ES2343536T3 - Plantas que tienen caracteristicas de crecimiento mejoradas y metodo para su elaboracion. - Google Patents

Abstract

Método para mejorar las características de crecimiento de las plantas con relación a las correspondientes plantas de control, que comprende: - la introducción de una mutación de tipo T161 D en el lugar de un gen que codifica una Quinasa que Depende de la Ciclina de tipo A (CDK), y/o - la introducción y sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una CDK de tipo A con una mutación de tipo T161 D, y opcionalmente - la selección de plantas que tienen características mejoradas decrecimiento, en donde dicha mutación de tipo T161 D es una sustitución de la treonina conservada en el bucle T por ácido aspártico y en donde dicha treonina conservada corresponde a treonina en la posición 161 en la SEQ ID NO: 8.

Description

Plantas que tienen características de crecimiento mejoradas y método para su elaboración.

La presente invención se relaciona generalmente con el campo de la biología molecular y se relaciona con un método para mejorar las características de crecimiento de una planta. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para mejorar las características de crecimiento de una planta por medio de la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico de la planta que codifica una quinasa que depende de la ciclina de tipo A (CDKA) y/o por medio de la modulación de la actividad en una planta de una proteína CDKA de una planta, donde la proteína CDKA contiene una mutación del tipo T161D o donde un ácido nucleico CDKA codifica tal proteína. La presente invención también se relaciona con plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico CDKA de una planta y/o actividad modulada de una proteína CDKA de una planta, donde la proteína CDKA contiene una mutación del tipo T161D o donde el ácido nucleico codifica tal proteína y donde las plantas tienen características mejoradas de crecimiento con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre. La invención también proporciona las CDKA de una planta con un motivo PSTAIRE y una mutación del tipo T161D, y ácidos nucleicos que codifican a tales proteínas.

La población mundial siempre creciente y la disminución de la oferta de tierras cultivables disponibles para la agricultura estimulan la investigación con miras al mejoramiento de la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para mejoras hortícolas y de los cultivos utilizan técnicas selectivas de crianza para identificar las plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas selectivas de crianza tienen varios inconvenientes, a saber que esas técnicas son típicamente de mano de obra intensiva y resultan en plantas que contienen a menudo componentes genéticos homogéneos que no siempre resultan en el rasgo deseable que está siendo transmitido por las plantas madre. Los avances en biología molecular le han permitido al género humano modificar el germoplasma de animales y plantas. La modificación por ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y la manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de suministrar cultivos o plantas que tienen diferentes rasgos hortícolas, agronómicos o económicos mejorados. Una característica de interés económico particular es la productividad. Normalmente se define como el producto mensurable la productividad de valor económico de un cultivo. Esta puede ser definida en términos de cantidad y/o de calidad. La productividad de un cultivo está influenciada por los estreses típicos a los cuales están sometidos las plantas o los cultivos. Tales estreses incluyen los estreses ambientales (avióticos) (tales como los estreses por temperatura provocados por temperaturas atípicamente altas o bajas; estreses provocados por deficiencia de nutrientes; estreses provocados por la falta de agua (sequía) y estreses bióticos (que pueden ser impuestos a las plantas por otras plantas (malas hierbas) plagas de animales y patógenos). No solamente se puede incrementar la productividad de un cultivo combatiendo uno o más de los estreses a los cuales está sometida la planta o el cultivo, sino que también se puede incrementar modificando los mecanismos inherentes de crecimiento de una planta.

Los mecanismos inherentes de crecimiento de una planta residen en una secuencia altamente ordenada de eventos colectivamente conocidos como el "ciclo celular". La habilidad para influir sobre el ciclo celular en una planta (ya sea utilizando tecnología de ADN recombinante o utilizando medios no recombinantes), y por lo tanto modificar diferentes características de crecimiento de una planta, tendría muchas aplicaciones en áreas tales como el mejoramiento de un cultivo, la reproducción de una planta, la producción de plantas ornamentales, arboricultora, horticultura, silvicultura, la producción de algas o de plantas (por ejemplo para uso como biorreactores, para la producción de sustancias tales como compuestos farmacéuticos, anticuerpos, o vacunas, o para la bioconversión de residuos orgánicos o para uso como combustible en el caso de algas y plantas de alta productividad).

La progresión a través del ciclo celular es fundamental para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos multicelulares y es crucial para la proliferación celular. Los componentes principales del ciclo celular están altamente conservados en levaduras, mamíferos, y plantas. El ciclo celular típicamente se divide en las siguientes fases secuenciales: G0-G1-S-G2-M. La replicación o la síntesis del ADN generalmente tienen lugar durante la fase S ("S" es por la síntesis de ADN) y la segregación mitótica de los cromosomas se presenta durante la fase M (la "M" es por mitosis), con la intervención de fases vacías, G1 (durante la cual crecen la células antes de la replicación del ADN) y G2 (un período después de la replicación del ADN durante el cual se prepara la célula para la división). La división celular se completa después de la citocinesis, la última etapa de la fase M. Las células que han salido del sitio celular y se han vuelto inactivas se dice que están en la fase G0. Las células en esta fase pueden ser estimuladas para entrar nuevamente al ciclo celular en la fase G1. La "G" en G1, G2 y G0 representa "vacío". La terminación del proceso del ciclo celular le permite a cada célula hija durante la división celular recibir una copia completa del genoma de los
padres.

La división celular está controlada por dos eventos principales del ciclo celular, a saber, la iniciación de la síntesis del ADN y la iniciación de la mitosis. Cada transición a cada uno de estos eventos clave está controlada por un punto de control representado por complejos específicos de proteína (involucrados en la replicación y división del ADN). La expresión de los genes necesarios para la síntesis del ADN en el límite entre G1/S está regulada por la familia E2F de factores de transcripción en células vegetales y de mamíferos (WO 96/25494; Muller y colaboradores, Genes and Development 15, 267 - 285, 2001; De Veylder y colaboradores, EMBO J. 21, 13602 - 1368, 2002). La entrada en el ciclo celular es regulada/activada por un complejo E2F/Rb que integra señales y permite la activación de la transcripción de genes del ciclo celular. La transición entre las diferentes fases del ciclo celular, y por lo tanto la progresión a través del ciclo celular, está dirigida por la formación y activación de diferentes proteínas serina/treonina quinasas, generalmente denominadas como quinasas que dependen de ciclina (CDK). Un prerrequisito para la actividad de estas quinasas es la asociación física con una ciclina específica, siendo el período de activación dependiente en gran medida de la expresión de la ciclina. El enlazamiento de ciclina induce cambios conformacionales en el lóbulo N-terminal de la CDK de asociación y contribuye a la localización y especificidad del sustrato del complejo. Las CDK monoméricas se activan cuando se asocian con ciclinas y por lo tanto tienen actividad de quinasa. Los niveles de proteína ciclina fluctúan en el ciclo celular y por lo tanto representan un factor principal en la determinación del período de activación de la CDK. La activación periódica de estos complejos que contienen ciclinas y CDK durante el ciclo celular media la regulación temporal de las transiciones del ciclo celular (controles). Otros factores que regulan la actividad de la CDK incluyen inhibidores de la CDK (los CKI o los ICK, los KIP, los CIP, los INK), la CDK para activación de quinasa (CAK), CDK fosfatasa (Cdc25) y subunidad de CDK (CKS) (Mironov y colaboradores Plant Cell 11, 509 - 522, 1999; Reed, S. I. Progress in Cell Cycle Research 2, 5 - 27,
1996).

En las plantas, se han estudiado hasta la fecha dos clases principales de las CDK, conocidas como las CDK de tipo A y de tipo B. Las CDK de tipo A regulan tanto las transiciones G1 a S y G2 a M, mientras que las CDK de tipo B parecen controlar únicamente el punto de control de G2 a M (Hemerly y colaboradores, 1995; Magyar y colaboradores, 1997; Porceddu y colaboradores, 2001). Además, se ha reportado la presencia de las CDK de tipo C y quinasas para la activación de CDK (las CAK) (Magyar y colaboradores, 1997; Umeda y colaboradores, 1998; Joubes y colaboradores, 2001), como también la presencia de las CDK de tipo D, tipo E y tipo F (Vandepoele y colaboradores. Plant Cell 14, 903 -916, 2002).

Se sabe que las CDK de tipo A tienen una estructura terciaria (Goldsmith y Cobb, Curr. Opin. Struct. Biol. 4, 833 - 840), incluyendo un motivo PSTAIRE altamente conservado que está involucrado en el enlazamiento de la ciclina. El núcleo catalítico de una CDK esta compuesto de un lóbulo N-terminal y un lóbulo C-terminal. El lóbulo C-terminal abarca una hendidura catalítica (responsable por el enlazamiento de ATP y del sustrato) e incluye además el así llamado bucle T, el nombre de un residuo de treonina que se conserva en varias familias de quinasa. En CDK2 humana, este residuo de treonina está en la posición 161, mientras que en cdc28 de Saccharomyces cerevisiae cdc2 de
Schizosaccharomyces pombe esta localizado en la posición 169 y 167 respectivamente. Se ha reportado que la fosforilación de este residuo de treonina provoca un cambio en la conformación estructural en el bucle T que es necesario para cambiar el estado de la quinasa a un estado activo (Gu y colaboradores, EMBO J. 11, 3995 - 4005). Diferentes estudios describen mutaciones de la treonina conservada en el bucle T (Ducommun y colaboradores EMBO J. 10, 3311 - 3319, 1991; Gould y colaboradores EMBO J. 10, 3297 - 3309; Marcote y colaboradores Mol. Cell. Biol. 13, 5122 - 5131, 1993; Ducommun y colaboradores Mol Cell. Biol. 11, 6177 - 6184, 1991; Coleman y colaboradores J. Biol. Chem. 272, 18869 - 18874, 1997; Martinez y colaboradores EMBO J. 16, 343 - 354, 1997; Gould y colaboradores Mol. Gen. Genet. 259, 437 - 448, 1998; Booher y colaboradores Mol. Cell. Biol. 6, 3523 - 3530, 1986; Solomon y colaboradores Mol. Biol. Cell 3, 13 - 27, 1992; Lim y colaboradores Mol. Cell. Biol. 16, 4573 - 4583, 1996), todas las mutaciones analizadas mostraron tener un impacto serio sobre el enlazamiento de los ligandos (tales como la ciclina o Suc1/ICK) y/o sobre la actividad de la quinasa, resultando en fenotipos defectuosos o letales en experimentos de complementación con levadura. Aunque la mutación tipo T169E (de acuerdo con la numeración para la levadura cdc28), y por analogía también la mutación tipo T169D, imita una fosforilación, se demostró que ninguna de las CDK con tales mutaciones fue capaz de complementar totalmente la levadura. Otros residuos que juegan un papel importante en la actividad de la proteína CDK de tipo A son la treonina en la posición 14 y tirosina en la posición 15. Después de la fosforilación de al menos uno de estos aminoácidos, se inactiva la CDK. WO 99/54489 describe el uso de una CDK con treonina 14 y tirosina 15 sustituidos por alanina y fenilalanina respectivamente para incrementar la tolerancia de las plantas al estrés por salinidad. WO 00/52171 describe un método para modificar una o más propiedades o características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas medidas por citoquina de una planta, que comprende la expresión de una fosfoproteína fosfatasa Cdc25 en una planta.

Sorprendentemente se ha encontrado ahora que la expresión en una planta de una quinasa dependiente de ciclina tipo A (CDKA) con una mutación de tipo T161D produce plantas que tienen características mejoradas de
crecimiento.

Por lo tanto, de acuerdo a una modalidad de la presente invención, se proporciona un método para mejorar las características de crecimiento de una planta con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, que comprende la modulación de la actividad en una planta de una quinasa que depende de ciclina de tipo A (CDK) que tiene una mutación de tipo T161D como se define más adelante y/o la modulación de la expresión de un ácido nucleico que codifica a tal CDK de tipo A, Y opcionalmente la selección de plantas que tienen características mejoradas de crecimiento.

Convenientemente, el desempeño del método de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen una variedad de características mejoradas de crecimiento con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre y cuyas características mejoradas de crecimiento incluyen al menos una mayor productividad con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre.

El término "mayor productividad" como se define aquí pretende significar un incremento en uno o más de los siguientes, cada uno con relación a las correspondientes plantas de tipos silvestre: (i) mayor biomasa (peso) de una o más partes de una planta, particularmente las partes que están por encima del suelo (cosechables), mayor biomasa de raíces o mayor biomasa de cualquier otra parte cosechable; (ii) mayor productividad total de semillas, que incluye un incremento en la biomasa de las semillas (peso de las semillas) y que puede ser un incremento en el peso de las semillas por planta o con base en una semilla individual; (iii) mayor número de flores ("floretes") por panícula (iv) mayor número de semillas (llenas); (v) mayor tamaño de las semilla, que puede influenciar también la composición de las semillas; (vi) mayor volumen de las semillas, que puede influenciar también la composición de las semillas (incluido el contenido total y la composición del aceite, la proteína y los carbohidratos); (vii) mayor área de las semillas individuales; (viii) mayores dimensiones en cuanto al largo y/o ancho de las semillas individuales; (ix) mayor índice de cosecha, que se expresa como la proporción del rendimiento de las partes cosechables, tal como semillas, sobre la biomasa total; y (x) mayor peso de mil granos (TKW), que se extrapola a partir del número de semillas llenas contabilizadas y su peso total. Un mayor TKW puede resultar de un mayor tamaño de la semilla y/o mayor peso de la semilla. Un mayor TKW puede resultar de un incremento en el tamaño del embrión y/o el tamaño del
endospermo.

Tomando al maíz como ejemplo, una mayor productividad puede manifestarse como uno o más de los siguiente: un incremento en el número de plantas por hectárea o por acre, un incremento en el número de espigas por planta, un incremento en el número de hileras, en el número de granos por hilera, en el peso del grano, TKW, en la longitud/diámetro de las espigas, entre otros. Tomando al arroz como ejemplo, una mayor productividad puede manifestarse como un incremento en uno o más de los siguiente: en número de plantas por hectárea o por acre, en el número de panículas por planta, en el número de espiguillas por panícula, en el número de flores por panícula, un incremento en la tasa de llenado de la semillas, expresado (en %) como la proporción del número de semillas llenas sobre el número de floretes (número total de semillas), un incremento en TKW, entre otros. Un incremento en la productividad puede resultar también en una arquitectura modificada, o puede ocurrir como resultado de una arquitectura
modificada.

De acuerdo con una característica preferida, el desempeño de los métodos de acuerdo con la presente invención da como resultado plantas que tienen mayor productividad y más particularmente, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semillas. Preferiblemente, el mayor rendimiento de semillas incluye un incremento en uno o más de los siguientes: el número de semillas (llenas), el peso total de las semillas, el tamaño de las semillas, el volumen de las semillas, el peso de mil granos y el índice de cosecha, cada uno con relación a las plantas de control.

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención se provee un método para incrementar la productividad de una planta con relación a las correspondientes plantas de control, cuyo método comprende la modulación de la actividad de una CDK de tipo A en una planta, cuya CDK tiene un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D como se define más adelante, y/o la modulación de la expresión de un ácido nucleico que codifica a tal CDKA o a un homólogo de la misma.

Ya que las plantas de acuerdo a la presente invención tienen una mayor productividad, es probable que esas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (al menos durante parte de su ciclo de vida), con relación a la tasa de crecimiento de las correspondientes plantas de tipo silvestre en una etapa correspondiente en su ciclo de vida. La mayor tasa de crecimiento puede ser específica para una o más partes de una planta o tipos de células, incluyendo semillas, de una planta, o puede ser sustancialmente en todas las partes de la planta completa. Las plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede ser entendido como el tiempo necesario para crecer a partir de una semilla madura seca hasta la etapa en la cual la planta ha producido semillas maduras secas, en forma similar al material de partida. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tales como el vigor inicial, la tasa de crecimiento, el período de floración y la velocidad de maduración de la semilla. Un incremento en la tasa de crecimiento puede presentarse en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o sustancialmente durante el ciclo de vida completo de la planta. Una mayor tasa de crecimiento durante las primeras etapas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar un vigor mejorado. El incremento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo que las plantas sean sembradas más tarde y/o cosechadas más pronto de lo que sería posible. Si se incrementa suficientemente la tasa de crecimiento, se posibilitaría la siembra de más semillas de la misma especie de planta (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por la siembra y cosecha de más plantas de arroz todo dentro de un período de crecimiento convencional). En forma similar, si se incrementa suficientemente la tasa de crecimiento, se posibilitaría la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de soja, patatas o cualquier otra planta adecuada). Puede ser posible entonces realizar varias cosechas del mismo rizoma en el caso de algunas plantas. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la producción anual de biomasa por acre (debido a un incremento en el número de veces (digamos en un año) que puede ser cultivada y cosechada una planta particular). Un incremento en la tasa de crecimiento puede permitir también en cultivo de plantas transgénicas en áreas geográficas más amplias que sus contrapartes de tipo silvestre, ya que las limitaciones territoriales para el desarrollo de un cultivo a menudo están determinadas por condiciones ambientales adversas ya sea en el momento de la siembra (comienzo de la temporada) o al momento de la cosecha (fin de la temporada). Tales condiciones adversas pueden ser evitadas si se acorta el ciclo de la cosecha. La tasa de crecimiento puede estar determinada por diferentes parámetros que se derivan de las gráficas de las curvas de crecimiento de experimentos de crecimiento; tales parámetros pueden ser: T Medio (el tiempo que le toma a las plantas alcanzar el 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que le toma a las plantas el 90% de su tamaño máximo), entre otros.

\newpage

La ejecución de los métodos de la invención produce plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para incrementar la tasa de crecimiento de las plantas, el cual comprende la modulación de la actividad de una CDK o de un homólogo de la misma en una planta, en donde la CDK o el homólogo tienen un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D, y/o la modulación de la expresión de un ácido nucleico que codifica a dicha CDKA o un homólogo de la misma.

Un incremento en la productividad y/o en la tasa de crecimiento se presenta ya sea que la planta se encuentre bajo condiciones no estresantes o que la planta esté expuesta a diferentes tipos de estrés comparado con las plantas de control. Las plantas responden típicamente a la exposición al estrés desarrollándose más lentamente. En condiciones de estrés severo, la planta puede incluso detener su crecimiento completamente. Por otro lado se define aquí un estrés moderado como un tipo de estrés al cual está expuesta una planta que no conduce a que la planta deje de crecer completamente sin la capacidad para reanudar el crecimiento. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con pesticidas) no se encuentran a menudo estreses severos en plantas de cultivo. En consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por un estrés moderado es a menudo una característica indeseable para la agricultura. Los estreses moderados son los estreses típicos a los cuales puede estar expuesta una planta. Estos estreses pueden ser los estreses bióticos y/o abióticos diarios (ambientales) a los cuales está expuesta una planta. Los estreses ambientales o abióticos típicos incluyen estreses por temperatura causados por un calentamiento atípico o temperaturas frías/congelantes; estrés por salinidad; estrés por agua (sequía o exceso de agua). Los estreses abióticos pueden ser causados también por compuestos químicos. Los estreses bióticos son típicamente aquellos estreses provocados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos. El término "condiciones no estresantes" como se lo utiliza aquí son aquellas condiciones ambientales que no van significativamente más allá de las condiciones climáticas diarias y otros condiciones abióticas que pueden encontrar las plantas. Las personas capacitadas en el arte son conscientes de las condiciones normales del suelo y de las condiciones climáticas para una ubicación geográfica dada.

Las características de crecimiento anteriormente mencionadas pueden ser modificadas convenientemente en cualquier planta.

El término "planta" como se lo utiliza aquí abarca a plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y partes de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluidos tubérculos), flores, y tejidos y órganos, en donde cada uno de los anteriormente mencionados incluye al gen/ácido nucleico de interés o la modificación específica en el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca células vegetales, cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas, nuevamente donde cada uno de los anteriormente mencionados incluyen al gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen algas, helechos y todas las plantas que pertenecen a la superfamilia de Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles, o arbustos seleccionados de la lista que comprende Abelmoschus spp., Acer spp., Actinidia spp., Agropyron spp., Allium spp., Amaranthus spp., Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena sativa, Averrhoa carambola, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp., Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carthamus tinctorius, Carya spp., Castanea spp., Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Cola spp., Colocasia esculenta, Corylus spp., Crataegus spp., Cucumis spp., Cucurbita spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Eleusine coracana, Eriobotrya japonica, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp., Gossypium hirsutum, Helianthus spp., Hibiscus spp., Hordeum spp., Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lemna spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Macrotyloma spp., Malpighia emarginata, Malus spp., Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Persea spp., Petroselinum crispum, Phaseolus spp., Phoenix spp., Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Rubus spp., Saccharum spp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Solanum spp., Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp., Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre
otros.

De acuerdo a una característica preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo que incluye soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata o tabaco. Más preferiblemente, la planta de acuerdo con la presente invención es una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, lo más preferible un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, mijo, cebada, centeno, avena o sorbo.

La actividad de una proteína CDKA puede ser modulada modulando los niveles de la proteína CDKA. Alternativamente, también se puede modular la actividad cuando no existen cambios en los niveles de una proteína CDKA. Esto puede presentarse cuando se alteran las propiedades intrínsecas del polipéptido, por ejemplo elaborando un mutante. De acuerdo con una característica preferida de la invención, la actividad modulada de la proteína CDKA con una mutación de tipo T161D y/o la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica esta CDKA es una actividad introducida y/o incrementada de una proteína CDKA con una mutación de tipo T161D y/o una mayor expresión de un ácido nucleico que codifica esta CDKA.

Los términos "CDK de tipo A" o "CDKA" como se define aquí pueden ser utilizados indistintamente y abarcan cualquier secuencia de aminoácidos que tienen actividad de quinasa dependiente de la ciclina y cuya secuencia cuando se la utiliza en la construcción de un árbol filogenético de CDK, tal como aquellos descritos en la Fig. 1 y Fig. 2, agrupaciones alrededor de las CDK de tipo A en vez de cualquiera de los otros grupos de CDK y cuya secuencia de aminoácidos incluye una secuencia de aminoácidos PSTAIRE. Una persona capacitada en el arte podría determinar fácilmente si una secuencia cualquiera de aminoácidos en cuestión cae dentro de la definición de una "CDK de tipo A" utilizando técnicas conocidas y un programa para la elaboración de tal árbol filogenético, tal como un paquete GCG, EBI o CLUSTAL, utilizando parámetros por defecto (ver por ejemplo Vandepoele y colaboradores. 2002). Después de la construcción de tal árbol filogenético, las secuencias agrupadas en el grupo de CDK de tipo A se considerará que cae dentro de la definición de una "CDK de tipo A" o "CDKA", y por lo tanto serán útiles en la ejecución de los métodos de la invención. Preferiblemente la CDK de tipo A incluye además un orden creciente de preferencia al menos del 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad total de secuencia con el aminoácido representado en el GenBank con el número de acceso CAA42922 (SEQ ID NO: 8) o con su forma mutante representada por la SEQ ID NO: 2. La identidad total de la secuencia se determina utilizando un algoritmo global de alineación, tal como el algoritmo de Needleman-Wunsch en el programa GAP (GCG, Wisconsin Package, Accelrys). Preferiblemente, la CDK de tipo A pertenece a la clase 1 de las CDK de tipo A (es decir,
CDKA;1).

El término "mutación tipo T161D" se define aquí como una mutación en una CDK de la treonina conservada correspondiente a la treonina 161 en CDC2 humana o CDKA;1 del arroz en ácido aspártico.

Más particularmente, el término "CDK que tiene una mutación tipo T161D" abarca proteínas CDK que contienen una sustitución de la treonina conservada en el bucle T por ácido aspártico. La sustitución de la treonina por ácido aspártico en una proteína resulta en la introducción de una carga negativa, imitando así la carga negativa de un grupo fosfato introducido por medio de fosforilación. Los métodos para introducir mutaciones en genes que resultan en sustituciones de aminoácidos son bien conocidos en el arte e incluyen mutagénesis dirigida al sitio con oligonucleótidos o por medio del uso de la PCR.

Los diferentes dominios estructurales en una proteína CDKA son bien conocidos (De Bondt y colaboradores, Nature 363, 595 - 602, 1993) y pueden ser identificados utilizando bases de datos especializadas, por ejemplo, SMART (Schultz y colaboradores (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857 - 5864; Letunic y colaboradores (2002) Nucleic Acids Res 30, 242 - 244; http://smart.embl-heidelberg.de/), InterPro (Mulder y colaboradores, (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315 - 318; http://www.ebi.ac.uk/interpro/), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalizad profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., páginas 53 - 61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo y colaboradores, Nucl. Acids. Res. 32: D134 - D137, (2004), http://www.expasy.org/prosite/) o Pfam (Bateman y colaboradores, Nucleic Acids Research 30(1): 276 - 280 (2002), http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/).

El dominio de quinasa de CDK es de una tipo S_TKc (SMART, número de acceso SM00220, InterPro, número de acceso IPR002290), y tiene actividad de Ser/Thr quinasa. El sitio activo predicho (VLHRDLKPQNLLI, en donde D es el residuo catalítico predicho) corresponde a la firma PS00108 de PROSITE. El sitio de enlazamiento de ATP (IGEGTYGVVYRARDKVTNETIALK) corresponde a la firma PS00107 de PROSITE.

Los métodos para la búsqueda e identificación de homólogos de CDK de tipo A estrían también dentro del ámbito de las personas capacitadas en el arte. Tales métodos incluyen la comparación de las secuencias representadas por la SEQ ID NO: 1 ó 2, o por el GenBank, número de acceso CAA42922, en un forma legible para el ordenador, con secuencias que están disponibles en bases de datos públicas tales como MIPS (http://mips.gsf.de/), GenBank (hftp://www.ncbi.nim.nih.gov/Genbank/index.html) o EMBL Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/
embl/index.html), utilizando algoritmos bien conocidos en el arte para la alineación o comparación de secuencias, tales como GAP (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48; 443 - 453 (1970)), BESTFIT (utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2; 482 - 489 (1981))), BLAST (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J., J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990)), FASTA y TFASTA (W. R. Pearson y D. J. Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 - 2448 (1988)). El programa para llevar a cabo el análisis por BLAST está públicamente disponible a través del National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Los homólogos mencionados más abajo fueron identificados utilizando los parámetros por defecto de BLAST (matriz de BLOSUM62, penalización por apertura de brecha 11 y penalización por extensión de la brecha 1) y preferiblemente se utilizan secuencias de longitud completa para el análisis. Estos métodos de alineación también permiten fácilmente la identificación de la treonina conservada que corresponde a la treonina 161 en CDC2 humana o CDKA;1 de arroz (SEQ ID NO: 8).

Los ejemplos de proteínas que caen bajo la definición de "CDK de tipo A o un homólogo de la misma" incluyen a las CDK con un motivo PSTAIRE, tal como las proteínas enlistadas en la Tabla 1. Las personas capacitadas en el arte son conscientes de las diferentes técnicas que pueden ser utilizadas para la introducción de un tipo de mutación T161D dentro de estas proteínas para hacerlas útiles en los métodos de la presente invención.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Ejemplos de proteínas CDK de tipo A de la planta con sus números de acceso en el GenBank o PIR (modificados a partir de Joubès y colaboradores, Plant Mol. Biol. 43, 607 - 620, 2000)

1

Se entiende que el término "CDK de tipo A o un homólogo de la misma" no está limitado a la secuencia representada por la SEQ ID NO: 2, pero que cualquier polipéptido que reúna los criterios de tener actividad de quinasa dependiente de la ciclina, que tenga un dominio PSTAIRE, y que tenga al menos 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8, puede ser adecuado para ser utilizado con los métodos de la invención, siempre y cuando la CDKA o su homólogo incluya una mutación de tipo T161D. Preferiblemente, la CDK de tipo A o un homólogo de la misma es un ortólogo de la proteína representada por la SEQ ID NO: 8.

Para determinar la actividad de quinasa de las CDK de tipo A, se encuentran disponibles diferentes ensayos y son bien conocidos en el arte (por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes 1 y 2, Ausubel y colaboradores (1994), Current Protocols; o en línea, tal como http://www.protocol-online.org). En resumen, el ensayo de la quinasa generalmente involucra: (1) poner en contacto la proteína quinasa con un sustrato de polipéptido que contiene al sitio objetivo que va a ser fosforilado; (2) permitir la fosforilación del sitio objetivo en un amortiguador apropiado para la quinasa bajo condiciones apropiadas; (3) separar los productos fosforilados del sustrato no fosforilado después de un período adecuado de reacción. La presencia o ausencia de actividad de la quinasa se determina por medio de la presencia o la ausencia del objetivo fosforilado. Además, se pueden realizar mediciones cuantitativas. Se pueden utilizar una proteína CDK purificada, o extractos celulares que contengan o estén enriquecidos con la proteína CDK como fuente de la proteína quinasa. La histona H1 o péptidos pequeños son particularmente adecuados como sustratos. El péptido debe incluir uno o más residuos de serina, treonina, o tirosina en un motivo del sitio de fosforilación. Una compilación de sitios de fosforilación puede ser encontrada en Biochimica et Biophysica Acta 1314, 191 - 225, (1996). Además, los sustratos de péptido pueden tener convenientemente una carga neta positiva para facilitar el enlazamiento con los filtros de fosfocelulosa, (permitiendo la separación de los péptidos fosforilados de los no fosforilados y la detección de los péptidos fosforilados). Si no se conoce un motivo del sitio de fosforilación, se puede utilizar un sustrato general de Ser/Thr quinasa. Por ejemplo, el péptido "ADAQHATPPKKKRKVEDPKDF" (Marshak y colaboradores J. Cell. Biochem. 45, 391, 1991) es un sustrato específico para CDK de tipo A. Para determinar los parámetros cinéticos para la fosforilación del péptido sintético, se requiere un rango de concentraciones de péptido. Para las reacciones iniciales, se puede utilizar una concentración de péptido de 0,7 - 1,5 mM. Para cada enzima quinasa, es importante determinar el amortiguador óptimo, la fuerza iónica, y el pH para la actividad. Un amortiguador estándar para quinasa 5x generalmente contiene 5 mg/ml de BSA (Albúmina de Suero Bovino que evita la absorción de la quinasa con el tubo de ensayo), Tris-Cl 150 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 100 mM. Las concentraciones óptimas de cationes divalentes se deben determinar empíricamente para cada proteína quinasa. Los amortiguadores adecuados para el ensayo de CDK son conocidos en el arte (por ejemplo John y colaboradores, Protoplasma 161, 70 - 74, 1991). Un donante comúnmente utilizado del grupo fosforilo es ATP marcado en forma radioactiva con [gama-^{32}P] (normalmente con una concentración final de 0,2 mM). La cantidad de ^{32}P incorporada en los péptidos se puede determinar midiendo la actividad sobre las almohadillas secas de nitrocelulosa en un contador de
centelleo.

Además, tal CDKA que incluye una mutación tipo T161D y expresada bajo el control de un promotor específico para el brote en Oryza sativa, incrementa el rendimiento de semillas comparado con las correspondientes plantas de tipo silvestre. Este incremento en la producción de semillas se puede medir de diferentes maneras, por ejemplo como un incremento en el peso total de las semillas, como un incremento en el número de semillas llenas cosechadas de la planta o como un Mayor Índice de cosecha.

La actividad biológica y/o funcional de una CDKA o un homólogo de la misma de acuerdo con la presente invención incluye al menos una que tiene actividad de quinasa que depende de la ciclina o que tiene actividad que incrementa la productividad en plantas como se describió anteriormente.

La presente invención también proporciona una quinasa mutante aislada que depende de la ciclina de tipo A (CDKA), seleccionada del grupo que consiste de:

(a)

la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2;

(b)

un homólogo de una proteína como la representada por la SEQ ID NO: 2, en donde el homólogo es una CDKA de origen vegetal con actividad de quinasa que depende de la ciclina, un dominio PSTAIRE y una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente, y que tienen al menos 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8;

(c)

un fragmento activo de una secuencia de aminoácidos como el definido en (a) o (b), en donde el fragmento activo que tiene actividad de quinasa que depende de la ciclina, un dominio PSTAIRE y una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Los "fragmentos activos" de una proteína CDK de tipo A abarcan al menos 100 residuos aminoácidos de una proteína CDK de tipo A, incluyendo un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D, cuyos residuos contiguos retienen actividad biológica y/o funcional similar a la proteína de ocurrencia natural que incluye la mutación de tipo T161D.

Una CDKA o un homólogo de la misma como se definió aquí anteriormente es codificada por una molécula de ácido nucleico CDKA. El ácido nucleico que codifica una CDKA o un homólogo de la misma puede ser cualquier ácido nucleico natural o sintético. Por lo tanto, el término "molécula de ácido nucleico CDKA" o "gen CDKA" como se definió aquí es cualquier molécula de ácido nucleico (incluidas aquellas que son el resultado de la degeneración del código genético) que codifica un polipéptido CDKA o un homólogo del mismo como se definió aquí anteriormente. Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico CDKA incluyen a aquella representada por la SEQ ID NO: 1, y aquellas que codifican los homólogos anteriormente mencionados. Los ácidos nucleicos CDKA y las variantes funcionales de los mismos pueden ser adecuados en la práctica de los métodos de la invención, siempre y cuando ellos codifiquen proteínas CDKA u homólogos de las mismas que contienen una mutación de tipo T161D. Tales variantes funcionales de ácidos nucleicos CDKA incluye porciones de una molécula de ácido nucleico CDKA, variantes alélicas, variantes de empalme y/o ácidos nucleicos capaces de hibridar con una molécula de ácido nucleico CDKA. El termino "funcional" en el contexto de una variante funcional se refiere a una variante (es decir, una porción o una secuencia de hibridación), que codifica un polipéptido que tiene actividad de quinasa que depende de la ciclina y que tiene una mutación de tipo T161D.

La presente invención también proporciona una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de:

a.

una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2;

b.

una molécula de ácido nucleico que codifica un homólogo o un fragmento activo de la molécula de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 2, en donde el homólogo es una Quinasa A que Depende de la Ciclina (CDKA) de origen vegetal e incluye un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161 D como se definió anteriormente, y tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8, y donde el fragmento activo tiene actividad de quinasa que depende de la ciclina, un dominio PSTAIRE y una mutación de tipo T161 D como se definió anteriormente;

c.

una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico de (a) o (b) anteriores, o su complemento, en donde la secuencia de hibridación o el complemento de la misma codifica una proteína CDKA de una planta que incluye un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D como se definió anterior- mente;

d.

variantes alélicas de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de (a) hasta (c) anteriores, en donde las variantes alélicas codifican una proteína CDKA de una planta que incluye un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente; y

e.

variantes alternativas de empalme de un ácido nucleico de acuerdo con cualquier de (a) hasta (c), en donde las variantes alternativas de empalme codifican una proteína CDKA de una planta que incluye un motivo PSTAIRE y que tiene una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

El término porción como se definió aquí se refiere a un pedazo de un ADN que codifica una CDKA, que contiene al menos 300 nucleótidos y donde la porción codifica un polipéptido que tiene actividad de quinasa que depende de la ciclina, que tiene un motivo PSTAIRE y que tiene una mutación de tipo T161D. Se puede preparar una porción, por ejemplo, haciendo una o más supresiones al ácido nucleico CDKA. Se pueden utilizar las porciones en forma aislada o pueden estar fusionadas a otras secuencias de codificación (o no codificadoras) con el propósito, por ejemplo, de producir una proteína que combina diferentes actividades, siendo una de ellas la actividad de la quinasa que depende de la ciclina. Cuando se fusionan a otras secuencias de codificación, el polipéptido resultante producido después de la traducción puede ser más grande que aquel predicho para el fragmento CDKA. Preferiblemente, la porción funcional es una porción de un ácido nucleico CDKA, más preferiblemente una porción de la molécula de ácido nucleico como la representada por la SEQ ID NO: 1.

Otra variante de una molécula de ácido nucleico CDKA en una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar bajo condiciones de rigurosidad reducida, preferiblemente bajo condiciones rigurosas, con una molécula de ácido nucleico CDKA como se definió aquí anteriormente, donde la secuencia de hibridación codifica un polipéptido CDKA que contiene un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D. Preferiblemente, la secuencia de hibridación es una que es capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, o con un ácido nucleico que codifica uno de los homólogos mencionados anteriormente, o con una porción de cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas. Lo más preferible, la secuencia de hibridación es capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1.

El término "hibridación" como se define aquí es un proceso en donde secuencias complementarias de nucleótidos sustancialmente homólogas se aparean entre sí. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución, es decir ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El proceso de hibridación puede presentarse también con uno de los ácidos nucleicos complementarios y movilizados a una matriz tal como partículas magnéticas, partículas de Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede presentarse además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon o inmovilizado, por ejemplo, por medio de fotolitografía, por ejemplo, a un soporte de vidrio silíceo (este último conocido como arreglos o microarreglos de ácido nucleico o como chips de ácido nucleico). Con el propósito de permitir que ocurra la hibridación, generalmente se desnaturalizan térmica o químicamente las moléculas de ácido nucleico para fundir una cadena doble en donde cadenas sencillas y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración de sal, la fuerza iónica y la composición del amortiguador de
hibridación.

\newpage

Las "condiciones rigurosas de hibridación" y "las condiciones rigurosas de lavado" de el ácido nucleico tales como las hibridaciones tipo Southern y Northern son dependientes de la secuencia y son diferentes bajo parámetros ambientales diferentes. La persona capacitada es consciente de diferentes parámetros que pueden ser alterados durante la hibridación y el lavado y que o bien mantendrán o cambiaran las condiciones rigurosas.

La T_{m} es la temperatura bajo una fuerza iónica y pH definidos, a la cual 50% de la secuencia objetivo hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La T_{m} depende de las condiciones de la solución y de la composición de la base y de la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. La tasa máxima de hibridación se obtiene aproximadamente desde 16ºC hasta 32ºC por debajo de la T_{m}. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electroestática entre las dos cadenas de ácido nucleico promoviendo así la formación del híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio hasta de 0,4 M. La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 a 0,7ºC por cada porcentaje de formamida, y la adición de 50% de formamida permite que se lleve a cabo la hibridación entre 30 y 45ºC, aunque la tasa de hibridación será menor. La falta de correspondencia de pares de bases reduce la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para sondas largas, la T_{m} disminuye aproximadamente 1ºC por % de falta de correspondencia de las bases. La T_{m} se puede calcular utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:

\bullet

híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267 - 284, 1984):

T_{m}=81.5^{o}C + 16.6xlog[Na^{+}]^{a} + 0.41x%[G/C^{b}] - 500x[L^{e}]^{-1} - 0,61x%\ de\ formamida

\bullet

híbridos de ADN-ARN o ARN-ARN:

T_{m}=79.8 + 18.5 (log_{10}[Na^{+}]^{a}) + 0.58\ (%\ de\ G/C^{b}) + 11.8\ (%\ de\ G/C^{b})^{2} - 820/L^{c}

\bullet

híbridos de oligo-ADN u oligo-ARN^{d}:

Para < 20 nucleótido:

T_{m} = 2 (/_{n})

Para 20-35 nucleótidos:

T_{m} = 22 + 1,46 (/_{n})

^{a} o para otro catión monovalente, pero únicamente preciso en el rango de 0,01 - 0,4 M.

^{b} únicamente preciso para el % de GC en el rango de 30% a 75%.

^{c} L = longitud del dúplex en pares de bases.

^{d} Oligo, oligonucleótido; /_{n}, longitud efectiva del iniciador = (no. de G/C) + (no. de A/T).

\quad

Nota: para cada 1% de formamida, se reduce la T_{m} aproximadamente en 0,6 a 0,7ºC, mientras que la presencia de urea 6 M reduce la T_{m} aproximadamente en 30ºC.

\vskip1.000000\baselineskip

La especificidad de la hibridación es típicamente la función de los lavados posteriores a la hibridación. Para remover las bases resultantes de la hibridación no específica, se lavan las muestras con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de tales lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución final de lavado: entre menos la concentración de sal y más alta la temperatura de lavado, más alta la rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente en o por debajo de la rigurosidad de hibridación. Generalmente, las condiciones rigurosas adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o los procedimientos de detección de la amplificación génica son como se expuso más arriba. Se pueden seleccionar también condiciones más o menos rigurosas. Generalmente, se seleccionan condiciones de baja rigurosidad que sean aproximadamente 50ºC menores al punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media son cuando la temperatura está 20ºC por debajo de la T_{m}, y las condiciones de alta rigurosidad son cuando la temperatura está 10ºC por debajo de la T_{m}. Por ejemplo, condiciones rigurosas son aquellas que son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones de A-L; y condiciones de rigurosidad reducida son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones de M-R. Se puede controlar el enlazamiento no específico por medio del uso de una cualquiera de las técnicas conocidas, tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteína, adiciones de ARN heterólogo, ADN y SDS al amortiguador de hibridación y tratamiento con
ARNasa.

Los ejemplos de condiciones de hibridación y de lavado están enlistados en la Tabla 2:

TABLA 2

2

TABLA 2 (continuación)

3

Para los propósitos de definir el nivel de rigurosidad, convenientemente se puede hacer referencia a Sambrook y colaboradores (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989).

Después de hibridación y lavado, se pueden detectar los dúplex por medio de autorradiografía (cuando se utilizaron sondas marcadas en forma radioactiva) o por medio de quimioluminiscencia, inmunodetección, por detección fluorescente o cromogénica, dependiendo del tipo de marcación de la sonda. Alternativamente, se puede realizar un ensayo de protección de la ribonucleasa para la detección de híbridos de ARN:ARN.

Se puede derivar una molécula de ácido nucleico CDKA o una variante de la misma a partir de cualquier fuente vegetal o artificial. Este ácido nucleico se puede modificar a partir de su forma activa en composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humanan deliberada; los ácidos nucleicos COKA en la presente invención tienen al menos una mutación que provoca la sustitución de T161D. El ácido nucleico es preferiblemente de origen vegetal, ya sea de la misma especie vegetal (por ejemplo en aquella en la cual va a ser introducida) o de una especie vegetal diferente. Se puede aislar el ácido nucleico de una especie monocotiledónea, preferiblemente de la familia Poaceae, más preferiblemente de Oryza sativa. Más preferiblemente, la CDKA aislada de Oryza sativa es CDKA;1. Lo más preferible, la CDKA;1 aislada de Oryza sativa y posteriormente mutada está representada por la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos para CDKA con la mutación de tipo T161D es como la representada por la SEQ ID NO: 2.

La actividad de un polipéptido CDKA o un homólogo del mismo, que tiene una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente, y/o expresión de un ácido nucleico que codifica a dicha CDKA puede ser modulada por medio de la introducción de una modificación genética (preferiblemente en el lugar de un gen CDKA). El lugar de un gen como se define aquí se entiende que es una región genómica que incluye al gen de interés y 10 kb secuencia arriba o secuencia debajo de la región de codificación.

Se puede introducir la modificación genética, por ejemplo, por medio de uno (o más) de los siguientes métodos: TILLING, mutagénesis dirigida al sitio, evolución dirigida y recombinación homóloga o por medio de la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido CDK de tipo A o un homólogo del mismo, donde COKA o el homólogo incluyen un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente. Después de la introducción de la modificación genética sigue una etapa de selección para una mayor expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido CDK con un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D y/o de selección para una mayor actividad de un polipéptido CDK con un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D, en donde el incremento en la expresión y/o en la actividad produce plantas que tienen características mejoradas de crecimiento.

Se puede introducir también una modificación genética en el lugar de un gen CDKA utilizando la técnica de TILLING (Targeted Induced Local Lesions IN Genomes: Lesiones Locales Inducidas Dirigidas en Genomas). Esta es una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar, y para eventualmente aislar variantes de mutagénesis de una molécula de ácido nucleico que codifica una CDK de tipo A con una mutación de tipo T161D capaz de exhibir actividad de quinasa que depende de la ciclina. TILLING también permite la selección de plantas que portan tales variantes mutantes. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con métodos de selección de alto rendimiento. Las etapas típicamente seguidas en TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei y Koncz (1992), En: C Koncz, N - H Chua, J Schell, eds, Methods in Arabidopsis Research. World Scientific, Singapore, páginas 16 - 82; Feldmann y colaboradores, (1994) En: EM Meyerowitz, CR Somerville, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 137 - 172; Lightner y Caspar (1998), En: J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, páginas 91 - 104); (b) preparación y reunión del ADN de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heterodúplex en un fondo común es detectada como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación mutantes individuales; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. Los métodos para TILLING son bien conocidos en el arte (McCallum Nature Biotechnol. 18, 455 - 457, 2000, Stemple Nature Rev. Genet. 5, 145 - 150, 2004).

Se puede utilizar la mutagénesis dirigida al sitio para generar variantes de ácidos nucleicos CDKA o porciones de los mismos que retienen actividad (tal como la actividad de la quinasa que depende de la ciclina). Se encuentran disponibles diferentes métodos para lograr una mutagénesis dirigida al sitio siendo los más comunes los métodos con base en la PCR (Ver por ejemplo Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds. http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html).

También se puede utilizar evolución dirigida para generar variantes de ácidos nucleicos CDKA. Esto consiste de iteraciones de arrastre de ADN seguido por la selección apropiada para generar variantes de ácidos nucleicos CDKA o porciones de los mismos que codifican polipéptidos CDKA u homólogos o porciones de los mismos que tienen una actividad biológica modificada (Castle y colaboradores, (2004) Science 304(5674): 1151 - 4; patentes estadounidenses nos. 5.811.238 y 6.395.547).

TILLING, la mutación dirigida al sitio y la evolución dirigida son ejemplos de tecnologías que permiten la generación de nuevos alelos y variantes de CDKA que retienen la función de CDKA y que son útiles por lo tanto en los métodos de la invención.

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnologíaa estándar utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levadura o el musgo Physcomitrella. Se han descrito métodos para llevar a cabo la recombinación homóloga en plantas so solamente para plantas modelo (Offringa y colaboradores (1990) EMBO J. 9, 3077 - 3084) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo, arroz (Terada y colaboradores, (2002) Nature Biotechnol. 20, 1030 - 1034; o lida y Terada (2004) Curr. Opin. Biotechnol. 15, 132 - 138). El ácido nucleico que va a ser dirigido (que puede ser una molécula de ácido nucleico CDKA o una variante de la misma como se definió aquí anteriormente) no necesita ser dirigido al lugar de un gen CDKA, si no que puede ser introducido, por ejemplo, en regiones de alta expresión. El ácido nucleico que va a ser dirigido puede ser un alelo mejorado utilizado para remplazar el gen endógeno o puede ser introducido además al gen endógeno.

Un método preferido para introducir una modificación genética (que en este caso necesita estar en el lugar de un gen CDKA) es introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido CDKA con una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente. Un polipéptido CDKA o un homólogo del mismo como se mencionó anteriormente y adecuado para la práctica de la presente invención, es uno que tiene actividad de quinasa que depende de la ciclina y, en orden creciente de preferencia, que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8, y donde el polipéptido CDK incluye un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D. El ácido nucleico que va a ser introducido en una planta puede ser una porción o una secuencia de hibridación como se definió aquí anteriormente.

Los "homólogos" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada de la cual se deriva.

Abarcadas por el término "homólogos" se encuentran las secuencias ortólogas y parálogas, dos formas especiales de homología, que abarcan conceptos evolucionarios utilizados para describir relaciones ancestrales de genes. Preferiblemente los ortólogos y parálogos útiles en la presente invención tienen la misma estructura y actividad que una CDK de tipo A y tienen la similitud más alta con la SEQ ID NO: 8 en una búsqueda recíproca con BLAST e incluye una mutación de tipo T161D.

El término "parálogos" se relaciona con genes homólogos que resultan de una o más duplicaciones de genes dentro del genoma de una especie. Se pueden identificar fácilmente los parálogos de una CDKA llevando a cabo un análisis con BLAST contra un conjunto de secuencias de la misma especie en la secuencia pregunta.

El término "ortólogos" se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a la relación ancestral de estos genes. Se pueden encontrar fácilmente ortólogos, por ejemplo, en especies de plantas monocotiledóneas llevando a cabo la así llamada búsqueda reciproca por explosión. Esto puede hacerse por medio de una primera explosión que implica explotar la secuencia en cuestión (por ejemplo, siendo las SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, de Arabidopsis thaliana) contra cualquier base de datos de secuencia, tal como la base de datos NCBI que se encuentra públicamente disponible y que puede ser encontrada en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Si se buscaron ortólogos en el arroz, se explotaría la secuencia en cuestión, por ejemplo, contra los 28.469 clones de ADNc de longitud completa de Oryza sativa Nipponbare disponibles en NCBI. Se pueden utilizar BLASTn o tBLASTX cuando se parte de nucleótidos o BLASTP o TBLASTN cuando se parte de la proteína, con valores estándar por defecto. Se pueden filtrar los resultados de la explosión. Se explotan nuevamente las secuencias de longitud completa ya sea de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados (segunda explosión) contra las secuencias del organismo a partir del cual se deriva la secuencia en cuestión, en este caso Arabidopsis thaliana. Se comparan luego los resultados de la primera y segunda explosiones. Se identifica un parálogo en caso de que la identificación positiva de alto nivel de la segunda explosión sea de la misma especie a partir de la cual se deriva la secuencia pregunta; Se identifica un ortólogo en caso de que la identificación positiva de alto nivel no sea de la misma especie a partir de la cual se deriva la secuencia pregunta. Tal parálogo u ortólogo es considerado también un homólogo de CDKA, siempre y cuando este homólogo incluya un dominio de serina/treonina quinasa e incluya un motivo PSTAIRE. En el caso de familias grandes, se puede utilizar ClustalW, seguido por la construcción de un árbol vecino de unión, para ayudar a visualizar el agrupamiento de genes relacionados e identificar ortólogos y parálogos.

Un homólogo puede estar en la forma de una "variante de sustitución" de una proteína, es decir, donde se ha removido al menos un residuo en una secuencia de aminoácidos y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de restricciones funcionales colocadas sobre el polipéptido; las inserciones serán usualmente aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos aminoácidos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos incluyen sustituciones conservadoras de aminoácidos (Tabla 3). Para producir tales homólogos, se pueden remplazar aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tengan propiedades similares (tales como similar, hidrofobisidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o a romper estructuras de hélice \alpha o estructuras de lámina \beta). Las tablas de sustitución conservadora son bien conocidas en el arte (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company). La variante se sustitución útil en los métodos de la presente invención es una variante de sustitución de un polipéptido CDKA e incluye un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D.

TABLA 3 Ejemplos de sustituciones conservadas de aminoácidos

4

Pueden hacerse sustituciones menos conservadas en caso de que las propiedades anteriormente mencionadas de los aminoácidos no sean tan críticas.

Un homólogo puede estar también en la forma de una "variante de inserción" de una proteína, es decir en donde se introducen uno o más residuos aminoácidos en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden incluir fusiones en el terminal amino y/o en el terminal carboxilo así como inserciones dentro de la secuencia de múltiples aminoácidos o de aminoácidos individuales. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones del terminal amino o del terminal carboxilo, aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos. Los ejemplos de proteínas o péptidos de fusión del terminal amino o del terminal carboxilo incluyen al dominio de enlazamiento o al dominio de activación de un activador transcripcional como el utilizado en el sistema híbrido doble de levadura, proteínas de recubrimiento de fago, etiqueta de (histidina)6, etiqueta de glutationa S-transferasa, proteína A, proteína para enlazamiento de maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo de Tag 100, epítopo de c-myc, epítopo de FLAG®, lacZ, CMP (péptido para enlazamiento de calmodulina), epítopo de HA, epítopo de proteína C y epítopo de VSV. La variante de inserción útil en los métodos de la presente invención es una variante de inserción de un polipéptido CDKA e incluye un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D.

Los homólogos en la forma de "variantes de supresión" de una proteína se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína, y abarcan fragmentos activos.

Se pueden elaborar fácilmente variantes de aminoácidos de una proteína utilizando técnicas para síntesis de péptidos bien conocidas en el arte, tales como las síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por medio de manipulaciones de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o supresión de una proteína son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para elaboración de mutaciones en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagénesis Dirigida al Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

El polipéptido CDKA o un homólogo del mismo con un motivo PSTAIRE, puede ser también un derivado. Los "derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden incluir sustituciones, supresiones o adiciones de residuos aminoácidos de ocurrencia natural o no natural comparado con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural de la proteína, por ejemplo, como se presenta en el GenBank con número de acceso CAA42922 (SEQ ID NO: 8). Los "derivados" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden incluir residuos aminoácidos alterados, glicosilados, acilados de ocurrencia natural o residuos aminoácidos de ocurrencia no natural comparado con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural del polipéptido. Un derivado puede incluir también uno o más sustituyentes no aminoácidos comparado con la secuencia de aminoácidos de la cual se deriva, por ejemplo una molécula reportera u otro ligando, enlazado en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula reportera que se enlaza para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos de ocurrencia no natural con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína de ocurrencia natural. El derivado útil en los métodos de la presente invención es un derivado de un polipéptido CDKA e incluye un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D.

Las quinasas de tipo CDK en plantas tienen una estructura molecular, que consiste de un lóbulo N y de un lóbulo C que contienen una hendidura catalítica y un bucle T (De Bondt y colaboradores 1993). Por lo tanto, se prevé que la modificación por ingeniería genética de los dominios de la quinasa en tal forma que se retiene o se modifica la actividad de la proteína CDK, puede resultar en la creación de un mutante de CDKA que es útil para la realización de los métodos de la invención. Un tipo preferido de variante incluye a aquellas generadas por supresión, apilamiento o arrastre del dominio (ver por ejemplo He y colaboradores, Science 288, 2360 - 2363, 2000; o las patentes estadounidenses 5.811.238 y 6.395.547), siempre y cuando la CDKA resultante incluye un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D.

El polipéptido CDKA o un homólogo del mismo pueden ser codificados por una variante alternativa de empalme de una molécula de ácido nucleico o gen CDKA. El término "variante" como se lo utiliza aquí abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la cual se han cortado, reemplazado o añadido intrones y/o exones seleccionados. Tales variantes serán aquellas que codifican polipéptidos que contienen una mutación de tipo T161D y en la cual se retienen la actividad biológica de la proteína, lo cual puede lograrse reteniendo selectivamente segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser elaboradas por el hombre. Los métodos para la elaboración de tales variantes de empalme son bien conocidos en el arte. Las variantes preferidas de empalme son las variantes de empalme derivadas del ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1. Se prefieren además las variantes de empalme que codifican un polipéptido que retiene la actividad de quinasa que depende de la ciclina y que tienen un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D.

El homólogo puede ser codificado también por una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido CDKA o un homólogo del mismo, preferiblemente una variante alélica del ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1, con tal de que el polipéptido codificado por la variante alélica tenga actividad de quinasa que depende de la ciclina e incluya un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D. Existen variantes alélicas en la naturaleza y está incluido dentro de los métodos de la presente invención el uso de estos alelos naturales con tal de que estos alelos incluyan una mutación de tipo T161D. Las variantes alélicas abarcan Polimorfismo de Nucleótidos Individuales (los SNP), así como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Supresión (los INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menos a 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cadenas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de los organismos.

De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, se prevé una expresión mejorada o reforzada de la molécula de ácido nucleico CDKA o una variante de la misma de acuerdo con la invención. Los métodos para obtener una expresión reforzada o mejorada (sobreexpresión) de genes o de productos génicos están bien documentados en el arte e incluyen, por ejemplo, sobreexpresión manejada por promotores adecuados, el uso de reforzadores de transcripción o reforzadores de traducción. Se pueden introducir ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o reforzadores en una posición apropiada (típicamente secuencia arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para favorecer la expresión de un ácido nucleico CDKA o variante del mismo de acuerdo con la invención. Por ejemplo, se pueden alterar in vivo promotores endógenos por medio de mutación, supresión, y/o sustitución (ver Kmiec, patente estadounidense No. 5.565.350; Zarling y colaboradores, PCT/US93/03868), o se pueden introducir promotores aislados en una célula vegetal en la orientación apropiada y distancia del gen modificado de acuerdo con la presente invención para controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación del extremo 3'de una región para codificación de nucleótidos. La región de poliadenilación se puede derivar del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de la planta, o a partir ADN T. La secuencia del extremo 3' que va a ser añadida se puede derivar, por ejemplo, de los genes para la nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente a partir de otro gen de la planta, o menos preferiblemente a partir de cualquier otro gen eucariota.

Se puede añadir también una secuencia de un intrón a la región 5' no traducida o la secuencia de codificación de la secuencia parcial de codificación para incrementar la cantidad del mensaje de madurez que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción tanto en construcciones para expresión en plantas como en animales ha demostrado que incrementa la expresión génica tanto en ARNm como en los niveles de proteína hasta en 1000 veces (Buchman y Berg, Mol. Cell Biol. 8, 4395 - 4405 (1988); Callis y colaboradores, Genes Dev. 1, 1183 - 1200 (1987)). Tal mejora en el intrón de la expresión génica es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones del maíz, como a los intrones 1, 2, y 6 de Adh1-S, el intrón de Bronze-1 son conocidos en el arte. Ver generalmente, The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

La invención también suministra construcciones genéticas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de acuerdo con la invención.

Por lo tanto, se proporciona una construcción génica que tiene:

(i)

una molécula de ácido nucleico que codifica una CDK de tipo A que contiene un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente;

(ii)

una o más secuencia(s) de control capaz(ces) de conducir la expresión en una planta de la secuencia de ácido nucleico de (i); y opcionalmente

(iii)

una secuencia de terminación de la transcripción.

Se pueden construir construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas capacitadas en el arte. Se pueden insertar las construcciones génicas en vectores, que pueden encontrarse comercialmente disponibles, adecuadas para la transformación en plantas y adecuadas para expresión del gen de interés en las células transformadas.

Se transforman las plantas con un vector que contiene la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico CDKA o una variante del mismo de acuerdo con la presente invención). La secuencia de interés está operativamente enlazada a una o más secuencias de control (al menos a un promotor). Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" son todos utilizados en forma intercambiable aquí y deben ser tomados en un contexto amplio para referirse a secuencias reguladoras de ácido nucleico capaces de efectuar la expresión de las secuencias con las cuales están enlazadas. Abarcadas por los términos anteriormente mencionados están las secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico eucariota clásico (incluida la caja TATA que es requerida para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias, reforzadores y silenciadores activadores secuencia arriba) que modulan la expresión génica en respuesta a estímulos externos y/o de desarrollo, o en una forma específica del tejido. También está incluida dentro del término una secuencia reguladora de transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de caja -10. El término "elemento regulador" también abarca una molécula sintética de fusión o un derivado que confiere, activa o refuerza la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término "operativamente enlazado" como se lo utiliza aquí se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora sea capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Convenientemente, se puede utilizar cualquier tipo de promotor para conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico. El promotor puede se un promotor inducible, es decir, que tiene iniciación de la transcripción inducida o incrementada en respuesta a un estímulo de desarrollo, químico, ambiental o físico. Adicionalmente o alternativamente, el promotor puede ser un promotor constitutivo, es decir un promotor que se expresa predominantemente en el menos un tejido u órgano y predominantemente en cualquier etapa de la vida de la planta. Adicionalmente o alternativamente, el promotor puede ser un promotor preferido por el tejido o preferido por la célula, es decir uno que sea capaz de iniciar preferencialmente la transcripción en ciertos tejidos tales como las hojas, las raíces, tejido de las semillas, etc., o incluso en células específicas. Los promotores capaces de iniciar la transcripción únicamente en ciertos tejidos o células son denominados aquí respectivamente como "específicos del tejido", y "específicos de la célula".

Preferiblemente, el ácido nucleico CDKA o una variante del mismo de acuerdo con la invención están operativamente enlazados a un promotor específico de un brote. El término "específico de un brote" como se define aquí se refiere a un promotor que se expresa predominantemente en el brote y en cualquier etapa en la vida de la planta. El término "brote" como se lo utiliza aquí abarca todas las partes aéreas de la planta incluidos tallos y ramas, hojas, yemas, órganos reproductores, incluidas las estructuras derivadas de los brotes tales como estolones, callos, rizomas o tubérculos. Preferiblemente, el promotor específico del brote capaz de expresar preferencialmente el ácido nucleico a través del brote es un promotor débil. Se pueden analizar la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión por ejemplo acoplando el promotor a un gen reportero y analizando la expresión del gen reportero en diferentes tejidos de la planta. Un gen reportero adecuado bien conocido por personas capacitadas en el arte es la beta-glucuronidasa. Se pueden comparar entonces la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión con aquel de un promotor de referencia bien caracterizado específico del brote, tal como el promotor Cab27 (expresión débil, GenBank AP004700), o el promotor putativo protoclorofílido reductasa (expresión fuerte, GenBank AL606456). La referencia aún "promotor débil" indica un promotor que conduce la expresión de una secuencia de codificación a un nivel bajo, a saber, a niveles de aproximadamente de 1/10.000 transcriptos hasta aproximadamente 1/100.000 transcriptos, hasta aproximadamente 1/500.0000 transcriptos por célula. Contrariamente, un "promotor fuerte" conduce la expresión de una secuencia de codificación a un nivel alto, o aproximadamente de 1/10 transcriptos hasta aproximadamente 1/100 transcriptos hasta aproximadamente 1/1.000 transcriptos por célula. Lo más preferible, el promotor capaz de expresar preferencialmente al ácido nucleico a través del brote de la planta es un promotor de metalotioneina de arroz como el presentado en la SEQ ID NO: 6. Debe ser claro que la aplicabilidad de la presente invención no está restringida al ácido nucleico CDKA representado por la SEQ ID NO: 1, ni la aplicabilidad de la invención está restringida a la expresión de un ácido nucleico CDK4 cuando está conducido por el promotor de metalotioneina de la SEQ ID NO: 6. Por lo tanto, la presente invención divulga una construcción como se describió anteriormente, en donde la secuencia de control es capaz de conducir la expresión en el brote; en particular la secuencia de control tiene un perfil de expresión comparable a la del promotor de metalotioneina del arroz de la SEQ ID NO: 6.

Opcionalmente, se pueden utilizar también uno o más secuencias terminadoras en la construcción introducida en una planta. El término "terminadora" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN al extremo de una unidad transcripcional que señala el procesamiento y poliadenilación 3' de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir reforzadores transcripcionales así como de traducción. Aquellos capacitados en el arte serán concientes de secuencias terminadoras y reforzadoras que pueden ser adecuadas para uso en la realización de la invención. Tales secuencias serían conocidas o las puede obtener fácilmente una persona capacitada en el arte.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir además un origen de la secuencia de replicación, que es requerido para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo específico de célula. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una construcción genética en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo una molécula de plásmido o de cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan al, f1-ori y colE1.

La construcción genética puede incluir opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se lo utiliza aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye a cualquier gen que confiera un fenotipo sobre una célula en la cual se exprese para facilitar la identificación y/o selección de las células que son transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse entre los marcadores que confieren resistencia antibiótica o herbicida, que introducen una nueva característica metabólica o que permiten selección visual. Los ejemplo de genes marcadores seleccionables incluyen a los genes que codifican proteínas que confieren resistencia a los antibióticos (tal como nptll que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina), a herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporcionan resistencia contra el glifosato), o genes que proporcionan una característica metabólica (tal como manA que permite que las plantas utilicen manosa como fuente única de carbono). Los genes que codifican proteínas marcadoras visuales resultan en la formación de color (por ejemplo \beta-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y derivados de la misma).

La presente invención también abarca plantas o células vegetales que pueden ser obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la presente invención. La presente invención suministra por lo tanto plantas o células vegetales que pueden ser obtenidas por medio del método de acuerdo con la presente invención, en donde las plantas o células vegetales tienen dentro de ellas un ácido nucleico CDKA o una variante del mismo, que codifica una CDKA que comprende un motivo PSTAIRE y que tiene una mutación de tipo T161D.

La invención también divulga una planta, una parte de una planta o una célula vegetal que comprende una construcción como la definida anteriormente.

La invención también prové un método para la producción de células vegetales transgénicas o plantas transgénicas que tienen características mejoradas de crecimiento, que comprende la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico CDKA o una variante del mismo que codifica una CDKA que incluye un motivo PSTAIRE y que tiene una mutación de tipo T161D.

Más específicamente, la presente invención provee un método para la producción de plantas transgénicas que tiene características mejoradas de crecimiento, donde el método comprende:

(i)

la introducción en una planta o en una célula vegetal de un ácido nucleico que codifica una CDK de tipo A que contiene una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente; y

(ii)

el cultivo de la célula vegetal bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta.

Se puede introducir directamente el ácido nucleico en una célula vegetal o en la misma planta (incluida la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta). De acuerdo a una característica preferida de la presente invención, se introduce preferiblemente el ácido nucleico en una planta por medio de transformación.

El término "transformación" como se mencionó aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido de la planta capaz de una propagación clónica subsiguiente, ya sea por organogénesis o por embriogénesis, puede ser transformado con una construcción genética de la presente invención y una planta completa regenerada a partir de allí. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas clónicos de propagación disponibles para, y mejor adaptados para, la especie particular que esta siendo transformada. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, mega gametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemas de la raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotiledón). El polinucleótido puede ser introducido en forma transitoria o estable en una célula huésped y puede ser mantenido en forma no integrada, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede estar integrado en el genoma huésped. La célula vegetal transformada resultante puede ser utilizada entonces para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas capacitadas en el
arte.

La transformación de una especie de planta es ahora una técnica bastante rutinaria. Convenientemente, se puede utilizar cualquiera de los diferentes métodos de transformación para introducir el gen de interés en un ancestro adecuado de la célula. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que incrementan la aceptación de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microinyección. Se pueden seleccionar los métodos a partir del método con calcio/polietilén glicol para protoplastos (Krens y colaboradores (1982) Nature 296, 72 - 74; Negrutiu y colaboradores (1987) Plant Mol. Biol. 8, 363 - 373); electroporación de protoplastos (Shillito y colaboradores (1985) Bio/Technol 3, 1099 - 1102); microinyección dentro del material de la planta (Crossway y colaboradores (1986) Mol. Gen. Genet. 202, 179 - 185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein y colaboradores (1987) Nature 327, 70); Infección (no integradora) con virus y similares. Las plantas de arroz transgénico que expresan una CDKA de acuerdo con la presente invención son preferiblemente producidas a través de transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación de arroz, tal como se describe en cualquiera de los siguientes documentos: solicitud de publicada de patente europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199, 612 - 617, 1996); Chan y colaboradores (Plant Mol. Biol. 22, 491 - 506, 1993), Hiei y colaboradores (Plant J. 6, 271 - 282, 1994). En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como el descrito ya sea por Ishida y colaboradores (Nature Biotechnol. 14, 745 - 50, 1996) o Frame y colaboradores (Plant Physiol. 129, 13 - 22, 2002).

Generalmente después de la transformación, se seleccionan células vegetales o las agrupaciones celulares por la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes expresables en la planta cotransformados con el gen de interés, después de lo cual se regenera el material transformado en una planta completa.

Después de la transferencia y regeneración del ADN, se pueden evaluar las plantas putativamente transformadas, por ejemplo utilizando análisis tipo Southern, por la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, se pueden monitorear los niveles de expresión del ADN recientemente introducido utilizando análisis tipo Northern y/o tipo Western siendo ambas técnicas bien conocidas por las personas ordinariamente capacitas en el arte.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar por medio de una variedad de medios, tales como por medio de propagación clónica o por medio de técnicas clásicas de reproducción. Por ejemplo, una primera generación de plantas transformadas (o T1) puede ser autofecundada para producir una segunda generación de transformantes homocigotos (o T2), y se pueden propagar adicionalmente las plantas T2 a través de técnicas clásicas de reproducción.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; los transformantes clónicos (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado a un vástago no transformado).

La presente invención divulga una célula vegetal o una planta producidas u obtenidas por medio de cualquiera de los métodos descritos aquí, y partes de la planta y propágulos de la misma. La presente invención también revela la progenie de una célula primaria transformada o transfectada, tejido, órgano o planta completa que ha sido producida por medio de cualquiera de los métodos anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la progenie exhiba la misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) como aquellas producidas en los padres por medio de los métodos de acuerdo con la invención.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico CDK aislado de una planta o una variante del mismo, que codifica una CDK de tipo A que contiene una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente. Las células huésped preferidas de cuerdo con la invención son células vegetales.

La invención también divulga partes cosechables de una planta de acuerdo con la invención tales como, pero sin limitarse a semillas, hojas, frutos, flores, tallos, rizomas, tubérculos y bulbos en donde dichas partes cosechables incluyen un ácido nucleico aislado que codifica una CDK de tipo A con una mutación T161D como se definió anteriormente. La invención se relaciona además con productos derivados, preferiblemente directamente derivados, de una parte cosechable de tal planta, tal como partículas secas o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón y proteínas, en donde dichos productos incluyen un ácido nucleico aislado que codifica una CDK de tipo A con una mutación T161 D como se definió anteriormente.

La presente invención abarca además el uso de una mutación de tipo T161 D en una proteína CDKA para mejorar las características de crecimiento de las plantas; tales características mejoradas de crecimiento son como se definió aquí anteriormente.

La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos CDKA o variantes de los mismos, y el uso de polipéptidos CDKA u homólogos de los mismos, donde la CDKA o el homólogo incluyen una mutación de tipo T161 D como se definió anteriormente, o donde el ácido nucleico CDKA o la variante codifica tal proteína. Un uso tal se relaciona con la mejora de las características de crecimiento de las plantas, en particular con la mejora en la productividad, especialmente la productividad de las semillas. La productividad de semillas puede incluir uno o más de lo siguiente: mayor número total de semillas, mayor número de semillas llenas, mayor peso de las semillas, mayor índice de cosecha, entre otros.

Los ácidos nucleicos CDKA o variantes de los mismos, o polipéptidos CDKA u homólogos de los mismos, pueden encontrar uso en programas de reproducción en los cuales se identifica un marcador de ADN que puede estar genéticamente enlazado a un gen CDKA o una variante del mismo. La CDKA o variantes de las mismas, o CDKA u homólogos de las mismas, pueden ser utilizados para definir un marcador molecular. Este ADN o marcador de proteína pueden ser utilizados luego en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen características mejoradas de crecimiento. El gen CDKA o una variante del mismo pueden, por ejemplo, ser un ácido nucleico como el representado por la SEQ ID NO: 1, o un ácido nucleico que codifica a cualquiera de los homólogos como se definió
aquí.

Las variantes alélicas de una CDKA, donde las variantes incluyen una mutación T161 D pueden encontrar también uso en programas de reproducción asistida por marcadores. Tales programas de reproducción requieren algunas veces de la introducción de una variación alélica por medio de tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagénesis EMS; alternativamente, el programa puede iniciar con una colección de variantes alélicas del así llamado origen "natural" causado en forma no intencional. La identificación de variantes alélicas tiene lugar entonces, por ejemplo, por medio de PCR. Esto es seguido por una etapa de selección para la selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y la cual produce características de crecimiento mejoradas en una planta. La selección se lleva a cabo típicamente por medio del monitoreo del desempeño del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de la SEQ ID NO: 1, o de ácidos nucleicos que codifican a cualquiera de los homólogos anteriormente mencionados. El desempeño de crecimiento puede ser monitoreado en un invernadero o en el campo. Otras etapas opcionales incluyen el cruzamiento de plantas, en las cuales se identificó la variante alélica superior, con otra planta. Esto podría ser utilizado, por ejemplo, para hacer una combinación de rasgos fenotípicos interesantes.

Se pueden utilizar también ácidos nucleicos CDKA de acuerdo con la invención para cartografiar genética y físicamente los genes de los cuales hacen parte, y como marcadores para rasgos enlazados con esos genes. Tal información puede ser útil en reproducción de plantas con el propósito de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de ácidos nucleicos CDKA o de variantes de los mismos requieren únicamente de una secuencia de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos CDKA o las variantes de los mismos pueden ser utilizados como marcadores de polimorfismo con longitud de fragmento de restricción (RFLP). Las transferencias tipo Southern de ADN genómico de la planta digerido con enzimas de restricción pueden ser sondadas con los ácidos nucleicos CDKA o variantes de los mismos. Los patrones de las bandas resultantes pueden ser luego sometidos a análisis genético utilizando programas de computador tales como MapMaker (Lander y colaboradores (1987) Genomics 1, 174 - 181) con el propósito de construir un mapa genético. Además, se pueden utilizar ácidos nucleicos para sondar transferencias tipo Southern que contienen los ADN genómicos tratados con endonucleasa de restricción de un grupo de individuos que representan a los padres y a la progenie de un cruce genético definido. La segregación de los polimorfismos de ADN es anotado y utilizado para calcular la posición del ácido nucleico CDKA o de una variante del mismo en el mapa genético previamente obtenido utilizando esta población (Botstein y colaboradores (1980) Am. J. Hum. Genet. 32, 314 - 331).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes de plantas para uso en cartografía genética están descritos en Bematzky y Tanksley (Genetics 112, 887 - 898, 1986). Numerosas publicaciones describen la cartografía genética de clones específicos de ADNc utilizando la metodología esbozada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, las poblaciones con entrecruzamiento F2, las poblaciones con retrocruzamiento, las poblaciones apareadas en forma aleatoria, las líneas casi isogénicas, y otros grupos de individuos pueden ser utilizados para cartografía. Tales metodologías son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte.

Se pueden utilizar también sondas de ácido nucleico para cartografía física (es decir, colocación de secuencias sobre mapas físicos; ver Hoheisel y colaboradores En: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, páginas. 319 - 346, y las referencias citadas allí).

En otra modalidad, se pueden utilizar sondas de ácido nucleico en cartografía directa de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7, 149 - 154). Aunque los métodos actuales de cartografía por FISH favorecen el uso de clones grandes (desde unos pocos hasta varios cientos de kb; ver Laan y colaboradores (1995) Genome Res. 5, 13 - 20), las mejoras en sensibilidad pueden permitir la realización de cartografía por FISH utilizando sondas más cortas.

Se pueden llevar a cabo una variedad de métodos con base en la amplificación de ácido nucleico de cartografía genética y física utilizando los ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11, 95 - 96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR, (CAPS; Sheffield y colaboradores (1993) Genomics 16, 325 - 332), ligación específica de alelos (Landegren y colaboradores (1988) Science 241, 1077 - 1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18, 3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter y colaboradores (1997) Nat. Genet. 7, 22 - 28) y Happy Mapping (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17, 6795 - 6807). Para estos métodos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de iniciadores para uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión del iniciador. El diseño de tales iniciadores es bien conocido por aquellos capacitados en el arte. En métodos que emplean cartografía genética con base en PCR, puede ser necesario identificar diferencias en la secuencia de ADN entre los padres del mapeo cruzado en la región correspondiente a la presente secuencia de ácido nucleico. Esto, sin embargo, generalmente no es necesario para métodos de cartografía.

De este modo, se puede llevar a cabo la generación, identificación y/o aislamiento de plantas mejoradas con actividad modulada de quinasa que depende de la ciclina mostrando características de crecimiento mejoradas.

La invención también divulga una composición que contiene una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una CDK de tipo A como se definió anteriormente y una composición que contiene una CDK de tipo A como se definió anteriormente.

Los ácido nucleicos CDKA o variantes de los mismos o polipéptidos CDKA u homólogos de los mismos de acuerdo con la presente invención pueden encontrar uso también como reguladores de crecimiento. Ya que se ha mostrado que estas moléculas son útiles en el mejoramiento de las características de crecimiento de las plantas, serían también reguladoras de crecimiento útiles, tal como herbicidas o estimuladoras del crecimiento. La presente invención proporciona por lo tanto una composición que contiene un CDKA o una variante del mismo o un polipéptido CDKA u homólogo del mismo, junto con un portador, diluyente o excipiente adecuado, para uso como regulador del crecimiento, en donde CDKA o el homólogo incluyen una mutación T161 D como se definió anteriormente, o donde CDKA o la variante codifican tal proteína.

Los métodos de acuerdo con la presente invención resultan en plantas que tienen características de crecimiento mejoradas, como se describió aquí anteriormente. Estas características de crecimiento convenientes pueden ser combinadas también con otras características económicamente ventajosas, tales como características adicionales de mejoramiento de la productividad, tolerancia a diferentes estreses, características que modifican diferentes rasgos arquitectónicos y/o rasgos bioquímicos y/o fisiológicos.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción de las figuras

Se describirá ahora la presente invención con referencia a las siguientes figuras en las cuales:

La Fig. 1 presenta un árbol filogenético de quinasas que dependen de la ciclina con un motivo PSTAIRE (o las CDK de tipo A).

La Fig. 2 muestra la agrupación de las CDK de tipo A de la Figura 1 con más detalle.

La Fig. 3 detalla ejemplos de secuencias útiles en la realización de los métodos de acuerdo con la presente invención. La SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 representan la secuencia de nucleótidos y de proteína de la CDKA utilizada en los ejemplos. El codón de inicio y de detención están indicados en negrilla en la SEQ ID NO: 1; la mutación esta indicada en negrilla y subrayada en la SEQ ID NO: 1 y 2. La SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 son secuencias iniciadoras utilizadas para el aislamiento del ácido nucleico CDKA;1. La SEQ ID NO: 5 representa al casete de expresión utilizado en la presente invención, que incluye al promotor de metalotioneina (referencia interna PRO0109, nucleótidos 1 - 1208), la secuencia de codificación para la CDKA mutada (referencia interna CDS0644_1 (nt 1285 - 2170) y el terminador (nt 2275 - 2709). La SEQ ID NO: 6 es la secuencia del promotor de metalotioneina.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Se describirá ahora la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos, que son únicamente para propósitos de ilustración.

Manipulación de ADN: a menos que se establezca otra cosa, se llevan a cabo las técnicas de ADN recombinante de acuerdo a protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y colaboradores (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.
html). Los materiales y métodos estándar para trabajo molecular en plantas están descritos en Plant Molecular Biology Labfax (1993) porR. D. D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Clonación Génica

Se clonó la CDKA;1 de Oryza sativa y posteriormente se hizo mutagénesis para la introducción de la sustitución de T161 D utilizando técnicas estándar. A continuación se amplificó la CDKA;1 mutante (código interno CDS0644_7) por medio de PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa en condiciones estándar y los iniciadores Prm04553 (SEQ ID NO: 3, sentido) y Prm04554 (SEQ ID NO; 4, complementario inverso), que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway. Se purificó el fragmento PCR resultante con métodos estándar. Se llevó a cabo entonces la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway®, un "clon de entrada", p06. Se adquirió el plásmido pDONR201 a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Construcción del Vector y Transformación del Arroz

Se utilizó posteriormente el clon de entrada p06 en una reacción LR con p03390, un vector de destinación utilizado para transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los bordes del ADN T, un marcador seleccionable de planta; un casete de expresión de un marcador visual; y un casete Gateway destinado a recombinación in vivo de LR con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Se localizó un promotor de metalotioneina de arroz para expresión específica en el retoño secuencia arriba de este casete Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR se transformó el vector de expresión resultante p017, que contiene al casete de expresión de la SEQ ID NO: 5, dentro de la cepa LBA4404 de Agrobacterium y posteriormente en plantas de Oryza sativa. Se les permitió a las plantas de arroz transformadas crecer y luego fueron examinadas para los parámetros descritos en el Ejemplo 3.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Evaluación de los Transformantes: Mediciones de Crecimiento

Aproximadamente se generaron 15 a 20 transformantes dependientes T0. Se transfirieron los transformantes primarios desde las cámaras de cultivo de tejidos hasta un invernadero para crecimiento y cosecha de semillas T1. Cuatro eventos de los cuales se retuvo la progenie T1 segregada 3:1 por la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos, se seleccionaron 10 plántulas T1 que contenían al transgén (hetero y homocigotos), y 10 plántulas T1 que carecían del transgén (nulicigotos), por medio de selección del marcador visual. Se transfirieron las plantas seleccionadas T1 a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta única con código de barras para enlazar en forma inequívoca los datos de fenotipificación con la planta correspondiente. Se cultivaron las plantas T1 seleccionadas sobre suelo en macetas de 10 cm de diámetro bajo las siguientes ajustes ambientales: período de luz = 11,5 h, intensidad de luz natural = 30.000 lux o más, temperatura durante el día = 28ºC o superior, temperatura durante la noche = 22ºC, humedad relativa = 60 - 70%.

Se cultivaron las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotos lado a lado en posiciones aleatorias. A partir de la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, se pasaron las plantas varias veces a través de un gabinete para formación de imágenes digitales. En cada instante de tiempo se tomaron imágenes digitales (2048 x 1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta al menos a partir de 6 ángulos diferentes.

Se cosecharon las panículas primarias maduras, se ensacaron, se marcaron con código de barras y luego se secaron durante tres días en el horno a 37ºC. Se trillaron luego las panículas y se recogieron todas las semillas. Se separaron las vainas llenas de las vacías utilizando un dispositivo de soplado de aire. Después de la separación, se contaron luego ambos lotes de semillas utilizando una máquina contadora comercialmente disponible. Se descartaron las vainas vacías. Se pesaron las vainas llenas en una balanza analítica y se midió el área de sección transversal de las semillas utilizando formación de imágenes digitales. Este procedimiento condujo al conjunto de parámetros relacionados con la semilla descritos más adelante.

Estos parámetros se obtuvieron en una forma automatizada a partir de las imágenes digitales utilizando un software para análisis de imágenes y se hizo un análisis estadístico. Se utilizó un ANOVA de dos factores (análisis de varianza) corregido por el diseño desequilibrado como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una prueba F sobre todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con ese gen. Se realizó la prueba F para verificar el efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para verificar un efecto total del gen, también denominado aquí como un "efecto génico global". Si el valor de la prueba F mostró que los datos eran significativos, entonces se concluyó que existió un efecto "génico", lo cual significa que no solamente la presencia o la posición del gen fue la causante del efecto. El umbral de significancia para un efecto génico global verdadero se estableció en un nivel de probabilidad del 5% para la prueba F.

Para verificar el efecto de los genes dentro de un evento, es decir, para un efecto específico de línea, se realizó una prueba t dentro de cada evento utilizando conjuntos de datos de las plantas transgénicas y de las correspondientes plantas nulas. "Plantas nulas" o "segregantes nulos" o "nulicigotos" se refiere a las plantas tratadas en la misma forma que las plantas transgénicas, pero a partir de las cuales se segregó el transgén. Se pueden describir también plantas nulas como las plantas homocigotos transformadas negativas. El umbral de significación para la prueba t fue establecido en un nivel de probabilidad del 10%. Los resultados para algunos eventos pueden estar por encima o por debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis de que un gen puede tener únicamente un efecto en ciertas posiciones en el genoma, y que la ocurrencia de este efecto que depende de la posición no es poco común. Esta clase de efecto génico también denominado aquí como un "efecto de línea del gen". Se obtuvo el valor p por comparación del valor t con la distribución t o alternativamente, por comparación del valor F con la distribución F. El valor p conduce a la probabilidad de que la hipótesis nula (es decir, que no exista efecto del transgén) sea correcta.

Los datos obtenidos en el primer experimento fueron confirmados en un segundo experimento con plantas T2. Se seleccionaron tres líneas para análisis adicionales. Se seleccionaron lotes de semillas de las plantas positivas (tanto hetero como homocigotas) en T1 monitoreando la expresión del marcador. Para cada evento escogido, se retuvieron luego los lotes de semillas heterocigotas para evaluación T2. Dentro de cada lote de semillas, se cultivaron un número igual de plantas positivas y negativas en el invernadero para evaluación.

Se evaluó un número total de 120 plantas transformadas en la generación T2, esto es, 40 plantas por evento de las cuales 20 fueron positivas para el transgén y 20 negativas.

Debido a que se llevaron a cabo dos experimentos con eventos de solapamiento, se llevó a cabo un análisis combinado. Esto es útil para verificación de la consistencia de los efectos sobre los dos experimentos, y si es el caso, para acumular evidencia a partir de ambos experimentos con el propósito de incrementar la confianza en la conclusión. El método utilizado fue un modelo mezclado. El método utilizado fue una aproximación de un modelo mezclado que tiene en cuenta la estructura multinivel de los datos (es decir experimento - evento - segregantes). Se obtuvieron los valores p por comparación de la prueba de razón de verosimilitud con las distribuciones chi cuadrado.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Evaluación de Transformantes: Medición de Parámetros Relacionados con la Productividad

Después del análisis de las semillas como se describió anteriormente, los inventores encontraron que las plantas transformadas con la construcción génica CDK que codifica una CDK de tipo A con una mutación de tipo T161 D tenían un mayor número de semillas llenas, un mayor peso total de semillas y un mayor índice de cosecha comparado con las plantas que carecen del transgén CDKA.

Se obtuvieron nuevamente los resultados positivos obtenidos para plantas en la generación T1, en la generación T2. En la Tabla 4, los datos muestran incrementos en el % total de biomasa y TKW, calculado a partir de los datos de las líneas individuales de la generación T2, y los respectivos valores p. Estos datos T2 fueron reevaluados en un análisis combinado con los resultados para la generación T1, y los valores p obtenidos mostraron que los efectos observados eran significativos (Tabla 4).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

5

\vskip1.000000\baselineskip

Número de semillas llenas

Se determinó el número de semillas llenas por medio del recuento del número de vainas llenas que quedaron después de la etapa de separación. 3 de las 4 líneas analizadas mostraron un incremento en el número de semillas llenas, hasta una cantidad del 186%. Hubo un incremento total del 62% en el número de semillas llenas producidas por plantas transgénicas con relación a los correspondientes segregantes nulos, cuyo incremento es estadísticamente significativo (valor p de 0,0012). En la generación T2 hubo un incremento para 2 de las 3 líneas analizadas. El incremento promedio para las líneas T2 fue del 14%, esto significa que el incremento fue también estadísticamente significativo (valor p de 0,0230). El análisis combinado de los datos de T1 y T2 también confirmó que el efecto génico global fue altamente significativo (valor p de 0,0000).

\vskip1.000000\baselineskip

Rendimiento total de semillas

Se midió el rendimiento total de semillas (peso total de las semillas) por planta pesando todas las vainas llenas cosechadas de una planta. 3 de las 4 líneas transgénicas T1 mostraron un incremento en el peso total de las semillas, que varió entre 43 y 178%. En promedio, el incremento en el rendimiento de semilla fue del 60% y este efecto total de la presencia del transgén sobre el rendimiento de las semillas fue significativo, como se evidencia por medio del valor P de la prueba F de 0,0019. Estos resultados fueron observados también en la generación T2. Las 3 líneas analizadas tuvieron un incremento en el rendimiento entre 14 y 48% con un promedio del 28%. El incremento promedio (15%) fue estadísticamente significativo (valor p de 0,0392) y también el análisis combinado de las plantas T1 y T2 mostró que existió un efecto génico global (valor p de 0,0002).

\vskip1.000000\baselineskip

Índice de cosecha

El índice de cosecha en la presente invención se define aquí como la relación entre el rendimiento total de semilla y el área por encima del suelo (mm^{2}), multiplicado por un factor 10^{6}. Todas las 4 líneas analizadas mostraron un mayor índice de cosecha, en el rango entre 9 y 229%. Existió un efecto génico total significativo (un efecto asociado con la presencia del transgén) sobre el índice de cosecha (un incremento total del 82%), con un valor t estadísticamente significativo para la prueba F de 0,0000. Se obtuvieron resultados similares para las plantas T2. El índice de coseche mostró un incremento total del 17% (valor p de 0,0110). Aquí también, el análisis combinado de los datos de T1 y T2 mostró un efecto génico global (valor p de 0,0000).

Además, existió una tendencia por un mayor número total de semillas. 3 de las 4 líneas T1 mostraron un incremento en el número total de semillas (un incremento total del 15%), estos resultados fueron confirmados en la generación T2 (un incremento total del 9%) y después de un análisis combinado se observó que estos incrementos son significativos (valor p de 0,0211).

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9625494 A [0005]

\bullet US 5565350 A, Kmiec [0067]

\bullet WO 9954489 A [0007]

\bullet US 9303868 W, Zarling [0067]

\bullet WO 0052171 A [0007]

\bullet EP 1198985 A1 [0085]

\bullet US 5811238 A [0050] [0064]

\bullet EP 04106225 A [0122]

\bullet US 6395547 A [0050] [0064]

\bullet US 60634015 B [0122]

Literatura citada en la descripción que no es de patente

\bulletMuller y colaboradores. Genes and Development, 2001, vol. 15, 267 - 285 [0005]

\bullet De Veylder y colaboradores. EMBO J., 2002, vol. 21, 13602 - 1368 [0005]

\bulletMironov y colaboradores. Plant Cell, 1999, vol. 11, 509 - 522 [0005]

\bulletReed, S. I. Progress in Cell Cycle Research, 1996, vol. 2, 5 - 27 [0005]

\bulletVandepoele y colaboradores. Plant Cell, 2002, vol. 14, 903 - 916 [0006]

\bulletGoldsmith; Cobb. Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 4, 833 - 840 [0007]

\bulletGu y colaboradores. EMBO J., vol. 11, 3995 - 4005 [0007]

\bulletDucommun y colaboradores. EMBO J., 1991, vol. 10, 3311 - 3319 [0007]

\bulletGould y colaboradores. EMBO J., vol. 10, 3297 - 3309 [0007]

\bulletMarcote y colaboradores. Mol. Cell. Biol., 1993, vol. 13, 5122 - 5131 [0007]

\bulletDucommun y colaboradores. Mol Cell. Biol., 1991, vol. 11, 6177 - 6184 [0007]

\bulletColeman y colaboradores. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 18869 - 18874 [0007]

\bulletMartínez y colaboradores. EMBO J., 1997, vol. 16, 343 - 354 [0007]

\bulletGould y colaboradores. Mol. Gen. Genet., 1998, vol. 259, 437 - 448 [0007]

\bulletBooher y colaboradores. Mol. Cell. Biol., 1986, vol. 6, 3523 - 3530 [0007]

\bulletSolomon y colaboradores. Mol. Biol. Cell, 1992, vol. 3, 13 - 27 [0007]

\bulletLim y colaboradores. Mol. Cell. Biol., 1996, vol. 16, 4573 - 4583 [0007]

\bullet De Bondt y colaboradores. Nature, 1993, vol. 363, 595 - 602 [0025]

\bulletSchultz y colaboradores. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95, 5857 - 5864 [0025]

\bulletLetunic y colaboradores. Nucleic Acids Res, 2002, vol. 30, 242 - 244, http://smart.embl-heidelberg.de [0025]

\bulletMulder y colaboradores. Nucl. Acids. Res., 2003, vol. 31, 315 - 318, http://www.ebi.ac.uk/interpro [0025]

\bullet A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. Bucher; Bairoch. ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. AAAIPress, 53 - 61 [0025]

\bulletHulo y colaboradores. Nucl. Acids. Res., 2004, vol. 32, D134 - D137, http://www.expasy.org/prosite [0025]

\bulletBateman y colaboradores. Nucleic Acids Research, 2002, vol. 30 (1), 276 - 280, http://www.sanger.ac.uk/
Software/Pfam [0025]

\bulletNeedleman; Wunsch. J. Mol. Biol., 1970, vol. 48, 443 - 453 [0027]

\bulletSmith; Waterman. Advances in Applied Mathematics, 1981, vol. 2, 482 - 489 [0027]

\bulletAltschul, S. F.; Gish, W.; Miller, W.; Myers, E. W.; Lipman, D. J. J. Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403 -410 [0027]

\bullet W. R. Pearson; D. J. Lipman. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 2444 - 2448 [0027]

\bulletAusubel y colaboradores Current Protocols in Molecular Biology, 1994, vol. 1, 2 [0030]

\bulletBiochimica et Biophysica Acta, 1996, vol. 1314, 191 -225 [0030]

\bulletMarshak y colaboradores. J. Cell. Biochem., 1991, vol. 45, 391 [0030]

\bulletJohn y colaboradores. Protoplasma, 1991, vol. 161, 70 - 74 [0030]

\bulletMeinkoth; Wahl. Anal. Biochem., 1984, vol. 138, 267 - 284 [0040]

\bulletSambrook y colaboradores. Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, 2001 [0043]

\bullet Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1989 [0043]

\bulletRedei; Koncz. Methods in Arabidopsis Research. World Scientific, 1992, 16 - 82 [0048]

\bulletFeldmann y colaboradores. Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994, 137 - 172 [0048]

\bulletLightner; Caspar. Methods on Molecular Biology. Humana Press, 1998, vol. 82, 91 - 104 [0048]

\bulletMcCallum. Nature Biotechnol., 2000, vol. 18, 455 - 457 [0048]

\bulletStemple Nature Rev. Genet., 2004, vol. 5, 145 - 150 [0048]

\bulletAusubel y colaboradores. Current Protocols in Molecular Biology [0049]

\bulletCastle y colaboradores. Science, 2004, vol. 304 (5674), 1151-4 [0050]

\bulletOffringa y colaboradores. EMBO J., 1990, vol. 9, 3077 - 3084 [0052]

\bulletTerada y colaboradores. Nature Biotechnol., 2002, vol. 20, 1030 - 1034 [0052]

\bulletTerada. Curr. Opin. Biotechnol., 2004, vol. 15, 132 - 138 [0052]

\bulletCreighton. Proteins. W.H. Freeman and Company, 1984 [0058]

\bulletHe y colaboradores. Science, 2000, vol. 288, 2360 - 2363 [0064]

\bulletBuchman; Berg. Mol. Cell Biol., 1988, vol. 8, 4395 - 4405 [0069]

\bulletCallis y colaboradores. Genes Dev., 1987, vol. 1, 1183 - 1200 [0069]

\bullet The Maize Handbook. Springer, 1994 [0069]

\bulletKrens y colaboradores. Nature, 1982, vol. 296, 72 - 74 [0085]

\bulletNegrutiu y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1987, vol. 8, 363 - 373 [0085]

\bulletShillito y colaboradores. Bio/Technol, 1985, vol. 3, 1099 - 1102 [0085]

\bulletCrossway y colaboradores. Mol. Gen. Genet., 1986, vol. 202, 179 - 185 [0085]

\bulletKlein y colaboradores. Nature, 1987, vol. 327, 70 [0085]

\bulletAldemita; Hodges. Planta, 1996, vol. 199, 612 - 617 [0085]

\bulletChan y colaboradores. Plant Mol. Biol., 1993, vol. 22, 491 - 506 [0085]

\bulletHiei y colaboradores. Plant J., 1994, vol. 6, 271 - 282 [0085]

\bulletIshida y colaboradores. Nature Biotechnol., 1996, vol. 14, 745 - 50 [0085]

\bulletFrame y colaboradores. Plant Physiol., 2002, vol. 129, 13 - 22 [0085]

\bulletLander y colaboradores. Genomics, 1987, vol. 1, 174 -181 [0097]

\bulletBotstein y colaboradores. Am. J. Hum. Genet., 1980, vol. 32, 314 - 331 [0097]

\bulletBematzky; Tanksley. Genetics, 1986, vol. 112, 887 - 898 [0098]

\bulletHoheisel y colaboradores. Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide. Academic press, 1996, 319 -346 [0099]

\bulletTrask. Trends Genet., 1991, vol. 7, 149 - 154 [0100]

\bulletLaan y colaboradores. Genome Res., 1995, vol. 5, 13 - 20 [0100]

\bulletKazazian. J. Lab. Clin. Med., 1989, vol. 11, 95 - 96 [0101]

\bulletSheffield y colaboradores. Genomics, 1993, vol. 16, 325 - 332 [0101]

\bulletLandegren y colaboradores. Science, 1988, vol. 241, 1077 - 1080 [0101]

\bulletSokolov. Nucleic Acid Res., 1990, vol. 18, 3671 [0101]

\bulletWalter y colaboradores. Nat. Genet., 1997, vol. 7, 22 - 28 [0101]

\bulletDear; Cook. Nucleic Acid Res., 1989, vol. 17, 6795 - 6807 [0101]

\newpage

\bulletSambrook. Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, 2001 [0108]

Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, 1994, vol. 1, 2, http://www.4ulr.com/products/
currentprotocols/index.html [0108]

\bullet R. D. D. Croy. Plant Molecular Biology Labfax. BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, 1993 [0108]

<110> CropDesign N.V.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Plantas que tienen características de crecimiento mejoradas y método para su elaboración

\vskip0.400000\baselineskip

<130> CD-126-PCT

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 04106225.8

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2004-12-01

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/634.015

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2004-12-07

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 885

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador: prm04553

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag cagtacgaga agg

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador: prm04554

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cattgtacca tctcaaggtc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2709

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

8

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1208

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

10

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cepa Allium

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

12

\hskip0,8cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cepa Allium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

14

\hskip0,8cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Antirrhinum majus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica nueva

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1076)..(1076)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Antirrhinum majus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

17

\hskip0,8cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1161

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Antirrhinum majus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

19

\hskip0,8cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Antirrhinum majus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1346

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

23

\hskip0,8cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Beta vulgaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Beta vulgaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

26

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1240

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Brassica napus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Brassica napus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

28

\hskip0,8cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1274

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Chenopodium rubrum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Chenopodium rubrum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

32

\hskip0,8cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

34

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

36

\hskip0,8cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1457

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon esculentum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon esculentum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1176

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon esculentum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

40

\hskip0,8cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon esculentum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

42

\hskip0,8cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 998

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Medicago sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Medicago sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

45

\hskip0,8cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1308

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Medicago sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Medicago sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1379

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nicotiana tabacum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

49

\hskip0,8cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nicotiana tabacum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

51

\hskip0,8cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1359

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nicotiana tabacum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nicotiana tabacum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

54

\hskip0,8cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nicotiana tabacum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

56

\hskip0,8cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nicotiana tabacum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

58

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1126

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

60

\hskip0,8cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Petroselinum crispum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Petroselinum crispum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 922

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Petunia hybrida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Petunia hybrida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1328

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Picea abies

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Picea abies

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

67

\hskip0,8cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pinus contorta

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pinus contorta

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip0,8cm

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pisum sativum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip0,8cm

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pisum sativum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Solanum tuberosum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Solanum tuberosum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1227

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sesbania rostrata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

75

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sesbania rostrata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

78

\hskip0,8cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 915

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Vigna acunitifolia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

82

\hskip0,8cm

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Vigna acunitifolia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

84

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1309

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Vigna unguiculata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Vigna unguiculata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

86

\hskip0,8cm

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1325

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

89

Claims (23)

1. Método para mejorar las características de crecimiento de las plantas con relación a las correspondientes plantas de control, que comprende:

-

la introducción de una mutación de tipo T161 D en el lugar de un gen que codifica una Quinasa que Depende de la Ciclina de tipo A (CDK), y/o

-

la introducción y sobreexpresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una CDK de tipo A con una mutación de tipo T161 D, y opcionalmente

-

la selección de plantas que tienen características mejoradas decrecimiento,

en donde dicha mutación de tipo T161 D es una sustitución de la treonina conservada en el bucle T por ácido aspártico y en donde dicha treonina conservada corresponde a treonina en la posición 161 en la SEQ ID NO: 8.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde dicha introducción de una mutación de tipo T161 D es efectuada ya sea por mutagénesis dirigida al sitio, recombinación homóloga, evolución dirigida y TILLING.

3. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico introducido que codifica un CDK de tipo A con una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1, se deriva de una planta, preferiblemente de una planta monocotiledónea, más preferiblemente de la familia Poaceae, lo más preferible de Oryza sativa.

4. Método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 3, en donde dicho ácido nucleico introducido que codifica una CDK de tipo A que tiene una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1, esta operativamente enlazado a un promotor capaz de expresar dicho ácido nucleico predominantemente en brotes.

5. Método de acuerdo a la reivindicación 4, en donde dicho promotor tiene un perfil de expresión comparable a la del promotor de metalotioneina de arroz de la SEQ ID NO: 6.

6. Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha característica mejorada de crecimiento de las plantas es mayor productividad con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre.

7. Método de acuerdo a la reivindicación 6, en donde dicha mayor productividad es mayor productividad de
semilla.

8. Construcción que comprende:

(i)

una molécula de ácido nucleico que codifica una CDK de tipo A que contiene un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161D como se definió anteriormente;

(ii)

una o más secuencia(s) de control capaz(ces) de conducir la expresión en una planta de la secuencia de ácido nucleico de (i); y opcionalmente

(iii)

una secuencia de terminación de la transcripción.

\vskip1.000000\baselineskip

9. Construcción de acuerdo a la reivindicación 8, en donde dicha secuencia de control es capaz de conducir la expresión en brotes.

10. Construcción de acuerdo a la reivindicación 9, en donde dicha secuencia de control tienen un perfil de expresión comparable a la del promotor de metalotioneina de arroz de la SEQ ID NO: 6.

11. Planta, parte de la planta o célula vegetal que contiene una construcción de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. Método para la producción de una planta transgénica que tiene características mejoradas de crecimiento, cuyo método comprende:

(i)

la introducción por medio de transformación en una planta o en una célula vegetal de un ácido nucleico que codifica una CDK de tipo A que contiene una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1;

(ii)

el cultivo de la célula vegetal bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta.

\newpage

13. Planta transgénica, parte de la planta o célula vegetal que contiene un ácido nucleico aislado que codifica una Quinasa que Depende de la Ciclina tipo A (CDK) que tienen una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1 y que tiene características mejoradas de crecimiento.

14. Planta, parte de la planta o célula vegetal de acuerdo a la reivindicación 11 ó 13, en donde dicha planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar o en donde la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, avena o sorbo.

15. Partes cosechables de una planta de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 11, 13 ó 14 y/o productos derivados de dichas plantas, en donde dichas partes cosechables y dichos productos incluyen un ácido nucleico aislado que codifica una CDK de tipo A con una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1.

16. Partes cosechables de acuerdo a la reivindicación 15, en donde dichas partes cosechables son semillas y en donde dichas semillas contienen un ácido nucleico aislado que codifica una CDK de tipo A con una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1.

17. Uso de una Quinasa que Depende de la Ciclina tipo A (CDK) que tienen una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1, o el uso de un ácido nucleico que codifica a tal CDK para mejorar las características de crecimiento de las plantas, en particular para mejorar el rendimiento, especialmente el rendimiento de semillas.

18. Uso de acuerdo a la reivindicación 17, en donde dicho rendimiento de semillas incluye uno o más de lo siguiente: mayor número total de semillas, mayor número de semillas llenas, mayor peso total de las semillas, y mayor índice de cosecha.

19. Uso de un ácido nucleico que codifica una Quinasa que Depende de la Ciclina de tipo A (CDK) que tienen una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1 como un marcador molecular para seleccionar plantas que tienen características mejoradas de crecimiento.

20. Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de:

(i)

una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2;

(ii)

una molécula de ácido nucleico que codifica un homólogo o fragmento activo de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, cuyo homólogo es una Quinasa A que Depende de la Ciclina (CDKA) de origen vegetal con actividad de quinasa que depende de la ciclina, que tienen un dominio PSTAIRE y una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1, y que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8, y cuyo fragmento activo tiene actividad de quinasa que depende de la ciclina, un dominio PSTAIRE y una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1;

(iii)

una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico de (i) o (ii) anteriores, o su complemento, en donde la secuencia de hibridación o el complemento de la misma codifica una CDKA de una planta que contiene un motivo ASTAIRE y una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1;

(iv)

variantes alélicas de un ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de (i) hasta (iii), cuyas variantes alélicas codifican una proteína CDKA de una planta que contiene un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1; y

(v)

variantes alternativas de empalme de un ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de (i) hasta (iii), cuyas variantes alternativas de empalme CDKA de una planta que contiene un motivo PSTAIRE y que tiene una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1.

21. Un mutante aislado de Quinasa que Depende de la Ciclina de tipo A (CDK), seleccionado del grupo que consiste de:

(i)

la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2;

(ii)

un homólogo de una proteína como el representado por la SEQ ID NO: 2, cuyo homólogo es una CDKA de origen vegetal con actividad de quinasa que depende de la ciclina, que tiene un dominio PSTAIRE y una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1, y que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8;

(iii)

un fragmento activo de una secuencia de aminoácidos como se define (i) hasta (iii), cuyo fragmento activo tiene actividad de quinasa que depende de la ciclina, un motivo PSTAIRE y una mutación de tipo T161 D como se define en la reivindicación 1.

22. Una composición que contiene una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 20.

23. Una composición que contiene una Quinasa que Depende de la Ciclina de tipo A (CDK) como se define en la reivindicación 21.