ES2349151T3 - Plantas que tienen caracteristicas de crecimiento mejoradas y metodo para su elaboracion. - Google Patents

Abstract

Método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta con relación a las correspondientes plantas de control de tipo silvestre, que comprende la introducción y expresión de una construcción genética que contiene un ácido nucleico que codifica una Quinasa Tipo Receptora que incluye un dominio de quinasa citoplasmática, un dominio transmembrana y al menos uno pero no más de tres dominios de Repetición Ricos en Leucina en el dominio extracelular, y seleccionar las plantas que tienen mayor rendimiento de semillas.

Description

La presente invención se relaciona en general con el campo de la biología molecular y tiene que ver con un método para mejorar las características de crecimiento de una planta. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta incrementando la expresión y/o la actividad de un receptor quinasa LRR (RLK827) o un homólogo del mismo en una planta. La presente también se relaciona con plantas que tienen mayor expresión de un ácido nucleico que codifica un receptor quinasa LRR o un homólogo del mismo, donde dichas plantas tienen mayor rendimiento de semilla con respecto a las plantas correspondientes de tipo silvestre. La invención también provee construcciones útiles en los métodos de la invención.

En razón a una población mundial siempre creciente y a la disminución del área de las tierras disponibles para la agricultura, sigue siendo un objetivo fundamental para la investigación en agricultura el mejoramiento de la eficiencia en las prácticas agricultura y el incremento de la diversidad de las plantas en horticultura. Los medios convencionales para mejoras hortícolas y de los cultivos utilizan técnicas selectivas de reproducción para identificar las plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas selectivas de reproducción tienen varios inconvenientes, a saber, que esas técnicas son típicamente de mano de obra intensiva y resultan en plantas que contienen a menudo complementos genéticos heterogéneos que no siempre resultan en la trasmisión del rasgo deseable por parte de las plantas madre. Los avances en biología molecular le han permitido al género humano manipular el germoplasma de animales y de plantas. La modificación por ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y la manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Tal tecnología ha conducido al desarrollo de plantas que tienen diferentes rasgos hortícolas, agronómicos o económicos mejorados. Los rasgos de interés económico particular son características de desarrollo tales como una alta productividad. Normalmente se define la productividad como la producción medible de valor económico de un cultivo. Esta puede ser definida en términos de cantidad y/o de calidad. La productividad depende directamente de diferentes factores, por ejemplo, del número y tamaño de los órganos, de la arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), de la producción de semilla y más. El desarrollo de la raíz, la absorción de nutrientes y la tolerancia al estrés pueden ser también factores importantes para la determinación de la productividad. Se puede incrementar por lo tanto la productividad del cultivo optimizando uno de los factores anteriormente mencionados.

El crecimiento y desarrollo de las plantas está determinado por señales internas y ambientales, tales como la señalización mediada por hormonas, la señalización por estrés y por nutrientes, el control del ciclo celular o señalización por desarrollo. Las células perciben estas señales a través de receptores de la superficie de la célula, que transducen la señal al interior de la célula. Muchos de estos receptores son proteína quinasas. Las proteína quinasas incluyen una gran familia de enzimas que median la respuesta de células eucariotas a estímulos por fosforilación de hidroxiaminoácidos. Las enzimas pertenecen a dos clases amplias con respecto a su especificidad por el sustrato: enzimas específicas para serina/treonina o específicas para tirosina. Las quinasas involucradas en la transducción de la señal se pueden clasificar en diferentes familias que son en su

2

mayoría de tirosina quinasas. Los Receptores Tirosina Quinasa (RTK por sus siglas en inglés) en animales tienen una estructura uniforme y están compuestos de un domino extracelular para enlazamiento del ligando, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático de tirosina quinasa. Entre las tirosina quinasas de la planta, las proteínas Quinasa tipo Receptoras (RLK por sus siglas en inglés) tienen un lugar destacado. Se conocen más de 600 RLK diferentes en las plantas. Tiene una estructura similar a los RTK de los animales. En la Fig. 1 figura una clasificación (Shiu y Bleecker, Proc. Natl. Acad. Sci USA 98, 10763 -10768, 2001). Se han caracterizado diferentes proteínas RLK de la planta, por ejemplo BRI1 (señalización brasinoide), CLV1 (diferenciación del meristemo), HAESA (abscisión de los órganos florales), XA21 (detección de hongos) CR4 (desarrollo de hojas y de endospermo), FLS2 (detección de flagelina/patógeno), SRK (autoincompatibilidad), entre otras (Becraft, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 163 -192, 2002; Diévart y Clark, Curr. Opin. Plant Biol. 6, 507 -516). Aproximadamente 200 de las RLK de plantas poseen una Repetición Rica en Leucina (LRR). Las LRR son motives de la secuencia de 23 a 25 residuos, que incluyen una secuencia de consenso LxxLxLxxN/CxL en donde x puede ser cualquier aminoácido. Estas LRR están presentes en proteínas con diversas funciones, tales como interacciones receptor hormona, inhibición enzimática, adhesión celular y el tráfico celular, y frecuentemente, se organizan los dominios del LRR en arreglos en tándem. Se ha demostrado que las LRR pueden ser críticas para la morfología y la dinámica del citoesqueleto. La función primaria de estos motivos parece ser la de suministrar un marco estructural versátil para la formación de interacciones proteína -proteína (Kobe y Kajava, Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 725 -732, 2001).

La combinación de Repeticiones Ricas en Leucina y de dominios de quinasa es característica para proteínas receptoras que medien señales externas dentro de la célula. Se piensa que actúan por medio de un mecanismo en el cual el(los) dominio(s) de la LRR, sobre todo extracelular(es), actúa(n) como un sensor(es) para una señal extracelular mientras que el dominio de quinasa es usualmente interno y participa en la transducción de la señal por medio de la fosforilación de objetivos intracelulares iniciando así la transducción de la señal. Las RLK han sido implicadas en las plantas en una variedad de procesos como el desarrollo de la planta, la resistencia a las enfermedades o autoincompatibilidad. En esta invención se demuestra que las características de crecimiento de una planta, y en particular la productividad, pueden ser mejoradas por medio de modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un RLK.

La solicitud internacional de patente WO 03/072763 divulga un receptor tipo quinasa que, cuando se sobreexpresa en plantas, resulta en un mayor crecimiento de la planta y de producción de semillas. Sin embargo, la proteína objetivo RLK no incluía ninguno de los dominios de la LRR en su dominio no citoplasmático, pero en vez de eso este dominio era rico en Prolina. Otra divulgación (WO 00/04761) reportó que por la sobreexpresión del receptor quinasa RKN, se mejoró el crecimiento de la raíz. En forma similar, se sugirió, pero no se muestra, en WO 98/59039 que la sobreexpresión del receptor quinasa BRI1 resultaría en una productividad modulada. Sin embargo, la RLK utilizada en los últimos dos casos incluye 22 dominios de la LRR en el dominio no citoplasmático, típico para la subfamilia LRR-X de las quinasas tipo receptor. Hasta el momento no existen reportes que muestren o que incluso sugieran que las quinasas tipo receptoras de la subfamilia LRR-I puedan ser útiles para mejorar las características de crecimiento de la planta, y en particular en una mayor productividad.

Se ha encontrado sorprendentemente ahora que una mayor expresión y/o actividad, con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre de una proteína RLK827 en las plantas produce plantas que tienen mejores características de crecimiento, y en particular mayor

3

productividad.

RLK827 es una quinasa tipo receptora que está estructuralmente relacionada con LRRPK, que es un miembro de la subfamilia LRR-I de quinasas tipo receptoras (Shiu y Bleecker, 2001). La proteína RLK827 madura tiene, partiendo del terminal N, un largo dominio no citoplasmático putativo, un dominio transmembrana único y un dominio de quinasa en la parte citoplasmática del terminal C. Las quinasas tipo receptoras se clasifican de acuerdo con la composición de su dominio no citoplasmático, que puede incluir secuencias ricas en prolina, dominios de lectina, dominios de la LRR, repeticiones EGF, repeticiones TNFR, dominios de taumatina o aglutinina, etc. Un gran grupo de quinasas tipo receptoras tienen Repeticiones Ricas en Leucina (LRR) en el dominio no citoplasmático. Las diferentes subfamilias LRR difieren entre sí en el número y en la posición de esas repeticiones ricas en leucina (para una visión general, ver Shiu y Bleecker, 2001). El dominio putativo no citoplasmático de RLK827 se caracteriza por la presencia de uno hasta tres dominios en tándem de repeticiones ricas en leucina en su parte terminal C; RLK827 pertenece por lo tanto a la subfamilia de receptor quinasas LRR-I. Las diferentes subfamilias de la LRR de receptores quinasa también se diferencian entre sí en su distribución cromosómica. A menudo están dispuestos en repeticiones en tándem. Las duplicaciones en tándem, las duplicaciones a gran escala y los reordenamientos de los cromosomas son, al menos en parte, responsables por la evolución y expansión de las quinasas tipo receptoras LRR en las plantas. Por lo tanto, con unas pocas excepciones, los receptores quinasa LRR-I se distribuyen sobre los cromosomas I, II y III en Arabidopsis.

De acuerdo con una modalidad de la presente invención se provee un método para mejorar el rendimiento de semilla de una planta que comprende incrementar la expresión y/o la actividad de un polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo y opcionalmente la selección de plantas que tienen mejor rendimiento de semilla.

Convenientemente, el desempeño de los métodos de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen mejor rendimiento de semilla con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre. Preferiblemente, el rendimiento mejorado de semilla incluye un mayor número de semillas (llenas), un mayor peso total de las semillas y un mayor índice de cosecha.

El término “mayor rendimiento” como se define aquí pretende significar un incremento en uno o más de los siguientes, cada uno con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre: (i) mayor biomasa (peso) de una o más partes de una planta, particularmente las partes que están por encima del suelo (cosechables), mayor biomasa de raíces o mayor biomasa de cualquier otra parte cosechable; (ii) mayor rendimiento total de semillas, que incluye un incremento en la biomasa de las semillas (peso de las semillas) y que puede ser un incremento en el peso de las semillas por planta o con base en una semilla individual; (iii) mayor número de semillas (llenas); (iv) mayor tamaño de las semilla; (v) mayor volumen de las semillas, (vi) mayor área de las semillas individuales; (vii) mayor longitud de las semillas individuales; (viii) mayor índice de cosecha, que se expresa como la proporción del rendimiento de las partes cosechables, tal como semillas, sobre la biomasa total; (ix) mayor número de floretes por panícula que se extrapola del número total de semillas contabilizadas y del número de panículas primarias; y (x) mayor peso de mil granos (TKW), que se extrapola a partir del número de semillas llenas contabilizadas y su peso total. Un mayor TKW puede resultar de un mayor tamaño de la semilla (largo, ancho o ambos) y/o mayor peso de la semilla. Un mayor TKW puede resultar de un incremento en el tamaño del embrión y/o el tamaño del endospermo.

Tomando al maíz como ejemplo, un mayor rendimiento puede manifestarse como uno o más de los siguiente: un incremento en el número de plantas por hectárea o por acre, un incremento en el

4

número de espigas por planta, un incremento en el número de hileras, en el número de granos por hilera, en el peso del grano, TKW, en la longitud/diámetro de las espigas, entre otros. Tomando al arroz como ejemplo, un mayor rendimiento puede manifestarse como un incremento en uno o más de los siguiente: en el número de plantas por hectárea o por acre, en el número de panículas por planta, en el número de espiguillas por panícula, en el número de flores por panícula, un incremento en la tasa de llenado de la semillas, un incremento en TKW, entre otros. Un incremento en el rendimiento puede resultar también en una arquitectura modificada, o puede ocurrir como resultado de una arquitectura modificada.

El desempeño de los métodos de la presente invención resulta en plantas que tienen mayor rendimiento de semilla. Preferiblemente, un incremento en el rendimiento de semilla incluye un incremento en uno o más entre el número de semillas llenas, el peso total de la semilla, y el índice de cosecha, cada uno con relación a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de semilla de una planta, el cual comprende incrementar la expresión y/o la actividad en una planta de un polipéptido RLK827 o de un homólogo del mismo.

Ya que las plantas modificadas de acuerdo a la presente invención tienen un mayor rendimiento de semilla, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (al menos durante parte de su ciclo de vida), con relación a la tasa de crecimiento de las correspondientes plantas de tipo silvestre en una etapa correspondiente en su ciclo de vida. La mayor tasa de crecimiento puede ser específica para una o más partes de una planta o tipos de células (incluidas las semillas), o puede ser sustancialmente a través de la planta completa. Las plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede ser entendido como el tiempo necesario para crecer a partir de una semilla madura seca hasta la etapa en la cual la planta ha producido semillas maduras secas, en forma similar al material de partida. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tales como el vigor inicial, la tasa de crecimiento, el período de floración y la velocidad de maduración de la semilla. Un incremento en la tasa de crecimiento puede presentarse en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o sustancialmente durante el ciclo de vida completo de la planta. Una mayor tasa de crecimiento durante las primeras etapas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar un vigor mejorado. El incremento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo que las plantas sean sembradas más tarde y/o cosechadas más pronto de lo que sería posible. Si se incrementa suficientemente la tasa de crecimiento, se posibilitaría la siembra de más semillas de la misma especie de planta (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por la siembra y cosecha de más plantas de arroz todo dentro de un período de crecimiento convencional). En forma similar, si se incrementa suficientemente la tasa de crecimiento, se posibilitaría la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de soja, patatas o cualquier otra planta adecuada). Puede ser posible entonces realizar varias cosechas del mismo rizoma en el caso de algunas plantas. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la producción anual de biomasa por acre (debido a un incremento en el número de veces (digamos en un año) que puede ser cultivada y cosechada una planta particular). Un incremento en la tasa de crecimiento puede permitir también en cultivo de plantas transgénicas en áreas geográficas más amplias que sus contrapartes de tipo silvestre, ya que las limitaciones territoriales para el desarrollo de un cultivo a menudo están determinadas por condiciones ambientales adversas ya sea en el momento de la siembra

5

(comienzo de la temporada) o al momento de la cosecha (fin de la temporada). Tales condiciones adversas pueden ser evitadas si se acorta el ciclo de la cosecha. La tasa de crecimiento puede estar determinada por diferentes parámetros que se derivan de las gráficas de las curvas de crecimiento de experimentos de crecimiento; tales parámetros pueden ser: T Medio (el tiempo que le toma a las plantas alcanzar el 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que le toma a las plantas el 90% de su tamaño máximo), entre otros.

La ejecución de los métodos de la invención produce plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para incrementar la tasa de crecimiento de las plantas, el cual comprende un incremento en la expresión y/o en la actividad en una planta de un polipéptido RLK827 o de un homólogo del mismo.

Un incremento en el rendimiento y/o en la tasa de crecimiento de la semilla se presenta ya sea que la planta se encuentre bajo condiciones no estresantes o que la planta esté expuesta a diferentes tipos de estrés comparado con las plantas de control. Las plantas responden típicamente a la exposición al estrés desarrollándose más lentamente. En condiciones de estrés severo, la planta puede incluso detener su crecimiento completamente. Por otro lado se define aquí un estrés moderado como un tipo de estrés al cual está expuesta una planta que no conduce a que la planta deje de crecer completamente sin la capacidad para reanudar el crecimiento. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con pesticidas) no se encuentran a menudo estreses severos en plantas de cultivo. En consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por un estrés moderado es a menudo una característica indeseable para la agricultura. Los estreses moderados son los estreses típicos a los cuales puede estar expuesta una planta. Estos estreses pueden ser los estreses bióticos y/o abióticos diarios (ambientales) a los cuales está expuesta una planta. Los estreses ambientales o abióticos típicos incluyen estreses por temperatura causados por un calentamiento atípico o temperaturas frías/congelantes; estrés por salinidad; estrés por agua (sequía o exceso de agua). Los estreses abióticos pueden ser causados también por compuestos químicos. Los estreses bióticos son típicamente aquellos estreses provocados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos.

Las características de crecimiento anteriormente mencionadas de rendimiento de semilla pueden ser modificadas convenientemente en cualquier planta.

El término “planta” como se lo utiliza aquí abarca a plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y partes de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluidos tubérculos), flores, y tejidos y órganos, en donde cada uno de los anteriormente mencionados incluye al gen/ácido nucleico de interés o la modificación específica en el gen /ácido nucleico de interés. El término “planta” también abarca células vegetales, cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas, nuevamente donde cada uno de los anteriormente mencionados incluyen al gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen algas, helechos y todas las plantas que pertenecen a la superfamilia de Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles, o arbustos seleccionados de la lista que comprende Abelmoschus spp., Acer spp., Actinidia spp., Agropyron spp., Allium spp., Amaranthus spp., Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena sativa, Averrhoa carambola, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp., Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp.,

6

Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carthamus tinctorius, Carya spp., Castanea spp., Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Cola spp., Colocasia esculenta, Corylus spp., Crataegus spp., Cucumis spp., Cucurbita spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Eleusine coracana, Eriobotrya japonica, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp., Gossypium hirsutum, Helianthus spp., Hibiscus spp., Hordeum spp., Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lemna spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Macrotyloma spp., Malpighia emarginata, Malus spp., Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Persea spp., Petroselinum crispum, Phaseolus spp., Phoenix spp., Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Rubus spp., Saccharum spp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Solanum spp., Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp., Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.

De acuerdo a una característica preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo que incluye soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata o tabaco. Más preferiblemente, la planta de acuerdo con la presente invención es una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, lo más preferible un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, mijo, cebada, centeno, avena o sorbo.

La actividad de una proteína RLK827 puede ser incrementada incrementando los niveles del polipéptido RLK827. Alternativamente, también se puede incrementar la actividad cuando no existen cambios en los niveles de una RLK827, o incluso cuando existe una reducción en los niveles de una RLK827. Esto puede presentarse cuando se alteran las propiedades intrínsecas del polipéptido, por ejemplo elaborando un mutante o seleccionando una variante que sea más activa que el tipo silvestre.

El término “RLK827 o un homólogo de la misma” como se define aquí se refiere a una Quinasa Tipo Receptora (RLK) que tiene actividad de quinasa y que incluye en su forma madura un dominio no citoplasmático (dominio extracelular), un dominio transmembrana único y un dominio putativo de quinasa citoplasmática. El dominio no citoplasmático o RLK827 incluye al menos 1 pero no más de 3 dominios de Repetición Rica en Leucina (LRR), preferiblemente están presentes dos dominios de la LRR, más preferiblemente tres dominios de la LRR. Más preferiblemente, la longitud del dominio no citoplasmático está en el rango entre 250 y 550 aminoácidos. El dominio no citoplasmático preferiblemente incluye el motivo de la secuencia de aminoácidos LRxFP(E/D)GxRNC(Y/F) (SEQ ID NO: 33), en donde x puede ser cualquier aminoácido y donde se pueden reemplazar hasta otros 2 aminoácidos más por medio de una sustitución conservada como la enlistada en la Tabla 2. Preferiblemente, el primer x en este motive es Y o A, y el segundo x es preferiblemente uno entre V, F, E y A.

El término "RLK827 o un homólogo de la misma" también se refiere a secuencias de aminoácidos que tienen en orden creciente de preferencia al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%,

7

48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad total de secuencia con el aminoácido representado por la SEQ ID NO: 2.

El término "RLK827 o un homólogo de la misma" incluye RLK827 (SEQ ID NO 2), sus parálogos y ortólogos. La identidad total de secuencia se determina utilizando un algoritmo de alineación global, tal como el algoritmo de Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), utilizando ajustes predeterminados de parámetros.

Los diferentes dominios estructurales en una proteína RLK827 pueden ser identificados utilizando bases de datos especializadas por ejemplo SMART (Schultz y colaboradores. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857 -5864; Letunic y colaboradores. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242 244; http://smart.embl-heidelberg.de/) o Pfam (Bateman y colaboradores, Nucleic Acids Research 30(1): 276 -280 (2002), http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/).

El dominio de quinasa es de una de tipo STYKc (SMART, número de acceso SM00221, InterPro, número de acceso IPR004040), y posiblemente tiene actividad de Ser/Thr/Tyr quinasa. En el extremo N terminal del dominio catalítico existe un tramo de residuos rico en glicina en cercanías del residuo de lisina, que se ha demostrado que está involucrado en el enlazamiento de ATP. En la parte central del domino catalítico existe un residuo conservado de ácido aspártico, que es importante para la actividad catalítica de la enzima.

Adicionalmente, los dominios de la LRR son bien conocidos en el arte y están definidos en Pfam (acceso PF00560) como motivos de secuencia de 20 a 29 residuos presentes en arreglos en tándem en una cantidad de proteínas con diversas funciones, tales como interacciones receptor hormona, inhibición de la enzima, adhesión celular y tráfico celular. Estudios recientes revelan la participación de proteínas de la LRR en el desarrollo temprano de mamíferos, desarrollo neutro, polarización celular, regulación de la expresión génica y señalización de apoptosis. La función primaria de estos motivos parece ser el de suministrar un marco estructural versátil para la formación de interacciones proteína-proteína. Los análisis de secuencia de las proteínas de la LRR sugieren la existencia de varias subfamilias diferentes de las LRR. Aparentemente las repeticiones de diferentes subfamilias nunca ocurren simultáneamente y más probablemente evolucionan independientemente. Sin embargo, todas las clases principales de la LRR parecen tener estructuras curvas de herradura con una lámina beta paralela sobre el lado cóncavo y principalmente elementos helicoidales sobre el lado convexo. Al menos seis familias de proteínas de la LRR, caracterizadas por diferentes longitudes y secuencias de consenso de las repeticiones, han sido identificadas. Once segmentos residuales de las LRR (LxxLxLxxN/CxL), correspondientes a la hebra β y regiones bucle adyacentes, están usualmente conservadas en proteínas de la LRR, mientras que las partes restantes de las repeticiones pueden ser muy diferentes. A pesar de las diferencias, cada una de estas variables contiene dos medias vueltas en ambos extremos y un segmento “lineal” (mientras la cadena sigue un camino lineal general), usualmente formado por una hélice, en el medio. La cara cóncava y los bucles adyacentes son las superficies más comunes de interacción de la proteína sobre proteínas de la LRR. Las estructuras en tridimensional de algunos complejos ligando-proteína de la LRR muestran que la superficie cóncava del dominio de la LRR es ideal para interacción con hélices alfa, soportando así las conclusiones tempranas de que la estructura alargada y curvada de la LRR proporciona un marco excepcional para lograr diferentes interacciones proteína-proteína. El modelamiento molecular sugiere que el patrón LxxLxL, que a menudo se conserva y que es más corto que el previamente propuesto

8

LxxLxLxxN/CxL, es suficiente para impartir la característica curvatura de herradura a las proteínas con repeticiones de 20 a 30 residuos. Los dominios de la LRR de una proteína LRK827 pueden diferir de los dominios cónicos de la LRR conocidos en el arte pero pueden ser identificados por medio de algoritmos adecuados de computador, preferiblemente aquellos utilizados en la base de datos Pfam.

Los dominios transmembrana son aproximadamente de 15 a 30 aminoácidos de largo y están usualmente compuestos de residuos hidrófobos que forman una hélice alfa. Usualmente se los predice con base en la hidrofobicidad (por ejemplo Klein y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 815, 468, 1985; o Sonnhammer y colaboradores, En J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, y C. Sensen, editores, Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pages 175 -182, Menlo Park, CA, 1998. AAAI Press.).

Los métodos para la búsqueda e identificación de homólogos de RLK827 estrían también dentro del ámbito de las personas capacitadas en el arte. Tales métodos incluyen la comparación de las secuencias representadas por la SEQ ID NO: 1 ó 2, en un formato legible por el ordenador, con secuencias que están disponibles en bases de datos públicas tales como MIPS (http://mips.gsf.de/), GenBank (hftp://www.ncbi.nim.nih.gov/Genbank/index.html) o en la Base de Datos de Secuencias de Nucleótidos EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html), utilizando algoritmos bien conocidos en el arte para la alineación o comparación de secuencias, tales como GAP (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48; 443 -453 (1970)), BESTFIT (utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2; 482 -489 (1981))), BLAST (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J., J. Mol. Biol. 215: 403 -410 (1990)), FASTA y TFASTA (W. R. Pearson y D. J. Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 -2448 (1988)). El programa para llevar a cabo el análisis por BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI). Los homólogos mencionados más abajo fueron identificados utilizando los parámetros predeterminados de BLAST (matriz de BLOSUM62, penalización por apertura de brecha 11 y penalización por extensión de la brecha 1) y preferiblemente se utilizan secuencias de longitud completa para el análisis.

Los ejemplos de proteínas que caen bajo la definición de "polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo incluye a las proteínas At1g51850, At1g51805, At1g51810, At2g04300, At3g21340, At1g49100 de Arabidopsis. Debe observarse que una agrupación de quinasas relacionadas tipo receptor putativo están localizadas en tándem sobre el cromosoma 1 de Arabidopsis thaliana, incluidas At1g51800, At1g51805, At1g51810, At1g51820, At1g51830, At1g51840, At1g51850, At1g51860, At1g51870, At1g51880 y At1g51890, de las cuales al menos cuatro de ellas están altamente relacionadas con RLK827.

Debe entenderse que el término polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo no se limita a las secuencias representadas por la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 19, sino que cualquier polipéptido que reúna los criterios de (i) tener un dominio de quinasa citoplasmática y (ii) tener al menos uno pero no más de tres dominios de la LRR y preferiblemente la secuencia de consenso de la SEQ ID NO: 33 en la parte putativa no citoplasmática de la proteína, separado del dominio de la quinasa por medio de una región transmembrana, y cuyo dominio de quinasa incluye la secuencia de consenso STYKc y/o

(iii) ser un parálogo u ortólogo de RLK827 y tener al menos 25% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, puede ser adecuado para uso en los métodos de la invención. Preferiblemente, el domino de quinasa es funcional, lo cual significa que el polipéptido RLK827 o su homólogo tienen actividad de quinasa.

9

Para determinar la actividad de quinasa de RLK827, se encuentran disponibles diferentes ensayos y son bien conocidos en el arte (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes 1 y 2, Ausubel y colaboradores (1994), Current Protocols; o en línea, tal como http://www.protocol-online.org). En resumen, el ensayo de la quinasa generalmente involucra: (1) poner en contacto la proteína quinasa con un sustrato de polipéptido que contiene al sitio objetivo que va a ser fosforilado; (2) permitir la fosforilación del sitio objetivo en un amortiguador apropiado para la quinasa bajo condiciones apropiadas; (3) separar los productos fosforilados del sustrato no fosforilado después de un período adecuado de reacción. La presencia o ausencia de actividad de la quinasa se determina por medio de la presencia o la ausencia del objetivo fosforilado. Además, se pueden realizar mediciones cuantitativas. Se podrían utilizar una proteína purificada RLK827, o extractos celulares que contengan o estén enriquecidos con la proteína RLK827 como fuente para la proteína quinasa. Alternativamente, se podría utilizar la aproximación de Zhao y colaboradores (Plant Mol. Biol. 26, 791 -803, 1994), donde el dominio citoplasmático de una quinasa de arroz tipo receptora fue expresada en Escherichia coli y ensayada por la actividad d quinasa. Como sustrato, son particularmente adecuados péptidos pequeños. El péptido debe incluir uno o más residuos de serina, treonina o tirosina en un motivo del sitio d fosforilación. Una compilación de sitios de fosforilación puede ser encontrada en Biochimica et Biophysica Acta 1314, 191 -225, (1996). Además, los sustratos de péptido pueden tener convenientemente una carga neta positiva para facilitar el enlazamiento con los filtros de fosfocelulosa, (permitiendo la separación de los péptidos fosforilados de los no fosforilados y la detección de los péptidos fosforilados). Si no se conoce un motivo del sitio de fosforilación, se puede utilizar un sustrato general de Ser/Thr quinasa. Por ejemplo, “péptido relacionado con Src” (RRLIEDAEYAARG) es un sustrato para muchas tirosina quinasas receptoras y no receptoras. Para determinar los parámetros cinéticos para la fosforilación del péptido sintético, se requiere un rango de concentraciones de péptido. Para las reacciones iniciales, se puede utilizar una concentración de péptido de 0,7 -1,5 mM. Para cada enzima quinasa, es importante determinar el amortiguador óptimo, la fuerza iónica, y el pH para la actividad. Un Amortiguador estándar para Quinasa 5x generalmente contiene 5 mg/ml de BSA (Albúmina de Suero Bovino que evita la absorción de la quinasa al tubo de ensayo), Tris-Cl 150 mM (pH 7,5), MgCl2 100 mM. Se requieren cationes divalentes para la mayoría de las tirosina quinasas, aunque algunas tirosina quinasas (por ejemplo, receptores quinasas de insulina, de IGF-1, y de PDGF) requieren MnCl2 en vez de MgCl2 (o además de MgCl2). Las concentraciones óptimas de cationes divalentes se deben determinar empíricamente para cada proteína quinasa. Un donante comúnmente utilizado del grupo fosforilo es ATP marcado en forma radioactiva con [gama-32P] (normalmente con una concentración final de 0,2 mM). La cantidad de 32P incorporada en los péptidos se puede determinar midiendo la actividad sobre las almohadillas secas de nitrocelulosa en un contador de centelleo.

Alternativamente, se puede analizar la actividad de un polipéptido RLK827 o de un homólogo del mismo por medio de la expresión del polipéptido RLK827 o de un homólogo del mismo bajo el control de un promotor GOS2 de arroz en plantas de arroz, y en particular en la variedad de arroz Nipponbare, que resulta en plantas con mayor rendimiento comparadas con las correspondientes plantas de tipo silvestre. Este incremento en rendimiento se puede medir por ejemplo como uno o más entre un incremento en el número de semillas llenas, en el peso total de las semillas y/o en el índice de cosecha.

El ácido nucleico que codifica un polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo puede ser cualquier ácido nucleico natural o sintético. Un polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo como

10

se definió aquí son codificados por una molécula de ácido nucleico RLK827. Por lo tanto el término "molécula de ácido nucleico RLK827" o "gen para RLK827" como se definió aquí es cualquier molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo como se definió anteriormente. Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico para RLK827 incluyen a aquellas representadas por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31. Los ácidos nucleicos para RLK827 y las variantes funcionales de los mismos pueden ser adecuados en la realización de los métodos de la invención. La variante funcional de los ácidos nucleicos para RLK827 incluye porciones de una molécula de ácido nucleico RLK827 y/o ácidos nucleicos capaces de hibridar con una molécula de ácido nucleico RLK827 o con una molécula de ácido nucleico que codifica un homólogo de RLK827. El término "funcional" en el contexto de una variante funcional se refiere a una variante de una molécula de ácido nucleico RLK827 (es decir una porción o una secuencia de hibridación), que codifica un polipéptido que tiene actividad de quinasa e incluye un dominio no citoplasmático (extracelular), el cual incluye al menos 1 pero no más de 3 motivos de la LRR y preferiblemente también al motivo de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 como se definió anteriormente, y un dominio de quinasa C terminal que está separado del dominio no citoplasmático por medio de un dominio transmembrana.

La LRR-I del tipo de las quinasas tipo receptoras en plantas tiene una estructura modular, y se ha demostrado que una proteína LRR es capaz de enlazar diferentes ligandos, por ejemplo el receptor SR160 del tomate y su homólogo tBRI1 del tomate son capaces de enlazar las hormonas brasinólida y sistemina, un péptido de señalamiento de larga distancia. La brasinólida y la sistemina no compiten por el enlazamiento, sugiriendo que ellas se enlazan a diferentes sitios. Por lo tanto, está previsto que la modificación por ingeniería genética de los dominios de la LRR (por ejemplo por medio de la alteración del número de dominios de la LRR, o por medio del apilamiento del dominio (enlazamiento al mismo(s) o a diferente(s) ligando(s)), o arrastre del dominio), en tal forma que se retiene o se modifica la actividad de la LRR, es útil en la generación de una variante de moléculas de ácido nucleico para RLK827 para la realización de los métodos de la invención. En forma similar, se puede modificar por ingeniería genética el dominio de la quinasa para mejorar la actividad de la quinasa. Un tipo preferido de variante incluye a aquellas generadas por supresión del dominio, apilado

o arrastre (ver por ejemplo He y colaboradores, Science 288, 2360 -2363, 2000, o las patentes estadounidenses 5.811.238 y 6.395.547).

El término porción como se definió aquí se refiere a una pieza de ADN que incluye al menos 150 nucleótidos. Se puede preparar una porción, por ejemplo, hacienda una o más supresiones a un ácido nucleico para RLK827. Se pueden utilizar las porciones en forma aislada o se las puede fusionar a otras secuencias de codificación (o no codificadoras) con el propósito, por ejemplo, de producir una proteína que combina diferentes actividades, siendo una de ellas actividad de proteína quinasa. Cuando se fusiona a otras secuencias de codificación, el polipéptido resultante producido después de la traducción podría ser mayor que el predicho para la porción de RLK827. La porción útil en los métodos de la presente invención incluye al menos el dominio de quinasa, preferiblemente también un dominio de la LRR no citoplasmático y un dominio transmembrana localizado en posición N terminal del dominio de la quinasa, más preferiblemente la porción incluye en el dominio no citoplasmático al menos 1 pero no más de 3 dominios de la LRR, lo más preferible, la porción incluye en el dominio no citoplasmático al menos 1 pero no más de 3 dominios de la LRR y el motivo de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 como se definió anteriormente. Preferiblemente, la porción

11

funcional es una porción de un ácido nucleico como la representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO:

18.

El término “hibridación” como se define aquí es un proceso en donde secuencias complementarias de nucleótidos sustancialmente homólogas se aparean entre sí. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución, es decir ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El proceso de hibridación puede presentarse también con uno de los ácidos nucleicos complementarios y movilizados a una matriz tal como partículas magnéticas, partículas de Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede presentarse además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon o inmovilizado, por ejemplo, por medio de fotolitografía, por ejemplo, a un soporte de vidrio silíceo (este último conocido como arreglos o microarreglos de ácido nucleico o como chips de ácido nucleico). Con el propósito de permitir que ocurra la hibridación, generalmente se desnaturalizan térmica o químicamente las moléculas de ácido nucleico para fundir una cadena doble en donde cadenas sencillas y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración de sal, la fuerza iónica y la composición del amortiguador de hibridación.

Las “condiciones rigurosas de hibridación” y “las condiciones rigurosas de lavado de hibridación” en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tales como las hibridaciones tipo Southern y Northern son dependientes de la secuencia y son diferentes bajo parámetros ambientales diferentes. La persona capacitada es consciente de diferentes parámetros que pueden ser alterados durante la hibridación y el lavado y que o bien mantendrán o cambiaran las condiciones rigurosas.

La Tm es la temperatura bajo una fuerza iónica y pH definidos, a la cual 50% de la secuencia objetivo hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La Tm depende de las condiciones de la solución y de la composición de la base y de la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. La tasa máxima de hibridación se obtiene aproximadamente desde 16ºC hasta 32ºC por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electroestática entre las dos cadenas de ácido nucleico promoviendo así la formación del híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio hasta de 0,4 M. La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 a 0,7ºC por cada porcentaje de formamida, y la adición de 50% de formamida permite que se lleve a cabo la hibridación entre 30 y 45ºC, aunque la tasa de hibridación será menor. La falta de correspondencia de pares de bases reduce la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para sondas largas, la Tm disminuye aproximadamente 1ºC por % de falta de correspondencia de las bases. La Tm se puede calcular utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:

• híbridos de ADN -ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267 -284, 1984):

Tm = 81,5ºC + 16,6 x log[Na+]a + 0,41 x %[G/Cb] -500 x [Lc]-1 -0,61 x % de formamida

• híbridos de ADN -ARN o de ARN -ARN:

Tm = 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (% de G/Cb) + 11,8 (% de G/Cb)2 -820/Lc

• híbridos de oligo-ADN u oligo-ARNd: Para < 20 nucleótido:

12

Tm= 2 (/n)

Para 20-35 nucleótidos:

Tm= 22 + 1,46 (/n)

a o para otro catión monovalente, pero únicamente preciso en el rango de 0,01 -0,4 M.

5 b únicamente preciso para el % de GC en el rango de 30% a 75%. c L = longitud del dúplex en pares de bases. d Oligo, oligonucleótido; /n, longitud efectiva del iniciador = 2 x (no. de G/C) + (no. de A/T).

Nota: para cada 1% de formamida, se reduce la Tm aproximadamente en 0,6 a 0,7ºC, mientras que la presencia de urea 6 M reduce la Tm aproximadamente en 30ºC.

10 La especificidad de la hibridación es típicamente la función de los lavados posteriores a la hibridación. Para remover las bases resultantes de la hibridación no específica, se lavan las muestras con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de tales lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución final de lavado: entre menos la concentración de sal y más alta la temperatura de lavado, más alta la rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan

15 típicamente en o por debajo de la rigurosidad de hibridación. Generalmente, las condiciones rigurosas adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o los procedimientos de detección de la amplificación génica son como se expuso más arriba. Se pueden seleccionar también condiciones más

o menos rigurosas. Generalmente, se seleccionan condiciones de baja rigurosidad que sean aproximadamente 50ºC menores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica con una 20 fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media son cuando la temperatura está 20ºC por debajo de la Tm, y las condiciones de alta rigurosidad son cuando la temperatura está 10ºC por debajo de la Tm. Por ejemplo, condiciones rigurosas son aquellas que son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones de A -L; y condiciones de rigurosidad reducida son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones de M -R. Se puede controlar el enlazamiento no

25 específico por medio del uso de una cualquiera de las técnicas conocidas, tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteína, adiciones de ARN heterólogo, ADN y SDS al amortiguador de hibridación y tratamiento con ARNasa.

Los ejemplos de condiciones de hibridación y de lavado están enlistados en la Tabla 1:

Tabla 1:

Condición de Rigurosidad

Polinucleótido Híbrido ± Longitud del Híbrido (pb) ‡ Temperatura de Hibridación y Amortiguador † Temperatura de Lavado y Amortiguador †

A

ADN:ADN > o igual a 50 65°C 1 X SSC; 42°C, 1 X SSC 50% de formamida o y 65°C; 0,3 X SSC

B

ADN:ADN <50 Tb*; 1 X SSC Tb*; 1 X SSC

C

ADN:ARN > o igual a 50 67°C 1 X SSC; 45°C, 1 X SSC 50% de formamida o y 67°C; 0,3 X SSC

D

ADN:ARN <50 Td*; 1 X SSC Td*; 1 X SSC

E

ARN:ARN > o igual a 50 70°C 1 X SSC; 50°C, 1 X SSC 50% de formamida o y 70°C; 0,3 X SSC

Condición de Rigurosidad

Polinucleótido Híbrido ± Longitud del Híbrido (pb) ‡ Temperatura de Hibridación y Amortiguador † Temperatura de Lavado y Amortiguador †

F

ARN:ARN <50 Tf*; 1 X SSC Tf*; 1 X SSC

G

ADN:ADN > o igual a 50 65°C 4 X SSC; o 45°C, 4 X SSC y 50% de formamida 65°C; 1 X SSC

H

ADN:ADN <50 Th*; 4 X SSC Th*; 4 X SSC

I

ADN:ARN > o igual a 50 67°C 4 X SSC; o 45°C, 4 X SSC y 50% de formamida 67°C; 1 X SSC

J

ADN:ARN <50 Tj*; 4 SSC Tj*; 4 X SSC

K

ARN:ARN > o igual a 50 70°C 4 X SSC; o 40°C, 6 X SSC y 50% de formamida 67°C; 1 X SSC

L

ARN:ARN <50 TI*; 2 X SSC TI*; 2 X SSC

M

ADN:ADN > o igual a 50 50°C 4 X SSC; o 40°C, 6 X SSC y 50% de formamida 50°C; 2 X SSC

N

ADN:ADN <50 Tn*; 6 X SSC Tn*; 6 X SSC

O

ADN:ARN > o igual a 50 55°C 4 X SSC; o 42°C, 6 X SSC y 50% de formamida 55°C; 2 X SSC

P

ADN:ARN <50 Tp*; 6 X SSC Tp*; 6 X SSC

Q

ARN:ARN > o igual a 50 60°C 4 X SSC; o 45°C, 6 X SSC y 50% de formamida 60°C.; 2 X SSC

R

ARN:ARN <50 Tr*; 4 X SSC Tr*; 4 X SSC

‡ La “longitud del híbrido” es la longitud anticipada para el ácido nucleico que hibrida. Cuando se hibridan los ácidos nucleicos de secuencia conocida, se puede determinar la longitud del híbrido por medio de la alineación de las secuencias y la identificación de las regiones conservadas descritas aquí. † SSPE (1 X SSPE es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM, y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede ser sustituido por SSC (1 X SSC es NaCl 0,15 M y citrato de sodio 15 mM) en los amortiguadores de hibridación y lavado; se llevan a cabo los lavados durante 15 minutos después de completar la hibridación. Las hibridaciones y los lavados pueden incluir adicionalmente reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0,5 -1,0%, 100 µg/ml de ADN desnaturalizado y fragmentado de esperma de salmón, pirofosfato de sodio al 0,5%, y hasta 50% de formamida. * Tb-Tr: La temperatura de hibridación para híbridos que se anticipó que eran de menos de 50 pares de bases de longitud debe ser 5 -10°C menor que la temperatura de fusión Tm de los híbridos; la Tm se determina de acuerdo a las ecuaciones anteriormente mencionadas. ± La presente invención también abarca la sustitución de una o más parejas de híbridos de ADN o ARN ya sea con un PNA, o un ácido nucleico modificado.

14

Para los propósitos de definir el nivel de rigurosidad, convenientemente se puede hacer referencia a Sambrook y colaboradores (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989).

Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 2 o un homólogo del mismo puede ser utilizado en un experimento de hibridación. Alternativamente se pueden utilizar fragmentos del mismo como sondas. Dependiendo del reservorio de partida de las secuencias a partir de las cuales se va a identificar RLK, se pueden seleccionar diferentes fragmentos para hibridación. Por ejemplo, cuando se desea un número limitado de homólogos con una alta identidad de secuencia con RLK827, se puede utilizar un fragmento menos conservado para hibridación tal como GGTAGACTCGCCAAAGAATTTGAACCACTCGTTGAT (nucleótidos 184 a 219 de la SEQ ID NO: 1). Por medio de la alineación de la SEQ ID NO 2 y homólogos del mismo es posible diseñar fragmentos equivalentes de ácido nucleico útiles como sondas para hibridación. Preferiblemente, la secuencia de hibridación incluye al menos el dominio de quinasa, preferiblemente también un dominio de la LRR no citoplasmático y un dominio transmembrana localizado en el N terminal del dominio de la quinasa, más preferiblemente la porción incluye en el dominio no citoplasmático al menos 1 pero no más de 3 dominios de la LRR, lo más preferible, la porción incluye en el dominio no citoplasmático al menos 1 pero no más de 3 dominios de la LRR y el motivo de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 como se definió anteriormente.

Después de hibridación y lavado, se pueden detectar los dúplex por medio de autorradiografía (cuando se utilizaron sondas marcadas en forma radioactiva) o por medio de quimioluminiscencia, inmunodetección, por detección fluorescente o cromogénica, dependiendo del tipo de marcación de la sonda. Alternativamente, se puede realizar un ensayo de protección de la ribonucleasa para la detección de híbridos de ARN:ARN.

Se puede derivar la molécula de ácido nucleico RLK827 o una variante de la misma a partir de cualquier fuente natural o artificial. Se pueden aislar el ácido nucleico/gen o una variante de los mismos a partir de una fuente microbiana, tal como bacteria, levadura u hongos, o a partir de una fuente vegetal, alga o animal. Este ácido nucleico puede ser modificado a partir de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humanan deliberada. El ácido nucleico es preferiblemente de origen vegetal, ya sea de la misma especie vegetal (por ejemplo de aquella en la cual va a ser introducida) o de una especie vegetal diferente. Se puede aislar el ácido nucleico a partir de una especie dicotiledónea, preferiblemente de la familia Brassicaceae, más preferiblemente de Arabidopsis thaliana. Más preferiblemente, la RLK827 aislada de Arabidopsis thaliana es representada por la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de RLK827 es como la representada por la SEQ ID NO: 2.

Las variantes funcionales útiles en los métodos también incluyen variantes alternativas de empalme de una molécula de ácido nucleico o gen RLK827. El término “variante alternativa de empalme” como se lo utiliza aquí abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la cual han sido cortados, reemplazados o añadidos intrones y/o exones seleccionados. Tales variantes serán aquellas en las cuales se retiene la actividad biológica de la proteína, lo cual puede lograrse reteniendo selectivamente segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser elaboradas por el hombre. Los métodos para elaborar tales variantes de empalme son bien conocidos en el arte. Las variantes de empalme preferidas son variantes de empalme de un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1. También se prefieren variantes de

15

empalme que codifican un polipéptido que retiene actividad de quinasa y que tiene al menos uno pero no más de tres dominios de la LRR en la parte putativa no citoplasmática de la proteína, separado del dominio de quinasa por una región transmembrana. Las variantes de empalme más preferidas incluyen también además el motivo de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 en el dominio putativo no citoplasmático. Las variantes de empalme que son las más preferidas de una molécula de ácido nucleico RLK827 son aquellas que codifican un polipéptido RLK827 como se definió anteriormente.

Las variantes funcionales útiles en los métodos incluyen además variantes alélicas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo, preferiblemente una variante alélica del ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente además, el polipéptido codificado por la variante alélica tiene actividad de quinasa y retiene al menos uno pero no más de tres dominios de la LRR en la parte putativa no citoplasmática de la proteína, separado del dominio de la quinasa por una región transmembrana. Las variantes alélicas más preferidas incluyen también además el motivo de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 en el dominio putativo no citoplasmático. Las variantes de empalme que son las más preferidas de una molécula de ácido nucleico RLK827 son aquellas que codifican un polipéptido RLK827 como se definió anteriormente. Existen variantes alélicas en la naturaleza y comprendido dentro de los métodos de la presente invención está el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas abarcan Polimorfismos de Nucleótidos Únicos (SNP por sus siglas en inglés), así como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Supresión (INDEL por sus siglas en inglés). El tamaño de los INDEL es usualmente menor a 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el grupo más grande de variantes de secuencia en cepas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de los organismos.

La expresión y/o actividad de un polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo pueden ser incrementadas también por medio de la introducción de una modificación genética (preferiblemente en el lugar de un gen RLK827). El lugar de un gen como se define aquí se entiende como una región genómica que incluye al gen de interés y 10 kb secuencia arriba o secuencia debajo de la región de codificación.

Se puede introducir la modificación genética, por ejemplo, por medio de uno (o más) de los siguientes métodos: activación del T-ADN, TILLING, mutagénesis dirigida al sitio, recombinación homóloga, evolución dirigida o por medio de la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo. Después de la introducción de la modificación genética allí sigue una etapa de selección para una mayor expresión y/o actividad de un polipéptido RLK827, en donde el incremento en la expresión y/o en la actividad produce plantas que tienen características de crecimiento mejoradas.

El etiquetado para la activación del T-ADN (Hayashi y colaboradores. Science 258, 1350 1353, 1992) involucra la inserción de T-ADN que usualmente contiene un promotor (puede ser también un reforzador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 KB secuencia arriba o secuencia debajo de la región de codificación de un gen en una configuración tal que dicho promotor dirija la expresión del gen objetivo. Típicamente, se interrumpe la regulación de la expresión del gen objetivo por medio de su promotor natural y el gen cae bajo el control del promotor recientemente introducido. El promotor está típicamente embebido en un T-ADN. Este TADN es insertado en forma aleatoria en un genoma de una planta, por ejemplo, a través de infección de Agrobacterium y conduce a la sobreexpresión de genes cerca al T-ADN insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la sobreexpresión de genes cerca al

16

promotor introducido. El promotor que va a ser introducido puede ser cualquier promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en el organismo deseado, en este caso una planta. Por ejemplo, promotores constitutivos, preferidos por el tejido, preferidos por un tipo de célula y promotores inducibles son todos adecuados para uso en la activación del T-ADN.

Se puede introducir también una modificación genética en el lugar de un gen RLK827 utilizando la técnica de TILLING (Targeted Induced Local Lesions IN Genomes: Lesiones Locales Inducidas Dirigidas en Genomas). Esta es una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar, y para eventualmente aislar variantes de mutagénesis de una molécula de ácido nucleico RLK827 capaz de exhibir actividad de RLK827. TILLING también permite la selección de plantas que portan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden incluso exhibir mayor actividad de RLK827 que aquella exhibida por el gen en su forma natural. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con métodos de selección de alto rendimiento. Las etapas típicamente seguidas en TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei y Koncz (1992), En: C Koncz, N -H Chua, J Schell, eds, Methods in Arabidopsis Research. World Scientific, Singapore, páginas 16 -82; Feldmann y colaboradores, (1994) En: EM Meyerowitz, CR Somerville, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 137 -172; Lightner y Caspar (1998), En: J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, páginas 91 -104); (b) preparación y reunión del ADN de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heterodúplex en un fondo común es detectada como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación mutantes individuales; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. Los métodos para TILLING son bien conocidos en el arte (McCallum Nature Biotechnol. 18, 455 -457, 2000, Stemple Nature Rev. Genet. 5, 145 -150, 2004).

Se puede utilizar la mutagénesis dirigida al sitio para generar variantes de ácidos nucleicos RLK827 o porciones de los mismos que retienen actividad, a saber, actividad de proteína quinasa. Se encuentran disponibles diferentes métodos para lograr una mutagénesis dirigida al sitio siendo los más comunes los métodos con base en la PCR (Ver por ejemplo Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds. http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index. html).

Se puede utilizar evolución dirigida para generar variantes de las moléculas de ácido nucleico RLK827 o porciones de las mismas que codifican polipéptidos RKS11 o RKS4 u ortólogos o porciones de los mismos que tienen una mayor actividad biológica. La evolución dirigida consiste de iteraciones de arrastre de ADN seguidas por selección apropiada y/o selección (Castle y colaboradores, (2004) Science 304(5674): 1151 -4; patentes estadounidenses nos. 5.811.238 y 6.395.547).

La activación de T-ADN, TILLING, la mutación dirigida al sitio y la evolución dirigida son ejemplos de tecnologías que permiten la generación de nuevos alelos y variantes de RLK827 que retienen la función de RLK827 y que son útiles por lo tanto en los métodos de la invención.

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnología estándar utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levadura o el musgo Physcomitrella. Se han descrito métodos para llevar a cabo la recombinación homóloga en plantas no solamente para plantas modelo (Offringa y colaboradores (1990) EMBO J. 9, 3077 -3084) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo, arroz (Terada y colaboradores, (2002)

17

Nature Biotechnol. 20, 1030 -1034; o lida y Terada (2004) Curr. Opin. Biotechnol. 15, 132 -138). El ácido nucleico que va a ser destinado (que puede ser una molécula de ácido nucleico RLK827 o una variante de la misma como se definió aquí anteriormente) no necesita ser dirigido al lugar de un gen RLK827, si no que puede ser introducido, por ejemplo, en regiones de alta expresión. El ácido nucleico que va a ser dirigido puede ser un alelo mejorado utilizado para remplazar el gen endógeno o puede ser introducido además al gen endógeno.

De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, se puede mejorar el rendimiento de semilla de una planta por medio de la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo.

Un método preferido para introducir una modificación genética (que en este caso no necesita estar en el lugar de un gen RLK827) es introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo. Un polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo como se mencionó anteriormente, es uno que tiene actividad de quinasa y que incluye un dominio no citoplasmático (extracelular), el cual incluye al menos 1 pero no más de 3 motivos de la LRR y preferiblemente también el motivo de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 como se definió anteriormente, y un dominio de quinasa en el terminal C que está separado del dominio no citoplasmático por un dominio transmembrana. Preferiblemente, el polipéptido RLK827 o un homólogo del mismo tiene en orden creciente de preferencia, al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41 %, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% o 99% de identidad total de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2.

Los “homólogos” de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada de la cual se deriva.

Abarcadas por el término “homólogas” se encuentran las secuencias ortólogas y las secuencias parálogas, dos formas especiales de homología, que abarcan conceptos evolucionarios utilizados para describir relaciones ancestrales de genes.

El término “parálogos” se relaciona con duplicaciones de genes dentro del genoma de una especie que conduce a genes parálogos. Se pueden identificar fácilmente los parálogos de RLK827 llevando a cabo un análisis con BLAST contra un conjunto de secuencias de la misma especie que en la secuencia pregunta.

El término “ortólogos” se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a especiación. Se pueden encontrar fácilmente ortólogos, por ejemplo, en especies de plantas monocotiledóneas llevando a cabo la así llamada búsqueda reciproca por explosión. Esto puede hacerse por medio de una primera explosión que implica explotar la secuencia en cuestión (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2) contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos NCBI que se encuentra públicamente disponible y que puede ser encontrada en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Si se buscaron ortólogos en el arroz, se explotaría la secuencia en cuestión, por ejemplo, contra los 28.469 clones de ADNc de longitud completa de Oryza sativa Nipponbare disponibles en NCBI. Se pueden utilizar BLASTn o tBLASTX cuando se parte de

18

nucleótidos o BLASTP o TBLASTN cuando se parte de la proteína, con valores estándar predeterminados. Se pueden filtrar los resultados de la explosión. Se explotan nuevamente las secuencias de longitud completa ya sea de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados (segunda explosión) contra las secuencias del organismo a partir del cual se deriva la secuencia en 5 cuestión. Se comparan luego los resultados de la primera y segunda explosiones. Se encuentra un ortólogo cuando los resultados de la segunda explosión producen como aciertos con la más alta similitud un ácido nucleico RLK827 o un polipéptido RLK827, por ejemplo, si uno de los organismos es Arabidopsis thaliana entonces se encuentra un parálogo. En el caso de familias grandes, se puede utilizar ClustalW, seguido por la construcción de un árbol de unión de vecinos, para ayudar a

10 visualizar la agrupación. Utilizando un procedimiento BLAST recíproco se identificó un ortólogo de arroz (número de acceso a Unigene Os.26918) representado por los EST CB631540, CB628137.1 y CB31541.1. Los ortólogos preferidos son aquellos que tienen la similitud más alta con RLK827 o con un parálogo de la misma en una búsqueda BLAST recíproca. Otros ejemplos de ortólogos de arroz están dados en las SEQ ID Nos 24, 26, 28, 30 y 32.

15 Un homólogo puede estar en la forma de una “variante de sustitución” de una proteína, es decir, donde se ha removido al menos un residuo en una secuencia de aminoácidos y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de restricciones funcionales colocadas sobre el polipéptido; las inserciones serán usualmente aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos

20 aminoácidos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos incluyen sustituciones conservadoras de aminoácidos (Tabla 2). Para producir tales homólogos, se pueden remplazar aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tengan propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad similares, propensión a formar o a romper estructuras de hélice α o estructuras de lámina β). Las tablas de sustitución conservadora son bien conocidas en el arte (ver por

25 ejemplo Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company). Tabla 2: Ejemplos de sustituciones conservadas de aminoácidos:

Residuo

Sustituciones Conservadoras Residuo Sustituciones Conservadoras

Ala

Ser Leu Ile; Val

Arg

Lys Lys Arg; Gln

Asn

Gln; His Met Leu; Ile

Asp

Glu Phe Met; Leu; Tyr

Gln

Asn Ser Thr; Gly

Cys

Ser Thr Ser; Val

Glu

Asp Trp Tyr

Gly

Pro Tyr Trp; Phe

His

Asn; Gln Val Ile; Leu

Ile

Leu, Val

Pueden hacerse sustituciones menos conservadas en caso de que las propiedades anteriormente mencionadas de los aminoácidos no sean tan críticas. Un homólogo puede estar también en la forma de una “variante de inserción” de una

30 proteína, es decir en donde se introducen uno o más residuos aminoácidos en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden incluir fusiones en el terminal amino y/o en el terminal carboxilo así como inserciones dentro de la secuencia de múltiples aminoácidos o de aminoácidos

19

individuales. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones del terminal amino o del terminal carboxilo, aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos. Los ejemplos de proteínas o péptidos de fusión del terminal amino o del terminal carboxilo incluyen al dominio de enlazamiento o al dominio de activación de un activador transcripcional como el utilizado en el sistema híbrido doble de levadura, proteínas de recubrimiento de fago, etiqueta de (histidina)6, etiqueta de glutationa S-transferasa, proteína A, proteína para enlazamiento de maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo de Tag 100, epítopo de c-myc, epítopo de FLAG®, lacZ, CMP (péptido para enlazamiento de calmodulina), epítopo de HA, epítopo de proteína C y epítopo de VSV.

Los homólogos en la forma de “variantes de supresión” de una proteína se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína.

Se pueden elaborar fácilmente variantes de aminoácidos de una proteína utilizando técnicas para síntesis de péptidos bien conocidas en el arte, tales como las síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por medio de manipulaciones de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o supresión de una proteína son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para elaboración de mutaciones en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagénesis Dirigida al Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

El polipéptido RKL827 o un homólogo del mismo puede ser un derivado. Los “derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden incluir sustituciones, supresiones o adiciones de residuos aminoácidos de ocurrencia natural o no natural comparado con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural de la proteína, por ejemplo, como se presenta en la SEQ ID NO: 2. Los "derivados" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden incluir residuos aminoácidos alterados, glicosilados, acilados de ocurrencia natural o residuos aminoácidos de ocurrencia no natural comparado con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural del polipéptido. Un derivado puede incluir también uno o más sustituyentes no aminoácidos comparado con la secuencia de aminoácidos de la cual se deriva, por ejemplo una molécula reportera u otro ligando, enlazado en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula reportera que se enlaza para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos de ocurrencia no natural con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína de ocurrencia natural.

De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, se prevé una expresión mejorada o reforzada de la molécula de ácido nucleico RLK827 o una variante de la misma. Los métodos para obtener una expresión reforzada o mejorada de genes o de productos génicos están bien documentados en el arte e incluyen, por ejemplo, sobreexpresión conducida por promotores adecuados, el uso de reforzadores de transcripción o de reforzadores de traducción. Se pueden introducir ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o reforzadores en una posición apropiada (típicamente secuencia arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para favorecer la expresión de un ácido nucleico RLK827 o variante del mismo. Por ejemplo, se pueden alterar in vivo promotores endógenos por medio de mutación, supresión, y/o sustitución (ver Kmiec, patente estadounidense No. 5.565.350; Zarling y colaboradores, PCT/US93/03868), o se

20

pueden introducir promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y distancia apropiada de un gen de la presente invención para controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación del extremo 3’ de una región para codificación de nucleótidos. La región de poliadenilación se puede derivar del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de la planta, o a partir de T-ADN. La secuencia del extremo 3’ que va a ser añadida se puede derivar, por ejemplo, de los genes para la nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente a partir de otro gen de la planta, o menos preferiblemente a partir de cualquier otro gen eucariota.

Se puede añadir también una secuencia de un intrón a la región 5’ no traducida o la secuencia de codificación de la secuencia parcial de codificación para incrementar la cantidad del mensaje de madurez que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción tanto en construcciones para expresión en plantas como en animales ha demostrado que incrementa la expresión génica tanto en ARNm como en los niveles de proteína hasta en 1000 veces (Buchman y Berg, Mol. Cell Biol. 8, 4395 -4405 (1988); Callis y colaboradores, Genes Dev. 1, 1183 -1200 (1987)). Tal mejora en el intrón de la expresión génica es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. El uso de los intrones del maíz, como a los intrones 1, 2, y 6 de Adh1-S, el intrón de Bronze-1 son conocidos en el arte. Ver generalmente, The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

La invención también suministra construcciones genéticas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de acuerdo con la invención.

Por lo tanto, se proporciona una construcción génica que incluye:

(i)

una molécula de ácido nucleico RLK827 o una variante funcional de la misma;

(ii)

una o más secuencias de control capaces de conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i); y opcionalmente

(iii) una secuencia de terminación de la transcripción.

Se pueden construir construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas capacitadas en el arte. Se pueden insertar las construcciones génicas en vectores, que pueden encontrarse comercialmente disponibles, adecuadas para la transformación en plantas y adecuadas para expresión del gen de interés en las células transformadas.

Se transforman las plantas con un vector que contiene la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico RLK827 o una variante funcional del mismo). La secuencia de interés está operativamente enlazada a una o más secuencias de control (al menos a un promotor). Los términos “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” son todos utilizados en forma intercambiable aquí y deben ser tomados en un contexto amplio para referirse a secuencias reguladoras de ácido nucleico capaces de efectuar la expresión de las secuencias con las cuales están enlazadas. Abarcadas por los términos anteriormente mencionados están las secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico eucariota clásico (incluida la caja TATA que es requerida para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias, reforzadores y silenciadores activadores secuencia arriba) que alteran la expresión dl gen en respuesta a estímulos externos y/o de desarrollo, o en una forma específica del tejido. También está incluida dentro del término una secuencia reguladora de transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o

21

secuencias reguladoras de la transcripción de caja -10. El término “elemento regulador” también abarca una molécula sintética de fusión o un derivado que confiere, activa o refuerza la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término “operativamente enlazado” como se lo utiliza aquí se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de

5 interés, de tal manera que la secuencia promotora sea capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Convenientemente, se puede utilizar cualquier tipo de promotor para conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor inducible, es decir, que tiene una iniciación de la transcripción inducida o incrementada en respuesta a un estímulo de desarrollo,

10 químico, ambiental o físico. Un ejemplo de un promotor inducible que sea un promotor inducible por estrés, es decir un promotor activado cuando se expone una planta a diferentes condiciones de estrés, es el promotor inducido por estrés por agua WS118. Adicionalmente o alternativamente, el promotor puede ser un promotor específico del tejido, es decir uno que es capaz de iniciar preferencialmente la transcripción en ciertos tejidos, tales como las hojas, las raíces, tejido de las semillas, etc. Un ejemplo

15 de un promotor específico de la semilla es el promotor oleosina el arroz de 18 kDa (Wu y colaboradores (1998) J Biochem 123(3): 386 -91). Preferiblemente, el ácido nucleico RLK827 o una variante funcional del mismo están operativamente enlazados a un promotor constitutivo. Un promotor constitutivo está transcripcionalmente activo durante la mayor parte, perno no necesariamente todas las fases de su

20 crecimiento y desarrollo y es sustancialmente expresado por doquier. Preferiblemente, el promotor constitutivo es un promotor GOS2 (de arroz) (nucleótidos 1 a 2193 en la SEQ ID NO: 3). Debe quedar claro que la aplicabilidad de la presente invención no está restringida al ácido nucleico RLK827 representado por la SEQ ID NO: 1, ni está restringida la aplicabilidad de la invención a la expresión de un ácido nucleico RLK827 cuando está dirigida por un promotor GOS2. Los ejemplos de otros

25 promotores constitutivos que pueden ser utilizados también para dirigir la expresión de un ácido nucleico RLK827 se muestran en la Tabla 3 a continuación. Tabla 3: Ejemplos de promotores constitutivos

Fuente del Gen

Motivo de Expresión Referencia

Actina

Constitutivo McElroy y colaboradores, Plant Cell, 2: 163-171, 1990

CAMV 35S

Constitutivo Odell y colaboradores, Nature, 313: 810-812, 1985

CaMV 19S

Constitutivo Nilsson y colaboradores, Physiol. Plant. 100:456-462, 1997

GOS2

Constitutivo de Pater y colaboradores, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992

Ubiquitina

Constitutivo Christensen y colaboradores, Plant Mol. Biol. 18: 675689, 1992

Ciclofilina del arroz

Constitutivo Buchholz y colaboradores, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994

Histona H3 del maíz

Constitutivo Lepetit y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992

Actina 2

Constitutivo An y colaboradores, Plant J. 10(1); 107-121, 1996

Opcionalmente, se pueden utilizar también uno o más secuencias terminadoras en la construcción introducida en una planta. El término “terminadora” abarca una secuencia de control 30 que es una secuencia de ADN al extremo de una unidad transcripcional que señala el procesamiento y poliadenilación 3’ de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. Los elementos

22

reguladores adicionales pueden incluir reforzadores transcripcionales así como de traducción. Aquellos capacitados en el arte serán conscientes de secuencias terminadoras y reforzadoras que pueden ser adecuadas para uso en la realización de la invención. Tales secuencias serían conocidas o las puede obtener fácilmente una persona capacitada en el arte.

Un ejemplo de un casete de expresión que contiene al ácido nucleico RLK827 operativamente enlazado al promotor GOS2 y que incluye adicionalmente una secuencia terminadora es dado en la SEQ ID NO: 3. Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir además un origen de secuencia de replicación, que es requerido para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo específico de célula. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una construcción genética en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo una molécula de plásmido o de cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan al f1-ori y colE1.

La construcción genética puede incluir opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se lo utiliza aquí, el término “gen marcador seleccionable” incluye a cualquier gen que confiera un fenotipo sobre una célula en la cual se exprese para facilitar la identificación y/o selección de las células que son transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse entre los marcadores que confieren resistencia antibiótica o herbicida, que introducen una nueva característica metabólica o que permiten selección visual. Los ejemplo de genes marcadores seleccionables incluyen a los genes que codifican proteínas que confieren resistencia a los antibióticos (tal como nptll que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina), a herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporcionan resistencia contra el glifosato), o genes que proporcionan una característica metabólica (tal como manA que permite que las plantas utilicen manosa como fuente única de carbono). Los genes que codifican proteínas marcadoras visuales resultan en la formación de color (por ejemplo β-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y derivados de la misma).

También se divulgan plantas que pueden ser obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la presente invención. La presente invención suministra por lo tanto plantas que pueden ser obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la presente invención, en donde las plantas tienen dentro de ellas un ácido nucleico RLK827 o una variante del mismo, o donde las plantas tienen dentro de ellas una modificación genética, preferiblemente en el lugar del un gen RLK827.

La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mayor rendimiento de semilla, que comprende la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico RLK827 o una variante funcional del mismo.

También se divulga un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mayor rendimiento de semilla, donde el método comprende:

(i)

la introducción en una planta o en una célula vegetal de un ácido nucleico RLK827 o una variante funcional del mismo; y

(ii)

el cultivo de la célula vegetal bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta. Se puede introducir directamente el ácido nucleico en una célula vegetal o en la misma planta

(incluida la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta). De acuerdo a una característica preferida de la presente invención, se introduce preferiblemente el ácido nucleico en una planta por medio de transformación.

El término “transformación” como se mencionó aquí abarca la transferencia de un

23

polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido de la planta capaz de una propagación clónica subsiguiente, ya sea por organogénesis o por embriogénesis, puede ser transformado con una construcción genética de la presente invención y una planta completa regenerada a partir de allí. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas clónicos de propagación disponibles para, y mejor adaptados para, la especie particular que está siendo transformada. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, mega gametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemas de la raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotiledón). El polinucleótido puede ser introducido en forma transitoria o estable en una célula huésped y puede ser mantenido en forma no integrada, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede estar integrado en el genoma huésped. La célula vegetal transformada resultante puede ser utilizada entonces para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas capacitadas en el arte.

La transformación de una especie de planta es ahora una técnica bastante rutinaria. Convenientemente, se puede utilizar cualquiera de los diferentes métodos de transformación para introducir el gen de interés en un ancestro adecuado de la célula. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que incrementan la aceptación de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microinyección. Se pueden seleccionar los métodos a partir del método con calcio/polietilén glicol para protoplastos (Krens y colaboradores (1982) Nature 296, 72 -74; Negrutiu y colaboradores (1987) Plant Mol. Biol. 8, 363 -373); electroporación de protoplastos (Shillito y colaboradores (1985) Bio/Technol 3, 1099 -1102); microinyección dentro del material de la planta (Crossway y colaboradores (1986) Mol. Gen. Genet. 202, 179 -185); infección por bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein y colaboradores (1987) Nature 327, 70) con virus (que no se integran) y similares. Las plantas de arroz transgénico que expresan un gen RLK827 son preferiblemente producidas a través de transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación de arroz, tal como se describe en cualquiera de los siguientes documentos: solicitud de publicada de patente europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199, 612 -617, 1996); Chan y colaboradores (Plant Mol. Biol. 22, 491 -506, 1993), Hiei y colaboradores (Plant J. 6, 271 -282, 1994), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia en su totalidad como si se las hubiera expuesto. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como el descrito ya sea por Ishida y colaboradores (Nature Biotechnol. 14, 745 -50, 1996) o por Frame y colaboradores (Plant Physiol. 129, 13 -22, 2002), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia en su totalidad como si se las hubiera expuesto.

Generalmente después de la transformación, se seleccionan células vegetales o agrupaciones celulares por la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes expresables en la planta cotrasnformados con el gen de interés, después de lo cual se regenera el material transformado en una planta completa.

Después de la transferencia y regeneración del ADN, se pueden evaluar las plantas putativamente transformadas, por ejemplo utilizando análisis tipo Southern, por la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, se pueden monitorear los niveles de expresión del ADN recientemente introducido utilizando análisis

24

tipo Northern y/o tipo Western siendo ambas técnicas bien conocidas por las personas ordinariamente capacitas en el arte. El cultivo de células vegetales transformadas en plantas maduras puede abarcar por lo tanto etapas de selección y/o regeneración y/o desarrollo hasta la madurez.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar por medio de una variedad de medios, tales como por medio de propagación clónica o por medio de técnicas clásicas de reproducción. Por ejemplo, una primera generación de plantas transformadas (o T1) puede ser autofecundadas para producir una segunda generación de transformantes homocigotos (o T2), y se pueden propagar adicionalmente las plantas T2 a través de técnicas clásicas de reproducción.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; los transformantes clónicos (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado a un vástago no transformado).

La presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida por medio de cualquiera de los métodos descritos aquí, y a todas las partes de la planta y propágulos de la misma. La presente invención se extiende además para abarcar la progenie de una célula primaria transformada o transfectada, tejido, órgano o planta completa que ha sido producida por medio de cualquiera de los métodos anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la progenie exhiba la(s) misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) como aquellas producidas en los padres por medio de los métodos de acuerdo con la invención, incluyendo dicha progenie una construcción genética como la definida en la reivindicación 1. La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico RLK827 aislado o una variante funcional del mismo. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células vegetales. La invención también divulga partes cosechables de una planta de acuerdo con la invención tales como, pero sin limitarse a semillas, hojas, frutos, flores, tallos, rizomas, tubérculos y bulbos en donde dichas partes cosechables incluyen una construcción genética como la definida en la reivindicación 1. La invención se relaciona además con productos derivados directamente de una parte cosechable de tal planta, tal como partículas secas o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas, en donde dichos productos incluyen la construcción genética como se define en la reivindicación 1.

La presente invención también abarca el uso de una construcción genética como se define en la reivindicación 1 en el mejoramiento del rendimiento de semilla por parte de las plantas.

Uno de tales usos se relaciona con el mejoramiento del rendimiento de semilla en las plantas. El rendimiento de semilla puede incluir uno o más de lo siguiente: mayor número de semillas (llenas), mayor peso de las semillas, mayor índice de cosecha, entre otros.

Los ácidos nucleicos RLK827 o las variantes funcionales de los mismos o los polipéptidos RLK827 u homólogos de los mismos, pueden encontrar uso en programas de reproducción en los cuales se identifica un marcador de ADN que puede estar genéticamente enlazado a un gen RLK827 o una variante del mismo. La RLK827 o variantes de las mismas o RLK827 u homólogos de los mismos, pueden ser utilizados para definir un marcador molecular. Este ADN o marcador de proteína pueden ser utilizados luego en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen rendimiento alterado de semilla. El gen RLK827 o una variante del mismo pueden, por ejemplo, ser un ácido nucleico como el representado por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 31.

25

Las variantes alélicas de una RLK827 pueden encontrar también uso en programas de reproducción asistida por marcadores. Tales programas de reproducción requieren algunas veces de la introducción de una variación alélica por medio de tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagénesis EMS; alternativamente, el programa puede iniciar con una recolección de variantes alélicas del así llamado origen “natural” causado en forma no intencional. La identificación de variantes alélicas tiene lugar entonces, por ejemplo, por medio de PCR. Esto es seguido por una etapa de selección para la selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y la cual da lugar a características de crecimiento mejoradas en una planta. La selección se lleva a cabo típicamente por medio del monitoreo del desempeño del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 31. El desempeño de crecimiento puede ser monitoreado en un invernadero o en el campo. Otras etapas opcionales incluyen el cruzamiento de plantas, en las cuales se identificó la variante alélica superior, con otra planta. Esto podría ser utilizado, por ejemplo, para hacer una combinación de rasgos fenotípicos interesantes.

Se pueden utilizar también un ácido nucleico RLK827 o una variante del mismo como sonda para cartografiar genética y físicamente los genes de los cuales hacen parte, y como marcadores para rasgos enlazados con esos genes. Tal información puede ser útil en reproducción de plantas con el propósito de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de ácidos nucleicos RLK827 o de variantes de los mismos requiere únicamente de una secuencia de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos RLK827 o las variantes de los mismos pueden ser utilizados como marcadores de restricción de polimorfismo con longitud de fragmento (RFLP). Las transferencias tipo Southern de ADN genómico de la planta digerido con enzimas de restricción pueden ser sondadas con los ácidos nucleicos RLK827 o variantes de los mismos. Los patrones de las bandas resultantes pueden ser luego sometidos a análisis genético utilizando programas de computador tales como MapMaker (Lander y colaboradores (1987) Genomics 1, 174 -181) con el propósito de construir un mapa genético. Además, se pueden utilizar ácidos nucleicos para sondar transferencias tipo Southern que contienen los ADN genómicos tratados con endonucleasa de restricción de un grupo de individuos que representan a los padres y a la progenie de un cruce genético definido. La segregación de los polimorfismos de ADN es anotado y utilizado para calcular la posición del ácido nucleico RLK827 o de una variante del mismo en el mapa genético previamente obtenido utilizando esta población (Botstein y colaboradores (1980) Am. J. Hum. Genet. 32, 314 331).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes de plantas para uso en cartografía genética están descritos en Bematzky y Tanksley (Plant Mol. Biol. Reporter 4, 37-41, 1986). Numerosas publicaciones describen la cartografía genética de clones específicos de ADNc utilizando la metodología esbozada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, las poblaciones con entrecruzamiento F2, las poblaciones con retrocruzamiento, las poblaciones apareadas en forma aleatoria, las líneas casi isogénicas, y otros grupos de individuos pueden ser utilizados para cartografía. Tales metodologías son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte.

Se pueden utilizar también sondas de ácido nucleico para cartografía física (es decir, colocación de secuencias sobre mapas físicos; ver Hoheisel y colaboradores En: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, páginas. 319 -346, y las referencias

26

citadas allí).

Se pueden utilizar sondas de ácido nucleico en cartografía directa de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7, 149 -154). Aunque los métodos actuales de cartografía por FISH favorecen el uso de clones grandes (desde unos pocos hasta varios cientos de KB; ver Laan y colaboradores (1995) Genome Res. 5, 13 -20), las mejoras en sensibilidad pueden permitir la realización de cartografía por FISH utilizando sondas más cortas.

Se pueden llevar a cabo una variedad de métodos con base en la amplificación de ácido nucleico de cartografía genética y física utilizando los ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11, 95 -98), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR, (CAPS; Sheffield y colaboradores (1993) Genomics 16, 325 332), ligación específica de alelos (Landegren y colaboradores (1988) Science 241, 1077 -1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18, 3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter y colaboradores (1997) Nat. Genet. 7, 22 -28) y Happy Mapping (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17, 6795 -6807). Para estos métodos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de iniciadores para uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión del iniciador. El diseño de tales iniciadores es bien conocido por aquellos capacitados en el arte. En métodos que emplean cartografía genética con base en PCR, puede ser necesario identificar diferencias en la secuencia de ADN entre los padres del mapeo cruzado en la región correspondiente a la presente secuencia de ácido nucleico. Esto, sin embargo, generalmente no es necesario para métodos de cartografía.

Los métodos de acuerdo con la presente invención resultan en plantas que tienen rendimiento mejorado de semilla, como se describió aquí anteriormente. Estas características de crecimiento convenientes pueden ser combinadas también con otras características económicamente ventajosas, tales como características adicionales de mejoramiento de la productividad, tolerancia a diferentes estreses, características que modifican diferentes rasgos arquitectónicos y/o rasgos bioquímicos y/o fisiológicos. Descripción de las figuras

Se describirá ahora la presente invención con referencia a las siguientes figuras en las cuales: La Fig. 1 presenta una vista gráfica de estructuras de quinasa de tipo receptor de la planta (adaptada de Shiu & Bleecker, 2001). La flecha indica la estructura de RLK827 y la subfamilia a la cual pertenece RLK827. La Fig. 2 muestra una representación esquemática de la estructura de la SEQ ID NO: 2. El triángulo indica secuencia con una armadura del sitio de enlazamiento de ATP. La Fig. 3 muestra al vector binario p031 para transformación y expresión en Oryza sativa de una RLK827 de Arabidopsis thaliana (referencia interna CDS0827) bajo el control de un promotor GOS2 de arroz (referencia interna PRO0129). La Fig. 4 detalla ejemplos de secuencias útiles en la realización de los métodos de acuerdo con la presente invención. El número “At” se refiere al número de Acceso de los MIP (http://mips.gsf.de/); otros identificadores se refieren a los números de acceso al GenBank.

Ejemplos

Se describirá ahora la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos, que son únicamente para propósitos de ilustración.

Manipulación de ADN: a menos que se establezca otra cosa, se llevan a cabo las técnicas de ADN recombinante de acuerdo a protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular

27

Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y colaboradores (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html). Los materiales y métodos estándar para trabajo molecular en plantas están descritos en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R. D. D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

Ejemplo 1: Clonación Génica

Se amplificó AtRLK827 de Arabidopsis thaliana (código interno CDS0827) por medio de PCR utilizando como molde una genoteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU). Después de transcripción inversa de ARN extraído de las plántulas, se clonaron los ADNc en pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio del inserto del banco era de 1.5 kb, y el número original de clones era de 1.59 x 107 cfu. Se determinó que el título original era de 9.6 x 105 cfu/ml, y después de una primera amplificación de 6 x 1011 cfu/ml. Después de la extracción del plásmido, se utilizaron 200 ng de molde en una mezcla de PCR de 50 µl. Se utilizaron los iniciadores prm00405 (SEQ ID NO: 4, sentido) y prm00406 (SEQ ID NO: 5, complementario inverso), que incluían los sitios AttB para recombinación Gateway, para amplificación por PCR. Se llevó a cabo la PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa en condiciones estándar. Se amplificó y purificó un fragmento de la PCR de 2750 pb utilizando también métodos estándar. Se llevó a cabo entonces la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento de la PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway®, un “clon de entrada”, p3080. Se adquirió el plásmido pDONR201 a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®. Ejemplo 2: Construcción del Vector y Transformación del Arroz

Se utilizó posteriormente el clon de entrada p3080 en una reacción LR con un vector de destinación utilizado para transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los bordes del T-ADN: un marcador seleccionable de planta; un casete de expresión de un marcador visual; y un casete Gateway destinado a recombinación in vivo de LR con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Se localizó un promotor GOS2 de arroz para expresión constitutiva secuencia arriba de este casete Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, se transformó el vector de expresión resultante p031 (Figura 3) dentro de la cepa LBA4404 de Agrobacterium y posteriormente en plantas de Oryza sativa. Se les permitió a las plantas de arroz transformadas crecer y luego fueron examinadas por los parámetros descritos en el Ejemplo 3. Ejemplo 3: Evaluación de los Transformantes: Mediciones de Crecimiento

Se generaron aproximadamente de 15 a 20 transformantes dependientes T0. Se transfirieron los transformantes primarios desde las cámaras de cultivo de tejidos hasta un invernadero para crecimiento y cosecha de semillas T1. Cuatro eventos de los cuales se retuvo la progenie T1 segregada

3:1 por la presencia/ausencia del transgén. Para cado uno de estos eventos, se seleccionaron 10 plántulas T1 que contenían al transgén (hetero y homocigotos), y 10 plántulas T1 que carecían del transgén (nulicigotos), por medio de selección del marcador visual. Se transfirieron las plantas seleccionadas T1 a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta única con código de barras para enlazar en forma inequívoca los datos de fenotipificación con la planta correspondiente. Se cultivaron las plantas T1 seleccionadas sobre suelo en macetas de 10 cm de diámetro bajo las siguientes ajustes ambientales: período de luz = 11,5 h, intensidad de luz natural = 30.000 lux o más, temperatura

28

durante el día = 28°C o superior, temperatura durante la noche = 22°C, humedad relativa = 60 -70%. Se cultivaron las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotos lado a lado en posiciones aleatorias. A partir de la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, se pasaron las plantas varias veces a través de un gabinete para formación de imágenes digitales. En cada instante de tiempo se tomaron imágenes digitales (2048 x 1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta al menos a partir de 6 ángulos diferentes.

Se cosecharon las panículas primarias maduras, se ensacaron, se marcaron con código de barras y luego se secaron durante tres días en el horno a 37ºC. Se trillaron luego las panículas y se recogieron todas las semillas. Se separaron las vainas llenas de las vacías utilizando un dispositivo de soplado de aire. Después de la separación, se contaron luego ambos lotes de semillas utilizando una máquina contadora comercialmente disponible. Se descartaron las vainas vacías. Se pesaron las vainas llenas en una balanza analítica y se midió el área de sección transversal de las semillas utilizando formación de imágenes digitales. Este procedimiento condujo al conjunto de parámetros relacionados con la semilla descritos más adelante.

Estos parámetros se obtuvieron en una forma automatizada a partir de las imágenes digitales utilizando un software para análisis de imágenes y se hizo un análisis estadístico. Se utilizó un ANOVA de dos factores (análisis de varianza) corregido por el diseño desequilibrado como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una prueba F sobre todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con ese gen. Se realizó la prueba F para verificar el efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para verificar un efecto total del gen, también denominado aquí como un “efecto génico global”. Si el valor de la prueba F mostró que los datos eran significativos, entonces se concluyó que existió un efecto “génico”, lo cual significa que no solamente la presencia o la posición del gen fue la causante del efecto. El umbral de significancia para un efecto génico global verdadero se estableció en un nivel de probabilidad del 5% para la prueba F.

Para verificar el efecto de los genes dentro de un evento, es decir, para un efecto específico de línea, se realizó una prueba t dentro de cada evento utilizando conjuntos de datos de las plantas transgénicas y de las correspondientes plantas nulas. “Plantas nulas” o “segregantes nulos” o “nulicigotos” se refiere a las plantas tratadas en la misma forma que las plantas transgénicas, pero a partir de las cuales se segregó el transgén. Se pueden describir también plantas nulas como las plantas homocigotos transformadas negativas. El umbral de significación para la prueba t fue establecido en un nivel de probabilidad del 10%. Los resultados para algunos eventos pueden estar por encima o por debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis de que un gen puede tener únicamente un efecto en ciertas posiciones en el genoma, y que la ocurrencia de este efecto que depende de la posición no es poco común. Esta clase de efecto génico también denominado aquí como un “efecto de línea del gen”. Se obtuvo el valor p por comparación del valor t con la distribución t o alternativamente, por comparación del valor F con la distribución F. El valor p conduce a la probabilidad de que la hipótesis nula (es decir, que no exista efecto del transgén) sea correcta.

Los datos obtenidos en el primer experimento fueron confirmados en un segundo experimento con plantas T2. Se seleccionaron tres líneas para análisis adicionales. Se seleccionaron lotes de semillas de las plantas positivas (tanto hetero como homocigotas) en T1 monitoreando la expresión del marcador. Para cada evento escogido, se retuvieron luego los lotes de semillas heterocigotas para evaluación T2. Dentro de cada lote de semillas, se cultivaron un número igual de plantas positivas y negativas en el invernadero para evaluación.

29

Se evaluó un número total de 120 plantas transformadas con RLK827 en la generación T2, esto es, 40 plantas por evento de las cuales 20 fueron positivas para el transgén y 20 negativas. Debido a que se habían llevado a cabo dos experimentos con eventos de solapamiento, se realizó un análisis combinado. Esto es útil para verificación de la consistencia de los efectos sobre los

5 dos experimentos, y si es el caso, para acumular evidencia a partir de ambos experimentos con el propósito de incrementar la confianza en la conclusión. El método utilizado fue un modelo mezclado. El método utilizado fue una aproximación de un modelo mezclado que tiene en cuenta la estructura multinivel de los datos (es decir experimento -evento -segregantes). Se obtuvieron los valores p por comparación de la prueba de razón de verosimilitud con las distribuciones chi cuadrado.

10 Ejemplo 4: Evaluación de Transformantes: Medición de Parámetros Relacionados con la Semilla

Después del análisis de las semillas como se describió anteriormente, los inventores encontraron que las plantas transformadas con la construcción génica RLK827 tenían un mayor número de semillas llenas, un mayor peso total de semillas y un mayor índice de cosecha comparado

15 con las plantas que carecen del transgén RLK827. Se obtuvieron nuevamente los resultados positivos obtenidos para plantas en la generación T1, en la generación T2. Como ejemplo, se dan los datos para la línea OS2 (Tabla 4).

Tabla 4:

Línea OS2

Generación T1 Generación T2 Análisis combinado

Diferencia en %

valor p Diferencia en % valor p valor p

Número de semillas llenas

41 0,0047 54 0,0726 0,0079

Peso total de las semillas

43 0,0051 60 0,0655 0,0065

Índice de cosecha

48 0,0007 57 0,0527 0,0003

Número de semillas llenas:

20 Se determinó el número de semillas llenas por medio del recuento del número de vainas llenas que quedaron después de la etapa de separación. La línea OS2 mostró un incremento significativo en el número de semillas llenas del 41% para la generación T1. Este incremento fue observado también en la generación T2 (+54%). El análisis combinado de los datos de T1 y T2 confirmó que el efecto sobre el número de semillas llenas fue altamente significativo (valor p de

25 0,0079).

Rendimiento total de semillas:

Se midió el rendimiento total de semillas (peso total de las semillas) por planta pesando todas las vainas llenas cosechadas de una planta. No solamente se incrementó el número de semillas llenas, sino también el peso total de las semillas. En la primera generación hubo un incremento del 43%, el

30 cual fue estadísticamente significativo. Este incremento fue confirmado en la generación T2 y el análisis combinado mostró que los incrementos en el rendimiento de semillas fueron significativos (valor p de 0,0065). Índice de cosecha: La línea OS2 tuvo además un mayor índice de cosecha. El índice de cosecha en la presente

35 invención se define como la relación entre el rendimiento total de semilla y el área por encima del suelo (mm2), multiplicado por un factor 106. Tanto en T1 como en T2 se observó un efecto positivo sobre el índice de cosecha (un incremento respectivamente de 48 y 57% con valores p de 0,0007 y 0,0527). Aquí también, el análisis combinado de los datos de T1 y T2 mostró un efecto significativo

30

(valor p de 0,0003). LISTADO DE SECUENCIA

<110> CropDesign N.V.

<120> Plantas que tienen características de crecimiento mejoradas y método para su elaboración 5 <130> CD-117-prio

<150> EP 04103393.7

<151> 2004-07-15

<150> US 60/589.235

<151> 2004-07-20 10 <160> 33

<170> Patentin versión 3.3

<210> 1

<211> 2655

<212> ADN 15 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

imagen1

31

imagen1

<210> 2

<211> 885

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

imagen1

32

imagen1

33

imagen1

34

imagen1

<210> 3

<211> 4898

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> casete de expresión

<400> 3

imagen1

35

imagen1

<210> 4

<211> 59

<212> ADN

5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> iniciador: prm00405

<400> 4

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag agacattttg tgtttattg

59

10

<210> 5

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

15

<223> iniciador: prm00406

<400> 5

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg atgcaaacta tcgagcgttt

50

<210> 6

<211> 2715

36

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

imagen1

<210> 7

<211> 865

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 7

37

imagen1

38

imagen1

39

imagen1

<210> 8

<211> 2028

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 8

40

imagen1

<210> 9

<211> 675

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 9

imagen1

41

imagen1

42

imagen1

<210> 10

<211> 2964

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 10

imagen1

43

imagen1

<210> 11

<211> 884

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 11

imagen1

44

imagen1

45

imagen1

46

imagen1

<210> 12

<211> 2532

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 12

imagen1

47

imagen1

<210> 13

<211> 843

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 13

imagen1

48

imagen1

49

imagen1

50

imagen1

<210> 14

<211> 2658

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 14

imagen1

51

imagen1

<210> 15

<211> 851

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 15

imagen1

52

imagen1

53

imagen1

54

imagen1

<210> 16

<211> 2704

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 16

imagen1

<210> 17 10 <211> 880

<212> PRT

55

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 17

imagen1

56

imagen1

57

imagen1

<210> 18

<211> 2667

<212> ADN

58

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 18

imagen1

<210> 19

<211> 888

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 19

imagen1

59

imagen1

60

imagen1

61

imagen1

<210> 20

<211> 820

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 20

imagen1

62

<210> 21

<211> 824

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 21

imagen1

<210> 22

<211> 807

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 22

imagen1

<210> 23

<211> 2721

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 23

imagen1

63

imagen1

<210> 24

<211> 906

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 24

imagen1

64

imagen1

65

imagen1

66

imagen1

<210> 25

<211> 2316

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 25

imagen1

67

imagen1

<210> 26

<211> 771

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 26

imagen1

68

imagen1

69

imagen1

70

imagen1

<210> 27

<211> 2604

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 27

imagen1

<210> 28

<211> 867 10 <212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 28

71

imagen1

72

imagen1

73

imagen1

<210> 29

<211> 2607

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 29

74

imagen1

<210> 30

<211> 783

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 30

imagen1

75

imagen1

76

imagen1

77

imagen1

<210> 31

<211> 2352

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 31

imagen1

78

<210> 32

<211> 868

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 32

imagen1

79

imagen1

80

imagen1

<210> 33

<211> 12

81

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de consenso

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (3)..(3)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (6)..(6)

<223> Xaa puede ser Asp o Glu

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (8)..(8)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (12)..(12)

<223> Xaa puede ser Tyr o Phe

<400> 33

imagen1

82

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

•

WO 03072763 A [0005] • US 5565350 A, Kmiec [0068]

•

WO 0004761 A [0005] • US 9303868 W, Zarling [0068]

•

WO 9859039 A [0005] • EP 1198985 A1 [0085]

•

US 5811238 A [0034] [0053] • EP 04103393 A [0118]

•

US 6395547 A [0034] [0053] • US 60589235 B [0118]

Literatura citada en la descripción que no es de patente

•

Shiu; Bleecker. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2001, vol. 98, 10763 -10768 [0003]

•

Becraft. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2002, vol. 18, 163 -192 [0003]

•

Diévart ; Clark. Curr. Opin. Plant Biol., vol. 6, 507 -516 [0003]

•

Kobe ; Kajava. Curr. Opin. Struct. Biol., 2001, vol. 11, 725 -732 [0003]

•

Schultz y colaboradores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95, 5857 -5864 [0024]

•

Letunic y colaboradores. Nucleic Acids Res, 2002, vol. 30, 242-244, http://smart.emblheidelberg.de [0024]

•

Bateman y colaboradores. Nucleic Acids Research, 2002, vol. 30 (1), 276 -280, http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam [0024]

•

Klein y colaboradores. Biochim. Biophys. Acta, 1985, vol. 815, 468 [0027]

•

Sonnhammer y colaboradores. Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. AAAI Press, 1998, 175 -182 [0027]

•

Needleman ; Wunsch. J. Mol. Biol., 1970, vol. 48, 443 -453 [0028]

•

Smith ; Waterman. Advances in Applied Mathematics, 1981, vol. 2, 482 -489 [0028]

•

Altschul, S. F. ; Gish, W. ; Miller, W. ; Myers, E. W. ; Lipman, D. J. J. Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403 -410 [0028]

•

W. R. Pearson ; D. J. Lipman. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1988, vol. 85, 2444 -2448 [0028]

•

Ausubel y colaboradores. Current Protocols in Molecular Biology, 1994, vol. 1, 2, http://www.protocol-online.org [0031]

•

Zhao y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1994, vol. 26, 791 -803 [0031]

•

Biochimica et Biophysica Acta, 1996, vol. 1314, 191 -225 [0031]

•

He y colaboradores. Science, 2000, vol. 288, 2360 -2363 [0034]

•

Meinkoth ; Wahl. Anal. Biochem., 1984, vol. 138, 267 -284 [0038]

•

Sambrook y colaboradores. Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 [0042]

•

Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1989 [0042]

•

Hayashi y colaboradores. Science, 1992, vol. 258, 1350 -1353 [0050]

•

Redei ; Koncz. Methods in Arabidopsis Research. World Scientific, 1992, 16 -82 [0051]

•

Feldmann y colaboradores. Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994, 137 -172 [0051]

•

Lightner ; Caspar. Methods on Molecular Biology. Humana Press, 1998, vol. 82, 91 -104 [0051]

•

McCallum. Nature Biotechnol., 2000, vol. 18, 455 -457 [0051]

•

Stemple. Nature Rev. Genet., 2004, vol. 5, 145 -150 [0051]

•

Ausubel y colaboradores. Current Protocols in Molecular Biology [0052]

•

Castle y colaboradores. Science, 2004, vol. 304 (5674), 1151 -4 [0053]

•

Offringa y colaboradores. EMBO J., 1990, vol. 9, 3077 -3084 [0055]

•

Terada y colaboradores. Nature Biotechnol., 2002, vol. 20, 1030 -1034 [0055]

•

lida ; Terada. Curr. Opin. Biotechnol., 2004, vol. 15, 132 -138 [0055]

•

Creighton. Proteins. W.H. Freeman and Company, 1984 [0062]

•

Buchman ; Berg. Mol. Cell Biol., 1988, vol. 8, 4395 -4405 [0070]

•

Callis y colaboradores. Genes Dev., 1987, vol. 1, 1183 -1200 [0070]

•

Maize Handbook. Springer, 1994 [0070]

•

Wu y colaboradores. J Biochem, 1998, vol. 123 (3), 386 -91 [0075]

•

McElroy y colaboradores. Plant Cell, 1990, vol. 2, 163 -171 [0076]

•

Odell y colaboradores. Nature, 1985, vol. 313, 810 -812 [0076]

•

Nilsson y colaboradores. Physiol. Plant., 1997, vol. 100, 456 -462 [0076]

•

de Pater y colaboradores. Plant J, November 1992, vol. 2 (6), 837 -44 [0076]

•

Christensen y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1992, vol. 18, 675 -689 [0076]

•

Buchholz y colaboradores. Plant Mol Biol., 1994, vol. 25 (5), 837 -43 [0076]

•

Lepetit y colaboradores. Mol. Gen. Genet., 1992, vol. 231, 276 -285 [0076]

•

An y colaboradores. Plant J., 1996, vol. 10 (1), 107 -121 [0076]

•

Krens y colaboradores. Nature, 1982, vol. 296, 72 -74 [0085]

•

Negrutiu y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1987, vol. 8, 363 -373 [0085]

•

Shillito y colaboradores. Bio/Technol, 1985, vol. 3, 1099 -1102 [0085]

•

Crossway y colaboradores. Mol. Gen. Genet., 1986, vol. 202, 179 -185 [0085]

•

Klein y colaboradores. Nature, 1987, vol. 327, 70 [0085]

•

Aldemita ; Hodges. Planta, 1996, vol. 199, 612 -617 [0085]

•

Chan y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1993, vol. 22, 491 -506 [0085]

•

Hiei y colaboradores. Plant J., 1994, vol. 6, 271 -282 [0085]

•

Ishida y colaboradores. Nature Biotechnol., 1996, vol. 14, 745 -50 [0085]

•

Frame y colaboradores. Plant Physiol., 2002, vol. 129, 13 -22 [0085]

•

Lander y colaboradores. Genomics, 1987, vol. 1, 174 -181 [0095]

•

Botstein y colaboradores. Am. J. Hum. Gene, 1980, vol. 32, 314 -331 [0095]

•

Bematzky ; Tanksley. Plant Mol. Biol. Reporter, 1986, vol. 4, 37 -41 [0096]

•

Hoheisel y colaboradores. Nonmammallan Genomic Analysis: A Practical Guide. Academic press, 1996, 319 -346 [0097]

•

Trask. Trends Genet., 1991, vol. 7, 149 -154 [0098]

•

Laan y colaboradores. Genome Res., 1995, vol. 5, 13 -20 [0098]

•

Kazazian. J. Lab. Clin. Med., 1989, vol. 11, 95 -98 [0099]

•

Sheffield y colaboradores. Genomics, 1993, vol. 16, 325 -332 [0099]

•

Landegren y colaboradores. Science, 1988, vol. 241, 1077 -1080 [0099]

•

Sokolov. Nucleic Acid Res., 1990, vol. 18, 3671 [0099]

•

Walter y colaboradores. Nat. Genet., 1997, vol. 7, 22 -28 [0099]

•

Dear ; Cook. Nucleic Acid Res., 1989, vol. 17, 6795 -6807 [0099]

•

Sambrook. Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 [0103]

110

111

5 • Ausubel y colaboradores. Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, 1994, vol. 1, 2 [0103]

• R. D. D. Croy. Plant Molecular Biology Labfax. BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK), 1993 [0103]

10

Claims (18)

1. Reivindicaciones

   1.

   Método para incrementar el rendimiento de semillas de una planta con relación a las correspondientes plantas de control de tipo silvestre, que comprende la introducción y expresión de una construcción genética que contiene un ácido nucleico que codifica una Quinasa Tipo Receptora que incluye un dominio de quinasa citoplasmática, un dominio transmembrana y al menos uno pero no más de tres dominios de Repetición Ricos en Leucina en el dominio extracelular, y seleccionar las plantas que tienen mayor rendimiento de semillas.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, donde dicha Quinasa Tipo Receptora es codificada por la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que hibrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con la SEQ ID NO: 1 y en donde dicha Quinasa Tipo Receptora incluye un dominio de quinasa citoplasmática, un dominio transmembrana y al menos uno pero no más de tres dominios de Repetición Ricos en Leucina, y el motivo de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 en el dominio extracelular.

3. 3.

   Método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde el ácido nucleico que codifica dicha Quinasa Tipo Receptora es de origen vegetal, preferiblemente de una planta dicotiledónea, preferiblemente además de la familia Brassicaceae, más preferiblemente el ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.

4. 4.

   Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha molécula de ácido nucleico que codifica a dicha Quinasa Tipo Receptora está operativamente enlazada a un promotor constitutivo.

5. 5.

   Método de acuerdo a la reivindicación 4, en donde dicho promotor constitutivo es un promotor GOS2.

6. 6.

   Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho mayor rendimiento de semillas se selecciona e uno cualquiera o más de (i) mayor biomasa de semilla; (ii) mayor número de semillas (llenas); (iii) mayor tamaño de las semillas; (iv) mayor volumen de las semillas; (v) mayor índice de cosecha (HI); y (vi) mayor peso de mil granos (TKW).

7. 7.

   Planta transgénica o célula de planta transgénica que incluye una construcción genética que contiene un ácido nucleico que codifica una Quinasa Tipo Receptora como la definida en la reivindicación 1.

8. 8.

   Construcción que incluye:

   (i)

   una molécula de ácido nucleico que codifica una Quinasa Tipo Receptora como la definida en la reivindicación 1;

   (ii)

   una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) en una célula vegetal; y opcionalmente

   (iii) una secuencia de terminación de la transcripción.

9. 9.

   Una construcción de acuerdo a la reivindicación 8, en donde dicha secuencia de control es un promotor constitutivo.

10. 10.

    Una construcción de acuerdo a la reivindicación 9, en donde dicho promotor constitutivo es un promotor GOS2.

11. 11.

    Una planta o una célula vegetal que contiene una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. 12.

    Método para la producción de una plata transgénica que tiene mayor rendimiento de semilla, cuyo método comprende:

    (i)

    la introducción en una célula vegetal de una construcción genética que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una Quinasa Tipo Receptora como la definida en la reivindicación 1;

    (ii)

    el cultivo de la célula vegetal, la regeneración de plantas y el crecimiento de dichas plantas.

13. 13.

    Una planta o célula vegetal transgénica que tiene mayor rendimiento de semilla con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre que incluye una construcción genética que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una Quinasa Tipo Receptora como la definida en la reivindicación 1 en dicha planta o célula vegetal.

14. 14.

    Una planta o célula vegetal transgénica de acuerdo a la reivindicación 7, 11 ó 13, en donde dicha planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar o en donde la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, avena de centeno o sorgo; o en donde dicha célula vegetal se deriva de una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar o en donde dicha célula vegetal se deriva de un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, avena de centeno o sorgo.

15. 15.

    Partes cosechables de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7, 11, 13 ó 14, en done las partes cosechables incluyen una construcción genética que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una Quinasa Tipo Receptora como la definida en la reivindicación 1.

16. 16.

    Partes cosechables de acuerdo a la reivindicación 15, en donde dichas partes cosechables son semillas.

17. 17.

    El uso de una construcción genética como la definida en la reivindicación 1 para mejorar el rendimiento de semilla de las plantas.

18. 18.

    El uso de acuerdo a la reivindicación 17, en donde dicho rendimiento de semilla incluye uno

    83

    o más de lo siguiente: mayor número de semillas (llenas), mayor peso de las semillas, mayor índice de cosecha y mayor peso de mil granos.

    “Siguen 25 páginas de dibujos”