JP2010517528A - 推定サイトカイニン受容体およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
該ポリペプチドは、
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド
から成る群から選択され、
ポリペプチドの発現の調整は、植物における少なくとも1つの形質の発現を調整する。
Description
従来の植物育種技術は、農作物の改良をもたらすことが知られている。選抜育種および交配等のこれらの技術は、種々の性質の子孫を生成するために、異なる遺伝的背景を有する植物に由来する遺伝子の交配を伴う。子孫は、望ましい形質を発現する植物を得るように選抜され、有害形質は、複数回の戻し交配または自殖によって除去され、望ましい性質を有する子孫を最終的に産生する。従来の育種方法は、種々の作物の性質を改善または改良するのに有用であることが分かっているが、これらの方法は、何百または何千もの遺伝子の交配を伴い、その中で、わずかな遺伝子のみが性質または形質の改良のために選抜される。さらに、これらの方法は、望ましい形質を得るために、子孫の大きい母集団から多数の系統を選抜し、数世代にわたってそれを戻し交配するため、何年もの交配を要する。従来の育種方法を使用して、他の形質に影響を及ぼすことなく1つの形質に対して選抜を行うことが通常困難であるため、一部の望ましくない形質も植物中に現れる可能性がある。
本発明者らは、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達経路に関与する、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを同定した。サイトカイニンは、特異的な生化学的および生理学的作用を提供するために、応答性植物細胞において作用する植物ホルモン(phytohormone)(または植物ホルモン(plant hormone))である。植物ホルモンは、最初に、植物成長および発達に重要な細胞性応答を刺激するために、ホルモンシグナルの伝達を開始する特異的受容体によって認識される。ホルモン受容体が、顕花植物からヒトに至る多くの真核生物において十分に研究されている一方で、植物ホルモン受容体の詳細な理解は不十分であった。植物ホルモン結合タンパク質は、そのような受容体の候補を提供するのではないかと見られている。
ポリペプチドは、
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド、
から成る群から選択され、
ポリペプチドの発現の調整は、植物における少なくとも1つの形質の発現を調整する。
i)SEQ ID NO:15に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iv)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成るポリヌクレオチドに相補的な核酸配列から選択される、少なくとも9個の連続した核酸残基
を含む核酸配列を含む、RNA干渉ポリヌクレオチド、および
v)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチド、
から成る群から選択される。
i)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、および
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される。
i)SEQ ID NO:15に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iv)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも9個の連続した核酸残基
を含む、RNA干渉ポリヌクレオチド、および
v)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を減少させることができる、ポリヌクレオチド、または
vi)i)からv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vii)i)からv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチドが提供される。
i)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、および
iv)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列から成る、ポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を増加させることができる、ポリヌクレオチド、または
v)i)またはiv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vi)i)またはiv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチドが提供される。
a)ポリペプチドの発現を調整するポリヌクレオチドを提供するステップであって、ポリペプチドは、
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチド、および
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド
から成る群から選択される、ステップと、
b)ステップ(a)のポリヌクレオチドで植物、植物部位、または植物細胞を形質転換するステップと、
c)形質転換した植物、植物部位、または植物細胞を成長させて、遺伝子導入植物を産生するステップと、
を含む、遺伝子導入植物を産生する方法が提供される。
i)SEQ ID NO:15に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、および
iv)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも9個の連続した核酸残基
を含む核酸配列を含む、RNA干渉ポリヌクレオチド、および
v)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を調整することができる、ポリヌクレオチド、または
vi)i)からv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vii)i)からv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチドを含む。
i)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、および
iv)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列から成る、ポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を増加させることができる、ポリヌクレオチド、または
v)i)またはiv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vi)i)またはiv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチドを含む。
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるか、またはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド、
から成る群から選択される単離されたポリペプチドが提供され、ポリペプチドの発現の調整は、植物における少なくとも1つの形質の発現を調整する。
本明細書で使用される以下の用語は、以下に示される意味を有するものとする。
以下、植物における形質の発現を調整するための新しい方法の例示的な限定されない実施形態、および新しい方法において使用するための、また新しい方法によって生産される材料が開示される。
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のいずれか1つ以上から成る群から選択されるか、またはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド、
から成る群から選択され、ポリペプチドの発現の調整は、植物における少なくとも1つの形質の発現を調整する。
LAR(m2g−1またはm2kg−1)=(全葉面積)/(全乾燥重量)
LAI=(作物の全葉面積)
(それが立っている全土地面積)
SLA(m2g−1)=(葉面積)/(葉乾燥質量)
Tm(ホモ)=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)−0.61(%ホルム)−500/L
M=一価カチオンのモル濃度を示す
%GC=配列における塩基の総数のグアニン(G)およびシトシン(c)の%
%ホルム=ハイブリダイゼーションバッファにおけるホルムアミドの%
L=ポリヌクレオチド配列の長さ
上記に概説される戦略を使用して、SEQ ID NO:2のポリヌクレオチド配列の272位で始まり、287位で終わる15個の連続した核酸残基を含む第2のアンチセンスポリヌクレオチドは、以下の核酸配列を有する。
第3および第4のアンチセンスポリヌクレオチドは、以下の核酸配列のそれぞれを有する。
15個の連続した核酸残基を含むさらなるアンチセンスポリヌクレオチドは、上記に説明されるように得ることができる。
上記に概説される戦略を使用して、SEQ ID NO:2のポリヌクレオチド配列の43位で始まり、51位で終わる9個の連続した核酸残基を含む第2のRNA干渉ポリヌクレオチドは、以下の配列を有する。
第3および第4のRNA干渉ポリヌクレオチドは、以下の配列のそれぞれを有する。
9個の連続した核酸残基を含むさらなるRNA干渉ポリヌクレオチドは、上に説明されるように得ることができる。siRNAの設計および使用に関するさらなる情報は、www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/10−0/105/sirna.htmlで利用可能な、「The siRNA User Guide」で見ることができる。
2iP−2−イソペンテニルアデニン
AHK−シロイヌナズナヒスチジンキナーゼ
AHP−シロイヌナズナヒスチジンリン酸転移タンパク質
AMM−アスパラギン最少培地
ARR−シロイヌナズナ応答調節因子
AS−アンチセンス抑制
A−アデノシン
BA−ベンジルアデニン
BLAST−Basic Local Alignment Search Tool
CAB−クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子
CaMV−カリフラワーモザイクウイルス
CRE−サイトカイニン応答
cDNA−相補的なデオキシリボ核酸
DNA−デオキシリボ核酸
ELISA−酵素免疫測定法
ETR1、ERS2、ETR2、およびEIN4−エチレン受容体
FAB−高速原子衝撃
G−グアニン
GFP−緑色蛍光タンパク質
HOG1−相同性依存型ジーンサイレンシング1
HSP−高スコア配列ペア
ITC−等温滴定熱量計
KD−解離定数
KNAT1−シロイヌナズナの結び目(Knotted)相同体1
LAI−葉面積指数
LAR−葉面積比
naRNA−メッセンジャーRNA
NCBI−National Center for Biotechnology Information
NOS−ノパリン合成酵素
OCS−オクトピン合成酵素
OE−過剰発現
OsCBP−オリザサティバサイトカイニン結合タンパク質
PCR−ポリメラーゼ連鎖反応
PNA−ペプチド核酸
PETCBP−ペチュニアサイトカイニン結合タンパク質
RNA−リボ核酸
RNAi−RNA干渉
RuBisCo−リブロース二リン酸カルボキシラーゼ
SAH−S−アデノシルホモシステイン
SAM−S−アデノシルメチオニン
siRNA−低分子干渉RNA
SSC−1−2x塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム
SAHH−S−アデノシル−L−ホモシステインヒドロラーゼ
SLA−比葉面積
STM−シュートメリステムレス転写因子
T−チミン
TDNA−転移DNA
Tm−熱融点
U−ウラシル
WT−野生型
ZR−ゼアチンリボシド
最良の形態を含む限定されない実施例、および比較例が、具体的な実施例を参照することによってより詳細にさらに記載されるが、いかようにも本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
材料および方法
植物材料および成長条件
シロイヌナズナのコロンビア生態型をこの研究に使用した。16時間の光条件/8時間の暗条件において、22℃で植物を生育した。実生アッセイのために、種子を表面殺菌し、2日間4℃で暗所において積層し、次に白色光(75μE.m2.s−1)に曝露した。3%のスクロースおよび0.9%の寒天を含むMurashige−Skoog(MS)培地上で、22℃で苗を生育した。発芽実験に対して、スクロースのないMS培地上で、特定のバッチの種子を播種した。
全長シロイヌナズナHOG1cDNA(SEQ ID NO:2)を5’および3’RACE戦略によって増幅した。cDNAの5’−および3’−cDNA(5’/3’−RACE)端配列を同定するために、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech Laboratories)を使用した。これらのPCR生成物を配列決定した。シロイヌナズナHOG1に対する全長cDNA配列(SEQ ID NO:2)を得るために、部分配列およびRACE PCR生成物を整列させた。
TRIzol方法(Invitrogen)を用いて、苗から全RNAを抽出した。One−Step RT kit(Qiagen)をメーカーの使用説明書に従って使用して実行した各定量PCR反応のために、RNaseフリーのDNaseIで処理した全RNA(0.5μg)を使用した。SYBRグリーンを使用して定量リアルタイムPCRを実行した。メーカーのプロトコルに従って、倍率変化の計算のためにチューブリン2のCt値に対してCt値を正規化した。
ITC(MCSITC, Microcal, Northampton, USA)によって、HOG1とサイトカイニンとの間の相互作用のサイトカイニン結合親和性および熱力学分析を検査した。3つの自然発生的サイトカイニン(ゼアチン、ベンジルアデニン、およびイソペンテニルアデニン)、ならびにチジアズロン(尿素由来の合成サイトカイニン)を使用した。加えて、アデノシンおよびNADを対照分子として使用し、サイトカイニンへのHOG1の結合特異性を検証した。MICROCAL ORIGINバージョン2.9により、1つの結合部位に対して最適な非線形最小二乗法を使用して、データを分析した。近似曲線から結合化学量論(n)および会合定数(KA)を計算した。続いて、KDを1/KAとして計算した。2μMの精製されたTAP−HOG1を含むサンプル細胞への0.1μMの精製されたAHP1の注入から得られたベースラインドリフトに対して、生の熱データを補正した。HOG1に添加されるAHP1のモル比に対して熱ピーク面積をプロットすることによって、結合等温線を作成した。
個々の35S:GFP−HOG1融合構成物を発現する遺伝子導入植物をそれらの表現型に従って選抜した。5日齢の苗からの根を根切りし、半強度のMS培地に取り付け、直後に、505から530nmバンドパスフィルタセットと組み合わせた488nmアルゴンレーザーを有する共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss CLSM 510)を使用した。
実生根の断片をカルス誘導培地(0.5μg/mlの2,4−ジクロロフェノキシ酢酸および0.05μg/mlのキネチンを添加したMS培地)上で4日間インキュベートした。得られたカルスを、Inoueらの方法(Nature 409:1060−1063, 2001)に従って、10日間隔で新鮮培地に継代培養しながら、シュート誘導培地(0.2μg/mlのインドール酪酸および種々の濃度のゼアチンを添加したMS培地)上で30日間インキュベートした。
サイトカイニンを100%のメタノールで全植物から抽出し、Yangら(FEBS 555:291−296, 2003)に記載されるように、イソペンテニルアデノシンおよびゼアチンリボシド検出キット(Sigma)を使用して定量化した。Rochaら(Plant Cell 17:404−417, 2005)に記載されるように、抽薹植物の粗タンパク質抽出物に対してSAHH分光光度アッセイを実行した。
サイトカイニン誘導性遺伝子発現の定量リアルタイムPCR(qRT−PCR)分析のために、3%の(w/v)スクロースを含むMS培地上で種子を発芽させ、6日間生育した。5分、15分、30分、または1時間、0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、または5μM[0.1%のジメチルスルホキシド(DMSO)中で可溶化し、MS培地で希釈した]を添加した同一のMS+スクロース液体培地(寒天を含まない)において苗をインキュベートすることによって、サイトカイニン処理を実行した。対応する期間、DMSO(0.1%、処理のためにサイトカイニンを溶解するために使用される濃度)で対照苗をインキュベートし、発現解析に使用した。RNA調製前に、WT、OE、およびAS苗を混合し、RNAlater溶液(Qiagen, Valencia, CA)中に保存した。Rneasy Plant Mini Kit(Qiagen)を使用して全RNAを抽出した。SYBRグリーンRT−PCR試薬(Applied Biosystems)を使用し、二本鎖cDNAを合成した。BAおよびDMSOの存在下、また非存在下で、WT、OE、およびAS苗の生物学的複製のそれぞれに存在する転写物の数を、3つの独立した複製から決定した。メーカーの使用説明書に従って(ABI Prism 7700 Sequence Detection System, User Bulletin #2)、転写物の誘導率を計算した。
すでにForlerら(上記を参照のこと)に記載されるように、ProtAおよびCBPタグを使用して、TAP−HOG1タンパク質複合体を精製した。ProtAプルダウンのために、IgG Sepharose beads(Amersham Biosciences #17−0969−01)を使用し、CBPプルダウンのために、カルモジュリン親和性樹脂(Stratagene #214303−52)を使用した。ウエスタンブロット分析のために、標準的なプロトコルを使用して、精製されたタンパク質をSDS−PAGEに供し、PVDF膜にブロットした。さらに、プルダウンしたHOG1複合体をSDS−PAGE電気泳動に供し、得られた顕著なバンドを同定するためにN末端配列決定を行った。AHP1は、主要な推定相互作用タンパク質バンドであるため、AHP1に対するcDNAをシロイヌナズナからクローニングし、組み換えAHP1を6Hisタグおよびチオレドキシンタグで大腸菌BL21において発現した(発現ベクターPET32EK/LICにおいて、Novagen)。HISタグ親和性カラム(BioRad)を使用して、タグを有する組み換えAHP1を精製した。上記に概説されるように、ITC(MCS−ITC, Microcal, Northampton, USA)を使用して、タンパク質相互作用(HOG1−AHP1)研究を実行した。
本発明者らは、植物発達のサイトカイニンシグナル伝達および調節へのHOG1の関与を分析するために、アンチセンス抑制および過剰発現戦略を使用した。
サイトカイニン分子は、精製されたTAP−HOG1および種々のサイトカイニンの等温滴定熱量計(ITC)によって示されるように、効率的に精製されたタンパク質と結合する。リガンド受容体結合反応速度を研究するために使用したITCという生物物理学的技術は、結合親和性(KA)を含む相互作用の重要な熱力学パラメータ、したがって、解離定数(KD)および結合化学量論(n)を得る。
Columbia University(www.cubic.bioc.columbia.edu)からのPHDhtmウェブ資源を使用して、HOG1タンパク質に対するドメイン検索を実施した。検索は、HOG1タンパク質が、典型的な受容体様構造を有することを示した。HOG1タンパク質は、予測膜貫通ヘリックス(SEQ ID NO:1の残基59から76から18個のアミノ酸に及ぶ)を有し、予測サイトカイニン結合ドメイン(SEQ ID NO:1の残基77から485から409個のアミノ酸に及ぶ)が膜の外側に存在する。タンパク質はまた、下流シグナル伝達中間体との相互作用に対して、細胞質内に推定部位を有し、N末端において58個のアミノ酸(SEQ ID NO:1の残基1から58)を含む。
定量リアルタイムPCR分析は、HOG1が、葉および花序茎において比較的高いレベルで、シロイヌナズナにおいて構成的に発現されることを示した(図1F)。これは、HOG1が、植物発達の調節において基本的な役割を果たす可能性があることを示唆する。
5つの独立した系統を各観察に使用した。各系統に対して、データは、3つの独立した複製からの平均である。アンチセンス系統は、発芽の遅延、抽薹の遅延、および老化の遅延を示した。
データは、3つの独立した複製からの平均±標準偏差を表す。5つの独立した系統をそれぞれの場合に使用した。アンチセンス系統は、野生型と比較して、葉バイオマスにおいて3倍の増加および種子収量において2倍の増加を有した。
葉面積(cm2)×1長角果当たりの種子重量(mg)(a)、葉面積(cm2)×1長角果当たりの種子数(b)、および1長角果当たりの種子重量(mg)×1長角果当たりの種子数(c)で相関係数を検証した。相関分析後に、スチューデントのt検定を実行した。t検定値を括弧内に示す。「r」値は、すべての試験における正相関を示す。これに基づいて、HOG1のアンチセンス抑制は、葉バイオマスおよび種子収量に寄与する主要パラメータの増加をもたらすことが予測される。
AHK型サイトカイニン受容体の三重機能喪失変異体は、このHOG1のアンチセンス抑制で認められるものと反対の表現型をもたらした(Higuchi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:8821−8826, 2004)。この相反する表現型は、過剰発現系統におけるHOG1タンパク質によるサイトカイニンの移行の潜在的な障害によって説明され得る。
hog1点変異体が、野生型のものと比較して、粗タンパク質抽出物においてわずかに低いSAHH活性を有したという以前の報告(Rocha et al. Plant Cell 17:404−417, 2005)にもかかわらず、野生型(2.92±0.15nmol/min/mgのタンパク質)、アンチセンス(2.84±0.21nmol/min/mgのタンパク質)、および過剰発現系統(3.02±0.19nmol/min/mgのタンパク質)からの粗タンパク質抽出物におけるSAHH活性に有意差はなかった。さらに重要なことに、本データは、精製されたTAP−HOG1タンパク質が、SAHH酵素活性を欠いていることを示した(図3H)。これらの結果は、このHOG1タンパク質が、サイトカイニン受容体であり得ることを示唆する。
組織培養反応は、HOG1がサイトカイニン応答の正の調節因子であるという見解を裏付けているが、6週間にわたる試験管内増殖を伴い、その間に、別のプロセスが表現型に寄与した可能性もある。したがって、比較的短い期間において、サイトカイニンによって直接誘導されることが既知である、選択された遺伝子の発現も検査した(図4A、4B、および表4)。これらの遺伝子は、KNAT1およびSTM(メリステム機能に関与するホメオボックス遺伝子、外因性サイトカイニンの添加後5分以内に誘導された)、ならびにARR4、ARR5、およびARR6(サイトカイニンによって誘導されたA型応答調節因子)を含んだ。サイトカイニン(ベンジルアデニン、BA、0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、または5μMにおいて)でのパルス処理前後に、野生型、HOG1過剰発現、およびHOG1アンチセンス抑制系統の苗からのRNAを使用して、定量リアルタイムPCR分析を実行した。いくつかの時間間隔(5分、15分、30分、および1時間)にわたって採取した組織に対してRNA抽出を実行した。BAの添加は、KNAT1およびSTM転写物の用量依存的な増加をもたらし、系統におけるHOG1の発現レベルおよび内在性サイトカイニン濃度に比例していた(図4A、4B、表4)。HOG1アンチセンス抑制系統におけるBA処理を行わない場合も、KNAT1およびSTMの転写レベルは、6から8倍有意に上方制御されたが、未処理の過剰発現系統は、未処理の野生型と比較して、これらの転写物の4から7倍の減少を示した(図4A)。しかしながら、5μMのBAの添加後1時間以内に、過剰発現系統(例えば、OE1およびOE12)は、未処理の野生型植物のものと比較して、KNAT1およびSTM転写物のレベルにおいて有意差を示さなかった(図4A、表4)。これは、この系統が内在性サイトカイニンレベルの減少を有するという知見と一致している。
サイトカイニン(ベンジルアデニン、BA、0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、または5μMにおいて)でのパルス処理前後の、野生型、HOG1過剰発現、およびアンチセンス抑制系統の苗からのRNA。3つの独立したアンチセンス抑制(AS1、AS8、AS21)および過剰発現(OE1、OE12、OE18)系統から、いくつかの時間間隔(5分、15分、30分、および1時間)にわたって採取した組織に対して、RNA抽出を実行した。分析した遺伝子は、KNAT1、STM(メリステム機能に関与するホメオボックス遺伝子)、ARR4、ARR5、およびARR6(サイトカイニンによって誘導されたA型応答調節因子)を含んだ。BAの添加は、KNAT1およびSTM転写物の用量依存的な増加をもたらした(倍率変化値の隣の矢印は、上方制御↑または下方制御↓を示す)。ARR1、ARR2(B型応答調節因子)、AHK2、AHK3、AHK4(ヒスチジンキナーゼサイトカイニン受容体)も分析した。しかしながら、これらの遺伝子が発現において2倍未満の変化を示したため、データはこの表に示していない。
HOG1タンパク質によって形成されるシグナル伝達複合体を決定し、サイトカイニン受容体としてのその役割をさらに裏付けるために、HOG1と相互作用するタンパク質を単離および同定した。
サイトカイニン応答を媒介するための新しいサイトカイニン受容体HOG1の役割をよりよく理解するために、サイトカイニンによって誘導された一次応答遺伝子、すなわち、A型ARR遺伝子(すなわち、ARR4、ARR5、およびARR6)を分析した。ARRの発現量の変化は、図4Bおよび表4に見られ、HOG1アンチセンスおよび過剰発現系統における測定されたサイトカイニン含有量に加えて、内在性サイトカイニンへの応答が、HOG1の影響を受けることを示唆する。これは、HOG1タンパク質を新しい受容体として、およびARRをAHP1に沿ったHOG1サイトカイニンシグナル伝達経路の下流シグナル伝達カスケードメンバーとして確認する。
材料および方法
植物材料
イネ、オリザサティバジャポニカ種に対して、栽培品種日本晴を使用した。これは、日本由来の市販品種である。別のイネ栽培品種(インディカ種)に対しても同様の研究が実行され得る。野生型シロイヌナズナ種子をLEHLE種子から得た(1102 South Industrial Blvd., Suite D, Round Rock TX 78681 USA)。
この研究においてDNAクローニングのために使用した細菌株は、大腸菌DH5αであり、別段の指示がない限り37℃で液体LB培地(Sambrook et al., 1989)中で増殖させた。使用したアグロバクテリウムツメファシエンス株は、GV3101(Koncz and Schell, 1986)であった。
RNA抽出後に、AMV(ニワトリ骨髄芽球症ウイルス)逆転写酵素(AMV−RT, Promega)を使用して、逆転写(RT)を実行した。cDNA生成物を、縮重プライマー
を使用したPCRに使用し、シロイヌナズナおよびイネから部分断片を単離した。PCR断片をクローニングおよび配列決定した。
SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech Laboratories)を使用して、cDNAの5’−および3’−cDNA(5’/3’−RACE)端配列を同定した。これらのPCR生成物を配列決定した。部分配列およびRACE PCR生成物を合わせて整列し、シロイヌナズナ(HOG1)およびイネ(OsCBP)に対する全長cDNA配列を得た。
Hieiらの方法(植物 Journal UK Vol. 6, pages 271−282, 1994)を使用した。
成熟したイネ種子を70%のエタノールで1.5分間表面殺菌した。120rpmで45分間の振とう器上の100mlの滅菌フラスコ中で、1滴のTween−20と共に漂白剤(20%)を添加した。これに続いて、処理した種子を滅菌蒸留水で十分に洗い流した。
アンチセンス構成物を含むバイナリープラスミド(pCAMBIA1301, R. Jefferson, CAMBIA, Australiaに基づく)をA.ツメファシエンス株AGL1に導入した。A.ツメファシエンスを、48〜73時間28℃で、10mg/lのリファンピシン、50mg/lのカナマイシン、および50mg/lのハイグロマイシンを含む固化YEP培地上に保存して増殖させた。1mlのバクテリア培養物を、28℃で、250mlのフラスコ内の同一の選択的抗生物質を含有する100mlのAB培地に添加した。0.8〜1.0のOD595の濃度に到達するまでバクテリアを増殖した。室温で10分間4,000rpmで遠心分離することによって、バクテリアを採取した。次に、上清を除去し、AMM培地において同体積の沈殿物を再懸濁することによって、バクテリアを一度洗浄し、室温で10分間4,000rpmで再び遠心分離した。上清を廃棄した。
100mlの滅菌フラスコ内の共培養したカルスを採取し、50〜75mlの滅菌蒸留水を使用して軽く振とうしながら、少なくとも10回洗浄した。余分な表面の水分を除去するために、滅菌ティッシュペーパーのパッド上でカルスを乾燥させた。カルス片を500mg/lのセフォタキシムおよび200mg/lのアンピシリンを含む100mlの滅菌蒸留水に移し、25℃において120rpmで2時間振とうした。水分を除去し、カルス片を滅菌ペーパーのパッド上でブロット乾燥した。形質転換細胞の選抜のために、カルス片を、9cm滅菌シャーレ中の2mg/lの2.4−D、250mg/lのセフォタキシム、200mg/lのアンピシリン、および50mg/lのハイグロマイシン(選択的培地)を含むNBO培地上に移した。密閉した皿を暗所において25℃でインキュベートした。
植物材料および成長条件
シロイヌナズナに対して、コロンビア生態型を使用し、植物を成長チャンバにおいて、22℃で、16時間の明条件および8時間の暗条件において生育した。イネ遺伝子形質転換実験のために、オリザサティバジャポニカ種日本晴を使用した。
5’および3’RACE戦略によって、全長HOG1cDNAを増幅した。すべての導入遺伝子構成物に対して、pGreen0229バイナリーベクター(Yu et al.、上記を参照のこと)を使用した。アンチセンス抑制のために、2つのSAHH特性に及ぶHOG1の850bp断片を使用した(SEQ ID NO:15)。過剰発現構成物のために、HOG1cDNAの完全なオープンリーディングフレームを使用した(SEQ ID NO:2)。TAPタグが付いたHOG1は、2つのタグ間にTEV開裂部位を有するProt Aおよびカルモジュリン結合ペプチドタグを含んだ。アグロバクテリウムツメファシエンス媒介性花浸漬方法(Clough, S. and Bent, A. 植物 Journal 16(6): 735−743(1998))によって、構成物をシロイヌナズナに導入した。
TRIzol方法(Invitrogen)を用いて、シロイヌナズナ苗またはイネ葉から全RNAを抽出した。One−Step RT kit(Qiagen)を使用して実行した各定量PCR反応のために、メーカーの使用説明書に従ってRNaseフリーのDNaseIで処理した全RNA(0.5μg)を使用した。SYBRグリーン(Applied Biosystems Inc.)を使用して定量リアルタイムPCRを実行した。メーカーのプロトコルに従って、倍率変化の計算のためにチューブリン2のCt値に対してCt値を正規化した。
ITC(MCSITC, Microcal, Northampton, USA)によって、HOG1とサイトカイニンとの間の相互作用のサイトカイニン結合親和性および熱力学分析を検査した。公開されたプロトコル(Forler et al.、上記を参照のこと)を使用して、35S::TAP−HOG1構成物を有するトランスジェニックシロイヌナズナ植物から、TAP−HOG1融合タンパク質を生成した。25回の注入(各注入は、37℃、3秒間隔で2μl)を含む各ITCアッセイに対して、0.01μMのベンジルアデニン(自然発生的サイトカイニン)および0.1μMの精製されたTAP−HOG1タンパク質を使用した。1つの結合部位に対して、MICROCAL ORIGINバージョン2.9によって、最適な非線形最小二乗法を使用して、データを分析した。近似曲線から結合化学量論(n)および会合定数(KA)を計算した。続いて、KDを1/KAとして計算した。
サイトカイニンを100%のメタノールで全植物から抽出し、Yangら(上記を参照のこと)に記載されるように、イソペンテニルアデノシン検出キット(Sigma)を使用して定量化した。
カルス生成のために、表面殺菌し皮を剥いたイネ種子を2mg/lの2,4−Dを添加したNBO培地(カルス誘導培地)上に配置し、次いで、暗所において30日間25℃でインキュベートすることによって、それらを誘発した。30日後、もろい胚カルスを得るまで、新生のカルスのさらなる継代培養を行った。
GIBCO−BRL Cell−Poratorを使用したエレクトロポレーションによって、全長HOG1を含有するバイナリープラスミドpCAMBIA1300(過剰発現およびアンチセンス抑制のそれぞれに対するセンスまたはアンチセンス配向)を、アグロバクテリウムツメファシエンスAGL1に導入した。制限消化によって形質転換したプラスミドを確認した。10mg/lのカルベニシリン、50mg/lのカナマイシン、および50mg/lのハイグロマイシンを含むYEP培地で、プラスミド構成物を有するアグロバクテリウムを培養し、48時間、25℃でインキュベートした。1mlのこの小規模培養物を、同一の選択抗生物質を含む100mlのAB液体培地に接種し、培養物が0.8から0.9のOD595に到達するまで、25℃でインキュベートした。培養物を10分間4000rpmで遠心分離した。バクテリア沈殿物を0.4のOD595の濃度までAMM培地で懸濁した。20から25mlのこの細菌懸濁液を深さ9cmのシャーレに入れ、元気に成長する淡黄色のもろい胚発生カルス(約5mmの大きさ)を、時々振とうしながら30分間浸漬した。カルスを乾燥ティッシュペーパーの滅菌パッド上に置くことによって、それらから余分な細菌懸濁液を除去した。続いて、接種されたカルスを深さ9cmの滅菌シャーレ中の2N6−AS培地上で培養し、2から3日間、暗所において25℃でインキュベートした。
共培養したカルスを、50〜75mlの滅菌水を使用して軽く振とうしながら、少なくとも10回洗浄し、滅菌ティッシュペーパー上に置いて乾燥させた。選抜のために、カルス片を、不稔シャーレ中の2mg/lの2,4−D、250mg/lのセフォタキシム、および50mg/lのハイグロマイシンを含むNBO培地に移した。4週間の選抜後に、ハイグロマイシン抵抗性マイクロカルスを推定トランスジェニックカルスとして選抜し、共培養したカルスから取り除き、さらなる増殖のために新鮮選択培地に移し、3週間培養した。元気に成長するハイグロマイシン抵抗性カルスを、1mg/lのBA、2mg/lのNAA、5mg/lのABA、および50mg/lのハイグロマイシンを含むNBO培地(再生前培地)に移し、3週間、暗所において25℃で培養した。再生前培地からの白色のコンパクトハイグロマイシン抵抗性カルスを、2mg/lのBA、1mg/lのIAA、1mg/lのNAA、1mg/lのキネチン、および50mg/lのハイグロマイシンを含むNBO培地(再生培地)に移し、14時間の明条件(25μMol/m2/s)の光周期において、25℃で培養した。3週間後、シュートの生長および根伸長のために、付着したカルスを含む再生されたハイグロマイシン抵抗性植物体を、Phytacon容器中の50mg/lのハイグロマイシンを含む100mlの1/2MS培地(植物体培地)に移した。植物体が容器の上部に到達するまで、植物体を培養した。植物体の各クラスターを、1/2MS溶液を含有する54ウェルのプラスチックトレイの単一ウェルに移した。植物体を、14時間の明条件(25μMol/m2/s)の光周期において、20℃で90%の相対湿度の成長チャンバにおいて、7〜10日適応させた。後に、植物を鉢内の土に移した。
定量リアルタイムPCR分析は、実施例1(c)に記載されるように、HOG1が、葉および花序茎において比較的高いレベルを有し、シロイヌナズナにおいて構成的に発現されることを示し、HOG1が、植物発達の調節において基本的な役割を果たし得ることを示唆した。精製されたHOG1は、実施例1(a)に記載されるように、サイトカイニン分子(ゼアチン、ベンジルアデニン、およびイソペンテニルアデニン)への高親和性結合を示した。
5つの独立した系統を各観察に使用した。各系統に対して、データは、3つの独立した複製からの平均を表す。アンチセンス系統は、発芽の遅延、抽薹の遅延、および老化の遅延を示した。
データは、3つの独立した複製からの平均±標準偏差を表す。5つの独立した系統をいずれの場合にも使用した。アンチセンス系統は、野生型と比較して、葉バイオマスにおいて3倍の増加および種子収量において2倍の増加を示した。
葉面積(cm2)×1長角果当たりの種子重量(mg)(a)、葉面積(cm2)×1長角果当たりの種子数(b)、および1長角果当たりの種子重量(mg)×1長角果当たりの種子数(c)で相関係数を検証した。相関分析後に、スチューデントのt検定を実行した。t検定値を括弧内に示す。「r」値は、すべての試験における正相関を示す。これに基づいて、HOG1のアンチセンス抑制は、葉バイオマスおよび種子収量に寄与する主要パラメータの増加をもたらすことが予測され得る。
1植物当たりの分げつ数に基づいて、各トランスジェニック系統内で、植物を「高」、「中」、および「低」としてグループ分けした。1植物当たりの分げつ、円錐花、および種子の総数は、平均±標準偏差として表した。各植物において完全充実穀粒のみを数えた。葉面積値は、1枚の葉の面積を表す。各植物の第2の分げつの完全に展開した第2の葉を指示パラメータとして測定した。生重量決定は、抜根された全植物に対してであり、選抜された植物のみを異なる系統に対して測定した。
本発明者らは、SEQ ID NO:2の単離されたポリヌクレオチドを使用して、植物における形質を調整する可能性を有する方法を示した。本明細書に開示された方法は、単位耕作面積当たりの農業生産性および穀粒収量を高めることができる.本明細書に開示された方法は、まぐさにおけるバイオマス生産を高め、葉菜および観葉植物における分枝を増加させるのに有用である。本明細書に開示された単離されたポリヌクレオチドは、単子葉植物および双子葉植物の両方に投与して、作物改良および別の商業的および科学的用途に有用な、調整された形質を有する植物を生成することができる。
Claims (36)
- 植物における少なくとも1つの形質の発現を調整する方法であって、
該植物による少なくとも1つのポリペプチドの発現を調整するステップを含み、
該ポリペプチドが、
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド、
から成る群から選択され、
該ポリペプチドの発現の該調整が、該植物における少なくとも1つの形質の発現を調整する、
方法。 - 前記植物による少なくとも1つのポリペプチドの発現を調整する前記ステップが、該ポリペプチドの発現を調整するポリヌクレオチドを該植物の1つ以上の細胞に導入するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの発現を調整する前記ステップが、該ポリペプチドの発現を減少させるステップを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記植物による前記ポリペプチドの発現を減少させる前記ステップが、該ポリペプチドの発現を減少させるポリヌクレオチドを該植物の1つ以上の細胞に導入するステップを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、
i)SEQ ID NO:15に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される少なくとも15個の連続した核酸残基を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iv)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成るポリヌクレオチドに相補的な核酸配列から選択される、少なくとも9個の連続した核酸残基
を含む核酸配列を含む、RNA干渉ポリヌクレオチド、および
v)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、請求項4に記載の方法。 - 前記ポリペプチドが、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有し、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記ポリペプチドが、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の配列相同性を有し、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、請求項1から6のうちのいずれか1項に記載の方法。 - 前記ポリペプチドが、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列相同性を有し、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、請求項1から6のうちのいずれか1項に記載の方法。 - 前記ポリペプチドが、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列相同性を有し、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、請求項1から6のうちのいずれか1項に記載の方法。 - 前記ポリペプチドの発現を調整する前記ステップが、該ポリペプチドの発現を増加させるステップを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記植物による前記ポリペプチドの発現を増加させる前記ステップが、該ポリペプチドの発現を増加させるポリヌクレオチドを該植物の1つ以上の細胞に導入するステップを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、
i)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7 、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、および
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド
から成る群から選択される、請求項11に記載の方法。 - 植物における前記の少なくとも1つの形質が、草高、植物バイオマス、頂芽の発達、分枝、稔性、開花、葉面積、老化、種子発芽、種子収量、種子重量、茎の発達、穀粒収量、分げつ数、花分裂組織の発達、および根の発達のうちのいずれか1つから成る群から選択される、請求項1から12のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの形質の前記調整が、前記ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、前記植物の分枝の増加、種子収量の増加、植物バイオマスの増加、穀粒収量の増加、分げつ数の増加、葉面積の増加、種子発芽の遅延、頂芽優勢の減少、遅咲き、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか1つから成る群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 少なくとも1つの形質の前記調整が、前記ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、前記植物の早咲き、矮性、葉数の減少、早期老化、早期種子発芽、ロゼット葉形成の遅延および減少、実生根の成長の増加、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか1つから成る群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 単離されたポリヌクレオチドであって、
i)SEQ ID NO:15に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iv)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも9個の連続した核酸残基
を含む核酸配列を含む、RNA干渉ポリヌクレオチド、および
v)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を減少させることができる、ポリヌクレオチド、または
vi)i)からv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vii)i)からv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチド。 - 単離されたポリヌクレオチドであって、
i)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、および
iv)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列から成る、ポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を増加させることができる、ポリヌクレオチド、または
v)i)からiv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vi)i)からiv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチド。 - 請求項16または17のうちのいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項18に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
- 請求項19に記載の宿主細胞を含む、植物。
- 遺伝子導入植物を産生する方法であって、
(a)ポリペプチドの発現を調整するポリヌクレオチドを提供するステップであって、該ポリペプチドが、
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド
から成る群から選択される、ステップと、
(b)ステップ(a)の該ポリヌクレオチドで植物、植物部位、または植物細胞を形質転換するステップと、
(c)形質転換した該植物、該植物部位、または該植物細胞を成長させて、該遺伝子導入植物を産生するステップと
を含む、方法。 - ステップ(a)における前記ポリヌクレオチドが、
i)SEQ ID NO:15に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、および
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iv)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも9個の連続した核酸残基
を含む核酸配列を含む、RNA干渉ポリヌクレオチド、および
v)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を調整することができる、ポリヌクレオチド、または、
vi)i)からv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vii)i)からv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、単離されたポリヌクレオチド
を含む、請求項21に記載の方法。 - ステップ(a)における前記ポリヌクレオチドが、
i)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
iv)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列から成る、ポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を増加させることができる、ポリヌクレオチド、または、
v)i)からiv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vi)i)からiv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、単離されたポリヌクレオチド
を含む、請求項21に記載の方法。 - ステップ(c)における前記成長が、前記の形質転換した植物、植物部位、または植物細胞の成長を可能にする条件下で、形質転換した該植物、該植物部位、または該植物細胞を培養することによる、請求項21〜23のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物部位が、根、茎、葉、花芽、花、シュート、種子、および枝から成る群から選択される、請求項21〜24のうちのいずれか1項に記載の方法。
- 単子葉植物または双子葉植物である、請求項20に記載の植物。
- オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草から成る群から選択される、請求項20または26に記載の植物。
- 植物が、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草から成る群から選択される、請求項21〜25のうちのいずれか1項に記載の方法によって産生される遺伝子導入植物。
- 植物が、稔性植物を産生することができる、請求項21〜25のうちのいずれか1項に記載の方法によって産生される遺伝子導入植物。
- 請求項26〜29のうちのいずれか1項に記載の植物の部位または種子。
- 根、茎、葉、花芽、花、シュート、種子、塊茎、実、および枝から成る群から選択される、請求項30に記載の部位。
- 請求項26〜29のうちのいずれか1項に記載の植物、または請求項30もしくは31に記載の部位または種子から再生された、植物またはその繁殖材料。
- 植物バイオマス生産のための、請求項16または17に記載のポリヌクレオチドで形質転換した植物の使用法。
- 前記植物が、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草から成る群から選択される、請求項33に記載の使用法。
- 前記植物バイオマス生産が、生物燃料生産のためである、請求項33または34に記載の使用法。
- 単離されたポリペプチドであって、
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および、
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド、
から成る群から選択される、単離されたポリペプチドであって、
該ポリペプチドの発現の該調整が、該植物における少なくとも1つの形質の発現を調整する、単離されたポリペプチド。
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