CN103215288A - 具有改良生长特性的植物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一般涉及分子生物学领域，并且涉及改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及通过调节编码细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的植物核酸在植物中的表达和/或通过调节植物CDK蛋白质在植物中的活性来改良植物生长特性的方法，所述CDK蛋白质包含不同的基序或所述CDK核酸编码这类蛋白质。本发明还涉及具有植物CDK核酸受调节的表达和/或植物CDK蛋白质受调节的活性的植物，所述CDK蛋白质包含不同的序列基序或所述核酸编码这类蛋白质，并且该植物相对于相应的野生型植物具有改良的生长特性。本发明还涉及特定核酸序列、含有所述核酸序列的核酸构建体、载体和植物，所述核酸序列编码具有上述植物生长改良活性的上述蛋白质。

Description

具有改良生长特性的植物及其制备方法

本申请是发明人于2007年5月31日提交的题为“具有改良生长特性的植物及其制备方法”的中国专利申请200780020589.X的分案申请。

本发明一般涉及分子生物学领域，并且涉及改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及通过调节编码细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的植物核酸在植物中的表达和/或通过调节植物CDK蛋白质在植物中的活性来改良植物生长特性的方法，所述CDK蛋白质包含不同的基序或所述CDK核酸编码这类蛋白质。本发明还涉及具有植物CDK核酸受调节的表达和/或植物CDK蛋白质受调节的活性的植物，所述CDK蛋白质包含不同的序列基序或所述核酸编码这类蛋白质，并且该植物相对于相应的野生型植物具有改良的生长特性。

本发明还涉及特定核酸序列、含有所述核酸序列的核酸构建体、载体和植物，所述核酸序列编码具有上述植物生长改良活性的上述蛋白质。

不断增加的世界人口和逐渐减少的农用耕地供应迫使人们朝着提高农业效率的方向进行研究。传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有期望性状的植物。然而，此类选育技术有一些缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常包含异质的遗传组分，当这些异质的遗传组分从亲本植物传递时不一定总是产生期望的性状。分子生物学的进展已经允许人类修饰动物和植物的种质。植物基因工程需要分离和操作遗传物质（一般以DNA或RNA的形式）以及随后将遗传物质引入植物。这类技术能够产生具有多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物。一种具有特殊经济利益的性状是产量。产量通常定义为具有经济价值的作物可测量产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。作物产量受到植物或作物所经受的特定胁迫的影响。这些胁迫包括环境(非生物)胁迫(例如反常的高温或低温引起的温度胁迫；营养缺陷引起的胁迫；缺水(干旱)引起的胁迫)和生物胁迫(其可由其他植物(种子)、害虫和病原体引起)。不仅可以通过抗击作物或植物所经受的一种或多种胁迫增加作物产量，还可以通过调节植物固有生长机制来增加作物产量。

植物生物量为饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草的产量。在谷物作物中使用产量的许多替代参数。其中首要的是估算植物大小。根据物种以及发育阶段的不同)可以通过许多方法测量植物大小，但是包括植物总干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座植物直径、叶长、根长、根生物量、分蘖数和叶数。许多物种在给定的发育阶段维持植物不同部分大小间的保守比。利用这些异速生长关系而对这些有关大小的测量结果进行由此及彼的外推(如Tittonell等2005Agric Ecosys & Environ105:213)。早期发育阶段的植物大小通常将与晚期发育阶段的植物大小有关。具有更大叶面积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多(Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica50:39)。除了植物所具有的最初达到较大大小的微环境或遗传优势的潜在延续，此为其附加效应。植物大小和生长速率存在着强遗传组件(如terSteege等2005 Plant Physiology139:1078)，且迄今为止，种种多样化基因型植物在一种环境条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小有关(Hittalmani等2003Theoretical Applied Genetics107:679)。以这种方式，使用标准环境作为田地中作物在不同时间和地点所遭遇的多样化动态环境的替代参数。

收获指数为种子产量与地上干重的比值，其在许多环境条件下相对稳定，因此在植物大小和谷物产量之间通常能够获得比较稳固的相关性(如RebetZke等2002Crop Science42:739)。这些方法固有地联系在一起，因为大多数谷物生物量取决于植物叶和茎当前或贮存的光合作用生产力(Gardener等1985Physiology of Crop Plants.Iowa State University Press，pp68-73)。因此，对植物大小的选择，甚至是在发育早期阶段的选择，已经用作为未来潜在产量的指标(如Tittonell等2005Agric Ecosys &Environ105:213)。当测试遗传差异对胁迫耐受性的影响时，温室或植物培养室与田地相比具有固有的优势:即能够使土壤性能、温度、水和营养的可用性以及光强度标准化。不过，因缺乏风力或昆虫导致不良授粉，或由于空间不足以让成熟根或冠层生长等等，对产量造成的这些人工局限性会限制这些控制环境在测试产量差异中的应用。因此，在培养室或温室标准条件下测量早期发育阶段的植物大小，是提供潜在遗传产量优势指标的标准方法。

植物的固有生长机制以高度有序的事件顺序存在，总称为"细胞周期"。影响植物细胞周期(使用重组DNA技术或使用非重组手段)并且由此调节植物的多种生长特性的能力将在例如增强作物、植物育种、产生观赏植物、树木培植、园艺学、林学、藻类或植物的产生领域中具有多种应用(例如用作产生例如药物、抗体或疫苗物质的生物反应器，或用于有机废物的生物转化的生物反应器或在高产量藻类和植物情况下用作燃料)。

细胞周期进程是所有多细胞生物生长和发育的基础并且对于细胞增殖至关重要。细胞周期的主要组件在酵母、哺乳动物和植物中高度保守。细胞周期通常被划分为下列顺序的时期:G0-G1-S-G2-M。DNA复制或合成通常发生在S期(“S”指DNA合成)，在M期发生染色体的有丝分离(“M”指有丝分裂)，以及介于其间的间期G1(DNA复制之前，此期间内细胞生长)和G2(DNA复制之后的时期，此期间内细胞为分裂做准备)。在M期的最后步骤为胞质分裂之后完成细胞分裂。已经退出细胞周期并且成为休眠的细胞称为处于G0期。可以刺激这一期间的细胞重返细胞周期处于G1期。在G1、G2和G0中的“G”代表“间期”。细胞周期进程的完成使每个子细胞在细胞分裂期间接受亲本基因组的完整拷贝。

细胞分裂由两个主要的细胞周期事件控制，即DNA合成的起始和有丝分裂的起始。这些关键事件的每一转换是由特定蛋白质复合物(涉及DNA复制和分裂)所代表的限制点控制。在G1/S边界DNA合成需要的基因的表达由哺乳动物和植物细胞中E2F家族转录因子调节(WO96/25494;Muller等人，Genes and Development15，267-285，2001；De Veylder等人，EMBOJ.21，13602-1368，2002)。通过E2F/Rb复合体整合信号并激活细胞周期基因的转录从而调节/引发进入细胞周期。由不同的异源二聚体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的形成和激活驱动细胞周期不同时期之间的转换以及由此的细胞周期进程，通常称上述异源二聚体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。激活这些激酶的先决条件是与特定细胞周期蛋白的物理缔合，激活时机很大程度上依赖于细胞周期蛋白的表达。细胞周期蛋白结合引起所结合的CDK的N-末端叶片(lobe)的构象改变并促使复合体的定位和底物特异性。当与细胞周期蛋白缔合时，单体CDK被激活并由此具有激酶活性。细胞周期蛋白水平在细胞周期中波动而因此代表确定CDK激活时机的主要因子。在细胞周期中含有细胞周期蛋白和CDK的这些复合体的周期性激活介导细胞周期转换(限制点)的时间性调节。调节CDK活性的其他因子包括CDK抑制剂(CKI或ICK、KIP、CIP、INK)、CDK激活激酶(CAK)。CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亚基(CKS)(Mironov等人，Plamt Cell11，509-522，1999;Reed，S.I.Progress in Cell CycleResearch2，5-27，1996)。

在植物中，目前已经研究的两种主要类型的CDK被称为A型和B型CDK。A型CDK调节G1-至-S和G2-至-M的转换，而B型CDK似乎仅控制G2-至-M限制点(Hemerly等人，1995;Magyar等人，1997;Porceddu等人，2001)。此外，已报道存在C型CDK和CDK激活激酶(CAK)(Magyar等人，1997;Umeda等人，1998;Joubès等人，2001)，同样存在D型、E型和F型CDK(Vandepoele等人，Plant Cell14，903，916，2002)。

已知A型CDK具有保守的三级结构(Goldsmith和Cobb，Curr.Opin.Struct.Bio1.4，833-840)，包括与细胞周期蛋白结合有关的高度保守的PSTAIRE基序。CDK的催化核心包括N端叶片和C端叶片。C端叶片包含一个催化裂(负责ATP和底物结合)并且还包括在许多激酶家族中保守的苏氨酸残基之后命名的，所谓的T环。在人CDK2中，这一苏氨酸残基在位置161，而在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)cdc28中以及在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)cdc2中，其分别位于位置169和167。据报道，该苏氨酸残基的磷酸化引起T环中结构构象改变，其为激酶转换为活性状态所必需的(Gu等人，EMBOJ.11，3995-4005)。许多研究描述了T环中保守苏氨酸的突变(Ducommun等人，EMBOJ.10，3311-3319，1991;Gould等人，EMBOJ.10，3297-3309;Marcote等人，Mol.Cell.Biol.13，5122-5131，1993;Ducommun等人，Mol Cell.Biol.11，6177-6184，1991;Coleman等人，J.Biol.Chem.272，18869-18874，1997;Martinez等人，EMBO J.16，343-354，1997;Gould等人，Mol.Gen.Genet.259，437-448，1998;Booher等人，Mol.Cell.Bio1.6，3523-3530，1986;Solomon等人，Mol.Biol.Cell3，13-27，1992;Lim等人，Mol.Cell.Biol.16，4573-4583，1996)，所有检测的突变显示出对配体的结合(例如细胞周期蛋白或Suc1/ICK)和/或激酶活性具有严重影响，在酵母互补实验中产生缺陷或致死表型。尽管T169E突变(根据酵母cdc28的编号)及其相似物T169D突变模拟磷酸化，已证明带有这类突变的CDK都不能完全补偿酵母。

在A型CDK蛋白质活性中具有重要作用的其他残基是位置14的苏氨酸和位置15的酪氨酸。一旦磷酸化这些氨基酸的至少一个，CDK失去活性。WO99/54489描述了使用分别由丙氨酸和苯丙氨酸取代苏氨酸14和酪氨酸15的CDK以增加植物对盐胁迫的耐受性。WO00/52171描述了调节一个或多个植物细胞周期蛋白介导的形态、生化和生理特性或特征的方法，其包括在植物中表达Cdc25磷蛋白磷酸酶。

上述CDK是参与信号转导级联的细胞周期检验点，所述信号转导级联确保细胞分裂中基因组的完整。作为有丝分裂中检验点的CDK由细胞周期蛋白A或细胞周期蛋白B调节。CDK仅在它们各自的细胞周期蛋白相关的细胞周期中有活性。虽然它们基本的有丝分裂作用是清楚的，然而这些蛋白激酶作用在活细胞中的分子机制必须阐明。具体地，不同CDK同种型和CDK-亚基的功能仍然不清楚。多种生物体中的遗传和生物化学分析已表明高度保守的CDK是进入有丝分裂及其存在需要的。结构研究和生物化学研究预示CDK调整特异性底物的识别，但是目前CDK的直接下游效应物是未知的。由于大多数CDK以不同的同种型存在，每个几乎功能不同，甚至其位置也很不相同。这意味着需要进一步的生物化学研究来阐明CDK作用的分子途径。

因此很需要参与植物分化的CDK的新的和更合适的编码基因。有利地，所述新基因应当尽可能多的具有以下特征:

·参与细胞周期和/或细胞分裂;

·参与器官发生;

·参与形态发生;

·影响植物的解剖结构(anatomy);

·增加代谢活性;

·增加植物不同器官的大小，所述器官优选种子或籽粒;和/或

·在不同器官和/或细胞区室中更广泛的活性。

因此，本发明的目的是提供其他CDK基因，其适合在植物中增加产量。该目的通过本发明用于制备式I化合物的方法实现。

因此，根据本发明的一个实施方案，提供了相对于对应的野生型植物，改良植物生长特性的方法，其包括调节植物中CDK基因的活性，优选调节A型CDK基因的活性，和/或调节此类CDK(优选A型CDK)的编码核酸的表达，并任选选择具有改良的生长特性的植物。

有利地，实施本发明的方法得到了相对于相应的野生型植物具有多种改良的生长特性的植物，并且该改良的生长特性至少包括相对于相应的野生型植物增加的产量。

本文所定义的术语"增加的产量"意指分别相对于相应的野生型植物，如下任一项或多项中的增加:

(i)植物的一个或多个部分增加的生物量(重量)，特别是地上(可收获)部分、增加的根生物量或任何其他可收获部分增加的生物量;

(ii)增加的种子总产量，其包括种子生物量(种子重量)的增加而其可以是每株植物或单个种子基础上种子重量的增加;

(iii)每个圆锥花序增加的花("小花")数量;

(iv)增加的(饱满)种子数;

(v)增加的种子大小，其也可能影响种子的组成;

(vi)增加的种子体积，其也可能影响种子的组成(包括油、蛋白质和糖类总含量和组成);

(vii)增加的单个种子面积;

(viii)增加的单个种子长度和/或宽度;

(ix)增加的收获指数，其表示为可收获部分如种子的产量与总生物量的比例;以及

(X)增加的千粒重(TKW)，其从所计的饱满种子数和它们的总重量推导出来。增加的TKW可产生自增加的种子大小和/或种子重量。增加的TKW可产生自胚胎大小和/或胚乳大小的增加。

以谷类为例，产量增加可以表现为下列一种或多种:每公顷或英亩植物数量增加、每株植物穗数量的增加、畦数、每畦种子数、粒重、TKW、穗的长度/直径的增加等。以稻为例，产量增加可以表现为下列一种或多种的增加:每公顷或英亩植物数量、每株植物的圆锥花序数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序花的数量，种子饱满率的增加((以%)表示为饱满种子数对小花数(种子总数)的比例)、TKW的增加等。产量增加还可产生改变的构造或可以作为改变构造的结果发生。

根据优选的特征，实施本发明的方法使植物具有增加的产量，更具体地，具有增加的生物量和/或增加的种子产量。优选地，增加的种子产量包括分别相对于对照植物在下列一种或多种中的增加:(饱满)种子数、种子总重量、种子大小、种子体积、千粒重和收获指数。

因此，本发明提供了相对于相应的对照植物增加植物产量的方法，该方法包括调节CDK或其同源物在植物中的活性，所述CDK或其同源物具有本文提及的基序之一，和/或调节编码这类CDK或其同源物的核酸的表达。

由于本发明的改良植物具有增加的产量，因此，相对于在其生命周期对应阶段的相应野生型植物的生长速度，这些植物很可能表现出增加的生长速度(至少在其部分的生命周期中)。生长速度增加可以是对植物的一个或多个部分或植物的细胞类型(包括种子)特异的，或者可以基本遍布整株植物。具有增加的生长速度的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期意指从干的成熟种子生长到植物产生干的成熟种子(类似于起始物质)的阶段所需的时间。此生命周期可以受到如早期活力、生长速度、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速度的增加可以发生在植物生命周期的一个或多个阶段或者基本遍布整个植物生命周期期间。在植物生命周期的早期阶段增加的生长速度反映了增强的活力。生长速度的增加可以改变植物的收获周期，这使得植物可以比可能的情形更晚播种和/或更早收获。如果生长速度充分增加，可以允许播种相同植物物种的更多种子(例如在播种和收获稻植物后，接着播种和收获更多的稻植物，所有这些都在一个常规生长期内)。类似的，如果生长速度充分增加，可以允许播种不同植物物种的更多种子(例如在播种和收获稻植物后，例如接着播种和任选收获大豆、马铃薯或任何其他适当的植物)。在一些植物的情形下，从同一根状茎收获更多次也是可能的。改变植物的收获周期可以使得每英亩每年生物量的产出增加(由于任何特定植物可以生长和收获次数(指在一年中)的增加)。生长速度的增加还使得转基因植物可以比它们的野生型对应物在更广的地域栽培，这是因为生长作物的区域性限制通常决定于种植时(早季)或收获时(晚季)的不利环境条件。如果收获周期缩短，那么可以避免此类不利条件。可以通过生长实验测绘生长曲线，得到多个参数来确定生长速度，此类参数可以是:TMid(植物达到其最大大小的50%所用的时间)以及T-90(植物达到其最大大小的90%所用的时间)等。

本发明方法的实施提供了具有增加的生长速度的植物。因此，本发明提供了增加植物生长速度的方法，该方法包括在植物中调节CDK、其同种型或同源物的活性，所述CDK或同源物具有(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE基序和本文提及的其他基序，和/或调节这类CDKA或其同源物的编码核酸的表达。

本文所用的术语"同种型"意指具有一些小的区别的蛋白质的不同形式(version)，如果蛋白质是酶，这也称为同工酶。同种型通常通过电泳或一些其他分离技术分离。这些技术基于多种机理:不同的基于座、多个等位片段(也称为等位基因、等位基因酶或同种异型酶)、不同亚基相互作用、不同剪接形式或不同的翻译后修饰。

与对照植物相比，无论植物是否在无胁迫条件下或植物是否接触多种胁迫，发生产量和/或生长速度的增加。植物一般通过生长更加缓慢来应答所接触的胁迫。在严重胁迫条件下，植物甚至完全停止生长。另一方面，本文将中等胁迫定义为植物所接触的不引起植物完全停止生长且没有能力恢复生长的任何胁迫。根据农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，在栽培的作物植物中通常不会遇到严重胁迫。因而，中等胁迫诱导的受损生长通常是农业所不希望的特征。中等胁迫是植物所接触的典型胁迫。这些胁迫可以是植物所接触的日常生物和/或非生物(环境)胁迫。典型的非生物或环境胁迫包括由反常的热或寒冷/冻结温度引起的温度胁迫;盐胁迫;水胁迫(干旱或过量的水)。非生物胁迫还可以由化学品引起。生物胁迫通常是那些由病原体，如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的胁迫。本文所用的术语"无胁迫条件"是不明显超出植物可能遇到的每日气候和其他非生物条件的那些环境条件。本领域的技术人员应明白指定地域的正常土壤条件和气候条件。

术语"增加""改进”或"提高”可互换，且在本申请意义上应理解为与本文所定义的野生型植物相比(例如，这意味着和没有引入本发明的CDK编码核酸序列的植物相比)，生长多出至少10%、20%、30%、40%或50%，优选至少60%、70%、80%、90%或100%，更优选150%、200%、300%。、400%或500%。

与对照、参照或野生型相比，就多肽在细胞、组织、细胞器、器官或生物或其部分中生物活性而言的增加优选至少多出5%，优选至少20%或至少50%，特别优选至少70%、80%、90%或以上，及其尤其优选至少200%、300%或400%，最优选至少500%或以上。

术语"调节活性"将意味着本发明核酸序列表达或该核酸序列编码的蛋白质的任何改变，这导致植物生长的增加。

可以在任何植物中有利地改良上述生长特性。

本文所用的术语"植物"包括整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎干、叶、根(包括块茎)、果实、柄、幼苗、块茎、花，以及组织和器官，其中前述的每种包含目的基因/核酸，或在目的基因/核酸中的特异性修饰。术语"植物"还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚胎、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样的，其中前述的每种包含目的基因/核酸。

"参照"、"对照"、或"野生型”尤其是细胞、组织、器官、生物体或其部分，它们未按照本发明的方法生产。从而，术语"野生型"、"对照”或"参照"可互换，并且可以是细胞或植物的部分，如细胞器、组织或植物，它们未按照本文所述的本发明方法修饰或处理。从而，用作为野生型、对照或参照的细胞或植物部分(如细胞器或植物)，尽可能地对应于(本发明的)细胞、植物或植物部分，而且除了本发明方法所致结果以外的任何其他特性都与本发明的主题对象(subject)尽可能地相同。因而，对野生型、对照或参照进行相同的处理，或者尽可能地进行相同处理，即条件或特性仅仅是可能有差异，但并不影响所测特性的品质。换言之，这意味着野生型代表(1)携带不变形式的基因或等位基因的植物，或者(2)由之获得本发明方法生产的植物的起始材料/植物。

优选在类似条件下对野生型植物和本发明方法生产的植物进行任何比较。术语"类似条件"是指在待比较的实验之间，所有的条件都保持相同：例如培养或生长条件、测定条件(如缓冲液组成、温度、底物、病原株、浓度等等)。

术语"参照"、"对照"或"野生型"优选为(比较)对象，如细胞器、细胞、组织、植物，其未按照本文所述方法修饰或处理，并且任何其他特性都与本发明的主题对象尽可能地相似。参照、对照或野生型在其基因组、转录物组(transcriptome)、蛋白质组或代谢物组(metabolome)方面与本发明的主题对象尽可能地相似。优选术语"参照-"、"对照-"或"野生型-"-细胞器、-细胞、-组织或植物与细胞器、细胞、组织或植物相关，所述细胞器、细胞、组织或植物与本发明的细胞器、细胞、组织或植物、或其部分在遗传上几乎相同，优选95%相同，更优选98%相同，甚至更优选99，00%相同，特别是99，10%。、99，30%、99，50%、99，70%。、99,90%。、99，99%、99，999%相同或更高(百分比)相同。最优选"参照"、"对照"或"野生型"为比较对象，如细胞器、细胞、组织、植物，其与使用本发明方法所对应的植物、细胞器在遗传上相同，根据本发明方法核酸分子或由其编码的基因产物经改变或修饰除外。在不能提供与本发明主题对象的差异仅在于不是本发明方法的主题对象的对照、参照或野生型的情况下，对照、参照或野生型可以是这样的生物体，其中导致本文所述精细化学品增加的活性调节原因已逆转或消除，例如通过负责减少基因产物的互补作用，例如通过稳定或瞬时(过量)表达、通过活化激动物或激动剂、通过灭活抑制剂或抬抗剂、通过加入活性化合物，如激素、通过转入增强子等。

尤其可用于本发明方法或过程中的植物包括藻类、蕨类植物以及属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括选自如下物种的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木:秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、冰草属物种(Agropyron spp.)、葱芹属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)，拟南芥(Arabidopsisthaliana)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦(Avena sativa)、阳桃(Averrhoacarambola)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、红花(Carthamus tinctorius)、山核桃属物种(Carya spp.)、栗属物种(Castaneaspp.)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、Cola spp.、芋(Colocasia esculenta)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumisspp.)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、菜蓟属物种(Cynard spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpuslongan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、穇子(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotryajaponica)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属物种(Fagus spp.)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunellaspp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthusspp.)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、浮萍属物种(Lemna spp.)、兵豆(Lensculinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinusspp.)、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、西印度樱桃(Malpighiaemarginata)、苹果属物种(Malus spp.)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkarazapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Oleaspp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryzaspp.)、稷(Panicum miliaceum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、鳄梨属物种(Persea spp.)、香芹(Petroselinumcrispum)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populusspp.)、牧豆树属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、Sesamum spp.、茄属物种(Solanum spp.)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygiumspp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属物种(Triticum spp.)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、枣属物种(Ziziphus spp.)等。

根据本发明优选的特征，植物是包含大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草的作物植物。更优选本发明的植物是单子叶植物，如甘蔗，最优选谷类，如稻、玉米、小麦、粟、大麦、黑麦、燕麦或高粱。

更优选的植物选自下组：菊科(Asteraceae)如向日葵属(Helianthus)、万寿菊属(Tagetes)，例如物种向日葵(Helianthusannus)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)；十字花科(Brassicaceae)如芸苔属(Brassica)、拟南芥属(Arabadopsis)，例如物种欧洲芸苔(Brassicanapus)、甘蓝型油菜物种(Brassica rapa ssp.)(芸苔、油菜籽油菜、芜菁)或拟南芥；豆科(Fabaceae)如大豆属(Glycine)，例如物种大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max)；亚麻科(Linaceae)如亚麻属(Linum)，例如物种亚麻(Linum usitatissimum)；禾本科(Poaceae)如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍(Zea)、小麦属(Triticum)，例如物种大麦(Hordeum vulgate)、黑麦(Secale cereale)、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、红燕麦(Avena byzantina)、野燕麦(Avena fatua var.sativa)、Avena hybrida[燕麦]、高粱或粟(Sorghum bicolor)、稻(Oryza sativa)，阔叶稻(Oryza latifolia)、玉米或玉蜀黍(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆锥小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、面包小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticumvulgare)；茄科(Solanaceae)如茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)，例如物种马铃薯(Solanum tuberosum)、番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme、红茄(Solanumintegrifolium)、Solanum lycopersicum)。

可以通过调节CDKA蛋白质的水平来调节CDKA蛋白质的活性。可选的，当CDKA蛋白质水平没有变化时，也可以调节其活性，这可以在例如通过产生突变体改变多肽固有特性时发生。根据本发明优选的特征，引入CDKA蛋白质改变的活性和／或此CDKA编码核酸改变的表达，和／或CDKA蛋白质活性增加和/或此CDKA编码核酸表达增加。

本文所定义的术语“A型CDK'’或“CDKA'’可交换地使用并且包括具有细胞周期蛋白依赖性激酶活性的任何氨基酸序列，而且当该序列(如优选由序列表(sequence protocol)中SEQ ID NO：45、47、49、51、53和/或SEO ID NO：55所示)用于CDK进化系统树的构建时，在A型CDK而非任何其他CDK类群周围聚类，且其氨基酸序列优选包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE氨基酸序列。本领域熟练的技术人员使用制备这样进化系统树的已知技术和软件，如GCG、EBI或CLUSTAL包，使用默认参数，可以容易地确定研究的任何氨基酸序列是否落入“A型CDK'’的定义内(见例如Vandepoele等人，2002)。一旦构建这样的进化系统树，在A型CDK类群聚类的序列被认为落入“A型CDK'’或“CDKA'’定义之内，并将因此用于实施本发明的方法。优选CDK还包含与SEQ ID NO：2所示的氢基酸具有一定的全序列同一性，所述全序列同一性按照增加的优选顺序为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。因此基于前述算法的程序是优选的。有利地，可使用程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等人，CABIOS，51989：151—153、)或优选使用程序Gap和BestFit(所述程序分别基于Needleman和Wunsch算法[J.Mol.Biol.48；443-453(1970)]以及smith和Waterman[Adv.Appl.Math.2；482-489(1981)]的算法)进行序列的比较。两个程序都是GCG软件包[Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711(1991)；Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389及以下列]的一部分。因此优选使用程序Gap在全序列范围上进行确定序列同源性的百分数的计算。使用核酸序列比较的下列标准校正：空位权重：50、长度权重：3、平均匹配：10.000、平均错配：0.000。

两个多肽之间的同源性应理解为指每种情况下在整个序列长度上的氨基酸序列的同一性，其借助于使用如下参数设置的GAP算法程序(Wisconsin Package版本10.0，Wisconsin大学，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison，美国)通过比较而计算得出：

空位权重：8长度权重：2

平均匹配：2,912平均错配：-2,003.

在两种情况下(核酸序列或氨基酸序列比较)，涉及的所示参数平均匹配和平均错配的数值是计算的结果。

CDKA蛋白质中多个结构域是众所周知的(De Bondt等人，Nature363，595-602，1993、)，并且可以使用专门的数据库鉴别，如SMART(Schultz等人(1998、)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864；Letuni等人(2002)Nucleic Acids Res30，242-244；http://smart．embl-heidelberg.de/)、InterPro(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315—318；http://www.ebi.ac.uk/interpro/)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，Ageneralized profile syntax for biomolecular sequences motifs and itsfunction in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；Proceedings2nd International ConfeFence on Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.、Brutlag D.、Karp P.、Lathrop R.、Searls D.编辑，53-6l页，AAAI出版，Menlo Park；Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004)，http://www.expasy.org/prosite/)或Pfam(Bateman等人，Nucleic AcidsResearch30(1)：276-280(2002)，http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)。

CDK的激酶结构域是S_TKc型(SMART登录号SM00220，Interpro登录号IPR002290)，并且具有Ser/Thr激酶活性。预测的活性位点(VLHRDLKPQNLLI，其中D是预测的催化残基)对应着PROSITE标签PS00108。活性位置的第1位可能存在苯丙氨酸对缬氨酸的取代。在第6位可能发生亮氨酸甲硫氨酸的取代，并且在第9位Gln可能被取代为Asn。ATP结合位点(IGEGTYGVVYRARDKVTNETIALK)对应着PROSITE标签PS00107。在ATP结合位点中可能发生其他突变。它们是：第11位Arg→Lys；笫12位Ala→Gly、第13位Arg→Leu、第15位Lys→Arg和第16位Val→Leu、Ala、Ser、Thr或Asn。

搜索和鉴定A型CDK同源物的方法是本领域的技术人员所熟悉了解的。此类方法包括使用本领域熟知的序列比对或比较的算法，如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48；443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics2；482-489(1981))的局部同源性算法)、BLAST(Altschul，S.F.、Gish，W.、Miller,W.、Myers，E.W.和Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444-2448(1988))，将计算机可读形式的SEQ ID NO1或2或由GenBank登录号CAA42922代表的序列与在公共数据库如MIPS(http://mips.gsf.de/)、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL核苷酸序列数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)中获得的序列进行比较。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得。下面提到的同源物是使用BLAST默认参数(BLOSUM62矩阵，空位开放罚分为11且空位延伸罚分为1)鉴定出的，且优选使用全长序列用于分析。这些比对方法也能够容易地鉴定对应于人CDC2或稻CDKA；1(SEQ ID NO：8)中苏氨酸161的保守苏氨酸。

应该理解术语“CDK，或优选A型CDK，或其同源物”不限于序列表中所示的序列，而是符合具有细胞周期蛋白依赖性激酶活性、有(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE结构域或本文公开的其他结构域、且与序列表中公开的序列(优选为序列SEQ ID NO：45、47、49、51、53和/或SEQ ID NO：55)具有至少80％、85％或90％，优选91％、92％、93％、94％或95％，最优选96％、97％、98％、99％或100％序列同一性标准的任何多肽，可以适用于本发明的方法，只要该CDK具有产量增加特性。

为了确定A型CDK的激酶活性，一些测定是可用的并且在本领域中众所周知(例如Current Protocols in Molecular Biology,1和2卷，Ausubel等人(，1994)，Current Protocols；或者是在线的，例如http://www.protocol-online.org)。

简言之，激酶测定通常包括(1)使激酶蛋白质接触含有待磷酸化的靶位点的底物多肽；(2)在适当的条件下，在适当的激酶缓冲液中进行靶位点的磷酸化；(3)在恰当的反应期后将磷酸化的产物从未磷酸化的底物中分离出来。激酶活性的存在或缺乏是通过磷酸化的靶标的存在或缺乏来确定的。另外，可以进行定量测量。纯化的CDK蛋白质，或者含有或富含CDK蛋白质的细胞提取物可以用作激酶蛋白质的来源。组蛋白H1或小肽尤其适合作为底物。肽在磷酸化位点基序中必须含有一个或多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基。可以在Biochimica et Biophysica Acta1314，191-225，(1996)中找到磷酸化位点的汇编。此外，肽底物可以有利地具有净正电荷，利于结合到磷酸纤维素滤器上(使能够将磷酸化的肽从未磷酸化的肽中分离出来并且检测磷酸化的肽)。如果不知道磷酸化位点基序，可以使用通用Ser/Thr激酶底物。例如，肽“ADAQHATPPKKKRKVEDPKDF”(，Marshak等人，J.Cell.Biochem.45，391，1991)是A型CDK的特异性底物。为了确定合成肽磷酸化的动力参数，需要肽浓度的范围。对于起始反应，可以使用0.7-1.5mM的肽浓度。对于每种激酶，重要的是要确定活性的最佳缓冲液、离子强度和pH。标准5×激酶缓冲液通常含有5mg/mlBSA(防止激酶吸附于测定管的牛血清白蛋白)、150mM Tris-Cl(pH7.5)、100mM MgCl₂。必须根据经验为每种蛋白激酶确定二价阳离子的最佳浓度。CDK测定的合适缓冲液是本技术领域公知的(例如John等人，Protoplasma161，70-74，1991)。常用的磷酰基(phophoryl)基团供体是放射性标记的[γ-³²P]ATP(通常是0.2mM终浓度)。在肽中掺入的³²P的量可以通过在闪烁计数器中硝化纤维素干垫上测量活性来确定。

此外，当在稻(Oryza sativa)中的茎干特异性启动子控制下表达这样的“CDK或其同源物或衍生物”时，与相应的野生型植物相比，其种子产量增加。可以以许多方式测量种子产量的增加，例如按照种子总重量的增加、从植物收获的饱满种子数的增加或增加的收获指数。

根据本发明的CDK或其同源物的生物和／或功能活性包括具有至少一种细胞周期蛋白依赖性激酶活性或具有如上所述的植物中增加产量的活性。

CDK，优选A型CDK蛋白质的“活性片段”包括CDK蛋白质的至少100、110、120、130、140或150个氨基酸残基，优选160、170、180、190或200个氨基酸残基，该连续的残基保留了与天然产生蛋白质相似的生物活性和／或功能活性。

如本文所定义的CDK或其同源物是由CDK核酸分子编码的。编码CDK或其同源物的核酸可以是任何天然或合成的核酸。因此本文定义的术语“CDK核酸分子”或“CDK基因”是如上定义的编码CDK多肽或其同源物的任何核酸分子(包括作为遗传密码简并结果的那些)。CDK核酸分子的实例包括由序列表所代表的核酸，以及编码上述同源物的那些核酸。CDK核酸及其功能性变体可适用于进行本发明的方法。这样的CDK核酸的功能性变体包括CDK核酸分子的部分、等位变体、剪接变体和／或能够与CDK核酸分子杂交的核酸。在功能性变体的范围中，术语“功能性”指的是编码具有细胞周期蛋白依赖性激酶活性的多肽的变体(即部分或杂交序列)。

本发明另一实施方案为分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：

a)分离的核酸分子，如SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55所示；

b)分离的核酸分子，其编码如SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所示的氨基酸序列；

c)分离的核酸分子，作为遗传密码简并性的结果，其序列能够根据如SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所示的多肽序列推导出来；

d)分离的核酸分子，其编码的多肽与(a)至(c)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少80％的同一性；

e)分离的核酸分子，编码如SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所示的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段为植物来源，且有利地包含(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S／R)(T／S／A)(L／I)基序；

f)编码蛋白质的分离的核酸分子，所述蛋白质包含选自以下的氨基酸序列：

aa)(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S／R)(T／S／A)(L／I)RE；

ab)(V／F／I)(L／I)HRD(L／M)K(P／S／T)(Q／N／S／G)N(L／I)L(V／L／I)；

ac)(I／L)(G／N)(E/R)G(T／A)YG(VII)V(Y／C)(R／K／S)(A／G／S)(R／L／T／I)(D／N)(K／R／E)(V／K／A／S／T／N)T(N／S／G)(E／K／Q)(T／L／I／K)(I／V)A(L／V／I)KK；

ad)LK(I／L)(C／A)DFGL(A／S)R；

ae)WYRAPE(L／I)L(L／F)(CIG)；

af)GCI(F／M)AE(I／L／M)；以及

ag)DLL(Q／N／S／R)(K／Q／R)(L／M)(L／F)(I／T／I／C)(F／Y／L)DP(T／E／D／R／S)(K／Q)RI；

g)分离的核酸分子或其互补物，其能够与上述(a)至(c)的核酸杂交，其中所述杂交序列或其互补物编码有利地包含(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S/R)(T／S／A)(L／I)基序的植物CDK蛋白质；

基于所述核酸分子，植物具有生长增加的活性。

本发明还提供选自以下的分离的核酸分子(=核酸序列)：

a)分离的核酸分子，如SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55所示；

b)分离的核酸分子，其编码如SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所示的氨基酸序列；

c)分离的核酸分子，作为遗传密码简并性的结果，其序列能够根据如SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所示的多肽序列推导出来；

d)分离的核酸分子，其编码的多肽与(a)至(c)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少80％的同一性；

e)分离的核酸分子，编码如SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所示的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段为植物来源，且有利地包含(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S／R)(T／S／A)(L／I)RE基序；

f)编码蛋白质的分离的核酸分子，所述蛋白质包含选自以下的氨基酸序列：

i)(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S／ID(T／S／A)(L／I)RE，优选为PSTAIRE；

ii)(V／F／I)(L／I)HRD(L／M)K(P／S／T)(Q／N／S／G)N(L／I)L(V／L／I)；优选为HRDXKXXNXL；

iii)(I／L)(G／N)(E／R)G(T／A)YG(V／I)V(Y／C)(R／K／S)(A／G／S)(R/L／T／I)(D／N)(K／R/E)(V／K／A／S／T／N)T(N／S／G)(E／K／Q)(T／L／I／K)(I/V)A(L／V／I)KK；

优选为GXVXXXXXXXTXXXXAXKK；

iv)LK(I／L)(C／A)DFGL(A／S)R，优选为LKXXDFGLXR；

v)WYRAPE(L／I)L(L／F)(C／G)，优选为WYRAPE；

vi、)GCI(F／M)AE(I／L／M)，优选为GCIXAEX；以及

vii)DLL(Q／N／S／R)(K／Q／R)(L／M)(L／F)(I／T／I／C)(F／Y／L)

DP(T／E／D/R/S)(1<／Q)RI，优选为DLLXXXXXXDPXXⅢ。

g)分离的核酸分子或其互补物，其能够与上述(a)至(c)的核酸杂交，其中所述杂交序列或其互补物编码有利地包含(P/N／A)(s／L／M／F)(T／S/R)(T／S／A)(L／I)RE基序的植物CDK蛋白质；

h)根据以上(a)至(d)中任一项核酸的等位变体，该等位变体编码植物CDK；和

i)根据(a)至(d)中任一项核酸的备选剪接变体，该备选剪接变体编码有利地包含(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S／R)(T／S／A)(L/I)RE基序的植物CDK蛋白质；

其中变量X代表任意氨基酸，以及

编码的蛋白质由此赋予产量增加。

关于核酸构建体(其包含本文所述核酸序列)或生物体(=转基因生物体，其转化了所述核酸序列或所述核酸构建体)的核酸序列，“转基因”意指通过遗传操作方法制备的那些构建体，优选其中

a、)表I A和／或I B，申请号1，第5和7列所示的核酸序列，或其衍生物，或

b、l遗传调控元件，例如启动子，其功能性连接到表I A和／或I B，申请号1，第5和7列所示的核酸序列，或其衍生物，或

c)(a)和(b)，

不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法修饰，有可能修饰采取的形式为例如一个或多个核苷酸的取代、添加、缺失、倒位或插入。“天然遗传环境”意指来源植物中的天然染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况下，优选至少是部分地维持核-aA．列的天然遗传环境。至少在核酸序列一侧侧接的环境序列长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。

除非另行指出，术语“多核苷酸”、“核酸”及“核酸分子”在本文互换使用。除非另行指出，术语“肽”、“多肽”及“蛋白质”在本文中互换使用。术语“序列”可能涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，取决于使用术语“序列”的上下文。术语“一个或多个基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”“核苷酸序列”或“一个或多个核酸分子”在本文用于指任何长度的多聚体形式的核苷酸，或者为核糖核苷酸或者为脱氧核糖核苷酸。这些术语仅述及分子的一级结构。

因此，如本文所用的术语“一个或多个基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”“核苷酸序列”或“一个或多个核酸分子”包括双链和单链DNA及RNA。它们还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸。优选本发明的DNA或RNA序列包含编码本文定义的多肽的编码序列。

“编码序列”为核苷酸序列，当将其置于合适的调控序列的控制之下时，转录为mRNA和／或翻译为多肽。编码序列的边界确定为5’-末端的翻译起始密码子和3，-末端的翻译终止密码子。编码序列可以包括但不局限于：mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，而且在一定的情形下也可以存在内含子。

“分离的”多核苷酸或核酸分子与存在于所述核酸分子天然来源中的其他多核苷酸或核酸分子分离开。分离的核酸分子可以是几kb的染色体片段，或者优选为仅包含基因编码区的分子。从而，本发明分离的核酸分子可以包含染色体区域，其为邻近的5’和3’或其他邻近的染色体区域，但是优选不含在所述核酸分子来源生物体的基因组或染色体环境中天然侧接此核酸分子序列的序列(例如，邻近编码核酸分子5'-UTR和3'-UTR区域的序列、)。在多种实施方案中，根据本发明方法中所使用的分离的核酸分子可以例如包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb所述核酸分子来源细胞的基因组DNA中天然侧接此核酸分子的核苷酸序列。

包含本发明方法中所用核酸分子例如本发明多核苷酸的完整序列或其部分的核酸分子，可以利用基于所用序列或其部分的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应进行分离。例如，包含所述完整序列或其部分的核酸分子可以利用基于此序列所产生的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应进行分离。例如，可以从细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等(1979)Biochemistry18：5294-5299的异硫氰酸胍提取法)，并且可以通过逆转录酶(例如莫洛尼(Moloney)MLV逆转录酶，可购自Gibco／BRL，Bethesda，MD；或AMV逆转录酶，可获自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL)产生cDNA。

对根据本发明的方法有利的核酸分子可基于其与本文公开的核酸分子的同源性，利用所述序列或其部分作为杂交探针，在严格杂交条件下按照标准杂交技术进行分离。就此而言，有可能使用，例如，具有至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多个核苷酸、优选长度至少为15、20或25个核苷酸的分离的核酸分子，其在严格条件下与上述核酸分子杂交，特别是与那些包含这样的核苷酸序列的核酸分子杂交，所述核苷酸序列为本发明方法中所用的核酸分子、编码本发明的蛋白质、或者为本发明的核i酸分子。也可以使用具有30、50、100、250个或更多个核苷酸的核酸分子。

本发明方法中所用的核酸序列，如序列表中特别是SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55所示，最好引入核酸构建体，优选表达盒中，这使得所述核酸分子在植物中的表达成为可能。

从而，本发明还涉及核酸构建体，优选表达载体，含有本发明的核酸分子，功能性连接于一个或多个调控元件或信号。

如本文所述，核酸构建体也可以含有其他欲引入生物体或细胞的基因。有可能并且最好在宿主生物体中引入并表达调控基因，如诱导物、抑制物或酶的基因，它们通过其酶促活性参与调控生物合成通路中的一个或多个基因。这些基因可以是异源或同源来源。而且，最好可能存在其他生物合成基因，或者这些基因可以位于一个或多个其他核酸构建体中。最好采用这样的基因，其影响植物的生长，例如调控序列或因子。通过使用强转录信号如启动子和／或增强子，可以有利地在转录水平产生调控元件的增强作用。不过，此外，也有可能利用翻译增强作用，例如通过增加mRNA稳定性或通过插入翻译增强子序列。

原则上，核酸构建体可以含有本文所述的调控序列以及与所包含基因的表迟相关的其他序列。从而，本发明的核酸构建体可用作为表达盒，从而可用于直接引入到植物中，或者将其引入到载体中。相应地，在一个买施方案中，核酸构建体为表达盒，包含微生物启动子或微生物终止子或两者兼而有之。在另一个实施方案中，表达盒包括植物启动子或植物终止子或两者兼而有之。

为将核酸分子引入到核酸构建体中，例如，作为表达盒的一部分，最好以技术人员已知的方式对符号性(codogenic)基因区段进行扩增和连接反应。优选按照类似于Pfu DNA聚合酶或Pfu／Taq DNA聚合酶混合物方案的方法。根据待扩增的序列选择引物。应当有利地选择引物，从而扩增物包含从起始到终止密码子的符号性序列。扩增之后，最好分析扩增物。例如，所述分析可以考虑质量和数量，并在凝胶电泳分离之后进行。其后，可以按照标准方案(例如Qiagen)纯化扩增物。然后可利用小份纯化的扩增物进行随后的克隆步骤。技术人员通常知晓合适的克隆载体。

它们尤其包括能够在易于操作的克隆系统像基于细菌、酵母或昆虫细胞(如杆状病毒表达)的系统中复制的载体，也即特别是确保在大肠杆菌(E.coli)中有效克隆的载体，其使得有可能稳定转化植物。必需要提及的载体为多种双元和共合体载体系统，它们适用于T-DNA介导的转化。通常此类载体系统的特征在于，它们至少含有vir基因和T-DNA边界序列，其中vir基因式农杆菌属介导的转化所必需的。

通常，载体系统优选还包含其他顺式调控区域，如启动子和终止子和／或选择标记，借助于它们能够鉴定适当转化的生物体。在共合体载体系统的情况下，vir基因和T-DNA序列位于同一载体上，而双元系统基于至少两个载体，其中一个携带vir基因而非T-DNA，而第二个携带T-DNA而非vir基因。因为这个事实，后述的载体相对较小，易于操作，并能够在大肠杆菌和农杆菌中复制。这些双元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明优选使用的双元载体有Bin19、pBI101、pBinAR、DGPTV和pCAMBIA。有关双元载体及其用途的综述由Hellens等，Trends in Plant Science(2000)5，446-451提供。所述载体优选以这样的方式修饰，从而它们已经含有编码转运肽的核酸，并且本发明的核酸，优选编码表II，申请号1，5和7列所示的多肽的核酸，能够从3’端(prime)克隆为转运肽编码序列(产生功能性特征)，其由质体指导并意味着成熟蛋白质发挥其生物学活性。

在重组表达载体中，“有效连接”表示目的核酸分子以这样的方式连接于调控信号，从而使所述所述核酸分子的表达成为可能：它们以这样的方式彼此连接，从而两种序列均实现归属于序列的预测功能(例如在体外转录／翻译系统中，或者如果载体被引入宿主细胞则在宿主细胞中)。

如本文所定义的术语部分是指编码CDK的DNA片段，其包含至少300、400、450或500个核苷酸，优选550、600、650或700个核苷酸，并且该部分编码具有细胞周期蛋白依赖性激酶活性的多肽，具有(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S／R)(T／S／A)(L／I)RE基序并具有下列序列VLHRDLKPQNLLI的活性位点，其中D是预测的催化残基，并且其中可发生所述序列的以下修饰：第1位：Val→Phe；第6位：Leu→Met；第9位：Gln→Asn。另外，所述CDK序列可有利地具有下列ATP结合位点IGEGTYGVVYRARDKVTNETIALK。在该ATP结合位点中也可发生一些突变。它们是下列突变：第11位Arg→Lys；第12位Ala→Gly；第13位Arg→Leu；第15位Lys→Arg和第16位Val→Leu、Ala、Ser、Thr或Asn。例如，可以通过对CDK核酸进行一个或多个缺失来制备部分。部分可以以分离的形式使用，或者可将其与其他编码(或非编码)序列融合，以便，例如，生产组合了若干活性(其中一种是细胞周期蛋白依赖性激酶活性)的蛋白质。当与其他编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比预测的CDK片段要大。优选功能性部分是CDK核酸的部分，更优选是SEQ IDNO：45、47、49、51、53或55所示核酸分子的部分。

术语“片段”、“序列片段”或“序列的一部分”、“部分”或“其部分”是指所参照原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)长度可变；最低长度为这样的序列，其大小足以提供具有与所参照原始序列相当的功能和／或活性的序列，或者在严格条件下与本发明的或本发明方法所用的核酸分子杂交，而最高长度并不重要。在有些应用中，最高长度通常并不比提供期望的原始序列活性和／或功能所需的大小长多少。

通常，截短的氨基酸序列长度为约5至约310个氨基酸。然而更经常的，该序列的长度最大为约250个氨基酸，优选最大为约200个氨基酸或约100个氨基酸。通常期望选择大约10、12或15个氨基酸的序列，最多最大为约20或25个氨基酸的序列。

另一CDK核酸分子的变体是能够在降低的严格条件下，优选在严格条件下能够与前述定义的CDK核酸分子杂交的核酸分子，其中杂交序列编码包含上述基序的CDK多肽。优选地，杂交序列是能够与核酸分子SEQID NO：45、47、49、51、53或55杂交的序列，或者是与编码上述同源物之一的核酸杂交的序列，或者是与任意前述序列的部分杂交的序列。最优选地，杂交序列是能够与核酸分子SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55杂交的序列。

本文所定义的术语“杂交，，是其中基本同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全发生在溶液中，即两条互补核酸都在溶液中。杂交过程还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖珠子或任何其他树脂上。此外杂交过程可还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于固相支持物如硝化纤维素膜或尼龙膜上，或通过例如照相平版印刷术固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片、)。为了使得杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和／或从单链核酸中除去发夹或其他二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成条件的影响。

在诸如Southern杂交和Northern杂交的核酸杂交实验中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是由序列决定的，并且随环境参数而不同。本领域技术人员认识到在杂交和洗涤中可以改变多种参数，而该参数将保持或改变严格条件。

T_m是在限定的离子强度和pH下，50％的靶标序列杂交至完全匹配的探针时的温度。T_m依赖于溶液条件、碱基组成以及探针的长度。例如，较长的序列在较高温度下特异杂交。最大杂交速率是在低于T_m大约16℃至32℃下得到。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥，从而促进杂交分子的形成；对于高达0.4M的钠浓度，这个作用是明显的。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0．6至0．7℃，而加入50％的甲酰胺虽然使杂交速率降低，但使杂交在30至45℃进行。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大探针，每％碱基错配使Tm降低大约1℃。由杂交分子的类型决定，可以使用下列公式计算T_m：

·DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal．Biochem．，138：267-284，1984)：

T_m=81.5℃+16.6×log[Na⁺]^a+0.41×％[G／C^b]-500×[L^c]^-1-0.61×％甲酰胺

·DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子：

T_m=79.8+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G／C^b)+11.8(％G／C^b)²—820／L^c

·寡-DNA或寡-RNA^d杂交分子：

对于<20个核苷酸：T_m=2(l_n)

对于20-35个核苷酸：T_m=22+1.46(l_n)

^a或对于其他一价阳离子，但是仅仅在0．01-0．4M范围内精确。

^b仅对于在30％至75％范围的％GC精确。

^cL=双链体中碱基对的长度。

^d寡，寡核苷酸；l_n，引物的有效长度=2×(G／C数)+(A/T数)。

注：对于每1％甲酰胺，T_m降低大约0.6至0.7℃，而6M尿素的存在降低T_m大约30℃。

杂交的特异性通常是杂交后洗涤的作用。为了除去非特异性杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低且洗涤温度越高，洗涤的严格性越高。洗涤条件通常在杂交严格性或低于杂交严格性下进行。总体上，如上所述设置核酸杂交测定或基因扩增检测操作的合适的严格条件。也可以选择相差不多的严格条件。通常，选择的低严格条件大约比在限定的离子强度和pH下特异性序列的热解链温度(T_m)低50℃。中等严格条件是低于T_m20℃的温度，而高严格条件是低于T_m10℃的温度。例如，严格条件是那些至少与例如条件A—L一样严格的条件；而简化的严格条件是至少与例如条件M—R一样严格的条件。可以使用多种已知技术中的任意一种，例如用含有蛋白质的溶液将膜封闭，添加异源RNA、DNA和SDS至杂交缓冲液中，以及用RNA酶处理，来控制非特异性的结合。

杂交和洗涤条件的实例在表1中列出：

表1：

“杂交分子长度”是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对序列和鉴定本文所述的保守区确定杂交分子长度。

在杂交和洗涤缓冲液中，SSPE(1×SSPE是0．15M NaCI、10mMNaH₂P0₄和1.25mM EDTA，pH7．4)可以代替SSC(1×SSC是0．15MNaCI和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后洗涤15分钟。杂交和洗涤可以另外地包括5×Denhardt试剂、0．5-1．0％SDS、100μg／ml变性的片段化的鲑精DNA、0．5％焦磷酸钠和高达50％甲酰胺。

^＊Tb-Tr：对于预期长度少于50个碱基对的杂交分子，杂交温度应该比杂交分子的解链温度T_m低5-10℃，根据上述公式确定T_m。

^±本发明还包括用PNA或修饰的核酸取代任意一个或多个DNA或RNA杂交配偶体。

为了定义严格性水平，可以方便地参考Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York or to Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)。

在杂交和洗涤后，由探针标记的类型决定，可以通过放射自显影(当使用放射性标记探针时、)或者通过化学发光、免疫检测、通过荧光或显色检测来检测双链体。或者，可以进行核糖核酸酶保护测定来检测RNA：RNA杂交分子。

CDK核酸分子或其变体可以来自任何植物或人工来源。可以通过精细的人工操作在组成和／或基因组环境方面对核酸的天然形式进行修饰。核酸优选植物来源的，可以是来自相同的植物物种(例如来自其待引入的植物物种)或来自不同的植物物种。核酸可以分离自单子叶物种，优选分离自禾本科(Poaceae)，更优选分离自稻或或玉蜀黍。更优选地，分离自稻的CDK是SEQ ID NO：45，或分离自玉蜀黍的CDK是SEQ ID NO：53。在本发明的另一实施方案中，核酸可分离自双子叶物种，优选分离自十字花科、槭树科(Aceraceae)、亚麻科或菊科，更优选分离自欧洲芸苔、大豆、亚麻或向日葵(Helianthus annuus)。更优选地，分离自欧洲芸苔的CDK是SEQ ID NO：47、分离自大豆的CDK是SEQ ID NO：49、分离自亚麻的CDK是SEQ ID NO：51或分离自向日葵的CDK是SEQ ID NO：55。

可以通过引入遗传修饰(优选在CDK基因的基因座)调节CDK多肽或其同源物的活性和／或这类CDK编码核酸的表达。如本文所定义的基因的基因座意指包括目的基因以及编码区的上游或下游10kb的区域。

例如，可以通过以下的任何一种(或多种)方法引入遗传修饰：TILLING、定点诱变、定向进化和同源重组或者通过在植物中引入和表达编码CDK的多肽或其同源物的核酸，该CDK或同源物含有如上所述的基序。在引入遗传修饰后，接下来的步骤是选择表达增加的核酸(该核酸编码含有如上所述的基序的CDK多肽)和／或选择活性增加的所述CDK多肽，这种表达和／或活性的增加使植物具有改良的生长特性。

也可以使用TILLING技术(靶向诱导基因组局部损害技术)，把遗传修饰引入到CDK基因的基因座中。这是一种诱变技术，用于产生和／或鉴定，并最终分离核酸分子的诱变变体，所述核酸分子编码具有如上所述的序列，能够呈现依赖细胞周期蛋白的激酶活性的CDK。TILLING还使能够选择携带这类突变变体的植物。TILLNG将高密度诱变与高通量筛选方法结合起来。TILLING一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei和Koncz(1992)，In：C Koncz，N-H Chua，J Schell编辑，Methods in Arabidopsis Research.World Scientific，Singapore，16-82页；Feldmann等人，(1994)In：EMMeyerowitz，CR Somerville编辑，Arabidopsis．Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor,NY，137-172页；Lightner和Caspar(1998)，In：J Martinez-Zapater,J Salinas编辑，Methods onMolecularBiology，82卷，Humana Press，Totowa，NJ，91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目标区域的PCR扩增；(d)变性和退火使能够形成异源双链体；(e)DHPLC，其中集合体中异源双链体的存在检测为色谱图中额外的峰值；(f)鉴定突变个体；和(g)突变体PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum Nature Biotechnol.18，455-457，2000，StempleNature Rev．Genet．5，145-150，2004)。

可以使用定点诱变产生保留了活性(例如依赖细胞周期蛋白的激酶活性)的CDK核酸或其部分的变体。多种方法可用来实现定点诱变，最常用的是基于PCR的方法(见例如Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology.Wiley编辑，http://www.4ulr.com／products/currentprotocols／index．html)。

也可以使用定向进化产生CDK核酸的变体。定向进化由重复的DNA改组组成，继之以适当的筛选和／或选择产生CDK核酸或其部分的变体，所述CDK核酸或其部分编码具有改变的生物活性的CDK多肽或同源物或其部分(Castle等人，(2004)Science304(5674)：1151-4；US5,811,238和US6,395,547)。

TILLING、定点诱变和定向进化是能够产生新的CDK等位基因和变体的技术实例，所述CDK等位基因和变体保留了CDK功能因而可用于本发明的方法中。

同源重组能够在基因组中限定的选择位置引入选定的核酸。同源重组是生物学中通常使用的常规技术，用于较低等的生物体如酵母或苔藓Phvscomitrella。在植物中进行同源重组的方法不仅已在模式植物中有描述(Offringa等人(1990)EMBO J．9，3077-3084)，而且在作物植物，例如稻中也有描述(Terada等人，(2002)Nature Biotechn01．20，1030-1034；或Iida和Terada(2004)Curt．Opin．Biotechnol．15，132-138)。待靶向的核酸(其可以是如上文所定义的CDK核酸分子或其功能性变体)不需要靶向到CDK基因的基因座中，而可以被引入到例如高表达的区域。待靶向的核酸可以是用于替换内源基因的改良的等位基因，或在内源基因之外额外引入。

引入遗传修饰(在这一情况中不需要在CDK基因的基因座中)的优选方法是在植物中引入和表达编码CDK多肽或其同源物的核酸。以上提到的且适用于本发明操作的CDK多肽或其同源物具有依赖细胞周期蛋白的激酶活性，其与SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所代表的氨基酸序列具有一定的序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，且该CDK多肽包含本文所述的基序。引入植物的核酸可以是如以上定义的部分或杂交序列。蛋白质的“同源物”涵盖相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和／或插入，且与其所衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。这意味着它们具有共同的祖先。术语“同源物”涵盖两种特殊形式的同源性，即直系同源序列和旁系同源序列，它们涉及用于描述基因遗传关系的进化概念。优选地，用于本发明的直系同源物和旁系同源物具有与CDK相同的结构且在交互BLAST搜索中与SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56具有最高相似性。术语“旁系同源”涉及由物种基因组内一个或多个基因复制产生的同源基因。CDK的旁系同源物可以容易地通过对来自与查询序列相同物种的一组序列进行BLAST分析来鉴定。术语“直系同源”涉及在不同生物中由于这些基因的祖先关系形成的同源基因。例如，通过实施所谓的交互blast搜索可以容易地找到单子叶或双子叶植物物种中的直系同源物。这可以通过在任何序列数据库，如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公众可获得的NCBI数据库中，对所讨论的序列(例如，来自单子叶物种稻或玉蜀黍，或双子叶物种欧洲芸苔、大豆、亚麻或向日葵的SEQ ID NO45、47、49、51、53或55)进行第一次blast。当起始于核苷酸时可以使用BLASTn或tBLASTX，或者当起始于蛋白质时可以使用BLASTP或TBLASTN，并使用标准缺省值。可以过滤blast结果。之后将过滤结果或未过滤结果的全长序列与所讨论的序列的来源生物(例如稻、玉蜀黍、欧洲芸苔、大豆、亚麻或向日葵)的序列进行反向blast(第二次blast)。然后对第一次和第二次blast的结果进行比较。如果第二次blast的最高相似性来自与查询序列所源自的相同物种时，就找到了旁系同源物；如果最高相似性并非来自与查询序列所源自的相同物种时，那么就找到了直系同源物。只要这一同源物含有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域并且含有(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S／R)(T／S／A)(L／I)RE基序，这样的直系同源物或旁系同源物也可认为是CDK的同源物。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，接着通过构建相邻连接树以帮助观察相关基因的聚类(clustering)并且鉴定直系同源物和旁系同源物。

同源物可以是蛋白质“取代变体”的形式，即其中氨基酸序列中的至少一个残基已经被除去，并且在其位置上插入不同的残基。氨基酸取代一般是单个残基的，但是取决于对多肽的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大约1、2、3、4或5个氨基酸残基，优选6、7、8、9到10个氨基酸残基。优选的，氨基酸取代包括保守性氨基酸取代(表2)。为了产生此类同源物，蛋白质的氨基酸可以被具有相似性质(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的特性)的其他氨基酸所置换。保守性替换表是本领域所熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。用于本发明方法中的取代变体是CDK多肽的取代变体并含有(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE基序和上述其他基序。

表2：保守性氨基酸取代的实例：

残基	保守性取代	残基	保守性取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu，Val

在上述氨基酸性质不是很关键的情况下，可以产生保守性较低的取代。

同源物还可以是蛋白质的“插入变体”的形式，即将其中一个或多个氨基酸残基引入到蛋白质中的预定位点。插入可包括氨基端和／或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，氨基酸序列内的插入将小于氨基或羧基端的融合，约为1到10个残基的数量。氨基或羧基端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂交系统的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬茵体外壳蛋白、(组氨酸)₆-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、

表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。可用于本发明的方法的插入变体是CDK多肽的插入变体并且含有本文所述的基序。

蛋白质“缺失变体”形式的同源物的特征在于从蛋白质除去一个或多个氨基酸，并且包含活性片段。

使用本领域熟知的肽合成技术，如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作，可以容易的制备蛋白质的氨基酸变体。对DNA序列进行操作以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，在DNA的预定位点产生突变的技术是本领域技术人员熟知的，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、快速变换的定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其他定点诱变方案。

带有(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S／R)(T／S／A)(L／I)RE基序的CDK多肽或其同源物也可以是衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，相对于蛋白质天然存在形式的氨基酸序列(例如，如序列46、48、50、52或56所示)，其可以包括天然和非天然存在的氨基酸残基的取代、缺失或添加。蛋白质的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，相对于多肽天然存在形式的氨基酸序列，其可以包括天然发生改变的、糖基化的、酰基化的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。相对于其所衍生自的氨基酸序列，衍生物还可包含一个或多个非氨基酸取代基，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报道分子或其他配体，如结合以便于检测的报道分子，以及相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸残基。可用于本发明方法的衍生物是具有CDK生物活性以及本文所述基序的CDK多肽衍生物。

植物中的CDK型激酶具有模块结构，其由N叶片和C叶片组成，含有一个催化裂和T环(De Bondt等人，1993)。因此可期望以保留或改变CDK蛋白质活性的方式进行激酶结构域的基因工程可以产生可用于操作本发明方法的CDK突变体。只要产生的CDK含有(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S／R)(T／S／A)(L／I)RE、ATP结合和活性部位基序，首选的变体类型包括由结构域缺失、堆积或改组产生的那些变体(见例如He等人，Science288，2360-2363，2000；或US专利5,811,238和6,395,547)。

CDK多肽或其同源物可以由CDK核酸分子或基因的备选的剪接变体编码。本文所用的术语“备选的剪接变体”包括核酸序列的变体，其中选择的内含子和／或外显子被切除、替换或添加。这样的变体可以是编码包含突变的多肽并且其中保留了该蛋白质的生物活性，其可以通过选择地保留该蛋白质的功能区段获得。这样的剪接变体可以在自然中发现或可以人工制备。制备这样的剪接变体的方法是本技术领域内熟知的。首选的剪接变体来自由SEQ ID NO45、47、49、51、53或55代表的核酸。另外首选的是其编码的多肽保留了依赖细胞周期蛋白激酶活性且含有本文所述基序。

所述同源物还可以由编码CDK多肽或其同源物的核酸的等位变体编码，优选由SEQ ID NO45、47、49、51、53或55代表的核酸的等位变体，只要由等位变体编码的多肽具有依赖细胞周期的蛋白激酶活性且含有本文所述基序。天然存在且包括在本发明方法中的等位变体使用这些天然的等位基因。等位变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小的插入／缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物天然存在的多态性株系中SNP和INDEL形成了最大类的序列变体。

根据本发明首选的方面，希望增强或增加本发明的CDK核酸分子或其变体的表达。得到基因或基因产物表达增强或增加的方法在本领域中有详细记载并且包括例如用适当的启动子驱动的过量表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入至多核苷酸非异源形式的适当位置上(一般为上游)，从而上调本发明的CDK核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和／或取代来体内改变内源启动子(参见Kmiec，美国专利5,565,350号；Zarling等人，PCT／US93／03868)，或者可以将分离的启动子以与本发明基因适当的方向和距离引入植物细胞中，从而调控基因的表达。

如果希望多肽表达，通常需要在多核苷酸编码区的3’-端包括多聚腺苷酸化作用区域。多聚腺苷酸化作用区域可以来自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3’端序列可以来自例如胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶基因，或可选的来自其他植物基因，或次优选的来自任何其他真核基因。

还可以将内含子序列添加到5’非翻译区或部分编码序列的编码序列以增加在胞质中聚集的成熟信使的量。已经表明在植物和动物表达构建体的转录单位中包含可剪接的内含子能在mRNA和蛋白质水平上使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg，Mol．Cell Biol．8，4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev．1，1183-1200(1987))。当将内含子置于转录单位的5’端附近时，此类内含子的基因表达的增强通常是最大的。玉米内含子Adhl-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。总体参见The Maize Handbook，116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，N．Y.(1994)。

本发明还提供了遗传构建体和载体，以便于引入和／或表达可用于本发明方法中的核苷酸序列。

因此，本发明提供了基因构建体，其包含：

(i)CDK核酸分子或其功能性变体，该核酸或变体编码含有(P／N／A)(S／L／M／F)(T／S/R)(T／S／A)(L／I)RE、ATP结合和活性部位基序的CDK；

(ii)能驱动(i)的核酸序列在植物中表达的一个或多个调控序列；和可选的

(iii)转录终止序列。

可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建可用于本发明方法的构建体。可以将基因构建体插入载体中，该载体是可商购的、适于转化到植物中并适于在转化的细胞中表达目的基因。

使用包含目的序列(即根据本发明的CDK核酸或其变体)的载体转化植物。将目的序列有效连接于一个或多个调控序列(至少连接于启动子)。术语“调节元件”、“一个或多个调节序列”、“调控序列”和“启动子”在本文都可以互换使用，且应当取其广义，指能影响与它们连接的序列表达的调节核酸序列。上述术语包括来源于经典真核生物基因组基因的转录调节序列(包括精确转录起始所需的TATA框，含有或不合CCAAT框序列)以及应答发育和／或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。该术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在这种情况下它可以包括-35框序列和／或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中的表达。如本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，使得启动子序列能起始目的基因的转录。

调节序列可与内源性或转基因蛋白质的编码序列有效连接，并控制其转录和／或翻译，或编码mRNA或表达的蛋白质的稳定性或衰变(decay)。为了修饰和控制编码序列的表达，可以改变、增加或改动其调节元件，例如启动子、UTR、剪接位点、加工信号、聚腺苷酸化位点、终止子、增强子、诱导物、阻抑物、转录后或翻译后修饰位点。调节序列尤其包括如本文公开的启动子和终止子的植物序列。例如，Hayashi等人，1992(Science258：1350-1353)或Weigel等人，2000(Plant Physiol．122，1003-1013)及其中引用的其他文献已描述了通过随机整合增强子元件来活化植物基因。例如，可以通过以更强的转基因启动子取代内源启动子，或者以不改变编码区而提供更高的稳定性的3'UTR替换内源3'UTR来调节内源蛋白质的表达水平。另外，可以通过转入实施例中所述的人工转录因子来调节转录调控。备选的启动子、终止子和UTR描述如下。

调节序列旨在能够特异性表达基因和特异性的蛋白质表达。例如，基于宿主植物，这意味着基因仅在诱导后表达和／或过量表达，或者组成型表达和／或过量表达。这些调节序列例如是结合诱导物或阻抑物的序列，由此调控核酸的表达。除了这些新的调节序列或取代这些序列的是，这些序列的天然调节仍然存在于真正的结构基于之前，如果合适，这些序列的天然调节可被遗传修饰，由此该天然调节被关闭或基因表达增加。作为规则，所述调节序列位于待表达的核酸序列的编码序列的上游(5’)、其中和／或下游(3’)。但是，本发明方法中所使用的以及本文描述的核酸构建体(=表达盒、表达构建体或基因构建体)也可以更简单的构建，这就是说在核酸序列或其衍生物之前没有插入其他调节信号，且天然启动子及其调节(序列)没有被移动。或者，天然调控序列以调控不再发生和／或基因表达增加的方式突变。这些修饰的启动子也可以被引入它们自己的位置，所述位置在部分序列形式(=启动子和部分本发明的核酸序列)的天然基因之前以增加活性。此外，基因构建体有利地还包含一个或多个已知的增强子序列(和启动子有效连接)，这能够增加核酸序列的表达。同时，可能在DNA序列的3，末端插入其他有利的序列(例如其他调节元件或终止子)。

调节序列包括转录和翻译调节序列或信号，例如位于上游(5’)的序列，其尤其涉及调节转录或翻译的起始，例如启动子或起始密码子，以及位于下游(3’)的序列，其尤其涉及调节转录或翻译的终止和转录物稳定性，例如聚腺苷酸化信号或终止密码子。调节序列可位于转录的编码区以及转录的非编码区，例如内含子，如例如剪接位点，调节细胞中本发明核酸分子表达的启动子，原则上可以使用能够刺激目的基因在植物中转录的所有调节序列均可以使用。“编码序列”是当在适当调节序列的控制下转录为mRNA和／或翻译为多肽的核苷酸序列。编码序列的边界由5’-末端的翻译起始密码子和3’-末端的翻译终止密码子确定。编码序列包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，同时在某些情况下可以存在内含子。

如上所述，调节序列或因子对所导入的基因的表达具有正效应，因此增加所导入的基因的表达。因此，通过使用强转录信号，例如强启动子和／或强增强子可以在转录水平上有利地发生表达的增加。另外，在翻译水平上增加表达也是可能的，例如通过转入翻译增强子序列，例如Ω增强子(例如增强转录物的核糖体结合)，或者通过增加mRNA的稳定性，例如通过已知赋予转录物高稳定性的3'UTR编码区取代3'UTR编码区，或者通过消除转录物的不稳定性来稳定转录物，这样mRNA分子比野生型更经常被翻译。例如植物中AU-丰富元件(ARE)和DST(下游)元件使转录物不稳定。诱变研究已证明在两个保守结构域(ATAGAT和GTA区)之间的残基对于不稳定功能是必须的。因此除去或诱变此类元件显然将导致转录物更加稳定、更高的转录速度和更高的蛋白质活性。翻译增强子也是“超驱动序列"，其包含烟草花叶病毒5’-非翻译前导序列，其增加蛋白质／RNA比率(Gallie等人，1987，Nucl．Acids Research15：8693-8711)。

增强子一般定义为顺式作用元件(cis active elements)，其可不依赖于位置和方向刺激基因转录。已在植物中鉴定了不同的增强子，其可以组成型刺激转录，或组织或刺激特异性刺激转录。组成型增强子的公知实例是来自35S启动子的增强子(Odell等人，1985，Nature313：810-812)或ocs增强子(Fromm等人，1989，Plant Cell1：977：984)。其他例子是G-Box基序四聚体，其在双子叶和单子叶植物中赋予高水平的组成型表达(Ishige等人，1999，Plant Journal，18，443-448)，或petE(A／T-丰富序列)，其在转基因烟草和马铃薯植物中作为基因表达的定量增强子(Sandhu等人，1998；Plant Mol Biol.37(5)：885-96)。除此之外，已描述了大量有助于特异性表达模式的顺式作用元件，所述特异性表达模式例如器官特异性表达，或响应生物或非生物胁迫的诱导性表达。该元件的例子是提供病原体或损伤诱导表达的元件(Rushton，2002，Plant Cell，14，749-762)，或保卫细胞特异性表达(Plesch，2001，Plant Journal28，455-464)。

有利地，可以使用任何类型的启动子驱动核酸序列的表达。启动子可以是诱导型启动子，即应答发育、化学、环境或物理刺激具有诱导的或增加的转录起始。另外的或可选的启动子可以是组成型启动子，即在植物的至少一种组织或器官中显著表达，且在植物的任何生命阶段显著性表达的启动子。另外的或可选的，启动子可以是组织偏好的或细胞偏好的启动子，即其能够在某些组织如叶、根、种子组织等，或甚至在特定细胞中优选地起始转录。能够仅在某些组织或细胞中起始转录的启动子在本文中分别称其为“组织特异性”和“细胞特异性”。在这些植物中有功能的合适启动子通常是已知的。它们可以采取组成型或诱导型启动子的形式。合适的启动子能够在多细胞真核生物中进行发育和／或组织特异性表达；从而可以有利地在植物中使用叶、根、花、种子、气孔、块茎或果实特异性启动子。例如，在植物中可用的不同植物启动子为诸如USP、LegB4-、DC3启动子或来自欧芹的泛素启动子等启动子。“植物”启动子包含调节元件，其介导编码序列区段在植物细胞中的表达。从而，植物启动子无需为植物来源的，而是可以来源于病毒或微生物，例如，特别是来源于攻击植物细胞的病毒。“植物”启动子也可以来源于植物细胞，例如，来源于经本文所述的欲在本发明方法中表达的核酸序列转化的植物。这对于其他“植物”调控信号同样适用，例如“植物”终止子的情况。为在植物中表达，核酸分子必须如上文所述的那样，有效连接于或者包含合适的启动子，所述启动子在合适的地点适时地以细胞或组织特异性方式表达该基因。可用的启动子有组成型启动子(Benfey等，EMBO J．8(1989)2195-2202)，如来源于植物病毒的那些启动子，如35S CAMV(Franck等，Cell21(1980)285-294)、19S CaMV(还参见US5352605和WO84／02913、)、34S FMV(Sanger等，Plant．Mol．Biol．，14，1990：433-443)、欧芹泛素启动子，或植物启动子如US4,962,028中所述的核酮糖二磷酸缩化酶／加氧酶(Rubisco)小亚基启动子或植物启动子PRP1[Ward等，Plant．Mol.Biol.22(1993)]、SSU、PGEL1、OCS[Leisner(1988)Proc Natl Acad SciUSA85(5)：2553-2557]、lib4、usp、mas[Comai(1990)Plant Mol Biol15(3)：373-381]、STLS1、ScBV(Schenk(1999)Plant Mol Biol39(6)：1221-1230)、B33、SAD1或SAD2(亚麻启动子，Jain等，Crop Science，39(6)，1999：1696-1701)或nos[Shaw等(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：7831-7846]。其他组成型植物启动子的实例为甜菜V-ATPase启动子(WO01／14572)。合成组成型启动子的实例有超级启动子(Super promoter)(WO95／14098)和来源于G-box的启动子(WO94／12015)。此外，适当的情况下还可以使用化学诱导型启动子，对照EP-A388186、EP-A335528、WO97／06268。在植物中稳定组成型表达本发明蛋白质是有利的。然而，如果收获前的晚期表达有利的话，最好诱导型表达本发明的多肽，因为代谢操作很可能会导致植物生产延迟。也能够通过化学诱导型启动子促进植物基因的表达(有关综述，参见Gatz1997，Annu．Rev．Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)。当期望以时间特异性方式表达基因时，化学诱导型启动子尤其适用。此类启动子的实例有水杨酸诱导型启动子(WO95／19443)、脱落酸诱导型启动子(EP335 528、)、四环素诱导型启动子(Gatz等(1992)Plant J．2，397-404)、环己醇或乙醇诱导型启动子(WO93／21334)，或者本文所述的其他启动子。其他合适的启动子是那些针对生物或非生物胁迫起反应的启动子，例如病原诱导的PRPl基因启动子(Ward等，Plant．Mol.Biol.22(1993)361-366、)、番茄热诱导型hsp80启动子(US5,187,267)、马铃薯冷诱导型α-淀粉酶启动子(WO96／12814)或创伤诱导型pinII启动子(EP-A-0 375 091)，或者本文所述的其他启动子。优选的启动子尤其是那些导致基因在组织和器官、在种子细胞如胚乳细胞以及发育中的胚细胞中表达的启动子。合适的启动子有油菜籽油菜napin基因启动子(US5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP启动子(Baeumlein等，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)、拟南芥油质蛋白启动子(WO98／45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白启动子(US5,504,200)、芸苔Bce4启动子(WO91／13980)、豆arc5启动子、胡萝卜DcG3启动子或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)，以及在单子叶植物中带来种子特异性表达的启动子，如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等。有利的种子特异性启动子有蔗糖结合蛋白启动子(WO00／26388)、菜豆蛋白启动子和napin启动子。必须考虑的合适的启动子有大麦lpt2或lptl基因启动子(WO95／15389和WO95／23230)，以及WO99／16890中所述的启动子(来自大麦大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻oryzin基因、稻醇溶谷蛋白基因、小麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱kasirin基因、黑麦黑麦碱基因的启动子)。其他合适的启动子为Amy32b、Amy6-6和Aleurain[US5,677,474]、Bce4(油菜籽油菜)[US5,530,149]、大豆球蛋白(大豆)[EP571 741]、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆)[JP06／62870]、ADRl2-2(大豆)[WO98／08962]，异柠檬酸裂合酶(油菜籽油菜)[US5,689,040]或α-淀粉酶(大麦)[EP781 849]。可用于在植物中表达基因的其他启动子有叶特异性启动子，如DE-A19644478中所述的那些；或者光调控的启动子，如豌豆petE启动子。其他合适的植物启动子有胞质FBPase启动子或马铃薯ST-LSI启动子(stockhaus等，EMBO J．8，1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶启动子(GenBank登录号U87999)或EP-A-0 249 676中描述的瘤特异性启动子(node-specific promoter)。优选地，本发明的CDK核酸或其变体有效连接到茎干特异性启动子。本文所定义的术语“茎干特异性”指的是在茎干中显著性表达，并在植物的任何生命阶段显著性表达的启动子。本文所用术语“茎干”包括植物的全部地上部分，包括茎和枝条、叶、芽、生殖器官，包括茎干衍生的结构，例如匍匐茎、球茎、根茎或块茎。优选地，能够在整个茎干中偏好地表达核酸的茎干特异性启动子是弱启动子。可以例如通过将启动子连接于报告基因并测定报告基因在多种植物组织中的表达来分析启动子的强度和／或表达方式。本领域技术人员已知的一个合适的报告基因是β-葡糖醛酸糖苷酶。接着可以将启动子强度和／或表达方式与充分表征的茎干特异性参考启动子，例如Cab27启动子(弱表达，GenBank AP004700)或推定的原叶绿素酸酯还原酶启动子(强表达，GenBank AL606456)相比较。关于“弱启动子”指驱动编码序列以低水平表达的启动子，即在每个细胞中约1／10,000转录物至约1／100,000转录物，至约1／500,000转录物的水平。相反地，“强启动子”驱动编码序列以高水平表达，或在每个细胞中约1／10转录物至约1／100转录物，至约1／1000转录物。最优选地，能够在整个植物中偏好地表达核酸的启动子是来自稻的金属硫蛋白启动子。应该清楚的是本发明的应用不限于序列表中描述的CDK核酸，尤其不限于由SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55所示的CDK核酸。任选的，还可在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语“终止子”包括调控序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，标志初级转录物的3′加工(在终止密码子后)和多聚腺苷酸化以及转录的终止。可用于本发明方法中的终止子例如是OCS1终止子、nos3终止子或35S终止子。有启动子的情况下，各基因使用不同的终止子序列。微生物中有用的终止子例如是fimA终止子、txn终止子或trp终止子。此类终止子可以是rho-依赖性的或rho-非依赖性的。其他调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员知晓适合用于实施本发明的终止子和增强子序列。此类序列是已知的，或本领域技术人员可以容易的获得。本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和／或复制所需的复制序列的起点。一个实例是需要遗传构建体在细菌细胞中作为附加型遗传元件(如质粒或黏粒分子)维持的情况。首选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。为检测和／或选择如序列表中所述以及本发明方法中所用核酸序列的成功转移，最好使用标记基因(=报道基因)。这些标记基因能够通过一系列不同的原理鉴定核酸分子的成功转移，例如通过视觉鉴定，借助于荧光、发光或者人眼不可见的光波波长范围，通过除草剂或抗生素抗性，通过称为营养标记(营养缺陷型标记)或抗营养标记(antinutritive marker)，通过酶测定或通过植物激素。可提及的此类标记的实例有GFP(=绿色荧光蛋白、)；荧光素／荧光素酶系统；β-半乳糖苷酶及其着色底物，例如X-Gal；针对例如咪唑啉酮、草甘磷、膦丝菌素或磺胺脲的除草剂抗性；针对例如博来霉素、潮霉素、链霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素等等的抗生素抗性；营养标记如甘露糖或木糖的利用；或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性。这仅仅是一小部分可能的标记的名单。技术人员对这类标记极为熟悉。优选根据不同生物体和选择方法来使用不同的标记。因此遗传构建体可以任选地包括可选择的标记基因。如本文所用，术语“可选择的标记或可选择的标记基因，，包括赋予细胞表型的任何基因，该基因在细胞中表达，有利于鉴定和／或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。选择性标记基因的实例包括其编码的蛋白质能赋予抗生素抗性的基因(如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt)、其编码的蛋白质赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox)，或提供陈代谢性状的基因(如允许植物利用甘露糖作为唯一碳源的manA)。编码可视标记蛋白质的基因导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、萤光(如萤光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白，GFP，及其衍生物)。已知核酸稳定或瞬时整合进植物细胞，仅少数细胞摄入外来DNA，并整合进其基因组(如果期望的话)，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(如上文所属，例如抗生素抗性、)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。植物中优选的可选择标记包括那些赋予除草剂如草甘膦或草丁膦抗性的标记。其他合适的标记为例如编码参与例如糖或氨基酸生物合成通路基因的标记，如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。编码基因如荧光素酶、gfp或其他荧光基因的标记同样适用。这些标记和前述标记可在突变体中使用，所述突变体中原有的这些基因没有功能，例如由于常规方法而缺失。此外，编码可选择标记的核酸分子与编码本发明多肽的核酸分子可以在同一个载体中引入宿主细胞或用于本发明的方法，或者在单独的载体中。由所引入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。一旦成功引入核酸，将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，通常特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明引入核酸的方法有利地采用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸，而第二个携带标记基因。较大比例的转化休接收或者对于植物而言含有(高达40%或以上的转化体)两个载体。对于农杆菌转化，转化体通常只接收载体的一部分，即为T-DNA所侧接的序列，其通常指表达盒。随后可通过杂交从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合进转座子的标记基因与期望的核酸一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10%)，一旦成功进行了转化，转座子跳出宿主细胞基因组并丢失。在其他一些情况下，转座子跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交消除标记基因。在微生物学领域，研发了有可能或便于检测此类事件的技术。另一有利的方法有赖于称为重组系统的方法，其优势在于可以免除杂交消除步骤。最著名的这类系统称为Cre/lox系统。Cre1为重组酶，且切除位于loxP序列之间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦成功进行了转化，由于该重组酶的表达，其得以切除。其他重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000:22255-22267;Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000:553-566)。根据本发明的核酸有可能位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。

本发明还包括可由本发明方法获得的植物或植物细胞。本发明因此提供可由本发明方法获得的植物或植物细胞，所述植物或植物细胞中引入了CDK核酸或其变体，所述CDK核酸或其变体编码本文公开的包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE、ATP结合和活性部位基序的CDK。

本发明还提供用于生产具有改良生长特性的转基因植物细胞或转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达CDK核酸或其变体，所述CDK核酸或其变休编码本文公开的包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE、ATP结合和活性部位基序的CDK。

更具体地，本发明提供了产生具有改良的生长特性的转基因植物的方法，该方法包括:

(i)向植物或植物细胞中引入编码CDK或其同源物的核酸;和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。

可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身(包括引入到植物的组织、器官或任何其他部分)。根据本发明首选的特征，优选通过转化将核酸引入植物。

本文所涉及的术语“转化”或“导入”包括将外源多核苷酸转移入宿主细胞，而不管转移所用的方法如何。无论通过器官发生还是胚胎发生能够随后克隆繁殖的植物组织，可以用本发明的遗传构建体转化，并且从其再生出整株植物。选择的特定组织将根据可用且最适于所转化特定物种的克隆繁殖系统而改变。示例性的靶标组织包括叶盘、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、雌配子、胼胝体组织、存在的分生组织(例如，顶端分生组织，腋生的芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以瞬时或稳定的将多核苷酸引入宿主细胞中，且可保持非整合状态，例如，作为质粒。可选择的，可以将其整合到宿主基因组中。接着可以使用本领域技术人员公知的方法，使用所得的转化植物细胞再生转化的植物。

外来基因转移进入植物基因组中称为转化。为实施转化，利用转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。有利的转化法是植物原位(in planta)转化。为此，有可能例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，证明使转化农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基尤为有利。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。为选择转化的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件中，从而可将转化植物与非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长周期之后，通过喷雾对其进行选择。另一可能性包括使用合适的选择剂，将种子，适用的情况下是在授粉之后，种植在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。其他有利的转化方法、特别是植物转化方法，为技术人员所公知，并在下文描述。

植物物种的转化目前是相当常规的技术。有利的，可以使用任意的一些转化方法将目的基因引入到合适的祖代细胞中。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄入的化学品、直接注射DNA到植物中、基因枪轰击、使用病毒或花粉转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature296，72-74;Negrutiu等人(1987)Plant Mol.Biol.8，363-373);原生质体的电穿孔(SMllito等人，(1985)Bio/Technol3，1099-1102);显微注射到植物材料中(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202，179-M5);DNA或RNA包被颗粒轰击(Klein等人，(1987)Nature327，70);用(非整合型)病毒感染等等。优选使用任何用于诸如芸苔属、大豆、谷物或稻转化的熟知方法，通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化产生表达本发明的CDK的转基因植物，所述转化的方法例如在以下任何文献中描述的方法:公开的欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996);Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6，271-282，1994)，公开内容以其全文在此引用作为参考。在谷物转化情形下，首选方法如在Ishida等人(Nature Biotechnol.14，745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol.129，13-22，200D所述，公开内容以其全文在此引用作为参考。作为举例，所述方法由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在Transgenic Plants，卷1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸或构建休克隆到载体中，所述载体适用于转化根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，特别是作物植物，例如作为举例的烟草植物，例如通过在农杆菌溶液中水浴擦伤的叶子或剁碎的叶子，然后在合适的培养基中培养之。例如，通过根瘤农杆菌的植物转化由

和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述，或者尤其是由于F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants在Transgenic Plants，卷1，Engineering and Utilization，编辑S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页而为人所知。

通常在转化以后，选择存在与目的基因共转移的由植物可表达基因编码的一个或多个标记的植物细胞或细胞群，接着将转化的材料再生成整株植物。

如所提到的那样，用本发明表达载休转化的农杆菌也可以以其自身已知的方法来转化植物，如实验植物，像拟南芥或作物植物，例如像谷类、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、芸苔、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、甜椒、油菜籽油菜、木薯淀粉、木薯、竹芋、万寿菊、苜蓿、生菜和多种树木、坚果和葡萄藤物种，特别是含油作物植物，如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油菜籽油菜、椰子、油椰、红花(Carthamus tinctorius)、可可豆，例如通过在农杆菌溶液中水浴划破的叶子或叶节，随后在合适的培养基中培养之。

除了转化体细胞、然后再生为完整植株以外，还有可能转化植物分生组织的细胞，特别是发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育中的植物获得种子，其中一定比例经转化因而是转基因的(Feldman，KA和MarksMD(1987).Mol Gen Genet208:274-289;Feldmann K(1992).在CKoncz，N-HChua和JShell编辑Methods inArabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页)。可选方、法基于荧光的反复去除以及莲座叶中心切除部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).PlantJ.5:551-558;Katavic(1994).Mol Gen Genet，245:363-370)。然而)特别有效的方法是真空渗透法，及其改良法如“浸花法”(floral dip)。对于拟南芥的真空渗透，用农杆菌悬液减压处理完整植株(Bechthold，N(1993).CRAcad Sci Paris Life Sci，316:1194-1199)，而对于“浸花法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液一起短暂孵育(Clough，SJ und Bent，AF(1998).The Plant J.16，735-743)。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中母系遗传，降低或消除了转基因通过花粉流失的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等，2004(Nature Biotechnology22(2)，225-229)系统展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导转基因位点特异性整合到质体中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述可摘自Bock(200l)Transgenic plastids in basic research and plantbiotechnology.J Mol Biol.2001Sep21;312(3):425-38或Maliga，P(2003)Progress towards commercialization of plastid transformation technology.Trends Biotechnol.21，20-28。其他生物技术方法最近被报道为不含标记的质体转化休的形式，这可以通过瞬时共合体标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology22(2)，225-229)。

遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者

和Willmitzer的出版物。

DNA转移和再生之后，可例如使用Southern分析评价推定的转化植物中目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组成。可选的或另外的，可使用Northern和/或Western分析监控新引入DNA的表达水平，两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。

可通过多种方法繁殖产生的转化植物，如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自交产生纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物可通过传统的育种技术进一步繁殖。

产生的转化生物可以是多种形式的。例如，它们可以是转化细胞与未转化细胞的嵌合体;克隆的转化体(例如，所有被转化以含有表达盒的细胞);转化与未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，嫁接到未转化的接穗中的转化的根茎)。

本发明显然延及由本文描述的任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及包括由任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求是该后代表现出与由本发明方法在亲代中产生相同的基因型和/或表型特征。

本发明还包括含有分离的植物CDK核酸或其变体的宿主细胞，所述核酸或其变体编码包含本文所公开的特征的CDK。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。

本发明还延及本发明植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎和鳞茎。本发明另外涉及来源于，优选直接来源于此类植物的可收获部分的产物，如干的颗粒或粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉和蛋白质。

本发明还包括在CDK基因和其编码的蛋白质对于改良植物生长特性的用途，这类改良的生长特性如以上所定义。

本发明还包括CDK核酸或其变体的用途，以及CDK多肽或其同源物的用途，该CDK或同源物包含本文公开的(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE。ATP结合和活性部位基序，或该CDK核酸或变体编码这类蛋白质。此类的用途之一涉及改良植物的生长特性，具体而言改良产量，特别是种子产量。种子产量可以包括下列一种或多种:增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的种子重量、增加的收获指数等。

CDK核酸或其变体，或CDK多肽或其同源物可以用在育种方案中，其中鉴定了与CDK基因或其变体遗传连锁的DNA标记。CDK或其变体，或CDK或其同源物可以用来定义分子标记。随后可以将此DNA或蛋白质标记用在育种方案中以选择具有改良的生长特性的植物。CDK基因或其变体可以是，例如由序列表中所示的核酸，优选SEQ ID NO:45、47、49、51、53或55所示的核酸，或编码任意本文所定义的同源物的核酸。

还发现CDK的等位变体可以用于标记辅助的育种方案中。此类育种方案有时需要通过植物的诱变处理，例如使用EMS诱变引入等位变异;可选的，该方案可以从收集无意产生的所谓“天然”来源的等位变体开始。之后通过例如PCR进行等位变体的鉴定。接着是选择步骤，用于选择所讨论序列的优良等位变体，其在植物中产生改良的生长特性。通常通过监控含有所讨论序列的不同等位变体(例如SEQ ID NO:45、47、49、51、53或55的不同等位变体，或编码任意上述同源物的核酸的不同等位变休)的植物的生长特性来进行选择。监控生长特性可以在温室或野外进行。此外可选的步骤包括使其中已鉴定优良等位变体的植物与另一植物杂交。例如，这可用于产生目标表型特征的组合。

还可使用本发明的CDK核酸或其变体作为探针对其为部分的基因进行遗传和物理作乱以及作为那些基因有关性状的标志。此类信息可用于植物育种，以开发具有期望表型的株系。CDK核酸或其变体的此类用途仅需要长度至少为15个核苷酸的核酸序列。CDK核酸或其变体可用作限制性片段长度多态性（RFLP)标记。可使用CDK核酸或其变体探测限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹。然后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1:174-181)对所得的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，该核酸可用于探测含有限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，所述基因组DNA来自代表亲本和确定的遗传杂交后代的一组个体。记录DNA多态性的分离，并用来计算CDK核酸或其变体在先前使用该群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。

在遗传作图中植物基因来源的探针的生产和用途在Bernatzky和Tanksley(Genetics112，887-898，1986)中有描述。众多出版物描述了使用上述方法或其变通形式对特定的cDNA克隆进行遗传作图。例如，可使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群休、近等基因系及其他的个体组作图。这类方法是本领域技术人员熟知的。

核酸探针也可用于物理作图(即将序列置于物理图上;参见Hoheisel等人，在:Non-mammalian Genomic Analysis:APractical Guide，Academic press1996，第319-346页，以及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。虽然现在的FISH作图方法偏向于使用大的克隆(几kb到几百kb;参见Laan等人(1995)Genome Res.5:13-20)，但是灵敏度的提高允许使用较短的探针进行FISH作图。

可以使用核酸进行多种基于核酸扩增方法的遗传和物理作图。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(198g)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS;Sheffield等人(1993)Genomics16，325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18:3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17:6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和生产引物对用于扩增反应或引物延伸反应。此类引物的设计是本领域技术人员所熟知的。在使用基于PCR的遗传作图方法中，需要鉴定在对应于此核酸序列的区域之上作图的亲代之间的DNA序列差异。但是这对作图方法通常不是必要的。

可以以此方式产生、鉴定和/或分离具有改变的依赖细胞周期蛋白的激酶活性、呈现改良的生长特性的改良植物。

本发明的CDK核酸或其变体，或CDK多肽或其同源物还可以用作生长调节剂。由于已经表明这些分子可用于改良植物的生长特性，它们也是有用的生长调节剂，如除草剂或生长刺激物。本发明因此提供了用作生长调节剂的组合物，其包含CDK或其变体，或CDK多肽或其同源物，连同合适的载体、稀释剂或赋形剂，所述CDK或同源物包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE、ATP结合和活性部位基序，或该CDK或变休编码这样的蛋白质。

根据本发明的方法产生如上所述的具有改良生长特性的植物。这些有利的生长特性也可与其他经济学上有利的性状组合，如进一步增加产量的性状、对各种胁迫的耐受性、修饰各种结构特征和/或生化和/或生理学特征的性状。

附图说明

本发明现在将参考以下附图进行描述，其中：

图1显示了载体EG073qcz，其也描述于序列表中的SEQ ID NO:57。

图2显示了载体EG065qcz，其也描述于序列表中的SEQ ID NO:58。

图3显示了载体pMME0607，其也描述于序列表中的SEQ ID NO:59。

图4显示了载体序列EG073qcz、EG065qcz和pMME0607，其也描述于序列表中的SEQ ID NO:57至59。

实施例

现在将参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在说明。

DNA操作:除非另外说明，重组DNA技术按照(Sambrook(2001)Molecular Cloning:a laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New Vork)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols的卷1和2(http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)中描述的标准方案进行。植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.DCroy的PlantMolecular Biology Labfax(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。

实施例1:基因克隆

SEQ ID NO:45可使用已知的成熟方法，克隆入质粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)Proc.Natl Acad.Sci.美国，75:3737-3741)、pACYC177(Change & Cohen(1978)J.Bacteriol.134:1141-1156)、pBS系列的质粒(PBSSK+，pBSSK-等;Stratagene，LaJolla，美国)，或黏粒，如SuperCos1(Stratagene，LaJolla，美国)或Lorist6(Gibson，T.J.Rosenthal，A.和Waterson，R.H.(1987)Gene53:283-286)，以在大肠杆菌中表达(参见，例如Sambrook，J.等人(1989)"Molecular Cloning:ALaboratory Manual″.Cold Spring Harbor Laboratory Press，或Ausubel，F.M.等人(1994)"Current Protocols in Molecular Biology″，John Wiley &Sons)。

实施例2:DNA测序以及计算机化功能分析

通过标准方法，特别是链测定方法，使用ABI377测序仪测序DNA(参见，例如Fleischman，R.D.等人(1995)"Whole-genome RandomSequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.，Science269;496-51D”。

实施例3:不同微生物(例如大肠杆菌(Escherichia coli)和根瘤农杆菌(AgrobacteHum tumefaciens))间DNA转移

本领域技术人员可得到允许核酸序列在不同微生物之间转移的穿梭载体，例如pYE22m、pPAC-ResQ、pClasper、pAUR224、pAMH10、pAML10、pAMT10、pAMU10、pGMH10、pGML10、pGMT10、pGMU10、pPGAL1、pPADH1、pTADH1、pTAex3、pNGA142、pHT3101及其衍生物。Soni R.和MurrayJ.A.H.[Nucleic Acid Research，第20卷，第21期，1992:5852]公开了分离此类穿梭载体的简单方法:如果需要，此类穿梭载体可以使用用于大肠杆菌的标准载体(Samb，ook，J.等人，(1989)，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，或Ausubel，F.M.等人(1994)"Current Protocols in Molecular Biology″，John WHey & Sons)和/或前述载体构建，所述载体具有用于大肠杆菌或根瘤农杆菌的复制起点，以及加入的来自大肠杆菌或根瘤农杆菌的合适标记。此类复制起点优选来自内源性质粒，所述内源性质粒分离自用于制备本发明中所用的植物的物种。用于这些物种作为转化标记的具休基因是卡那霉素抗性基因(例如来自Tn5或Tn-903转座子的那些)或氯霉素抗性基因(Winnacker，E.L.(1987)"From Genes to Clones-Introduction to GeneTechnology，VCH。Weinheim)，或其他抗生素抗性基因，例如G418抗性、庆大霉素抗性、新霉素抗性、潮霉素抗性或四环素抗性。

使用标准方法，可以将目的基因克隆进入上述穿梭载体之一。并将此类杂交载体导入本发明方法所用的微生物菌株中。

实施例4:测定突变/转基因蛋白质的表达

基于突变或转基因蛋白质与野生型蛋白质以类似的方式和量表达的事实，进行突变或转基因蛋白质在转化的宿主细胞中的活性观察。通过Northern印记进行测定突变基因或转基因(可用于基因产物的翻译的mRNA量的标记)转化的量的合适方法(参见，例如，Ausubel等人，(1988)Current Protocols in Molecular Biology，Wiley:New York)，其中引物以这种方式设计，所述方式是引物与提供了可检测标记(通常是放射性标记或化学发光标记)的目的基因结合，这样当提取生物培养物的总RNA、在凝胶上分离、应用到稳定的基质和用该探针温育时，探针的结合和结合的量指示该基因mRNA的存在及其量。另一方法是定量PCR。该信息检测基因转录的程度。细胞总RNA可例如从酵母或大肠杆菌中通过多种方法分离，所述方法是本领域已知的，例如根据制造商的指示使用Ambion试剂盒或如Edgington等人，Promega Notes Magazine Number41，1993，第14页中所述。

使用诸如Western印记的标准技术测定从该mRNA翻译的蛋白质的存在或相对量(参见，例如，Ausubel等人(1988)"Current Protocols inMolecular Biology″，Wiley，New Vork)。在该方法中，提取细胞总蛋白质、通过凝胶电泳分离、转移到如硝酸纤维素的基质上，以及与和目的蛋白质特异性结合的探针(例如抗休)温育。该探针通常直接或间接提供易检测的化学发光标记或显色(colorimetric)标记。标记的存在和观察到的量指示细胞中寻找的突变蛋白质的存在和量。但是其他方法也是已知的。

实施例5:遗传修饰微生物的生长:培养基和培养条件

诸如大肠杆菌的遗传修饰微生物可以在本领域技术人员已知的合成或天然生长培养基中生长。诸如大肠杆菌的微生物用的大量不同生长培养基是众所周知、方便可及的。

实施例6:转化农杆菌

使用热休克或电穿孔方案可将质粒转化进入根瘤农杆菌(GV3101pMP90;Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204:383-396)。转化的菌落可在YEP培养基上以28℃生长2天，并用相应的抗生素(Rif/Gent/Km)选择。这些农杆菌培养物用于植物转化。

根据以下标准条件培养和转化拟南芥:Bechtold1993(Bechtold，N.，Ellis，J.，Pelletier，G.1993.In planta Agrobacterium mediated gene transferby infiltration of Arabidopsis thaliana plantsC.R.Acad.Sci.Paris.316:1194-1199);Bent等人，1994(Bent，A.，Kunkel，B.N.，Dahlbeck，D.，Brown，K.L.，Schmidt，R.，Giraudat，J.，Leung，J.和Staskawicz，B.J.1994;PPCS2of Arabidopsis thaliana:A leucin-rich repeat class of plant diseaseresistant genes;Science265:18564860)。

转基因拟南芥植物可在York生长室中分别培养于罐中，所述罐含有4:1(v/v)混合的土和石英砂。标准生长条件是:16小时明8小时暗的光周期、20℃、60%相对湿度和150μE的光通量密度。为了诱导萌发，播种的种子黑暗中至于4℃3天。植物每天浇水直至它们大约3周龄，此时通过限制水施于干旱。同时，相对湿度以隔天10%的增量降低至20%。在所述条件下检测植物改良的生长。

通常将所述实验进行三次连续的独立实验是有益的。在第一个实验中，待检测的每个基因播种10株独立的T2株系。确定未显示可见的损伤症状的植物的百分数。然后在第二个实验中以相同的实验方法确认阳性株系。之后在第三个实验中重复确认表现出改良的生长的最佳株系的至少7个重复。

在另一实验中，对于各主要株系，再次测定得自不同的转化事件但是含有相同基因构建体的其他株系。总结并分析所有结果。

实施例6：载体构建和稻转化

在稻中表达诸如在图1-4中所示的，含有表达盒SEQ ID NO：60的载体是有益的。序列表中所示的SEQ ID NO：1可转入所述载体。所述载体可转化进入农杆菌菌株LBA4404，随后转化进入稻植株。使转化的稻植株生长，然后检测实施例7中描述的参数。

实施例7：转化体的评估：生长测量

一般产生大约15到20个独立的T0转化体。将初级转化体从组织培养箱转移到温室中生长，并收获T1种子。4个事件得以保留，其中T1后代发生3：1的转基因存在／缺乏分离。对于这些事件中的每一个，通过可视标记筛选10个包含转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)，以及10个缺乏转基因的T1幼苗(失效合子)。将选择的T1植物转移到温室中。每个植物具有一个唯一的条形码标签以将表型数据与对应植物明确联系起来。所选择的T1植物在10cm直径花盆的土壤中在下列环境状态下生长：光周期=11．5小时、日光强度=30,000勒克斯或更多、日间温度=28℃或更高、夜间温度=22℃、相对湿度=60-70％。转基因植物和相应的失效合子在随机位置上并排生长。从播种期到成熟期，使植物几次通过数字成像箱。在每个时间点上从至少6个不同的角度取得每株植物的数字图像(2048×1536像素，一千六百万色)。

收获成熟的初级圆锥花序、装袋并贴上条码标签，然后在37℃烤箱中干燥三天。随后将圆锥花序脱粒并且收集所有的种子。使用鼓风装置将饱满外壳和空外壳分开。在分离后，使用可商购的计数器对两批种子进行计数。弃去空外壳。在分析天平上称重饱满的外壳并且使用数字成像测量种子的截面积。此方法得到下述一组种子相关参数。

这些参数是使用图像分析软件以自动方式从数字图像中得到，并且进行统计分析。双因素ANOVA(方差分析)修正不平衡设计并用作统计模型用于植物表型特征的全面评估。对用本发明基因转化的所有植株全部事件的所有测量参数进行F测验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总效应，亦称之为整体基因效应。如果F检验的值显示数据具有显著性，则结论是有“基因”效应，意味着不仅基因的存在或定位引起了效应。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F测验的5％概率水平。

为了检查基因在事件中的效应，即株系特异性效应，在每一事件中使用来自转基因植物和相应无效植物的数据组进行t检验。“无效植物”或“无效分离子”或“无效合子”是与转基因植物以相同方式处理，但是转基因已经与其分离的植物。也可以将无效植物描述为纯合的阴性转化植物。将t检验显著性的阈值设定为10％概率水平。一些事件的结果可以高于此阈值或低于此阈值。这是基于这种假设，即基因可以仅在基因组中的某些位置中具有效应，并且这一位置依赖性效应的发生并非罕见。本文中此类基因效应也称为“基因的株系效应”。通过比较t值和t分布得到p值，或者备选的，通过比较F值和F分布得到p值。p值给出了无效假设(即没有转基因效应)为正确的概率。

将在第一个实验中得到的数据使用T2植物在第二个实验中证实。选择3个株系进一步分析。通过监控标记基因表达来筛选T1中来自阳性植物(杂合子和纯合子)的一批种子。对于每一个选择的事件，随后保存几批杂合种子用于T2评估。在每批种子中，在温室中种植等量的阳性和阴性植物用于评估。

在T2代中评估总数为120个的转化植物，即每个事件有40个植物，其中有20个为转基因阳性且20个为阴性。

由于进行了具有重叠事件的两个实验，进行组合分析。这可用于检查两个实验效应的一致性，并且如果在这种情形下，可用于从两个实验中收集证据从而增加结论的可信性。使用的方法是考虑到数据的多级结构(即实验-事件-分离子)的混合模型方法。通过比较卡方分布的似然比测定得到p值。

实施例8：转化体的评估：产量有关参数的测量

当对上述种子进行分析时，发明人能够发现用编码具有本文所述的基序的CDK的CDK基因构建体转化的植物比缺乏CDK转基因的植物具有增加的饱满种子数、增加的种子总重量和增加的收获指数。

在T2代中再次得到在T1代植物中所得的阳性结果。在与T1代结果的组合分析中重新评估这些T2数据，并且得到的p值表明观察到的效应具有显著性。

饱满种子数

通过计算分离步骤后保留的饱满外壳数确定饱满种子数。通常4个测试株系中的3个显示饱满种子数的显著增加。

种子总产量

通过对从植物收获的所有饱满外壳称重测量每株植物的种子总产量(种子总重量)。通常4个转基因T1株系中的3个显示种子总重量的增加。

收获指数

本发明中的收获指数在本文中定义为种子总产量与地上面积(mm²)之间的比率，乘以因子10⁶。所有测试的株系显示增加的收获指数。

此外，有种子总数增加的总体趋势。

实施例9：用于生物分析(bioanalytical analyse)的植物培养物

为了生物分析转基因植物，所述转基因植物如上培养。

实施例10：转化植物的代谢分析

根据本发明确定的修饰通过如下方法进行测定。

a)匀浆样品

使用球磨机(Retsch)进行样品的均浆。将10至30颗稻粒移至塑料管(Eppendorf，Safe-Lock，2mL)中，在液氮冷却条件下，用不锈钢球进行匀浆。

b)冻干

在实验过程中，小心将样品保持在深度冷冻状态(温度<-40℃)，或者直到首次与溶剂接触之前，通过冻干匀浆材料使之不含水分。

将样品转移到预冷的(-40℃)冷冻干燥器中。主要干燥阶段的初始温度为-35℃，而压力为0．120mbar。在干燥阶段，按照压力和温度程序来改变参数。12小时后的最终温度为+30℃，而最终压力为0．001至0．004mbar。在关闭真空泵和冷却机器之后，向系统中冲入空气(经干燥管干燥)或氩。

c)萃取

在向冻干设备中充气后，即刻牢固密封装有冻干植物材料的管，以保护材料免受空气湿度的影响。为进行萃取，在玻璃纤维萃取套管中称重部分(50mg)干燥的匀浆化植物材料，并转移至ASE装置(快速溶剂萃取仪ASE200，配有溶剂控制器和AutoASE软件(DIONEX))的5ml萃取柱中。

向ASE装置(，快速溶剂萃取仪ASE200，配有溶剂控制器和AutoASE软件(DIONEX))的24个样品点填充植物材料，包括一些测试质量控制的样品。

用大约10ml甲醇／水(80／20，v／v)于T=70℃和p=140bar下，以5分钟的加热阶段，1分钟的静态萃取来萃取极性物质。用大约10ml甲醇／二氯甲烷(40／60，v／v)于T=70℃和p=140bar下，以5分钟的加热阶段，1分钟的静态萃取来萃取更为亲脂性的物质。在相同的玻璃管(离心管，50ml，配有螺帽和可穿透的隔膜，以用于ASE(DIONEX))中萃取两种溶剂混合物。

用市售内参如核醣醇、L-甘氨酸-2,2-d₂、L丙氨酸-2,3,3,3-d₄、甲硫氨酸-d₃、精氨酸_(¹³c)、色氨酸-d₅、α-甲基吡喃葡糖苷十九烷酸甲酯、十一烷酸甲酯、十三烷酸甲酯、十五烷酸甲酯和二十九烷酸甲酯处理溶液。

将总萃取物与8ml水混合。弃去植物样品固体残留物和萃取套管。

振荡萃取物，然后以至少1400g离心5至10分钟，以加速相分离。取1ml上清甲醇／水相(“极性相”，无色)进行进一步GC分析，并取1ml进行LC分析。弃去剩余的甲醇／水相。取0．75ml有机相(“脂质相”，深绿色)进行进一步的GC分析，并取0．75ml进行LC分析。所有移除的级分经IR Dancer红外真空干燥机(Hettich)蒸发干燥。蒸发过程中最高温度不超过40℃。设备中的压力为不超过10mbar。

d、)处理脂质相和极性相以进行LC／MS或LC／MS／MS分析

将经蒸发干燥的脂质萃取物吸收于流动相。将经蒸发干燥的极性萃取物吸收于流动相。

e)LC-MS分析

LC部分在可由Agilent Technologies，美国商购的LCMS系统中进行。将10μl极性萃取物以200μl／min的流速注入系统。色谱期间分离柱(反相C18、)维持在15℃。对于脂质相萃取物，将5μl以200μl／min的流速注入系统。分离柱(反相C18)维持在30℃。以梯度洗脱进行HPLC。

质谱分析在配有turbo喷雾离子源的Applied Biosystems API4000三级四极仪器中进行。对于极性萃取物，仪器以负离子模式通过全扫描模式在100-1000amn测量。对于脂质相萃取物，仪器以正离子模式通过全扫描模式在100-1000amu测量。

f)衍生脂质相以进行GC／MS分析

为了进行甲醇分解转移作用(transmethanolysis)，向蒸发干燥的萃取物中添加140μl氯仿、37μl盐酸(以重量计37％的HCl水溶液)、320μl甲醇和20μl甲苯的混合物。牢固密封容器，并于100℃加热2小时，同时振荡。随后对溶液进行蒸发至干。残留物彻底干燥。

通过与甲氧胺盐酸盐(5mg／ml吡啶溶液，100μl于60℃进行1．5小时)在牢固密封的容器中反应来进行羰基的甲氧化作用。加入20μl奇数碳的直链脂肪酸溶液(7至25碳原子的脂肪酸各0．3mg／mL而27、29和31碳原子的脂肪酸各0．6mg／mL的3／7(v／v)吡啶/甲苯溶液)作为时间标准。最后，还是在牢固密封的容器中于60℃用100μlN-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2,2,2-三氟乙酰胺(MSTFA)衍生30分钟。注入GC之前的终体积为220μl。

g)衍生极性相以进行GC／MS分析

通过与甲氧胺盐酸盐(5mg／ml吡啶溶液，50μl于60℃进行1．5小时)在牢固密封的容器中反应来进行羰基的甲氧化作用。加入10μl奇数碳的直链脂肪酸溶液(7至25碳原子的脂肪酸各0．3mg／mL而27、29和31碳原子的脂肪酸各0．6mg／mL的3／7(v／v)吡啶/甲苯溶液)作为时间标准。最后，还是在牢固密封的容器中于60℃用50μl N-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2,2,2-三氟乙酰胺(MSTFA)衍生30分钟。注入GC之前的终体积为110μl。

h)GC-MS分析

GC-MS系统包括与Agilent5973MSD偶联的Agilent6890GC。自动取样器为来自CTC的CompiPal或GCPal。为进行分析，根据待分析的样品材料和相分离步骤级分的不同，采用一般市售的毛细管分离柱(30m×0．25mm×0．25μm)，使用含0％至35％芳香族部分的具有不同聚甲基硅氧烷的固定相(例如：DB-1ms、HP-5ms、DB-XLB、DB-35ms、AgilentTechnolo-gies)。根据样品材料和相分离步骤级分的不同，采用不同的加热速率，烘箱温度程序始于70℃终于340℃梯度，以不分流(splitless)模式注射多达1μL的终体积，以实现充分的色谱分离以及各分析物峰内的多次扫描。使用平常的GC-MS标准条件，例如恒速额定的1至1．7ml／min，并以氦作为流动相。通过在70eV电子撞击进行离子化，m/z扫描范围为15至600，扫描速率为2.5至3次扫描/秒，标准频率条件。

i)多种植物样品的分析

分别对20个植物样品的独立系列进行样品测量(也称为顺序)。实验中，每个顺序含有至少3个重复的各转基因株系，外加至少3株相应的无效分离株系作为对照。各分析物的峰面积调整为确立的植物干重面积(标准化面积)。通过相对于对照进一步标准化来计算比值。实验中，通过用标准化面积除以同顺序中对照组相应数据的均值来计算比值。所获得的数值称为对照比(ratio_by_control)。这些数值在顺序间是可比较的，并表明突变体中的分析物浓度与对照组有多大差异，对照组为给定顺序中相应无效分离株系的植物。合适的对照在证明载体和转化方法本身对于植物的代谢组成没有显著的影响之前预先选定。因此，与对照组相比记录的变化无疑是由突变引起的。

不同植物分析的结果示于下表3:

分析含有本文公开的CDK蛋白质的编码基因的稻植物的种子。

表3:稻植物中CDK蛋白质代谢分析的结果

代谢物	最小_比率	最大_比率	方法
				甲硫氨酸	1,254	1,456	CC
脯氨酸	0,627	0,628	GC
				天冬酰胺	1,845	2,255	GC
半胱氨酸	1,526	2,029	GC
				黄体	1，793	2,593	LC
玉米黄质	2,165	4,267	LC
				辅酶Q9	1,368	1,391	LC

第1栏显示了所分析的代谢物。第2和3栏显示了转基因植物与对照株系比较发现的所分析代谢物的增长范围。第4栏显示了分析方法。

Claims (30)

1.相对于相应的对照植物，改良植物生长特性的方法，其包括以下步骤：

(a)在植物中导入至少一种选择以下的核酸序列，所述核酸序列编码细胞周期蛋白依赖性激酶：

i)分离的核酸分子，如SEQ ID NO：1、51、45、47、49、53或55所示；

ii)分离的核酸分子，其编码如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的氨基酸序列；

iii)分离的核酸分子，作为遗传密码简并性的结果，其序列能够根据如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的多肽序列推导出来；

iv)分离的核酸分子，其编码的多肽与(i)至(iii)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少80％的同一性；

v)分离的核酸分子，其编码如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段为植物来源，且有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序；

vi)编码蛋白质的分离的核酸分子，所述蛋白质包含选自以下的氨基酸序列：

aa)(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE；

ab)(V/F/I)(L/I)HRD(L/M)K(P/S/T)(Q/N/S/G)N(L/I)L(V/L/I)；

ac)(I/L)(G/N)(E/R)G(T/A)YG(V/I)V(Y/C)(R/K/S)(A/G/S)(R/L/T/I)(D/N)(K/R/E)(V/K/A/S/T/N)T(N/S/G)(E/K/Q)(T/L/I/K)(I/V)A(L/V/I)KK；

ad)LK(I/L)(C/A)DFGL(A/S)R；

ae)WYRAPE(L/I)L(L/F)(C/G)；

af)GCI(F/M)AE(I/L/M)；以及

ag)DLL(Q/N/S/R)(K/Q/R)(L/M)(L/F)(I/T/I/C)(F/Y/L)DP(T/E/D/R/S)(K/Q)RI；

vii)分离的核酸分子或其互补物，其能够与上述(i)至(iii)的核酸杂交，其中所述杂交序列或其互补物编码有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白质；

viii)根据以上(i)至(iv)中任一项核酸的等位变体，所述等位变体编码植物CDK；和

ix)根据(iii)至(iv)中任一项核酸的备选剪接变体，所述备选剪接变体编码有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白质；

(b)选择相对于相应的对照植物具有改良的生长特性的植物。

2.权利要求1的方法，其中所述活性的调节通过引入植物来源的编码CDK的核酸序列实现。

3.权利要求1或2的方法，其中所述编码CDK的核酸序列来自单子叶或双子叶植物。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述编码细胞周期蛋白依赖性激酶的核酸序列来自物种稻、欧洲芸苔、大豆、亚麻、玉蜀黍或向日葵。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述编码CDK的核酸序列与调节序列有效连接。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是相对于相应的对照植物的增加的产量。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述增加的产量为增加的种子产量。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述增加的种子产量选自下列中的任一项或多项：(i)增加的种子重量；(ii)增加的种子总数；(iii)增加的饱满种子数；(iv)增加的收获指数。

9.根据权利要求1-8中任一项的方法获得的非繁殖植物部分或非繁殖植物细胞。

10.相对于相应的对照植物，改良植物生长特性的方法，其包括以下步骤：

(c)在植物中导入至少一种选择以下的核酸序列，所述核酸序列编码细胞周期蛋白依赖性激酶(＝CDK)：

i)分离的核酸分子，如SEQ ID NO：1、51、45、47、49、53或55所示；

ii)分离的核酸分子，其编码如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的氨基酸序列；

iii)分离的核酸分子，作为遗传密码简并性的结果，其序列能够根据如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的多肽序列推导出来；

iv)分离的核酸分子，其编码的多肽与(i)至(iii)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少80％的同一性；

v)分离的核酸分子，其编码如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段为植物来源，且有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序；

vi)编码蛋白质的分离的核酸分子，所述蛋白质包含选自以下的氨基酸序列：

aa)(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE；

ab)(V/F/I)(L/I)HRD(L/M)K(P/S/T)(Q/N/S/G)N(L/I)L(V/L/I)；

ac)(I/L)(G/N)(E/R)G(T/A)YG(V/I)V(Y/C)(R/K/S)(A/G/S)(R/L/T/I)(D/N)(K/R/E)(V/K/A/S/T/N)T(N/S/G)(E/K/Q)(T/L/I/K)(I/V)A(L/V/I)KK；

ad)LK(I/L)(C/A)DFGL(A/S)R；

ae)WYRAPE(L/I)L(L/F)(C/G)；

af)GCI(F/M)AE(I/L/M)；以及

ag)DLL(Q/N/S/R)(K/Q/R)(L/M)(L/F)(I/T/I/C)(F/Y/L)DP(T/E/D/R/S)(K/Q)RI；

vii)分离的核酸分子或其互补物，其能够与上述(i)至(iii)的核酸杂交，其中所述杂交序列或其互补物编码有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白质；

viii)根据以上(i)至(iv)中任一项核酸的等位变体，所述等位变体编码植物CDK；和

ix)根据(iii)至(iv)中任一项核酸的备选剪接变体，所述备选剪接变体编码有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白质；

(d)选择相对于相应的对照植物具有改良的生长特性的植物；以及

(e)在植物能够生长和发育的条件下培养所述植物。

11.权利要求10的方法，其中编码细胞周期蛋白依赖性激酶的核酸序列来自植物。

12.权利要求10或11的方法，其中所述编码CDK的核酸序列来自单子叶或双子叶植物。

13.权利要求10-12中任一项的方法，其中所述编码细胞周期蛋白依赖性激酶的核酸序列来自物种稻、欧洲芸苔、大豆、亚麻、玉蜀黍或向日葵。

14.权利要求10-13中任一项的方法，其中所述编码CDK的核酸序列与调节序列有效连接。

15.权利要求10-14中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是相对于相应的对照植物的增加的产量。

16.权利要求15的方法，其中所述增加的产量为增加的种子产量。

17.权利要求15或16的方法，其中所述增加的种子产量选自下列中的任一项或多项：(i)增加的种子重量；(ii)增加的种子总数；(iii)增加的饱满种子数；(iv)增加的收获指数。

18.根据权利要求10-17中任一项的方法获得的非繁殖植物部分或非繁殖植物细胞。

19.分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：

a)分离的核酸分子，如SEQ ID NO：1、51、45、47、49、53或55所示；

b)分离的核酸分子，其编码如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的氨基酸序列；

c)分离的核酸分子，作为遗传密码简并性的结果，其序列能够根据如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的多肽序列推导出来；

d)分离的核酸分子，其编码的多肽与(i)至(iii)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少80％的同一性；

e)分离的核酸分子，其编码如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段为植物来源，且有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序；

f)编码蛋白质的分离的核酸分子，所述蛋白质包含选自以下的氨基酸序列：

aa)(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE；

ab)(V/F/I)(L/I)HRD(L/M)K(P/S/T)(Q/N/S/G)N(L/I)L(V/L/I)；

ac)(I/L)(G/N)(E/R)G(T/A)YG(V/I)V(Y/C)(R/K/S)(A/G/S)(R/L/T/I)(D/N)(K/R/E)(V/K/A/S/T/N)T(N/S/G)(E/K/Q)(T/L/I/K)(I/V)A(L/V/I)KK；

ad)LK(I/L)(C/A)DFGL(A/S)R；

ae)WYRAPE(L/I)L(L/F)(C/G)；

af)GCI(F/M)AE(I/L/M)；以及

ag)DLL(Q/N/S/R)(K/Q/R)(L/M)(L/F)(I/T/I/C)(F/Y/L)DP(T/E/D/R/S)(K/Q)RI；

g)分离的核酸分子或其互补物，其能够与上述(i)至(iii)的核酸杂交，其中所述杂交序列或其互补物编码有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白质；

凭借所述核酸分子，植物具有增加的生长活性。

20.基因构建体，其包含分离的核酸分子，所述分离的核酸分子具有权利要求19中所要求的核酸序列，其中所述核酸与一个或多个调节信号功能性连接。

21.载体，其包含权利要求19中所要求的核酸或权利要求20中所要求的基因构建体。

22.非繁殖、非植物品种转基因植物细胞，其包含权利要求19中所要求的核酸、权利要求20中所要求的基因构建体或权利要求21中所要求的载体中的至少一种。

23.权利要求22的非繁殖、非植物品种转基因植物细胞，其中所述植物是双子叶或单子叶植物。

24.权利要求22或23的非繁殖、非植物品种转基因植物细胞，其中所述植物选自甘蔗、芸苔/油菜籽油菜、大豆、稻、棉花、马铃薯、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦、油椰、甜菜、向日葵或高粱。

25.权利要求19中所要求的核酸分子、权利要求20中所要求的基因构建体或权利要求21中所要求的载体在改良植物生长特性，尤其是提高产量，特别是提高种子产量中的用途。

26.权利要求9或18中的非繁殖植物部分或非繁殖植物细胞，其中所述植物部分是可收获部分。

27.权利要求26中的非繁殖植物部分或非繁殖植物细胞，其中所述植物部分是种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎或鳞茎的非繁殖部分，或死亡的植物细胞。

28.产品，其衍生自权利要求9、18、22、23、24、26和27中任一项所述的非繁殖植物部分或非繁殖植物细胞。

29.权利要求28中所要求的产品，其中所述产品是干的颗粒或粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉和蛋白质。

30.宿主细胞，其包含选自以下的核酸分子：

a)分离的核酸分子，如SEQ ID NO：1、51、45、47、49、53或55所示；

b)分离的核酸分子，其编码如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的氨基酸序列；

c)分离的核酸分子，作为遗传密码简并性的结果，其序列能够根据如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的多肽序列推导出来；

d)分离的核酸分子，其编码的多肽与(i)至(iii)的核酸分子所编码的多肽的氨基酸序列具有至少80％的同一性；

e)分离的核酸分子，其编码如SEQ ID NO：2、52、46、48、50、54或56所示的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段，所述同源物、衍生物或活性片段为植物来源，且有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序；

f)编码蛋白质的分离的核酸分子，所述蛋白质包含选自以下的氨基酸序列：

aa)(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)RE；

ab)(V/F/I)(L/I)HRD(L/M)K(P/S/T)(Q/N/S/G)N(L/I)L(V/L/I)；

ac)(I/L)(G/N)(E/R)G(T/A)YG(V/I)V(Y/C)(R/K/S)(A/G/S)(R/L/T/I)(D/N)(K/R/E)(V/K/A/S/T/N)T(N/S/G)(E/K/Q)(T/L/I/K)(I/V)A(L/V/I)KK；

ad)LK(I/L)(C/A)DFGL(A/S)R；

ae)WYRAPE(L/I)L(L/F)(C/G)；

af)GCI(F/M)AE(I/L/M)；以及

ag)DLL(Q/N/S/R)(K/Q/R)(L/M)(L/F)(I/T/I/C)(F/Y/L)DP(T/E/D/R/S)(K/Q)RI；

g)分离的核酸分子或其互补物，其能够与上述(i)至(iii)的核酸杂交，其中所述杂交序列或其互补物编码有利地包含(P/N/A)(S/L/M/F)(T/S/R)(T/S/A)(L/I)基序的植物CDK蛋白质；

凭借所述核酸分子，植物具有增加的生长活性。

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