagttgt ggaatgagaa gggaaccggc 1320 aagcaccttg acgagaaggt ggctgcactt 1380 aagctcacca aggaccagtc tgactacctc 1440 gctgcctaca ggtactgatc aaagaggata 1500 atggg 1535 <211> 466

<212> PRT

<213> Homólogo de Brassica alboglabra (seqüência de aminoácido)

<4 00> 11

Met Ala Leu Ile Val Glu Lys Thr Ser Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val 15 10 15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Leu Glu Leu Ala 20 25 30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro 35 40 45

Ala Gln Pro Phe Lys Gly Ala Arg Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr 50 55 60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu 65 70 75 80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu 100 105 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly *20 115 120 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr 130 135 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Ile Phe Glu Lys Thr 145 150 155 160

Gly Gln Val Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Pro Glu Phe Gln Ile

165 170 175

Val Leu Ser Ile Ile Lys Glu Gly Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys Tyr 180 185 190

His Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr 195 200 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Glu Ser Gly Ala Leu Leu Phe 210 215 220 Pro Ala Ile Asn 225

Leu Tyr Gly Cys

Asp Val Met Ile 260

Val Gly Lys Gly 275

Ile Val Thr Glu

290

Gly Leu Gln Val 305

Phe Val Thr Thr

Arg Lys Met Lys 340

Asn Glu Ile Asp 355

Ile Thr Ile Lys

370

Ser Gly Ile Ile 385

Ala Thr Gly His

Val Ile Ala Gln 420

Glu Lys Lys Val 435

Ala Leu His Leu

450

Asp Ile 465

Val Asn Asp Ser Val Thr 230

Arg His Ser Leu Pro Asp 245 250

Ala Gly Lys Val Ala Val 265

Cys Ala Ala Ala Met Lys 280

Ile Asp Pro Ile Cys Ala 295

Leu Thr Leu Glu Asp Val 310

Thr Gly Asn Lys Asp Ile 325 330

Asn Asn Ala Ile Val Cys 345

Met Gln Gly Leu Glu Thr 360

Pro Gln Thr Asp Arg Trp 375

Val Leu Ala Glu Gly Arg 390

Pro Ser Phe Val Met Ser 405 410

Leu Glu Leu Trp Asn Glu 425

Tyr Val Leu Pro Lys His 440

Gly Lys Leu Gly Ala Lys 455

Lys Ser Lys Phe Asp Asn 235 240

Gly Leu Met Arg Ala Thr 255

Ile Cys Gly Tyr Gly Asp 270

Thr Ala Gly Ala Arg Val 285

Leu Gln Ala Met Met Glu 300

Val Ser Glu Ala Asp Ile 315 320

Ile Met Val Asp His Met 335

Asn Ile Gly His Phe Asp 350

Phe Pro Gly Val Lys Arg 365

Val Phe Pro Asp Thr Lys 380

Leu Met Asn Leu Gly Cys 395 400

Tyr Pro Phe Thr Asn Gln 415

Lys Ser Ser Gly Lys Tyr 430

Leu Asp Glu Lys Val Ala 445

Leu Thr Lys Leu Thr Lys 460 <211> 1752 alboglabra (seqüência de nucleotídeo) <212> DNA <213> Homólogo de Brassica <4 00> 12 acccctctct ctgccccaat cttagatccg aaaaaatggc 60 acggggacac acttctctct gttgatcgtt gagaagacgt cgagtggccg tgagtacaag gtcaaggaca tgtctcaggc 120 cgacttcggt cgtctcgagc tcgagctcgc cgaagttgag atgccaggac tcatggcttg 180 ccgtaccgag ttcggcccag ctcagccctt caaaggcgct agaatcaccg gatctctcca 240 catgacgatc cagaccgccg tcctcatcga aaccctaacc gccctcggcg cggaagtcag 300 atggtgctcc tgcaacatct tctcaaccca agaccacgcc gccgccgcaa tcgcccgtga 360 ctccgccgcc gttttcgcct ggaaaggtga gacgcttcag gagtactggt ggtgcacgga 420 gcgtgctctc gactggggcc caggtggtgg tccagatctg atcgtcgatg acggtggcga 480 cgccacgctt ttgatccacg agggagtgaa ggccgaggag atctttgaga agacgggtca 540 ggttcctgat cccacttcca ctgacaaccc tgagttccag atcgtgcttt cgatcatcaa 600 ggaaggtctc caggttgatc ctaagaagta ccacaagatg aaggagagac tcgtcggtgt 660 ctctgaggag accaccaccg gtgtcaagag gctttaccag atgcaggaaa gtggagccct 720 tttgttccca gccattaacg tcaacgactc cgtcaccaag agcaagttcg acaacttgta 780 cggttgccgt cactctctac ctgatggtct catgagggcc actgatgtca tgatcgccgg 840 aaaggttgcg gttatctgtg gttatggtga tgtcggtaag ggttgtgccg ctgccatgaa 900 aaccgctggt gctagagtca ttgtgaccga gatcgacccc atctgtgccc tacaagctat 960 gatggaaggg cttcaagttc tgacccttga ggatgtcgtc tctgaagctg acatctttgt 1020 caccaccacc ggtaacaaag acatcatcat ggttgaccac atgaggaaga tgaagaacaa 1080 cgctatcgtc tgcaacattg gtcactttga caacgagatt gacatgcaag gacttgagac 1140 cttccctgga gtgaagcgta tcaccatcaa gccccagacc gacaggtggg tgttcccaga 1200 caccaagtcc ggaatcattg ttttggccga gggtcgtctc atgaacttgg gttgtgccac 1260 tggtcaccca agtttcgtga tgtcttaccc tttcaccaac caggtgattg cccagcttga 1320 gctttggaac gagaagtcga gcggtaagta cgagaagaag gtgtacgttc tacccaagca 1380 tttggatgag aaggttgcgg cacttcactt gggcaagctt ggagctaagc tcactaagct 1440 gacaaaggac atctgactag tcagcattcc cattgaagga ccatacaagc ctgctcacta 1500 caggtactga gagaagaatg gagagagcgg tttatttcta gtttggtctt ctgatgaagt 1560 tgaccgaata tccttctgaa taaggattct tgtcttttga ttgttgtgct tgttcttctt 1620 ttttctgaat ttatcttgaa acttaaatta gcctttggtt atttgatttt gtgttgtgtt cattgttcta ctctttaaaa aatagaaaca aaaaagttgg ataaaaaaaa aaaaaaaaaa

20

30

aaaaaaaaaa aa <210> 13 <211> 485 <212> PRT <213> Homólogo de Petúnia híbrida (seqüência de aminoácido) <400> 13 Met Ala Leu Leu Val Glu Lys Thr Thr Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val 1 5 10 15 Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala 20 25 30 Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro 35 40 45 Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Lys Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr 50 55 60 Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu 65 70 75 80 Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu 100 105 110 Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly 115 120 125 Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr 130 135 140 Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Tyr Ala Lys Asp 145 150 155 160 Gly Thr Val Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Val Glu Phe Gln Leu 165 170 175 Val Leu Gly Ile Ile Lys Glu Ser Leu Lys Thr Asp Pro Thr Lys His 180 185 190 1680

1740

1752

PETCBP Thr Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr 195 200 205

Gly Val Lys Arg Leu Thr Arg Cys Lys Leu Met Glu Leu Cys Phe Ser 210 215 220

Gln Leu Pro Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn 225 230 235 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr 245 250 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Ala Gly Tyr Gly Asp 260 265 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Met Ser Leu Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val 275 280 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Leu Met Glu 290 295 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ala Asp Ala Asp Ile 305 310 315 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met 325 330 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp '20 340 345 350

Asn Glu Ile Asp Met Leu Gly Leu Glu Thr Phe Pro Gly Val Lys Arg 355 360 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr Asn 370 375 380

Ser Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys 385 390 395 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Val Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln 405 410 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Ser Ser Gly Lys Tyr 420 425 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala 435 440 445 Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Ser Lys

Asp Gln Ala Asp Tyr Ile Asn Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Pro

485

<210> 14

<211> 1855

<212> DNA

<400> 14

gcgggggtct cactttcttc ttctctacaa aaaccccatc aagaagtaga gctaaaaaac 60

tccatttcaa taatggcttt acttgttgaa aaaacaacat caggccgtga gtacaaggtt 120

aaagacatgt ctcaggcaga cttcggccgg ctcgaaatcg agttggccga agttgaaatg 180

cctggactca tggcttgtcg tactgaattt ggaccttcac aaccttttaa aggtgccaag 240

attactggat ctttacatat gactattcaa actgctgtct tgattgagac tttgacagca 300

ttaggtgctg aagttagatg gtgttcttgt aatatctttt ctactcaaga tcatgctgct 360

gctgctatcg ctcgtgatag cgctgctgtc ttcgcctgga aaggcgagac cttgcaggag 420

tactggtggt gtaccgagag ggcactagat tggggtccag gtggaggacc tgatttgatt 480

gttgatgatg gaggtgacgc tacactcttg attcatgaag gagttaaagc tgaagaagag 540

tatgctaagg atgggacagt cccagatcct acctctaccg ataacgttga gtttcagctt 600

gtgctaggta ttattaagga aagtttaaag actgatccta caaagcatac taagatgaag 660

gaaaggcttg ttggtgtttc tgaggaaact accactggtg ttaagagact taccagatgc 720

aagctaatgg aactttgctt ttcccagcta cccaatgtta acgactctgt taccaagagc 780

aagtttgaca acttgtacgg atgccgccac tcactgcccg atggtctcat gagggctact 840

gatgttatga ttgccggaaa ggttgccgtt gttgccggtt acggagatgt tggcaaaggg 900

tgtgctatgt ,ccttgaagca agctggtgcc cgtgtgatcg tgactgagat tgacccaatc 960

tgtgctctcc aggctctcat ggaaggccta caagttctca ctcttgagga tgttgttgct 1020

gatgctgata tctttgtcac cacaaccggt aacaaggaca tcatcatggt tgaccacatg 1080

aggaagatga agaacaatgc cattgtctgc aacattggcc actttgacaa tgaaatcgac 1140

atgcttggtc ttgagacatt cccaggtgtg aagaggatca caatcaagcc tcaaactgac 1200

aggtgggtct tcccagacac caacagtggc atcattgtct tggccgaggg tcgtctcatg 1260 1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1855

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

850

129

aacttgggat gtgccactgg acaccccagt gtcgtgatgt cctgttcttt cactaaccaa gtcattgccc aactcgagtt gtggaatgag aagagctctg gcaagtatga gaagaaggtg tacgtcttgc caaagcacct cgacgagaag gtcgctgccc ttcaccttgg aaagctcgga gccaagctta ccaagctctc caaggatcaa gctgactaca ttaacgtacc agttgagggt ccttacaagc cagttcacta caggtactaa gggaagacaa attgacagtg gagatacatt ctcgcggcat gattgttttg cttttaatac tttgattttg tttaggatac tagtgttttt attattgttg gggatatatt gaggggaagt tgggcatgtt ttgctggaaa gaaatggtct catttgaaag aaagacctaa atgtgttgaa taagatttga gttatggttg ggtggtgtgg tatgatattg tagtaagtta gatccttttg cgttttggtc tatgattttt gtttcaagaa atcagagcta cattttctct ttccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa <210> 15 <211> 850 <212> DNA <213> Construção de HOGl Antissentido de 850 bp <4 00> 15 gcgctagaat caccggatct ctccacatga cgatccagac cgccgtcctc atcgaaaccc taaccgccct cggcgcggaa gtcagatggt gctcctgcaa catcttctca acccaagacc acgccgccgc cgcaatcgcc cgtgactccg ccgccgtttt cgcctggaaa ggtgagacgc ttcaggagta ctggtggtgc acggagcgtg ctctcgactg gggcccaggt ggtggtccag atctgatcgt cgatgacggt ggcgacgcca cgcttttgat ccacgaggga gtgaaggccg aggagatctt tgagaagacg ggtcaggttc ctgatcccac ttccactgac aaccctgagt tccagatcgt gctttcgatc atcaaggaag gtctccaggt tgatcctaag aagtaccaca agatgaaggg gagactcgtc ggtgtctctg aggagaccac caccggtgtc aagaggcttt accagatgca ggaaagtgga gcccttttgt tcccagccat taacgtcaac gactccgtca ccaagagcaa gttcgacaac ttgtacggtt gccgtcactc tctacctgat ggtctcatga gggccactga tgtcatgatc gccggaaagg ttgcggttat ctgtggttat ggtgatgtcg gtaagggttg tgccgctgcc atgaaaaccg ctggtgctag agtcattgtg accgagatcg accccatctg tgccctacaa gctatgatgg aagggcttca agttctgacc cttgaggatg tcgtctctga agctgacatc tttgtcacca ccaccggtaa caaagacatc atcatggttg accacatgag <210> 16 <211> 15 tcggcgcgga agtca 15

15

20

25

30

<212> DNA <213> Fragmento 1 Antissentido <400> 16 ctcggcgcgg aagtc <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Fragmento 2 Antissentido <400> 17 tcggcgcgga agtca <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Fragmento 3 Antissentido <400> 18 cggcgcggaa gtcag <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Fragmento 4 Antissentido <4 00> 19 ggcgcggaag tcaga <210> 20 <211> 9 <212> DNA <213> Fragmento 1 de siRNA <400> 20 agatccgaa <210> 21 <211> 9 <212> DNA <213> Fragmento 2 de siRNA 15

15

15 10

15

25

30

<4 00> 21 gatccgaaa <210> 22 <211> 9 <212> DNA <213> Fragmento 3 de siRNA <400> 22 atccgaaaa <210> 23 <211> 9 <212> DNA <213> Fragmento 4 de siRNA <400> 23 tccgaaaaa <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Iniciador PETl <400> 24 aagatgccct ggactctact atggtcactt <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Iniciador PET2 <400> 25 tcagaacttg ctcttggtag acag <210> 26 <211> 432 <212> PRT <213> Homosapiens (seqüência <4 00> 26 aaqatgccct qgactctact atggtcactt 30

24

Met Ser Asp Lys Leu Pro Tyr Lys Val Ala Asp Ile Gly Leu Ala Ala 10 15

Trp Gly Arg Lys Ala Leu Asp Ile Ala Glu Asn Glu Met Pro Gly Leu 20 25 30

Met Arg Met Arg Glu Arg Tyr Ser Ala Ser Lys Pro Leu Lys Gly Ala 35 40 45

Arg Ile Ala Gly Cys Leu His Met Thr Val Glu Thr Ala Val Leu Ile 50 55 60

Glu Thr Leu Val Thr Leu Gly Ala Glu Val Gln Trp Ser Ser Cys Asn 65 70 75 80

Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala Ala Ala Ile Ala Lys Ala Gly

85 90 95

Ile Pro Val Tyr Ala Trp Lys Gly Glu Thr Asp Glu Glu Tyr Leu Trp 100 105 110

Cys Ile Glu Gln Thr Leu Tyr Phe Lys Asp Gly Pro Leu Asn Met Ile

115 120 125

Leu Asp Asp Gly Gly Asp Leu Thr Asn Leu Ile His Thr Lys Tyr Pro 130 135 140

Gln Leu Leu Pro Gly Ile Arg Gly Ile Ser Glu Glu Thr Thr Thr Gly 145 150 155 160

Val His Asn Leu Tyr Lys Met Met Ala Asn Gly Ile Leu Lys Val Pro

165 170 175

Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn Leu 180 185 190

Tyr Gly Cys Arg Glu Ser Leu Ile Asp Gly Ile Lys Arg Ala Thr Asp 195 200 205

Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Ala Gly Tyr Gly Asp Val 210 215 220

Gly Lys Gly Cys Ala Gln Ala Leu Arg Gly Phe Gly Ala Arg Val Ile 225 230 235 240

Ile Thr Glu Ile Asp Pro Ile Asn Ala Leu Gln Ala Ala Met Glu Gly

245 250 255

Tyr Glu Val Thr Thr Met Asp Glu Ala Cys Gln Glu Gly Asn Ile Phe 260 265 270

Val Thr Thr Thr Gly Cys Ile Asp Ile Ile Leu Gly Arg His Phe Glu 275 280 285

Gln Met Lys Asp Asp Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp Val 5 290 295 300

Glu Ile Asp Val Lys Trp Leu Asn Glu Asn Ala Val Glu Lys Val Asn 305 310 315 320

Ile Lys Pro Gln Val Asp Arg Tyr Arg Leu Lys Asn Gly Arg Arg Ile 325 330 335

10 Ile Leu Leu Ala Glu Gly Arg Leu Val Asn Leu Gly Cys Ala Met Gly 340 345 350

His Pro Ser Phe Val Met Ser Asn Ser Phe Thr Asn Gln Val Met Ala 355 360 365

Gln Ile Glu Leu Trp Thr His Pro Asp Lys Tyr Pro Val Gly Val His 15 370 375 380

Phe Leu Pro Lys Lys Leu Asp Glu Ala Val Ala Glu Ala His Leu Gly 385 390 395 400

Lys Leu Asn Val Lys Leu Thr Lys Leu Thr Glu Lys Gln Ala Gln Tyr 405 410 415

k'20 Leu Gly Met Ser Cys Asp Gly Pro Phe Lys Pro Asp His Tyr Arg Tyr 420 425 430

<210> 27

<211> 485

<212> PRT

25 <213> Homólogo de Lycopersicon esculentum (seqüência de aminoácido)

<400> 27

Met Ala Leu Leu Val Glu Lys Thr Thr Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val . 1 5 10 15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala

20 25 30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Ser Arg Ala Glu Phe Gly Pro 35 40 45 Ser Gln Pro Val Lys Gly Ala Lys Ile Thr Cys Ser Leu His Met Thr 50 55 60

Ile Gln Thr Ala Phe Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu 65 70 75 80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu 100 105 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly 115 120 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr 130 135 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Ala Lys Asn 145 150 155 160

Gly Thr Val Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Val Glu Phe Gln Leu

165 170 175

Val Leu Thr Ile Ile Lys Glu Ser Leu Lys Thr Asp Pro Leu Arg Tyr 180 185 190

Thr Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr 195 200 205

Gly Val Lys Lys Leu Tyr Gln Met Pro Ala Asn Gly Ser Leu Leu Phe 210 215 220

Leu Pro Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn 225 230 235 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

245 250 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Leu Val Ala Gly Tyr Gly Asp 260 265 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Met Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val 275 280 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Thr Met Glu

290

295

300 Gly Leu Gln Val Leu Phe Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Val Asp Ile 305 310 315 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met 325 330 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp 340 345 350

Asn Glu Ile Asp Met His Gly Leu Glu Thr Phe Pro Gly Val Lys Arg 355 360 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr Asn 370 375 380

Ser Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys 385 390 395 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln 405 410 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Arg Ser Ser Gly Lys Tyr 420 425 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala 435 440 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Phe Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Thr Lys 450 455 460

Asp Gln Ala Asp Tyr Ile Tyr Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Pro 465 470 475 480

Ala His Tyr Arg Tyr 485

<210> 28

<211> 1754

<212> DNA

<213> Homólogo de Lycopersicon esculentum (seqüência de nucleotídeo)

<400> 28

tctcagatct catcttaaac cctttttttt ctcttatact cgccttaccc atggctctac 60

tcgttgagaa gaccacctct ggccgcgagt acaaggtgaa ggacatgtct caggctgact 120

tcggcaggct cgaaatcgag cttgctgaag ttgaaatgcc tggtctcatg gcttcacggg 180 ctgaatttgg gccttcacag cccgttaaag gtgcaaagat cacttgttct ttgcatatga 240 ctatccaaac tgctttcctg attgaaaccc taactgcttt gggtgctgaa gttagatggt 300 gttcttgcaa catcttctca actcaggacc atgctgcagc agccattgca cgtgacagtg 360 ctgctgtctt tgcctggaaa ggtgagactt tgcaggagta ctggtggtgt actgagaggg 420 cacttgactg gggtccaggt ggtggtcctg atctgattgt tgatgatgga ggtgatgcta 480 ctctgttgat tcatgaggga gttaaggctg aagaggagtt tgctaagaat ggaacagtcc 540 cagatcccac ttctactgac aatgttgagt ttcaacttgt gcttactatt attaaggaga 600 gcttaaagac tgatccatta aggtacacta agatgaagga gagacttgtt ggtgtttctg 660 aggaaactac cactggtgtt aagaagcttt accaaatgcc agctaatgga tctttgcttt 720 tcctgcctat caatgttaat gactctgtta ccaagagcaa gtttgacaac ttgtatggat 780 gccgccactc acttcccgat ggtctcatga gggctactga tgttatgatt gctggaaagg 840 ttgctcttgt tgctggttat ggagatgtcg gcaagggatg tgctgctgcc atgaaacaag 900 ctggtgcccg tgtgattgtg actgagattg acccaatctg tgctctccag gctaccatgg 960 aaggccttca ggttttgttc ttggaggatg ttgtttctga ggttgatatc tttgtgacca 1020 ccaccggtaa caaggacatc atcatggttg accacatgag gaagatgaag aacaatgcca 1080 ttgtctgcaa cattggtcac tttgacaacg aaatcgacat gcatggtctt gaaaccttcc 1140 ctggtgtgaa gaggatcaca atcaagccac aaaccgacag atgggtcttt cccgacacca 1200 acagtggcat cattgtgttg gccgagggtc gtctcatgaa cttgggatgt gccactggac 1260 accccagttt tgtgatgtct tgctctttca ctaaccaagt cattgcccaa ctcgagttgt 1320 ggaatgagag gagcagtggc aaatacgaga agaaggtgta cgtcttgcca aagcaccttg 1380 acgagaaggt tgctgccctt catcttggaa agttcggagc caagcttacc aaactcacca 1440 aggatcaagc tgactacatt tacgtacctg ttgagggtcc ttacaagcct gctcactaca 1500 ggtactgagg aagagacgct cacagtggaa caacgatacg gcggcatgat tgttttgttt 1560 taaactttta ttttgtttag gtagtgtgtt tttattttgt tgggggatat tttgctggaa 1620 agttgaccta aatgtgtttg aataatattt gaattatggt tggggtggtg tcatatgata 1680 ttgtaccaag ttagattcat ttgctttctt gtttctataa aatttgcttc aaggaaacaa 1740 agcatcatgt tttt 1754 <210> 29

<211> 484

<212> PRT

<213> Homólogo de Solanum tuberosum (seqüência de aminoácido)

<400> 29 Met Ala Leu Leu Val Glu Lys Thr Thr Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val 15 10 15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala 20 25 30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Ser Arg Thr Glu Phe Gly Pro 35 40 45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Lys Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr 50 55 60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu 65 70 75 80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala 85 90 95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu 100 105 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly 115 120 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr 130 135 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Ala Lys Asn 145 150 155 160

Gly Thr Ile Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Val Glu Phe Gln Leu 165 170 175

Val Leu Thr Ile Ile Lys Glu Ser Leu Lys Thr Asp Pro Leu Arg Tyr 180 185 190

Thr Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr 195 200 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Ala Asn Gly Thr Leu Leu Phe 210 215 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn 225 230 235 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr 245 250 255 Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Leu Val Ala Gly Tyr Gly Asp 260 265 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Met Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val 275 280 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Thr Met Glu 290 295 300

Gly Leu Gln Val Leu Pro Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Val Asp Ile 305 310 315 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

325 330 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp 340 345 350

Asn Glu Ile Asp Met His Gly Leu Glu Thr Phe Pro Gly Val Lys Arg 355 360 365

Ile Thr Ile Ser Ser Asn Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr Asn Ser 370 375 380

Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys Ala 385 390 395 400

Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln Val 405 410 415

Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Arg Ser Ser Gly Lys Tyr Glu 420 425 430

Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala Ala 435 440 445

Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Thr Lys Asp 450 455 460

Gln Ala Asp Tyr Ile Ser Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Pro Ala 465 470 475 480

His Tyr Arg Tyr

30

<210> 30

<211> 1738 120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1738

139

<212> DNA <213> Homólogo de Solanum tuberosum (seqüência de nucleotídeo) <4 00> 30 aaggaagaag agaaaagctc tcagatctca tctcaaaccc tttcatttct cttatactcg ccttacccat ggctctactc gttgagaaga ccacctctgg ccgcgagtac aaggtgaagg acatgtccca ggcagacttc ggcaggctcg aaatcgagct tgccgaggtt gaaatgcctg gtctcatggc ttcccgtact gaattcggcc cttcacagcc ctttaaaggt gcaaagatca ctggatctct gcatatgact atccaaactg ctgtccttat tgaaacccta actgctttgg gtgctgaagt tagatggtgt tcttgcaaca tcttctcaac tcaggaccat gctgcagcag ccattgcacg tgatagtgct gctgtttttg cctggaaagg tgagactttg caggagtact ggtggtgtac tgagagggca cttgattggg gtccaggtgg tggtcctgat ctgattgttg atgatggagg tgatgctact ctcttgattc atgagggagt taaggcagag gaagagtttg ctaagaatgg gacaatccca gatcctactt ctactgacaa tgttgagttt caacttgtgc ttactattat taaggagagc ttaaagactg atcctttaag gtacactaag atgaaggaga gacttgttgg tgtttctgag gaaactacca ctggtgttaa gaggctttac caaatgcagg ctaatggaac tttgctattc cctgctatca atgttaatga ctctgttacc aagagcaagt ttgacaactt gtatggatgc cgccactcac tgcctgatgg tctcatgagg gctactgatg ttatgattgc cgggaaggtt gctcttgttg ctggttatgg agatgtcggc aagggatgtg ctgctgccat gaaacaagct ggtgcccgtg tgattgtgac tgagattgat ccaatctgtg ctcttcaggc aaccatggaa ggactccagg ttcttcctct tgaggatgtt gtttctgagg ttgatatctt tgtgaccacc actggtaaca aggacatcat catggttgac cacatgagga agatgaagaa caatgccatt gtctgcaaca ttggtcactt tgacaatgaa atcgacatgc atggtcttga gaccttccct ggtgtgaaga ggatcacaat cagctcaaac gacagatggg tcttcccaga caccaacagt ggcatcattg tcttggccga gggtcgtctc atgaacttgg gatgtgccac tggacacccc agttttgtga tgtcttgctc tttcactaac caagtcattg cgcaactcga gttgtggaat gagaggagca gtggcaaata cgagaagaag gtgtacgtct tgccaaaaca cctcgatgag aaggttgctg cccttcatct tggaaagctc ggagccaagc tcaccaaact taccaaggat caagctgact acatcagcgt accagttgag ggtccttaca agcctgctca ctacaggtac tgagggaaga gacactcatg gtggaacaac gatatcacgg cacgattgtt ttgtttttaa tactttgatt ttgtttaggt agtgtgtttt tattattgtt gggggcaagt tggcatgttt tgctggcacg ttgcacctaa atgtgtttgc aatcatcatt cgaattcatg gtgttggggt tgtgtcatct gcatattgta ctcaagcatt catttgca

Claims

1. Método de modular a expressão de pelo menos uma caracte- rística em uma planta, o método compreendendo a etapa de modulação da expressão de pelo menos um polipeptídeo pela planta, em que o polipeptí- deo é selecionado do grupo que consiste em: i) um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:1; ii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cido que é selecionada do grupo que consiste em qualquer um ou mais do aminoácido 9 a aminoácido 230, de aminoácido 1 a aminoácido 58, de ami- noácido 77 a aminoácido 485, de aminoácido 59 a aminoácido 76, de ami- noácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; iii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; e iv) um polipeptídeo que consiste em uma seqüência de aminoá- cido de acordo com a SEQ ID NO:1, em que a modulação da expressão do polipeptídeo modula a expressão de pelo menos uma característica na planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa de modulação da expressão de pelo menos um polipeptídeo pela planta com- preende introduzir em uma ou mais células da planta polinucleotídeo que modula a expressão do polipeptídeo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a etapa de modulação da expressão do polipeptídeo compreende reduzir a expres- são do polipeptídeo.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a etapa de redução da expressão do polipeptídeo pela planta compreende introduzir em uma ou mais células da planta polinucleotídeo que reduz a expressão do polipeptídeo.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o polipeptí- deo é selecionado do grupo que consiste em: i) polinucleotídeo antissense que compreende a seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; ii) polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 15 resíduos de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; iii) polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 15 resíduos de ácido nucleico contíguos de polinucleotídeo que é complementar a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que com- preende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1; iv) polinucleotídeo de interferência de RNA que compreende uma seqüência de ácido nucleico compreendendo pelo menos 9 resíduos de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico que é complementar a polinucleotídeo consistindo na seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; e v) polinucleotídeo antissense que consiste na seqüência de áci- do nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptí- deo compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 80% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a6, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 85% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular sina- lização de citoquinina na planta.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a . 6, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 90% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular sina- lização de citoquinina na planta.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a6, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 95% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular a si- nalização de citoquinina na planta.

10. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a eta- pa de modulação da expressão do polipeptídeo compreende aumentar a expressão do polipeptídeo.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a etapa de aumentar a expressão do polipeptídeo pela planta compreende introduzir em uma ou mais células da planta polinucleotídeo que aumenta a expressão do polipeptídeo.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o polipep- tídeo é selecionado do grupo que consiste em: i) polinucleotídeo que compreende uma seqüência de ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, ii) polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido que é selecionada do grupo que consiste em qualquer um ou mais do aminoácido 9 a aminoácido 230, de aminoácido 1 a aminoácido 58, de aminoácido 77 a aminoácido 485, de aminoácido 59 a aminoácido 76, de aminoácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; e iii) polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de se- qüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta.

13. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a pelo menos uma característica em uma planta é selecionada do grupo que consiste em qualquer um de altura da planta, biomassa da planta, desenvol- vimento de botão apical, ramificação, fertilidade, florescimento, área da fo- lha, senescência, germinação de semente, produção de semente, peso de semente, desenvolvimento de tronco, produção de grão, número de cultivos, desenvolvimento de meristemaa floral e desenvolvimento de raiz.

14. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a modula- ção de pelo menos uma característica é selecionada do grupo que consiste em qualquer um de ramificação aumentada, produção de semente aumenta- da, biomassa da planta aumentada, produção de grão aumentada, número de cultivos aumentado, área da folha aumentada, germinação de semente retardada, predominância apical diminuída, florescimento retardado, ou combinações dos mesmos na planta com relação a uma planta do mesmo tipo em que a expressão do polipeptídeo não foi modulada.

15. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a modu- lação de pelo menos uma característica é selecionada do grupo que consiste em qualquer um de florescimento precoce, nanismo, número diminuído de folhas, senescência precoce, germinação de semente precoce, formação i ,20 retardada e reduzida de folhas de roseta, crescimento de raiz de muda au- mentado, ou combinações dos mesmos na planta, com relação a uma planta do mesmo tipo em que a expressão do polipeptídeo não foi modulada.

16. Polinucleotídeo isolado selecionado do grupo que consiste em: i) polinucleotídeo antissense que compreende a seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; ii) polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 15 resíduos de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; e iii) polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 15 resíduos de ácido nucleico contíguos de polinucleotídeo que é complementar a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que com- preende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:1; iv) polinucleotídeo de interferência de RNA compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que compreende pelo menos 9 resíduos de áci- do nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico de acor- do com a SEQ ID NO: 15; e v) polinucleotídeo antissense que consiste na seqüência de áci- do nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; em que o polinucleotídeo é capaz de diminuir a expressão de um polipeptí- deo que modula pelo menos uma característica em uma planta, ou vi) polinucleotídeo que é complementar a qualquer um de i) a v), ou vii) polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas para qualquer um de i) a v).

17. Polinucleotídeo isolado selecionado do grupo que consiste em: i) polinucleotídeo que compreende uma seqüência de ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO:1; ii) polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido que é selecionada do grupo que consiste em qualquer um ou mais do aminoácido 9 a aminoácido 230, de aminoácido 1 a aminoácido 58, de aminoácido 77 a aminoácido 485, de aminoácido 59 a aminoácido 76, de aminoácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina em uma planta; iii) polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de se- quência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina em uma planta; e iv) polinucleotídeo que consiste em uma seqüência de ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO:1; em que o polinucleotídeo é capaz de aumentar a expressão de um polipeptí- deo que modula pelo menos uma característica em uma planta, ou v) polinucleotídeo que é complementar a qualquer um de i) a iv); ou vi) polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas para qualquer um de i) a iv).

18. Vetor compreendendo polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 16 ou 17.

19. Célula hospedeira transformada com um vetor como definido na reivindicação 18.

20. Planta compreendendo uma célula hospedeira como definido na reivindicação 19.

21. Método de produzir uma planta transgênica compreendendo as etapas de: (a) fornecer polinucleotíeo que module a expressão de um poli- peptíeo, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em: í) um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:1; ii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cido que é selecionada do grupo que consiste em qualquer um ou mais de aminoácido 9 a aminoácido 230, de aminoácido 1 a aminoácido 58, de ami- noácido 77 a aminoácido 485, de aminoácido 59 a aminoácido 76, de ami- noácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; iii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; e iv) um polipeptídeo que consiste em uma seqüência de aminoá- cido de acordo com a SEQ ID NO:1; (b) transformar uma planta, parte da planta ou célula da planta com o polinucleotídeo de etapa (a), e (c) cultivar a planta transformada, parte da planta ou célula da planta para produzir a planta transgênica.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o polipep- tídeo na etapa (a) compreende polinucleotídeo isolado selecionado do grupo que consiste em: v) Polinucleotídeo antissense que compreende a seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; vi) Polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 15 resíduos de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; e vii) Polinucleotídeo antissense que compreende pelo menos 15 resíduos de ácido nucleico contíguos de polinucleotídeo que é complementar a uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que com- preende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:1; viii) Polinucleotídeo de interferência de RNA compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que compreende pelo menos 9 resíduos de ácido nucleico contíguos selecionados da seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; e ix) Polinucleotídeo antissense que consiste na seqüência de áci- do nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 15; em que o polinucleotídeo é capaz de modular a expressão de um polipeptí- deo que modula pelo menos uma característica em uma planta, ou x) um polinucleotídeo que é complementar a qualquer um de i) a v), ou xi) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas pa- ra qualquer um de i) a v).

23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o polipep- tídeo na etapa (a) compreende polinucleotídeo isolado selecionado do grupo que consiste em: i) polinucleotídeo que compreende uma seqüência de ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO:1, ii) polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido que é selecionada do grupo que consiste em qualquer um ou mais do aminoácido 9 a aminoácido 230, de aminoácido 1 a aminoácido 58, de aminoácido 77 a aminoácido 485, de aminoácido 59 a aminoácido 76, de aminoácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; iii) polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de se- qüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:1 e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta; e iv) polinucleotídeo que consiste em uma seqüência de ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO:1, em que o polinucleotídeo é capaz de aumentar a expressão de um polipeptí- deo que modula pelo menos uma característica em uma planta, ou v) polinucleotídeo que é complementar a qualquer um de i) a iv), ou vi) polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas para qualquer um de i) a iv).

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, em que o cultivo na etapa (c) é cultivando a planta transformada, parte da planta ou célula da planta sob condições que permitem o crescimento da planta transformada, parte da planta ou célula da planta.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, em que a parte da planta é selecionada do grupo que consiste em raiz, tronco, folha, botão, flor, broto, semente e galho.

26. Planta de acordo com a reivindicação 20, em que a planta é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.

27. Planta de acordo com a reivindicação 20 ou 26, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em aveia, cevada, trigo, centeio, milho, arroz, sorgo, milho miúdo, amaranto, grama-do-reino, grama doce, cana, bambu, grama de forragem, capim diamante e capim turfa.

28. Planta transgênica quando produzida pelo método de qual- quer uma das reivindicações 21 a 25, em que a planta é selecionada do gru- po que consiste em aveia, cevada, trigo, centeio, milho, arroz, sorgo, milho miúdo, amaranto, grama-do-reino, grama doce, cana, bambu, grama de for- ragem, capim diamante e capim turfa.

29. Planta transgênica quando produzida pelo método de qual- quer uma das reivindicações 21 a 25, em que a planta é capaz de produzir plantas férteis.

30. Parte ou a semente de uma planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29.

31. Parte de acordo com a reivindicação 30, em que a parte é selecionada do grupo que consiste em raiz, tronco, folhas, botão, flor, broto, semente, tubérculo, fruto e galho.

32. Planta ou material de propagação regenerado da mesma de uma planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, ou uma parte ou uma semente de acordo com a reivindicação 30 ou 31.

33. Uso de uma planta transformada com polinucleotídeo de a- cordo com a reivindicação 16 ou 17 para biomassa da produção da planta.

34. Uso de acordo com a reivindicação 33, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em aveia, cevada, trigo, centeio, milho, arroz, sorgo, milho miúdo, amaranto, grama-do-reino, grama doce, cana, bambu, grama de forragem, capim diamante e capim turfa.

35. Uso de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que a bio- massa da produção da planta é para a produção de biocombustível.

36. Polipeptídeo isolado selecionado do grupo que consiste em: i) um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:1; ii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cido que é selecionada do grupo que consiste em qualquer um ou mais do aminoácido 9 a aminoácido 230, de aminoácido 1 a aminoácido 58, de ami- noácido 77 a aminoácido 485, de aminoácido 59 a aminoácido 76, de ami- noácido 231 a aminoácido 405, e de aminoácido 406 a aminoácido 438 de SEQ ID NO: 1, ou em posições equivalentes em um homólogo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina em uma planta; iii) um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoá- cido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para A seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:1 e que é capaz de modular sinali- zação de citoquinina em uma planta; e iv) um polipeptídeo que consiste em uma seqüência de aminoá- cido de acordo com a SEQ ID NO:1, em que a modulação da expressão do polipeptídeo modula a expressão de pelo menos uma característica na planta.

37. Método de modular a expressão de pelo menos uma carac- terística em uma planta, o método compreendendo a etapa de modulação da expressão de pelo menos um polipeptídeo pela planta, em que o polipeptí- deo é um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido com pelo menos 70% de identidade de seqüência para uma seqüência de amino- ácido de acordo com a SEQ ID NO:1, em que a referida seqüência de ami- noácido compreende uma seqüência de aminoácido de aminoácido 59 a a- minoácido 76 de SEQ ID NO:1, ou em posições equivalentes em um homó- logo dos mesmos, e que é capaz de modular sinalização de citoquinina na planta, em que a modulação da expressão do polipeptídeo modula a expres- são de pelo menos uma característica na planta.

38. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep- tídeo compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos97,5% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e que é capaz de modular sinalização de cito- quinina na planta.