DE112009000313T5

DE112009000313T5 - Pflanzen mit erhöhtem Ertrag

Info

Publication number: DE112009000313T5
Application number: DE112009000313T
Authority: DE
Inventors: Gerhard Dr. RITTE; Oliver Dr. BLÄSING; Oliver Dr. THIMM
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2011-04-28
Also published as: US20110010800A1; CA2716180A1; WO2009106596A3; WO2009106596A2; MX2010009010A; AR070719A1; BRPI0908093A2; CN102016048A; AU2009218478A1; EP2247735A2

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze oder eines Teils davon, das zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze oder einem Teil davon führt, dadurch, dass man eine oder mehrere Aktivitäten aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) erhöht oder erzeugt.

Description

Die vorliegende, hier offenbarte Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze erhöhtem Ertrag bereit, bei dem man eine oder mehrere Aktivitäten in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die eines oder mehrere Merkmale einer transgenen Pflanze verstärken oder verbessern, und Zellen, Nachkommenschaften, Samen und Pollen, die sich von diesen Pflanzen oder Teilen ableiten, sowie Herstellungsverfahren und Verfahren zur Anwendung solcher Pflanzenzellen bzw. Pflanzen, Nachkommschaften, Samen oder Pollen. Dieses verbesserte Merkmal/diese verbesserten Merkmale zeigt/zeigen sich insbesondere in einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise durch die Verbesserung eines oder mehrerer Ertragsmerkmale.
Unter Freilandbedingungen hängt die Leistung von Pflanzen zum Beispiel hinsichtlich Wachstum, Entwicklung, Aufbau von Biomasse und Samenbildung von der Fähigkeit der Pflanze, zahlreiche Umweltbedingungen, -veränderungen und -stressfaktoren zu tolerieren bzw. sich daran anzupassen, ab. Seit Anbeginn der Landwirtschaft und des Gartenbaus besteht ein Bedarf, bei der Kultivierung von Pflanzen Pflanzenmerkmale zu verbessern. Durch Zuchtstrategien werden die Kulturpflanzeneigenschaften zum Widerstehen gegen biotische und abiotische Stressfaktoren, zur Verbesserung der Nährstoffnutzungseffizienz und zur Veränderung anderer den Pflanzen eigener kulturpflanzenspezifischer Ertragsparameter gefördert, d. h. die Erhöhung des Ertrags durch die Anwendung von technischen Fortschritten. Pflanzen sind sesshafte Organismen und müssen infolgedessen dazu fähig sein, mit verschiedenen Umweltstressfaktoren zu leben. Biotische Stressfaktoren wie Pflanzenschädlinge und Pathogene einerseits und abiotische Umweltstressfaktoren andererseits sind bedeutende limitierende Faktoren des Wachstums und der Produktivität von Pflanzen (Boyer, Plant Productivity and Environment, Science 218, 443–448 (1982); Bohnert et al., Adaptations to Environmental Stresses, Plant Cell 7 (7), 1099–1111 (1995)), die so der Kultivierung und der geographischen Verteilung von Pflanzen Grenzen setzen. Den verschiedenen Stressfaktoren ausgesetzte Pflanzen haben typischerweise geringe Erträge an Pflanzenmaterial wie Samen, Früchten oder anderen Produkten. Durch abiotische und biotische Stressfaktoren bewirkte Verluste an Kulturpflanzen und Kulturpflanzenertragsverluste stellen einen wichtigen ökonomischen und politischen Faktor dar und tragen insbesondere in vielen unterentwickelten Ländern zu Nahrungsmittelknappheit bei.
Bei den heutzutage herkömmlichen Verfahren zum Herbeiführen von Verbesserungen bei Kulturpflanzen und Gartenpflanzen wendet man selektive Zuchtverfahren an, um Pflanzen mit wünschenswerten Charakteristika zu identifizieren. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es inzwischen möglich, das Erbgut von Pflanzen auf eine spezifische Weise zu modifizieren. Die Modifikation eines einzelnen Gens zum Beispiel führte in mehreren Fällen zu einer signifikanten Steigerung z. B. der Stresstoleranz (Wang et al., 2003) sowie anderer Ertragsmerkmale. Es besteht ein Bedarf, Gene zu identifizieren, die Resistenz gegen verschiedene Kombinationen von Stressfaktoren verleihen oder die unter suboptimalen Wachstumsbedingungen einen verbesserten Ertrag verleihen. Es besteht immer noch ein Bedarf daran, Gene zu identifizieren, die dazu in der Lage sind, insgesamt den Ertrag von Pflanzen zu verbessern.
Weiterhin hat das Ansteigen der Bevölkerung und der Klimawechsel in den jüngsten Jahren die Möglichkeit einer weltweiten Nahrungsmittel-, Futter- und Treibstoffknappheit deutlich vor Augen geführt. 70% des vom Menschen verwendeten Wassers wird von der Landwirtschaft verbraucht, und dies zu einem Zeitpunkt, wo die Niederschlagsmenge in vielen Teilen der Welt rückgängig ist. Weiterhin sind, da sich die Landnutzung von bäuerlichen Betrieben auf Städte und Vorstädte verschiebt, weniger Hektar landwirtschaftliche Nutzfläche verfügbar, um landwirtschaftliche Kulturen anzubauen. Die Agrarbiotechnologie hat versucht, dem steigenden Bedarf der Menschheit durch genetische Modifikationen von Pflanzen gerecht zu werden, die zum Beispiel durch Vermitteln einer besseren Toleranz gegenüber abiotischen Stressreaktionen oder durch Erhöhen der Biomasse den Kulturpflanzenertrag steigern könnten.
Die Agrarbiotechnologen haben bei ihren Versuchen, transgene Pflanzen zu entwickeln, die einen erhöhten Ertrag aufweisen, und zwar entweder durch erhöhte abiotische Stresstoleranz oder durch erhöhte Biomasse, Assays in Modellpflanzensystemen, Gewächshausstudien an Kulturpflanzen und Feldversuche eingesetzt.
Die Agrarbiotechnologen bedienen sich auch Messungen von anderen Parametern, die den möglichen Einfluss eines Transgens auf den Kulturpflanzenertrag angeben. Für Futterkulturen wie Luzerne, Silomais und Heu korreliert die pflanzliche Biomasse mit dem Gesamtertrag. Bei Kornfrüchten jedoch hat man zum Abschätzen des Ertrags andere Parameter verwendet, wie die Pflanzengröße gemessen als Gesamtpflanzentrockengewicht, oberirdisches Trockengewicht, oberirdisches Frischgewicht, Blattfläche, Stengelvolumen, Pflanzenhöhe, Rosettendurchmesser, Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, Anzahl der Bestockungstriebe und Anzahl der Blätter. Die Pflanzengröße zu einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später während der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann typischerweise mehr Licht und Kohlendioxid als eine kleinere Pflanze absorbieren und wird daher wahrscheinlich während desselben Zeitraums gewichtsmäßig mehr zunehmen. Bei der Pflanzengröße und der Wachstumsrate besteht eine starke genetische Komponente, und die Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung wird für verschiedene Genotypen vermutlich mit der Größe unter einer anderen Umweltbedingung korrelieren. So verwendet man eine Standardumwelt, um die verschiedenen und dynamischen Umwelten, die von den Kulturpflanzen im Feld an unterschiedlichen Orten und zu unterschiedlichen Zeitpunkten angetroffen werden, nachzuahmen.
Obwohl einige Gene, die an der Stressreaktion, der Wassernutzung und/oder der Biomasse in Pflanzen beteiligt sind, charakterisiert wurden, war bis jetzt die Entwicklung von transgenen Kulturpflanzen mit einem verbesserten Ertrag nur begrenzt erfolgreich, und es sind keine solchen Pflanzen auf den Markt gebracht worden. Es besteht daher Bedarf, zusätzliche Gene zu identifizieren, die die Fähigkeit, den Ertrag von Kulturpflanzen zu erhöhen, aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze erhöhtem Ertrag bereit, welches mindestens den folgenden Schritt umfasst: Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten, im Folgenden als eine oder mehrere „Aktivitäten” oder als eine oder mehrere der „genannten Aktivitäten” oder für eine ausgewählte Aktivität als die „genannte Aktivität” bezeichnet, in einer Pflanze, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) in dem hier angegebenen subzellulären Kompartiment oder Gewebe.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung demgemäß eine transgene Pflanze bereit, die ein isoliertes Polynukleotid gemäß Tabelle I in dem darin angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe überexprimiert. Die erfindungsgemäße transgene Pflanze weist verglichen mit einer entsprechenden Wildtyppflanze einen verbesserten Ertrag oder erhöhten Ertrag auf. Die Begriffe „verbesserter Ertrag” oder „erhöhter Ertrag” können austauschbar verwendet werden.
Der Ausdruck ”Ertrag” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, allgemein auf ein messbares Produkt von einer Pflanze, insbesondere einer Kulturpflanze. Ertrag und Ertragszunahme (im Vergleich zu einer nicht transformierten Ausgangspflanze bzw. einer Wildtyppflanze) lässt sich auf eine Reihe von Wegen messen, und es versteht sich, dass es einem Fachmann möglich ist, angesichts der jeweiligen Ausführungsformen, der jeweils betroffenen Kulturpflanze und dem speziellen betreffenden Zweck bzw. der betreffenden Anwendung die korrekte Bedeutung zu bestimmen.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „verbesserter Ertrag” oder der Begriff „erhöhter Ertrag” jegliche Ertragsverbesserung von jeglichem vermessenen Pflanzenprodukt wie Korn, Frucht oder Faser. Erfindungsgemäß können Veränderungen bei unterschiedlichen phänotypischen Merkmalen den Ertrag verbessern. So sind zum Beispiel, jedoch ohne Einschränkung, Parameter wie Blütenorganentwicklung, Wurzelinitiation, Wurzelbiomasse, Anzahl der Samen, Samengewicht, Harvest Index, Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, Blattbildung, phototropismus, Apikaldominanz und Fruchtentwicklung geeignete Maße für einen verbesserten Ertrag. Jegliche Ertragserhöhung ist erfindungsgemäß ein verbesserter Ertrag. So kann zum Beispiel die Ertragsverbesserung einen Anstieg von 0,1%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder mehr bei jeglichem gemessenem Parameter umfassen. Zum Beispiel ist eine Erhöhung des Sojabohnen- oder Maisertrags in Bushel/Acre, der von einer Kultur abstammt, welche Pflanzen umfasst, die für die Nukleotide und Polypeptide von Tabelle I transgen sind, im Vergleich zu dem Ertrag in Bushel/Acre von unbehandelten Sojabohnen oder unbehandeltem Mais, die/der unter denselben Bedingungen herangezogen wurde(n), erfindungsgemäß ein verbesserter Ertrag. Der erhöhte oder verbesserte Ertrag kann in Gegenwart oder Abwesenheit von Stressbedingungen erzielt werden.
Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung bezieht sich gesteigerter oder erhöhter „Ertrag” auf einen oder mehrere Ertragsparameter, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biomasseertrag, Ertrag an Trockenbiomasse, Ertrag an oberirdischer Trockenbiomasse, Ertrag an unterirdischer Trockenbiomasse, Ertrag an Frischgewichtbiomasse, Ertrag an oberirdischer Frischgewichtbiomasse, Ertrag an unterirdischer Frischgewichtbiomasse, gesteigertem Ertrag an Erntegut, entweder Trockengewicht oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides, gesteigertem Ertrag an Kulturpflanzenfrüchten, entweder Trockengewicht oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides, und vorzugsweise gesteigertem Ertrag an Samen, entweder Trockengewicht oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides. So stellt die vorliegende Erfindung zum Beispiel Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen oder Pflanzen bereit, die ein erhöhtes Ertragsmerkmal zeigen können, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress und/oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder eine erhöhte intrinsische Biomasseproduktion verglichen mit einer entsprechenden (z. B. nicht transformierten) Wildtyppflanze oder Ausgangspflanze, bei dem man eine oder mehrere der oben erwähnten Aktivitäten erhöht oder erzeugt.
Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich eine Erhöhung des Ertrags auf einen erhöhten oder verbesserten Kulturpflanzenertrag oder Erntegutertrag.
Der Kulturpflanzenertrag wird im vorliegenden Zusammenhang als diejenige Anzahl Bushel des entsprechenden Agrarprodukts (wie Korn, Futter oder Samen), die pro Acre geerntet wird, definiert. Der Kulturpflanzenertrag wird von abiotischen Stressfaktoren wie Trocken-, Hitze-, Salinitäts- und Kältestress und von der Größe (Biomasse) der Pflanze beeinflusst. Traditionelle Pflanzenzüchtungsstrategien sind relativ langsam und sind bei der Vermittlung einer erhöhten Toleranz gegenüber abiotischen Stressfaktoren im Allgemeinen nicht erfolgreich gewesen. Beim Mais haben die durch die traditionelle Züchtung erzielten Kornertragsverbesserungen beinahe ein Plateau erreicht.
Dementsprechend kann der Ertrag einer Pflanze jeweils von der betreffenden Pflanze/Kulturpflanze von Interesse sowie deren jeweils vorgesehener Verwendung (wie Nahrungsmittelproduktion, Futterproduktion, der Produktion von verarbeiteten Nahrungsmitteln, der Produktion von Biotreibstoff, Biogas oder Alkohol oder dergleichen) von Interesse abhängen. Gemäß einer Ausführungsform wird Ertrag als Harvest Index (ausgedrückt als Verhältnis des Gewichts der entsprechenden erntbaren Teile dividiert durch die Gesamtbiomasse), das Gewicht der erntbaren Teile pro Fläche (Hektar, Quadratmeter oder dergleichen); und dergleichen berechnet. Der Harvest Index, d. h. das Verhältnis des Biomasseertrags zu der gesamten kumulativen Biomasse zum Erntezeitpunkt, ist beim Mais während der selektiven Züchtung auf Kornertrag über die letzten hundert Jahre im Wesentlichen unverändert geblieben. Dementsprechend sind die jüngsten Ertragsverbesserungen, die beim Mais erzielt wurden, das Ergebnis einer erhöhten Gesamtbiomasseproduktion pro Kulturflächeneinheit. Diese erhöhte Gesamtbiomasse wurde durch eine erhöhte Saatstärke erzielt, die zu adaptiven phänotypischen Veränderungen, wie Reduktion des Blattwinkels, was die Beschattung der unteren Blätter reduzieren kann, und Farnengröße, was den Harvest Index erhöhen kann, geführt hat. Der Harvest Index ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil und ermöglicht so eine gute Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag. Pflanzengröße und Kornertrag sind intrinsisch miteinander verbunden, da der Großteil der Kornbiomasse von der stattfindenden oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität der Blätter und des Stengels der Pflanze abhängt. Wie bei der abiotischen Stresstoleranz sind Messungen der Pflanzengröße während der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken für die Messung der potentiellen Ertragsvorteile, die durch die Gegenwart eines Transgens vermittelt werden.
Beispielsweise bezieht sich der Ertrag auf den Biomasseertrag, z. B. auf den Trockengewicht-Biomasseertrag und/oder Frischgewicht-Biomasseertrag. Biomasseertrag bezieht sich auf die oberirdischen oder unterirdischen Teile einer Pflanze, je nach den speziellen Umständen (Testbedingungen, spezielle Pflanze von Interesse, Anwendung von Interesse und dergleichen). Gemäß einer Ausführungsform bezieht sich der Biomasseertrag auf die oberirdischen und unterirdischen Teile. Der Biomasseertrag kann als Frischgewicht, als Trockengewicht oder auf einer feuchtigkeitsangepassten Basis berechnet werden. Der Biomasseertrag kann auf einer Pro-Pflanze-Basis oder bezogen auf eine spezielle Fläche (z. B. Biomasseertrag pro Acre/Hektar/Quadratmeter oder dergleichen) berechnet werden.
Bei anderen Ausführungsformen bezieht sich ”Ertrag” auf den Samenertrag, der sich anhand eines oder mehrerer der folgenden Parameter bestimmen lässt: Anzahl an Samen oder Anzahl. an gefüllten Samen (pro Pflanze oder pro Fläche (Acre/Hektar/Quadratmeter oder dergleichen)); Samenfüllrate (Verhältnis zwischen der Anzahl an gefüllten Samen und der Gesamtanzahl an Samen); Anzahl Blüten pro Pflanze; Samenbiomasse oder Gesamtsamengewicht (pro Pflanze oder pro Fläche (Acre/Hektar/Quadratmeter oder dergleichen)); Tausendkorngewicht (TKG; extrapoliert aus der Anzahl gezählter gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht; eine Erhöhung des TKG kann auf eine erhöhte Samengröße, ein erhöhtes Samengewicht, eine erhöhte Embryogröße und/oder einen erhöhten Endosperm zurückzuführen sein). Auch andere Parameter, die eine Messung des Samenertrags erlauben, sind im Stand der Technik bekannt. Der Samenertrag lässt sich auf Trockengewichtsbasis oder auf Frischgewichtsbasis oder typischerweise auf einer feuchtigkeitsangepassten Basis, z. B. bei einer Feuchtigkeit von 15,5 Prozent, bestimmen.
In einer Ausführungsform bedeutet der Begriff „erhöhter Ertrag”, dass der photosynthetische aktive Organismus, insbesondere eine Pflanze, verglichen mit dem entsprechenden photosynthetischen aktiven Wildtyporganismus unter abiotischen Umweltstressbedingungen eine erhöhte Wachstumsrate aufweist.
Eine erhöhte Wachstumsrate ergibt sich unter anderem durch bzw. vermittelt eine erhöhte Biomasseproduktion der gesamten Pflanze oder eine erhöhte Biomasseproduktion der oberirdischen Teile einer Pflanze oder durch eine erhöhte Biomasseproduktion der unterirdischen Teile einer Pflanze oder durch eine erhöhte Biomasseproduktion von Teilen einer Pflanze wie Stengel, Blätter, Blüten, Früchte und/oder Samen.
In einer Ausführungsform davon beinhaltet erhöhter Ertrag höhere Fruchterträge, höhere Samenerträge, höhere Frischgewichtproduktion und/oder höhere Trockengewichtproduktion.
In einer weiteren Ausführungsform davon bedeutet der Begriff „erhöhter Ertrag”, dass der photosynthetische aktive Organismus, vorzugsweise die Pflanze, verglichen mit dem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetischen aktiven Wildtyporganismus unter abiotischen Umweltstressbedingungen ein verlängertes Wachstum aufweist. Ein verlängertes Wachstum umfasst das Überleben und/oder Weiterwachsen des photosynthetisch aktiven Organismus, vorzugsweise der Pflanze, zu dem Zeitpunkt, wenn der nicht transformierte, photosynthetisch aktive Wildtyporganismus optische Anzeichen von Defizienz und/oder Absterben zeigt.
So handelt es sich zum Beispiel in einer Ausführungsform bei der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Pflanze um eine Maispflanze. Erhöhter Ertrag für Maispflanzen bedeutet in einer Ausführungsform erhöhten Samenertrag, insbesondere bei Maissorten, die für Futter oder Nahrungsmittelzwecke verwendet werden. In einer Ausführungsform bezieht sich erhöhter Samenertrag des Maises auf eine erhöhte Korngröße bzw. ein erhöhtes Korngewicht, eine erhöhte Anzahl Körner pro Kolben oder eine erhöhte Anzahl Kolben pro Pflanze. Weiterhin ist in einer Ausführungsform die Kolbenausbeute erhöht, und dies ist insbesondere bei Maispflanzensorten, die für Futterzwecke verwendet werden, nützlich. Weiterhin ist zum Beispiel die Länge oder Größe des Kolbens erhöht. In einer Ausführungsform bezieht sich erhöhter Ertrag bei einer Maispflanze auf ein verbessertes Kolben-Korn-Verhältnis.
Bei einer Ausführungsform handelt es sich zum Beispiel bei der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Pflanze um eine Sojobohnenpflanze. Erhöhter Ertrag bei Sojabohnenpflanzen bedeutet in einer Ausführungsform erhöhten Samenertrag, insbesondere bei Sojabohnensorten, die für Nahrungsmittel- oder Futterzwecke verwendet werden. In einer Ausführungsform bedeutet erhöhter Samenertrag bei Sojabohnen eine erhöhte Samengröße bzw. ein erhöhtes Samengewicht, eine erhöhte Anzahl Samen pro Hülse oder eine erhöhte Anzahl Hülsen pro Pflanze.
Bei einer Ausführungsform handelt es sich zum Beispiel bei der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Pflanze um eine Rapspflanze. Erhöhter Ertrag bei Rapspflanzen bedeutet in einer Ausführungsform erhöhten Samenertrag, insbesondere bei Rapssorten, die für Nahrungsmittel- oder Futterzwecke verwendet werden. In einer Ausführungsform bedeutet erhöhter Samenertrag bei Raps eine erhöhte Samengröße bzw. ein erhöhtes Samengewicht, eine erhöhte Anzahl Samen pro Schote oder eine erhöhte Anzahl Schoten pro Pflanze.
Bei einer Ausführungsform handelt es sich zum Beispiel bei der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Pflanze um eine Baumwollpflanze. In einer Ausführungsform bedeutet erhöhter Ertrag bei Baumwollpflanzen erhöhten Faserertrag. In einer Ausführungsform bezieht sich erhöhter Baumwollertrag bei Baumwolle auf eine erhöhte Faserlänge.
In einer Ausführungsform bezieht sich erhöhter Samenertrag des Maises auf eine erhöhte Korngröße bzw. ein erhöhtes Korngewicht, eine erhöhte Anzahl Körner pro Kapsel oder eine erhöhte Anzahl Kapseln pro Pflanze.
Dieser erhöhte Ertrag gemäß der vorliegenden Erfindung lässt sich typischerweise erzielen, indem man, im Vergleich zu einer ursprünglichen Pflanze bzw. einer Wildtyppflanze, eines oder mehrere der Ertragsmerkmale einer Pflanze steigert oder verbessert. Zu diesen Ertragsmerkmalen einer Pflanze, deren Verbesserung zu einem erhöhten Ertrag führt, zählen, ohne dass dies als Einschränkung gelten soll, die Erhöhung des intrinsischen Ertragspotentials der Pflanze, eine verbesserte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder eine erhöhte Toleranz gegenüber Stress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Stress.
Dementsprechend wird gemäß vorliegender Erfindung der Ertrag dadurch erhöht, dass man ein oder mehrere wie im vorliegenden Text definierte Ertragsmerkmale verbessert.
Das intrinsische Ertragspotential kann sich zum Beispiel in einer Verbesserung des spezifischen (intrinsischen) Samenertrags (z. B. hinsichtlich einer erhöhten Samen-/Korngröße, einer erhöhten Ährenzahl, einer erhöhten Anzahl an Samen pro Ähre, einer Verbesserung- der Samenfüllung, einer Verbesserung der Samenzusammensetzung, Embryo- und/oder Endospermverbesserungen oder dergleichen); Modifikation und Verbesserung der inhärenten Wachstums- und Entwicklungsmechanismen einer Pflanze (wie Pflanzenhöhe, Pflanzenwachstumsrate, Anzahl an Schoten, Position der Schoten an der Pflanze, Anzahl an Internodien, Platzfestigkeit der Schoten, Effizienz der Knöllchenbildung und Stickstofffixierung, Effizienz der Kohlenstoffassimilation, Verbesserung der Keimlingsvitalität bzw. Jungpflanzenvitalität, verbesserte Keimungseffizienz (unter Stress- oder Nicht-Stress-Bedingungen), Verbesserung der Pflanzenarchitektur, Zellzyklusmodifikationen, Photosynthesemodifikationen, verschiedene Signalwegmodifikationen, Modifikation der Steuerung der Transkription, Modifikation der Steuerung der Translation, Modifikation von Enzymaktivitäten und dergleichen); und/oder dergleichen zeigen.
Die Verbesserung oder Erhöhung der Stresstoleranz einer Pflanze kann sich zum Beispiel in einer verbesserten oder erhöhten Toleranz einer Pflanze gegenüber Stress, insbesondere abiotischem Stress, zeigen. In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich abiotischer Stress im Allgemeinen auf abiotische Umweltbedingungen, denen eine Pflanze typischerweise ausgesetzt ist, einschließlich Bedingungen, die typischerweise als Bedingungen von ”abiotischem Stress” bezeichnet werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Dürre (Toleranz gegenüber Dürre lässt sich als Ergebnis einer verbesserten Wassernutzungseffizienz erzielen), Bedingungen von Hitze, niedrigen Temperaturen und Kälte (wie Frostbedingungen und kühlen Temperaturbedingungen), Salinität, osmotischer Stress, Schatten, hohe Pflanzendichte, mechanischer Stress, oxidativer Stress und dergleichen.
Die Erhöhung des Ertrags der Pflanze kann auch vermittelt werden, indem man die „Nährstoffnutzungseffizienz einer Pflanze” erhöht, z. B. indem man die Nutzungseffizienz von Nährstoffen einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Phosphor, Kalium und Stickstoff, verbessert. Es besteht zum Beispiel ein Bedarf an Pflanzen, die dazu fähig sind, Stickstoff effizienter zu nutzen, so dass für das Wachstum weniger Stickstoff benötigt wird, was somit zu einem verbesserten Ertragsniveau unter Stickstoffmangelbedingungen führt. Weiterhin lassen sich mit den gegenwärtigen bzw. standardgemäßen Niveaus an Stickstoffaufwand höhere Erträge erzielen. Dementsprechend wird der Pflanzenertrag erhöht, indem man die Stickstoffnutzungseffizienz (NUE) einer Pflanze oder eines Teils davon erhöht. Aufgrund der hohen Stickstoffdüngerkosten im Verhältnis zu den Einkommen aus Agrarprodukten und darüber hinaus seiner abträglichen Wirkung auf die Umwelt ist es wünschenswert, Strategien zu entwickeln, um den Stickstoffaufwand zu reduzieren und/oder die Stickstoffaufnahme und/oder die Verwertung des zur Verfügung stehenden Stickstoffs zu optimieren und gleichzeitig einen optimalen Ertrag, eine optimale Produktivität und eine optimale Qualität von Pflanzen, vorzugsweise kultivierten Pflanzen, z. B. Kulturpflanzen, zu bewahren. Ebenfalls wünschenswert ist es, den gleichen Kulturpflanzenertrag mit einem geringeren Düngemitteleinsatz und/oder einen höheren Ertrag auf Böden mit ähnlicher oder sogar schlechterer Qualität zu erzielen.
Eine gesteigerte Stickstoffnutzungseffizienz der Pflanze lässt sich gemäß der folgenden Methode bestimmen und quantifizieren: Transformierte Pflanzen werden in einer Wachstumskammer (Svalöf Weibull, Svalöv, Schweden) in Töpfen herangezogen. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so werden Samen davon in Töpfe ausgesät, die eine 1:1 (v:v) Mischung von nährstoffarmem Boden („Einheitserde Typ 0”, 30% Lehm, Tantau, Wansdorf Deutschland) und Sand enthalten. Die Keimung wird durch eine 4-tägige Dunkelperiode bei 4°C induziert. Anschließend werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen herangezogen. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, sind die Standardwachstumsbedingungen folgende: Photoperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit, 20°C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, und eine Photonenflussdichte von 200 μE. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so werden sie jeden zweiten Tag mit einer stickstoffarmen Nährstofflösung gegossen. Nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Nach einer Gesamtzeit von 29 bis 31 Tagen werden die Pflanzen geerntet und anhand des Frischgewichts der oberirdischen Teile der Pflanzen, vorzugsweise der Rosetten, bonitiert.
Demgemäß macht die Veränderung der genetischen Zusammensetzung einer Pflanze diese bei der derzeit verwendeten standardmäßigen Düngerausbringung produktiver bzw. behält die Pflanze ihre Produktionsraten mit einem signifikant verringerten Dünger-Betriebsmittel aufrecht. Eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz kann das Ergebnis einer erhöhten Aufnahme und Assimilation von Düngerstickstoff und/oder die anschließende Neumobilisierung und Neuverwertung von akkumulierten Stickstoffreserven sein. Pflanzen, die Gene für die Verbesserung der Stickstoffnutzungseffizienz enthalten, können daher für die Ertragserhöhung verwendet werden. Die Verbesserung der Stickstoffnutzungseffizienz in Mais würde den erntbaren Kornertrag pro Einheit Betriebsmittel-Stickstoffdünger erhöhen, und zwar sowohl in Entwicklungsländern, wo begrenzt Stickstoffdünger verfügbar ist, als auch in entwickelten Ländern, wo das Ausmaß der Stickstoffverwendung hoch bleibt. Eine Verbesserung der Stickstoffverwertung gestattet auch, die Betriebsmittelkosten am Hof zu verringern, die Verwendung und Abhängigkeit von für die Stickstoffdüngerproduktion erforderlichen nicht erneuerbaren Energiequellen zu verringern und den Einfluss der Stickstoffdüngerherstellung und -verwendung in der Landwirtschaft auf die Umwelt zu verringern.
In einer Ausführungsform wird die Stickstoffnutzungseffizienz gemäß dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren bestimmt. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Messen des Stickstoffgehalts im Boden, und
(b) Bestimmen, ob der Stickstoffgehalt im Boden für das Wachstum einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze, z. B. einer Kulturpflanze, optimal oder suboptimal ist, und
(c1) wenn der Stickstoffgehalt für das Wachstum der ursprünglichen Pflanze oder der Wildtyppflanze suboptimal ist, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in diesem Boden, oder
(c2) wenn der Stickstoffgehalt für die ursprüngliche Pflanze oder die Wildtyppflanze optimal ist, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in dem Boden und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag eines Standards, einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze, Selektieren und Heranziehen der Pflanze, die den höchsten Ertrag aufweist.

Wird der Pflanzenertrag erhöht, indem man die Stresstoleranz(en) der Pflanze erhöht. Im Allgemeinen kann der Ausdruck „erhöhte Toleranz gegenüber Stress” als das Überleben von Pflanzen und/oder eine höhere Ertragsproduktion unter Stressbedingungen, verglichen mit einer nicht transformierten Pflanze vom Wildtyp bzw. Ausgangspflanze, definiert werden: So ist zum Beispiel die erfindungsgemäße Pflanze oder die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Pflanze besser an Stressbedingungen angepasst. „Verbesserte Adaptation” an Umweltstressfaktoren wie zum Beispiel Dürre, Hitze, Nährstoffarmut, Temperaturen unter dem Nullpunkt und/oder kühle Temperaturen bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf eine verbesserte pflanzliche Leistung, die zu einem erhöhten Ertrag führt, insbesondere in Bezug auf ein oder mehrere der wie oben genauer definierten Ertragsmerkmale.
Während ihres Lebenszyklus ist eine Pflanze im Allgemeinen verschiedenen Umweltbedingungen ausgesetzt. Hier werden alle solchen Bedingungen, die unter gewissen Umständen einen Einfluss auf den Pflanzenertrag haben, als „Stress”bedingung bezeichnet. Umweltstressfaktoren können allgemein in biotische und abiotische (Umwelt-)Stressfaktoren unterteilt werden. Ungünstige Nährstoffbedingungen werden manchmal auch als „Umweltstress” bezeichnet. Die vorliegende Erfindung zieht auch Lösungen für diese Art von Umweltstress in Betracht, die sich zum Beispiel auf eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz beziehen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Pflanzenertrag beispielsweise dadurch erhöht, dass man die Toleranz(en) einer Pflanze gegenüber abiotischem Stress erhöht.
Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke „gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Stress”, „gesteigerte Resistenz gegen abiotischen Umweltstress”, „gesteigerte Toleranz gegenüber Umweltstress”, „verbesserte Anpassung an Umweltstress” und andere Variationen davon sowie Ausdrücke mit einer ähnlichen Bedeutung austauschbar verwendet und beziehen sich ohne Einschränkung auf eine Verbesserung der Toleranz gegenüber einem oder mehreren der wie hier beschriebenen abiotischen Umweltstressfaktoren, verglichen mit einer entsprechenden ursprünglichen Pflanze bzw. Wildtyppflanze oder einem Teil davon.
Der Ausdruck Toleranz(en) gegenüber abiotischem Stress bezieht sich zum Beispiel auf Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen, Toleranz gegenüber Dürre bzw. verbesserte Wassernutzungseffizienz, Toleranz gegenüber Hitze, Toleranz gegenüber Salzstress und andere. Um die Toleranz oder Resistenz einer Pflanze gegenüber abiotischen Stressfaktoren zu bestimmen, bedient man sich auch Untersuchungen der Reaktion einer Pflanze auf Austrocknen, osmotischen Schock und Temperaturextreme.
Stresstoleranz in Pflanzen wie Toleranz gegenüber Stress durch niedrige Temperaturen, Dürre, Hitze und Salz können ein gemeinsames, für das Pflanzenwachstum wichtiges Element, nämlich die Verfügbarkeit von Wasser, haben. Pflanzen sind während ihres Lebenszyklus typischerweise Bedingungen von verringertem Wassergehalt in der Umwelt ausgesetzt. Die Schutzstrategien sind ähnlich denen für die Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen.
Dementsprechend bezieht sich dieses Ertragsmerkmal in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der erfindungsgemäßen Pflanze und/oder eine erhöhte Toleranz der erfindungsgemäßen Pflanze gegenüber Dürrebedingungen. Bei der Wassernutzungseffizienz handelt es sich um einen Parameter, der häufig mit Dürretoleranz korreliert ist. Eine Erhöhung der Biomasse bei schlechter Wasserverfügbarkeit kann auf einer relativ verbesserten Wachstumseffizienz oder einem reduzierten Wasserverbrauch beruhen. Beim Selektieren von Merkmalen für die Verbesserung von Kulturpflanzen würde eine Erniedrigung der Wassernutzung ohne Veränderung des Wachstums insbesondere in einem bewässerten Agrarsystem, wo die Wasseraufwandkosten hoch sind, von Bedeutung sein. Eine Erhöhung des Wachstums ohne entsprechendes sprungartiges Ansteigen der Wassernutzung wäre bei allen Agrarsystemen anwendbar. In vielen Agrarsystemen, wo die Wasserzufuhr nicht limitierend ist, erhöht ein erhöhtes Wachstum den Ertrag auch dann, wenn dabei mit einer Erhöhung der Wassernutzung zu rechnen sein muss.
Wenn der Boden wasserarm ist, bzw. wenn Wasser während Dürreperioden nicht verfügbar ist, sind die Kulturpflanzenerträge beschränkt. Ein Wasserdefizit bei Pflanzen entsteht dann, wenn die Transpiration der Blätter das Wasserangebot von den Wurzeln übersteigt. Das verfügbare Wasserangebot steht mit der in dem Boden gehaltenen Wassermenge sowie der Fähigkeit der Pflanze, dieses Wasser mit ihrem Wurzelsystem zu erreichen, in Zusammenhang. Die Transpiration von Wasser von den Blättern steht mit der Fixierung von Kohlendioxid durch die Photosynthese durch die Stomata in Zusammenhang. Die beiden Vorgänge sind positiv miteinander korreliert, so dass ein hoher Kohlendioxidinflux durch die Photosynthese eng mit dem transpirationsbedingten Wasserverlust in Zusammenhang steht. Entweicht Wasser transpirationsbedingt aus dem Blatt, so wird das Blattwasserpotential reduziert, und die Stomata neigen dazu, sich hydraulisch zu schließen, wodurch die Photosyntheserate limitiert wird. Da der Kulturpflanzenertrag von der Fixierung von Kohlendioxid während der Photosynthese abhängig ist, stellen die Wasseraufnahme und Transpiration Faktoren dar, die zum Kulturpflanzenertrag beitragen. Pflanzen, die fähig sind, zum Fixieren derselben Kohlendioxidmenge weniger Wasser zu verbrauchen, oder die fähig sind, bei einem niedrigeren Wasserpotential normal zu funktionieren, weisen das Potential auf, mehr Photosynthese zu machen und dadurch in vielen Agrarsystemen mehr Biomasse und ökonomischen Ertrag zu produzieren.
Der Ausdruck Dürrestress bezieht sich auf einen Umweltstress, der einen Wassermangel in Pflanzen oder eine verminderte Wasserversorgung von Pflanzen zur Folge hat, einschließlich einem sekundären Stress durch niedrige Temperaturen und/oder Salz und/oder einem primären Stress während einer Dürre oder Hitzewelle, z. B. Austrocknung usw.
Eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürrebedingungen lässt sich zum Beispiel nach der folgenden Methode bestimmen und quantifizieren: Transformierte Pflanzen werden einzeln in Töpfen in einer Wachstumskammer (York Industriekälte GmbH, Mannheim, Deutschland) kultiviert. Die Keimung wird induziert. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden die ausgesäten Samen 3 Tage lang bei 4°C im Dunkeln gehalten, um die Keimung zu induzieren. Anschließend werden die Bedingungen 3 Tage lang zu 20°C/6°C Tages-/Nacht-Temperatur mit einem 16/8 h-Tag-Nacht-Zyklus bei 150 μE/m²s geändert. Anschließend werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen herangezogen. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, sind die Standardwachstumsbedingungen folgende: Photoperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit, 20°C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, und eine Photonenflussdichte von 200 μE. Die Pflanzen werden wachsen gelassen und kultiviert, bis sie Blätter entwickeln. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden sie täglich bewässert, bis sie ungefähr 3 Wochen alt waren.
Beginnend zu dieser Zeit wurde eine Dürre durch Wasserentzug herbeigeführt. Nachdem die nicht transformierten Wildtyppflanzen sichtbare Symptome einer Schädigung aufzeigen, beginnt die Auswertung, und die Pflanzen werden hinsichtlich Symptomen von Dürresymptomen und hinsichtlich des Biomasseproduktion-Vergleichs mit Wildtyp- und Nachbarpflanzen 5–6 Tage lang nacheinander bonitiert. In einer Ausführungsform wird die Toleranz gegenüber Dürre, z. B. Toleranz gegenüber zyklischer Dürre, nach der in den Beispielen beschriebenen Methode bestimmt.
Bei einer Ausführungsform handelt es sich bei der Toleranz gegenüber Dürre um eine Toleranz gegenüber zyklischer Dürre.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bestimmen, ob die Wasserversorgung in der Pflanzfläche für das Wachstum einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze, zum Beispiel einer Kulturpflanze, optimal oder suboptimal ist und/oder Bestimmen der visuellen Symptome von Verletzungen von Pflanzen, die in der Pflanzfläche wachsen, und (b1) wenn die Wasserversorgung suboptimal für das Wachstum einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze ist oder visuelle Symptome von Dürre bei einer Standardpflanze, einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze, die in der Pflanzfläche wachsen, festgestellt werden können, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in diesem Boden, oder (b2) wenn die Wasserversorgung optimal für die ursprüngliche Pflanze bzw. die Wildtyppflanze ist, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in dem Boden und Vergleich des Ertrags mit dem Ertrag einer Standardpflanze, einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze und Auswahl und Heranziehen der Pflanze, die den höchsten Ertrag zeigt.

Zu den sichtbaren Schädigungssymptomen gehören eines oder eine beliebige Kombination von zwei, drei oder mehreren der folgenden Merkmale: Welken; Braunfärbung der Blätter; Abnahme des Turgordrucks, was ein Herunterhängen von Blättern bzw. Nadelstängeln und Blüten zur Folge hat; Herunterhängen und/oder Abwerfen von Blättern oder Nadeln; die Blätter sind grün, aber im Vergleich zu den Kontrollen leicht zum Boden hin abgewinkelt; die Blattkanten haben begonnen, sich nach innen zu falten (einzudrehen); vorzeitiges Abwerfen von Blättern oder Nadeln; Verlust von Chlorophyll in den Blättern oder Nadeln und/oder Vergilbung.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei diesem Ertragsmerkmal der erfindungsgemäßen Pflanze um eine erhöhte Toleranz dieser Pflanze gegenüber Bedingungen von Hitze.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei diesem Ertragsmerkmal der erfindungsgemäßen Pflanze um eine erhöhte Toleranz dieser Pflanze gegenüber niedrigen Temperaturen, wozu z. B. Frosttoleranz und eine Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen zählt. Niedrige Temperaturen beeinträchtigen eine Vielzahl von biologischen Vorgängen. Sie verzögern oder inhibieren nahezu alle metabolischen und zellulären Vorgänge. Die Reaktion von Pflanzen auf niedrige Temperaturen ist eine wichtige Determinante ihres ökologischen Bereichs. Das Problem, die niedrigen Temperaturen ertragen zu müssen, wird dadurch verschlimmert, dass es erforderlich ist, die Wachstumsperiode über den in hohen Breitengraden oder großen Höhen anzutreffenden kurzen Sommer hinaus zu verlängern. Die meisten Pflanzen haben Anpassungsstrategien entwickelt, um sich gegen niedrige Temperaturen zu schützen. Im Allgemeinen kann man die Anpassung an niedrige Temperaturen in eine Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen und eine Frosttoleranz unterteilen.
Eine Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen findet man in der Natur in Arten aus gemäßigten oder borealen Zonen, und sie ermöglicht das Überleben und ein verbessertes Wachstum bei niedrigen Temperaturen, jedoch Nicht-Frost-Temperaturen. Arten aus tropischen oder subtropischen Zonen sind empfindlich gegenüber kühlen Temperaturen und zeigen häufig Welken, Chlorose oder Nekrose, ein verlangsamtes Wachstum und sogar Absterben bei Temperaturen um etwa 10°C während eines oder mehrerer Entwicklungsstadien. Dementsprechend bezieht sich eine verbesserte oder gesteigerte „Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen”, oder Abwandlungen hiervon, auf eine verbesserte Adaptierung an niedrige, jedoch Nicht-Frost-Temperaturen um 10°C, vorzugsweise Temperaturen zwischen 1 bis 18°C, weiter bevorzugt 4–14°C, und am stärksten bevorzugt 8 bis 12°C, was hierin nachstehend als eine „kühle Temperatur” bezeichnet wird.
Eine Frosttoleranz ermöglicht ein Überleben bei Temperaturen von um null Grad bis insbesondere Temperaturen von unter null Grad. Man nimmt an, dass dies durch ein Verfahren gefördert wird, das als Kälteakklimatisierung bezeichnet wird und das bei niedrigen Temperaturen, jedoch Nicht-Frost-Temperaturen, stattfindet und für eine erhöhte Frosttoleranz bei Temperaturen von unter null Grad sorgt. Darüber hinaus haben die meisten Arten aus gemäßigten Regionen Lebenszyklen, die an die saisonalen Temperaturveränderungen angepasst sind. Bei diesen Pflanzen können niedrige Temperaturen über den Prozess der Stratifizierung und Vernalisierung auch eine wichtige Rolle bei der Pflanzenentwicklung spielen. Es wird offensichtlich, dass eine klare Unterscheidung zwischen bzw. Definition von Toleranz gegenüber kühlen Temperaturen und Frosttoleranz schwierig ist, und dass die Prozesse überlappend oder miteinander verbunden sein können. Eine verbesserte oder gesteigerte ”Frosttoleranz”, oder Abwandlungen hiervon, bezieht sich hier auf eine verbesserte Adaptierung an Temperaturen nahe oder unter null, nämlich vorzugsweise Temperaturen unterhalb von 4°C, weiter bevorzugt unter 3 oder 2°C, und besonders bevorzugt bei oder unter 0 (null) °C oder unterhalb von –4°C, oder sogar extrem niedrige Temperaturen bis hinab zu –10°C oder tiefer, was hierin als „Frosttemperatur” bezeichnet wird.
Demgemäß kann die erfindungsgemäße Pflanze in einer Ausführungsform nach dem Ausgesetztsein an niedrige Temperaturen verglichen mit einer Wildtyppflanze oder ursprünglichen Pflanze, die gegenüber kühlen Temperaturen empfindlich ist, frühes Keimpflanzenwachstum zeigen, wodurch in einer weiteren Ausführungsform die Samenkeimungsraten verbessert werden. Der Vorgang der Samenkeimung hängt stark von der Umwelttemperatur ab, und die Eigenschaften der Samen bestimmen das Ausmaß an Aktivität und Leistungsfähigkeit während der Keimung und dem Auflaufen der Keimpflanzen, wenn sie niedrigen Temperaturen ausgesetzt sind. In einer Ausführungsform stellt das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin eine Pflanze bereit, die unter kühlen Temperaturbedingungen eine reduzierte Verzögerung der Blattentwicklung aufweist.
Eine gesteigerte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen lässt sich zum Beispiel nach der folgenden Methode bestimmen: Transformierte Pflanzen werden in Blumentöpfen in einer Wachstumskammer (z. B. York, Mannheim, Deutschland) herangezogen. Handelt es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana, so werden die Samen davon in Töpfe eingesät, die eine 3,5:1 (v:v) Mischung an nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand enthalten. Die Pflanzen werden unter Standardwachstumsbedingungen wachsen gelassen. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, sind die Standardwachstumsbedingungen folgende: Photoperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit, 20°C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, und eine Photonenflussdichte von 200 μmol/m²s. Die Pflanzen werden herangezüchtet und kultiviert. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden sie jeden zweiten Tag bewässert. Nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Kälte (z. B. Abkühlen bei 11–12°C) wird 14 Tage nach der Aussaat bis zum Ende des Experiments angewandt. Nach einer Gesamtwachstumsperiode von 29 bis 31 Tagen werden die Pflanzen geerntet und anhand des Frischgewichts der oberirdischen Teile der Pflanzen, im Fall von Arabidopsis vorzugsweise der Rosetten, bonitiert.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bestimmen, ob die Temperatur in der Pflanzfläche für das Wachstum einer ursprünglichen Pflanze oder einer Wildtyppflanze, zum Beispiel einer Kulturpflanze, optimal oder suboptimal ist und (b1) wenn die Temperatur suboptimal niedrig für das Wachstum einer auf dieser Fläche wachsenden ursprünglichen Pflanze oder Wildtyppflanze ist, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in diesem Boden oder (b2) wenn die Temperatur optimal für die ursprüngliche Pflanze bzw. die Wildtyppflanze ist, Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze in dem Boden und Vergleich des Ertrags mit dem Ertrag einer Standardpflanze, einer ursprünglichen Pflanze oder einer Pflanze vom Wildtyp und Auswahl und Heranziehen der Pflanze, die den höchsten Ertrag zeigt.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann es sich bei diesem Ertragsmerkmal auch um eine erhöhte Salinitätstoleranz (Salztoleranz), eine Toleranz gegenüber osmotischem Stress, eine erhöhte Schattentoleranz, eine erhöhte Toleranz gegenüber einer hohen Pflanzendichte, eine erhöhte Toleranz gegenüber mechanischen Stressfaktoren, und/oder eine erhöhte Toleranz gegenüber oxidativem Stress handeln.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus, wie einer Pflanze, beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Trockenbiomasseertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten oberirdischen Trockenbiomasseertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten unterirdischen Trockenbiomasseertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer anderen Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Frischgewichtbiomasseertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten oberirdischen Frischgewichtbiomasseertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten unterirdischen Frischgewichtbiomasseertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer weiteren Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Ertrag an erntbaren Pflanzenteilen aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Ertrag an trockenen erntbaren Pflanzenteilen aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Ertrag an trockenen oberirdischen erntbaren Pflanzenteilen aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Ertrag an unterirdischen trockenen erntbaren Pflanzenteilen aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress in einer anderen Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Frischgewichtertrag an erntbaren Pflanzenteilen aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Frischgewichtertrag an oberirdischen erntbaren Pflanzenteilen aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Frischgewichtertrag an unterirdischen erntbaren Pflanzenteilen aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer weiteren Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Kulturpflanzenfruchtertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Frischkulturpflanzenfruchtertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Trockenkulturpflanzenfruchtertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen ein gesteigertes Korntrockengewicht aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer weiteren Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Samenertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Frischgewichtsamenertrag aufweist.
Bei einem photosynthetisch aktiven Organismus bedeutet der Begriff „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einer Ausführungsform davon, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise eine Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus beim Antreffen von abiotischen Umweltstressbedingungen einen gesteigerten Trockensamenertrag aufweist.
Bei den abiotischen Umweltstressbedingungen, denen der Organismus ausgesetzt ist, kann es sich jedoch z. B. um einen beliebigen der im vorliegenden Text erwähnten abiotischen Umweltstressfaktoren handeln. Vorzugsweise handelt es sich bei dem photosynthetisch aktiven Organismus um eine Pflanze, z. B. eine hier beschriebene Pflanze. Bei einer gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten Pflanze kann es sich um eine Kulturpflanze, z. B. Mais, Sojabohne, Reis, Baumwolle oder Raps (z. B. Canola) handeln.
In einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz des erzeugten Maises auf einen verbesserten oder erhöhten Proteingehalt des Maissamens, insbesondere in Maissamen, der als Futtermittel verwendet wird. In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz auf eine erhöhte Korngröße oder eine höhere Kornzahl pro Pflanze. In einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Wassernutzungseffizienz des erzeugten Maises auf eine erhöhte Korngröße oder -zahl, verglichen mit einer Wildtyppflanze. Weiterhin bezieht sich in einer Ausführungsform eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen auf Jungpflanzenwüchsigkeit und gestattet das frühe Auspflanzen und Säen einer gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Maispflanze.
In einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz der erzeugten Sojabohnenpflanze auf einen verbesserten oder erhöhten Proteingehalt des Sojabohnensamens, insbesondere in Sojabohnensamen, der als Futtermittel verwendet wird. In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl. In einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der erzeugten Sojabohnenpflanze auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl. Weiterhin bezieht sich in einer Ausführungsform eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen auf Jungpflanzenwüchsigkeit und gestattet das frühe Auspflanzen und Säen einer gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Sojabohnenpflanze.
In einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz der erzeugten Rapspflanze auf einen verbesserten oder erhöhten Proteingehalt des Rapssamens, insbesondere in Rapssamen, der als Futtermittel verwendet wird. In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl pro Pflanze. In einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der erzeugten Rapspflanze auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl pro Pflanze. Weiterhin bezieht sich in einer Ausführungsform eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen auf Jungpflanzenwüchsigkeit und gestattet das frühe Auspflanzen und Säen einer gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Rapspflanze. In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von winterfestem Raps (winterhartem Raps), bei dem man eine winterfeste Rapspflanze in dem obenerwähnten erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.
In einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz der erzeugten Baumwollpflanze auf einen verbesserten Proteingehalt des Baumwollsamens, insbesondere in Baumwollsamen, der als Futtermittel verwendet wird. In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl. In einer Ausführungsform bezieht sich eine erhöhte Wassernutzungseffizienz der erzeugten Baumwollpflanze auf eine erhöhte Samengröße oder -zahl. Weiterhin bezieht sich in einer Ausführungsform eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen auf Jungpflanzenwüchsigkeit und gestattet das frühe Auspflanzen und Säen einer gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Baumwollpflanze.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, die ein verbessertes Ertragsmerkmal verglichen mit der entsprechenden Ausgangs- oder Wildtyppflanze aufweist, und zwar dadurch, dass man eine oder mehrere Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) in dem hier angegebenen subzellulären Kompartiment und/oder Gewebe dieser Pflanze erhöht oder erzeugt.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz aufweist, bereit.
Bei der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielten und von der transgenen Pflanze der Erfindung gezeigten Nährstoffnutzungseffizienz handelt es sich zum Beispiel um Stickstoffnutzungseffizienz.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielten und von der transgenen Pflanze der Erfindung aufgewiesenen Resistenz gegen abiotischen Stress um eine erhöhte Toleranz gegen niedrige Temperatur, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegen Kälte.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze bereit, die verglichen mit einer entsprechenden Ausgangs- oder Wildtyppflanze einen erhöhten intrinsischen Ertrag oder eine erhöhte Biomasse aufweist, und zwar dadurch, dass man eine oder mehrere dieser Aktivitäten erhöht oder erzeugt.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielten und von der transgenen Pflanze der Erfindung aufgewiesenen Resistenz gegen abiotischen Stress um eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz und Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber Kälte.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielten und von der transgenen Pflanze der Erfindung aufgewiesenen Resistenz gegen abiotischen Stress um eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz und Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber Kälte sowie einen erhöhten intrinsischen Ertrag.
Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Nachkommen, Samen und/oder Pollen, die von solch einer Pflanze abstammen, oder für die Herstellung solch einer Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann auch eine erhöhte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, insbesondere eine Toleranz gegen Kälte, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle oder -pflanze aufweisen, dadurch, dass man eine oder mehrere dieser „Aktivitäten” in dem hier angegebenen subzellulären Kompartiment und/oder Gewebe dieser Pflanze erhöht oder erzeugt.
Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Nachkommen, Samen und/oder Pollen, die von solch einer Pflanze abstammen, oder für die Herstellung solch einer Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann eine Stickstoffnutzungseffizienz (NUE) sowie eine erhöhte Toleranz gegen niedrige Temperatur und/oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle oder -pflanze aufweisen, dadurch, dass man eine oder mehrere dieser Aktivitäten in dem hier angegebenen subzellulären Kompartiment und/oder Gewebe dieser Pflanze erhöht oder erzeugt.
Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Nachkommen, Samen und/oder Pollen, die von solch einer Pflanze abstammen, oder für die Herstellung solch einer Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze kann eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz (NUE) sowie Toleranz gegen niedrige Temperatur und erhöhte Toleranz gegen Dürre und erhöhten intrinsischen Ertrag verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle oder -pflanze aufweisen, dadurch, dass man eine oder mehrere dieser Aktivitäten in dem hier angegebenen subzellulären Kompartiment und/oder Gewebe dieser Pflanze erhöht oder erzeugt.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform eine transgene Pflanze bereit, die verglichen mit der entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Ausgangs- oder Wildtyppflanzenzelle oder -pflanze, ein oder mehrere Ertragsmerkmale aufweist, und die eine erhöhte oder neu erzeugte eine oder mehrere Aktivitäten ausgewählt aus der obenerwähnten Gruppe von Aktivitäten in dem hier angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe in dieser Pflanze aufweist.
Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Nachkommen, Samen und/oder Pollen, die von solch einer Pflanze abstammen, oder für die Herstellung solch einer Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze weist eine erhöhte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und Stickstoffnutzungseffizienz (NUE) verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle oder -pflanze auf, und zwar dadurch, dass man eine oder mehrere dieser „Aktivitäten” erhöht oder erzeugt.
Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Nachkommen, Samen und/oder Pollen, die von solch einer Pflanze abstammen, oder für die Herstellung solch einer Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze weist eine erhöhte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und einen erhöhten intrinsischen Ertrag verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle oder pflanze auf, und zwar dadurch, dass man eine oder mehrere dieser „Aktivitäten” erhöht oder erzeugt.
Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze; von Nachkommen, Samen und/oder Pollen, die von solch einer Pflanze abstammen, oder für die Herstellung solch einer Pflanze bereitgestellt; jede Pflanze weist eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz und einen erhöhten intrinsischen Ertrag verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle oder -pflanze auf, und zwar dadurch, dass man eine oder mehrere dieser „Aktivitäten” erhöht oder erzeugt.
Demgemäß wird eine Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paar) in einem oder mehreren spezifischen Kompartimenten einer Zelle erhöht und vermittelt einen erhöhten Ertrag, z. B. weist die Pflanze eine Erhöhung oder Verbesserung des genannten Ertragsmerkmals auf. So wird zum Beispiel diese Aktivität in den Plastiden einer Zelle gemäß Tabelle I oder II in Spalte 6 erhöht, was zu einem erhöhten Ertrag der entsprechenden Pflanze führt. Zum Beispiel vermittelt die spezifische Lokalisierung dieser Aktivität in den Plastiden ein verbessertes oder erhöhtes Ertragsmerkmal gemäß Tabelle VIIIA, B, C und/oder D. Weiterhin kann diese Aktivität in den Mitochondrien einer Zelle erhöht werden und erhöht den Ertrag in einer entsprechenden Pflanze, wodurch zum Beispiel ein verbessertes oder erhöhtes Ertragsmerkmal vermittelt wird, wie zum Beispiel gegebenenfalls die entsprechenden Aktivitäten in Tabelle VIIIA, B, C und/oder D angeben.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyppflanze erhöhten Ertrag, umfassend mindestens einen der Schritte ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(i) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv, gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II bzw. Tabelle IV;
(ii) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Expressionsprodukts eines Nukleinsäuremoleküls oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle, umfassend ein oder mehrere Polynukleotid(e), gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, und
(iii) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines funktionellen Äquivalents von (i) oder (ii).

Demgemäß wird die Erhöhung oder Herstellung von einer oder mehreren dieser Aktivitäten zum Beispiel durch ein oder mehrere Expressionsprodukte dieses Nukleinsäuremoleküls, zum Beispiel Proteinen, vermittelt. Demgemäß wird in der oben beschriebenen vorliegenden Erfindung die Erhöhung oder Herstellung von einer oder mehreren dieser Aktivitäten zum Beispiel durch ein oder mehrere Protein(e) vermittelt, die jeweils ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe gemäß Tabelle II, Spalte 5 und 7, umfassen.
In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Schritte: (i) Erhöhen oder Erzeugen der Expression mindestens eines Nukleinsäuremoleküls und/oder (ii) Erhöhen oder Erzeugen der Expression eines Expressionsprodukts mindestens eines Nukleinsäuremoleküls und/oder (iii) Erhöhen oder Erzeugen einer oder mehrerer Aktivitäten eines durch mindestens ein Nukleinsäuremolekül (im folgenden Text „Yield Related Protein (YRP)”-Codiergen bzw. „YRP”-Gen) codierten Expressionsprodukts, wobei das Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül umfasst, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Nukleinsäuremolekül, das für Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II codiert;
(b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I;
(c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II abgeleitet sein kann und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht;
(d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens etwa 30, zum Beispiel 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98 oder 99% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht;
(e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens etwa 30, zum Beispiel 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98 oder 99% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codiert wird, codiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht;
(f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht;
(g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) codiert wird und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann;
(h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst;
(i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II wiedergegeben wird, und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht;
(j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und
(k) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens etwa 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt, 1000 nt, 1500 nt, 2000 nt oder 3000 nt eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird, screent.

Demgemäß werden die Gene der vorliegenden Erfindung oder diejemigen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und die für ein Protein mit einer Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX), die für ein Protein umfassend ein Polypeptid, das von einer Nukleinsäuresequenz gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7 codiert wird, und/oder die für ein Protein umfassend ein Polypeptid gemäß Tabelle II, Spalte 5 und 7, codieren, oder die mit dem Primer-Satz gemäß Tabelle III, Spalte 7, amplifiziert werden können, auch „YRP-Gene” genannt.
Proteine oder Polypeptide, die von den „YRP-Genen” codiert werden, werden als „Yield Related Proteins” oder „YRP” bezeichnet. Für den Rahmen der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Proteine mit einer Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX), Protein(e) umfassend ein Polypeptid, das von einer oder mehreren Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, codiert wird, oder Protein(e) umfassend ein Polypeptid gemäß Tabelle II, Spalte 5 und 7, oder Proteine umfassend die Konsensus-Sequenz gemäß Tabelle IV, Spalte 7, oder umfassend ein oder mehrere Motive gemäß Tabelle IV, Spalte 7, ebenfalls als „Yield Related Proteins” oder „YRPs” bezeichnet.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Erzeugen einer Pflanze mit einem erhöhten oder verbesserten Ertrag verglichen mit der entsprechenden Ausgangs- oder Wildtyppflanze bereit, und zwar dadurch, dass man eine oder mehrere Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX), die von einem oder mehreren YRP oder dem Genprodukt von einem oder mehreren YRP-Genen, zum Beispiel von dem Genprodukt einer Nukleinsäuresequenzen umfassend ein Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, z. B. oder durch ein oder mehrere Proteine, jeweils umfassend ein Polypeptid, das von einer oder mehreren Nukleinsäuresequenzen ausgewählt aus der Gruppe gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7 codiert wird, oder von einem oder mehreren Protein(en), jeweils umfassend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe gemäß Tabelle II, Spalte 5 und 7, oder ein Protein mit einer Sequenz entsprechend der Konsensus-Sequenz gemäß Tabelle IV, Spalte 7, vermittelt wird.
Wie erwähnt kann der erhöhte Ertrag von einem oder mehreren Ertragsmerkmalen vermittelt werden. So betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung einer Pflanze mit diesem einen bzw. diesen mehreren verbesserten Ertragsmerkmalen.
So stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem oder mehreren verbesserten Ertragsmerkmalen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, z. B. Stickstoffnutzungseffizienz (NUE), erhöhte Stressresistenz, z. B. Resistenz gegen abiotischen Stress, erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, erhöhte Wassernutzungseffizienz, erhöhte Stressresistenz, z. B. Resistenz gegen abiotischen Stress, insbesondere Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, Dürretoleranz und einem erhöhten intrinsischen Ertrag bereit.
In einer Ausführungsform wird/werden eine oder mehrere dieser Aktivitäten dadurch erhöht, dass man die Menge und/oder spezifische Aktivität von einem oder mehreren Proteinen mit dieser Aktivität in einer Pflanzenzelle oder einem Kompartiment davon erhöht, z. B. dadurch, dass man die Menge und/oder spezifische Aktivität von einem oder mehreren YRP, z. B. von Polypeptiden gemäß Tabelle II, Spalte 5 und 7 oder entsprechend der Konsensussequenz gemäß Tabelle VI, Spalte 7, in einer Zelle oder einem Kompartiment einer Zelle erhöht.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden Ausgangs- oder Wildtyppflanze, z. B. einer transgenen Pflanze, das Folgendes umfasst:

(a) Erhöhen oder Erzeugen von einer oder mehreren Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) in einem Pflanzenzellkern, einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, z. B. mit den hier erwähnten Verfahren; und (b) Kultivieren oder Heranziehen der Pflanzenzelle, der Pflanze oder des Teils davons unter Bedingungen, die die Entwicklung der Pflanzenzelle, der Pflanze oder des Teils davon gestatten; und (c) Gewinnen einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Ausgangs oder Wildtyppflanze aus diesem Pflanzenzellkern, einer Pflanzenzelle, einem Pflanzenteil; (d) und gegebenenfalls Selektieren der Pflanze oder eines Teils davon mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel mit einem erhöhten oder verbesserten Ertragsmerkmal, z. B. einer verbesserten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder Resistenz gegen abiotischen Stress, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle, die z. B. sichtbare Defizienzsymptome und/oder Absterben aufweist.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Identifizieren einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, umfassend das Screening einer Population von einem/einer oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon auf diese Aktivität, wobei man das Ausmaß der Aktivität mit dem Aktivitätsausmaß in einer Referenz vergleicht; Identifizieren eines/einer oder mehrerer Pflanzenzellkerne, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen oder Teile davon mit der verglichen mit der Referenz erhöhten Aktivität, gegebenenfalls Herstellen einer Pflanze aus den identifizierten Pflanzenzellkernen, der identifizierten Pflanzenzelle oder dem identifizierten Pflanzengewebe.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Identifizieren einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, umfassend das Screening einer Population von einem/einer oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon auf das Expressionsniveau einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid, das diese Aktivität vermittelt, codiert, Vergleichen des Expressionsniveaus mit einer Referenz; Identifizieren eines/einer oder mehrerer Pflanzenzellkerne, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen oder Teilen davon mit dem verglichen mit der Referenz erhöhten Expressionsniveau, gegebenenfalls Herstellen einer Pflanze aus den identifizierten Pflanzenzellkernen, der identifizierten Pflanzenzelle oder dem identifizierten Pflanzengewebe.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Population von Pflanzen, umfassend das Überprüfen der Wachstumstemperatur(en) in dem Anbaugebiet, Vergleichen der Temperaturen mit der optimalen Wachstumstemperatur einer Pflanzenspezies oder einer Art, deren Anbau in Betracht gezogen wird, z. B. die hier erwähnte Ausgangs- oder Wildtyppflanze, Anbauen und Heranziehen der erfindungsgemäßen Pflanze, wenn die Wachstumstemperatur für das Anbauen und das Heranziehen der Pflanzenspezies oder Art, deren Anbau in Betracht gezogen wird, z. B. die Ausgangs- oder Wildtyppflanze, nicht optimal ist.
Das Verfahren kann teilweise oder ganz ein oder mehrmals wiederholt werden.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Verbesserung der Adaptation an Umweltstress, insbesondere Erhöhung der Stickstoffverwertungseffizienz, bereit.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine Pflanze mit einem erhöhten oder verbesserten Ertrag bereit. Wie erwähnt kann erfindungsgemäß ein erhöhter oder verbesserter Ertrag dadurch erzielt werden, dass man ein oder mehrere Ertragsmerkmale, z. B. die Nährstoffnutzungseffizienz, die Wassernutzungseffizienz, die Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere niedere Temperatur oder Dürre, verglichen mit der entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Wildtyppflanze, erhöht oder verbessert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diese Merkmale durch ein Verfahren für eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress in einem photosynthetisch aktiven Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, verglichen mit einem entsprechenden (nichttransformierten) photosynthetisch aktiven Wildtyp-Organismus erzielt.
„Verbesserte Adaptation” an Umweltstress wie z. B. Gefrier- und/oder Kältetemperaturen bezieht sich auf eine verbesserte pflanzliche Leistung unter Umweltstressbedingungen.
In einer weiteren Ausführungsform bedeutet „erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress” in einem photosynthetisch aktiven Organismus, dass der photosynthetisch aktive Organismus, vorzugsweise die Pflanze, wenn er wie hier erwähnte abiotische Umweltstressbedingungen antrifft, z. B. Niedertemperaturbedingungen, darunter Kälte- und Gefriertemperaturen, oder z. B. Dürre, einen erhöhten Ertrag aufweist, z. B. einen erhöhten Ertrag wie hier erwähnt aufweist, z. B. einen Samenertrag oder einen Biomasseertrag, verglichen mit einem entsprechenden (nichttransformierten) photosynthetisch aktiven Wildtyp- oder Ausgangsorganismus, z. B. einer Wildtyp- oder Ausgangspflanze.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle mit einem erhöhten Ertrag, z. B. Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle bereit, und zwar dadurch, dass man eine oder mehrere Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) erhöht oder erzeugt.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Proteine mit einer Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) und die Polypeptide gemäß Tabelle II, Spalte 5 und 7 „Yield Related Proteins” („YRPs”) genannt. Beide Begriffe sollen dasselbe bedeuten und sind austauschbar.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle mit einem erhöhten Ertrag, z. B. Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle bereit, und zwar dadurch, dass man eine oder mehrere Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) erhöht oder erzeugt.
In einer weiteren Ausführungsform weist der erfindungsgemäße photosynthetisch aktive Organismus, insbesondere die erfindungsgemäße Pflanze, einen erhöhten Ertrag unter abiotischen Umweltstressbedingungen auf und weist eine erhöhte Toleranz gegenüber einem weiteren abiotischen Umweltstress auf oder weist ein weiteres verbessertes Ertragsmerkmal auf.
In einer weiteren Ausführungsform deckt die vorliegende Erfindung den Bedarf, neue, einzigartige Gene zu identifizieren, die fähig sind, einem photosynthetisch aktiven Organismus, vorzugsweise Pflanzen, bei Expression oder Überexpression von endogenen und/oder exogenen Genen einen erhöhten Ertrag zu verleihen, z. B. mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, z. B. einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung YRP und YRP-Gene bereit.
In einer weiteren Ausführungsform davon deckt die vorliegende Erfindung den Bedarf, neue, einzigartige Gene zu identifizieren, die fähig sind, einem photosynthetisch aktiven Organismus, vorzugsweise Pflanzen, bei Expression oder Überexpression von endogenen Genen einen erhöhten Ertrag zu verleihen, z. B. mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, z. B. einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung YRP und YRP-Gene, die von Pflanzen abstammen, bereit. Insbesondere sind Gene von Pflanzen in Spalte 5 sowie in Spalte 7 von Tabelle I oder II beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform davon deckt die vorliegende Erfindung den Bedarf, neue, einzigartige Gene zu identifizieren, die fähig sind, einem photosynthetisch aktiven Organismus, vorzugsweise Pflanzen, bei Expression oder Überexpression von exogenen Genen einen erhöhten Ertrag zu verleihen, z. B. mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, z. B. einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung YRP und YRP-Gene, die von Pflanzen und anderen Organismen in Spalte 5 sowie Spalte 7 von Tabelle I oder II abstammen, bereit.
In einer weiteren Ausführungsform deckt die vorliegende Erfindung den Bedarf daran, neue, einzigartige Gene zu identifizieren, die fähig sind, photosynthetisch aktiven Organismen, vorzugsweise Pflanzen, bei Expression oder Überexpression von endogenen und/oder exogenen Genen eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress in Kombination mit einer Ertragserhöhung zu vermitteln.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zum Beispiel transgenen photosynthetisch aktiven Organismus oder eines Teils davon oder einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon für die Herstellung solch einer Pflanze, wobei der Organismus einen erhöhten Ertrag aufweist, z. B. wobei die Pflanze ein erhöhtes Ertragsmerkmal aufweist, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, wie zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber Trockenheit und/oder niederer Temperatur, und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen intrinsischen Ertrag und/oder ein sonstiges erhöhtes Ertragsmerkmal aufweist, verglichen mit einem entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus oder einem Teil davon, oder einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Erhöhen oder Erzeugen von einer oder mehreren dieser Aktivitäten, z. B. der Aktivität des YRP oder des Genprodukts des YRP-Gens, z. B. einer Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) in einem photosynthetisch aktiven Organismus oder einem Teil davon, z. B. einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, und (b) gegebenenfalls Regenerieren einer Pflanze aus dieser Pflanzenzelle, diesem Pflanzenzellkern oder Teil davon, Heranziehen des photosynthetisch aktiven Organismus oder eines Teils davon, z. B. einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, unter Bedingungen, die die Entwicklung eines photosynthetisch aktiven Organismus oder eines Teils davon, vorzugsweise einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon, gestatten, mit erhöhtem Ertrag, z. B. mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, z. B. einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem intrinsischen Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nichttransformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus oder eines Teils davon, vorzugsweise einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem erhöhten Ertrag oder eines Pflanzenzellkerns, einer Pflanzenzelle oder eines Teils davon für die Herstellung solch einer Pflanze, der Ertrag erhöht verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Erhöhen oder Erzeugen in diesem Pflanzenzellkern, dieser Pflanzenzelle, dieser Pflanze oder diesem Teil davon von einer oder mehreren dieser Aktivitäten, z. B. der Aktivität des YRP oder des Genprodukts des YRP-Gens; (b) gegebenenfalls Regenerieren einer Pflanze aus dem Pflanzenzellkern, der Pflanzenzelle oder dem Teil davon, Heranziehen der Pflanze unter Bedingungen, vorzugsweise in Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffmangel- und/oder abiotischen Stresses, die die Entwicklung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze gestatten; und (c) Selektieren der Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise einer verbesserten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder Resistenz gegen abiotischen Stress verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder eines Teils davon, die/der sichtbare Symptome von Defizienz und/oder Absterben unter diesen Bedingungen zeigt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zum Beispiel transgenen photosynthetisch aktiven Organismus oder eines Teils davon, vorzugsweise einer Pflanze, oder einer Pflanzenzelle, eines Pflanzenzellkerns oder eines Teils davon für die Regeneration dieser Pflanze, wobei die Pflanze einen erhöhten Ertrag aufweist, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal aufweist, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress aufweist, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder intrinsischen Ertrag und/oder ein sonstiges erhöhtes Ertragsmerkmal aufweist verglichen mit einem entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus oder eines Teils davon, vorzugsweise einer Pflanze, wobei das Verfahren mindestens die folgenden Schritte umfasst:

(a) Erhöhen oder Erzeugen von einer oder mehreren dieser Aktivitäten, z. B. der Aktivität des YRP oder des Genprodukts des YRP-Gens, z. B. einer Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paar) in einem photosynthetisch aktiven Organismus oder eines Teils davon, vorzugsweise einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon, (b) Heranziehen des photosynthetisch aktiven Organismus gemeinsam mit einem z. B. nichttransformierten photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus unter abiotischen Umweltstressbedingungen oder Defizienzbedingungen;
(c) Selektieren des photosynthetisch aktiven Organismus mit einem erhöhten Ertrag, z. B. mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, erhöhtem Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal, oder eines Teils davon, zum Beispiel eine Pflanzenzelle, wobei der Ertrag verglichen mit einem entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, photosynthetisch aktiven Wildtyporganismus, zum Beispiel einer Pflanze, erhöht ist, nachdem der z. B. nichttransformierte photosynthetisch aktive Wildtyporganismus oder ein Teil davon visuelle Symptome von Defizienz und/oder Absterben aufweist.

In einer Ausführungsform in der gesamten Beschreibung bezieht sich abiotischer Umweltstress auf Niedertemperaturstress.
In einer Ausführungsform ist die Aktivität, zum Beispiel die Aktivität des Proteins gemäß Tabelle II, Spalte 3 oder von den Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 codiert, in dem Teil einer Zelle gemäß Tabelle II oder Tabelle I in Spalte 6 erhöht.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze, wobei eine Pflanzenzelle oder ein Pflanzenzellkern oder ein Pflanzengewebe für die Herstellung solch einer Pflanze mit einem Nukleinsäuremolekül transformiert wird, das ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der folgenden Gruppe umfasst:

(a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II codiert;
(b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I;
(c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II abgeleitet sein kann und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht;
(d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30, zum Beispiel 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98 oder 99% Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht;
(e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30, zum Beispiel 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98 oder 99% Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codiert wird, codiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht;
(f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht;
(g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) codiert wird und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann;
(h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst;
(i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II wiedergegeben wird, und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht;
(j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle 111 amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und
(k) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 20, 30, 50, 100, 200, 300, 500 oder 1000 oder mehr nt eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird, screent, und Regenerieren einer transgenen Pflanze aus diesem transformierten Pflanzellkern, dieser transformierten Pflanzenzelle bzw. diesem transformierten Pflanzengewebe mit erhöhten Ertrag.

Eine Modifikation, d. h. eine Erhöhung, kann durch endogene oder exogene Faktoren herbeigeführt werden. So kann zum Beispiel eine Erhöhung der Aktivität in einem Organismus oder Teil davon dadurch verursacht werden, dass man ein Genprodukt oder einen Vorläufer oder einen Aktivator oder einen Agonisten zu dem Medium oder der Ernährung zugibt, oder dadurch erzeugt werden, dass man die genannten Dinge in einen Organismus transient oder stabil einführt. Weiterhin kann solch eine Erhöhung dadurch erzielt werden, dass man die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder das codierte Protein in das korrekte Zellkompartiment, zum Beispiel in den Zellkern oder cytoplasmisch oder in Plastiden entweder durch Transformation und/oder durch Zielsteuerung einführt. Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung sollen die Begriffe „cytoplasmisch” und „nichtzielgesteuert” bedeuten, dass die Nukleinsäure der Erfindung ohne Hinzufügen einer nichtnatürlichen Transitpeptid-Codiersequenz exprimiert wird. Bei einer nichtnatürlichen Transitpeptid-Codiersequenz handelt es sich um eine Sequenz, die nicht ein natürlicher Bestandteil einer Nukleinsäure der Erfindung, zum Beispiel der Nukleinsäuren gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, ist, sondern vielmehr eine, die durch molekulare Manipulationsschritte wie zum Beispiel in dem Beispiel unter „an die Plastiden zielgesteuerte Expression” beschrieben ist. Die Begriffe „cytoplasmisch” und „nichtzielgesteuert” sollen daher nicht eine zielgesteuerte Lokalisierung an ein beliebiges Zellkompartiment für die Produkte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen durch ihre natürlich vorkommenden Sequenzeigenschaften innerhalb des Hintergrunds des transgenen Organismus ausschließen. Der subzelluläre Ort des reifen Polypeptids, das sich von den beigelegten Sequenzen ableitet, kann vom Fachmann für den Organismus/für die Pflanze unter Verwendung von Software-Werkzeugen wie TargetP (Emanuelsson et al., (2000), Predicting subcellular localization of Proteins based an their N-terminal amino acid sequence., J. Mol. Biol. 300, 1005–1016.), ChloroP (Emanuelsson et al. (1999), ChloroP, a neural network-based method for Predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites., Protein Science, 8: 978–984.) oder andere Prädikations-Software-Werkzeuge (Emanuelsson et al. (2007), Locating Proteins in the cell using TargetP, Signale, and related tools., Nature Protocols 2, 953–971) prognostiziert werden.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer zum Beispiel transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, zum Beispiel mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer geteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal verglichen mit einer entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze, das Folgendes umfasst: (a) Erhöhen oder Erzeugen von einer oder mehreren der Aktivitäten, zum Beispiel der Aktivität des YRP oder des Genprodukts des YRP-Gens, zum Beispiel einer Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) in eine Organelle, zum Beispiel in einen Plastiden oder ein Mitochondrium, einer Pflanzenzelle, zum Beispiel gemäß Spalte 6 von Tabelle I, und (b) Heranziehen der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die die Entwicklung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffsnutzungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze, gestatten.
In einer Ausführungsform wird eine Aktivität, wie sie im vorliegenden Text als YRP-vermittelt beschrieben wird, zum Beispiel ein Polypeptid gemäß Tabelle II, in dem Plastiden erhöht oder erzeugt, wenn in Spalte 6 von jeder Tabelle I der Begriff „plastidär” für dieses Polypeptid angeführt ist.
In einer Ausführungsform wird eine Aktivität, wie sie im vorliegenden Text als YRP-vermittelt beschrieben wird, zum Beispiel ein Polypeptid gemäß Tabelle II, in den Mitochondrien erhöht oder erzeugt, wenn in Spalte 6 von jeder Tabelle I der Begriff „Mitochondrien” für dieses Polypeptid angeführt ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer zum Beispiel transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal verglichen mit einer entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze, das Folgendes umfasst:

(a) Erhöhen oder Erzeugen von einer oder mehreren der Aktivitäten im Cytoplasma einer Pflanzenzelle, und
(b) Heranziehen der Pflanze unter Bedingungen, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal verglichen mit einer entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze, gestatten.

In einer Ausführungsform wird eine Aktivität, wie sie im vorliegenden Text als durch ein Polypeptid gemäß Tabelle II vermittelt beschrieben wird, in dem Cytoplasma erhöht oder erzeugt, wenn in Spalte 6 von jeder Tabelle I der Begriff „cytoplasmatisch” für dieses Polypeptid angeführt ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer zum Beispiel transgenen Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, oder eines Teils davon, zum Beispiel eine Pflanze mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal verglichen mit einer entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze, das Folgendes umfasst:

(a1) Erhöhen oder Erzeugen von einer oder mehreren der Aktivitäten, zum Beispiel der Aktivität des YRP oder des Genprodukts des YRP-Gens, zum Beispiel einer Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX), in eine Organelle einer Pflanzenzelle, oder (a2) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP, zum Beispiel eines Proteins gemäß Tabelle II, Spalte 3 oder wie von den Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, codiert und das mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Transitpeptid codiert, verbunden ist, in der Pflanzenzelle; oder (a3) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP, zum Beispiel eines Proteins gemäß Tabelle II, Spalte 3 oder wie von den Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, codiert und das mit einer Nukleinsäuresequenz die für eine Organellenlokalisierungssequenz, insbesondere eine Chloroplastenlokalisierungssequenz, codiert, verbunden ist, in der Pflanzenzelle; (a4) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines YRP, zum Beispiel eines Proteins gemäß Tabelle II, Spalte 3 oder wie von den Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, codiert und das mit einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Mitochondrienlokalisierungssequenz codiert, verbunden ist, in der Pflanzenzelle; und (b) Regenerieren einer Pflanze aus dieser Pflanzenzelle; (c) Heranziehen der Pflanze unter Bedingungen, die die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einem sonstigen erhöhten Ertragsmerkmal verglichen mit einer entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze, gestatten.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird bei dem Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem erhöhten Ertrag die Aktivität dadurch erhöht oder erzeugt, dass man

(a1) die Aktivität eines Proteins gemäß Tabelle II, Spalte 3, das von den Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, codiert wird, in einer Organelle einer Pflanze durch Transformieren der Organelle erhöht oder erzeugt, oder
(a2) die Aktivität eines Proteins gemäß Tabelle II, Spalte 3, das von den Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, in dem Plastiden einer Pflanze oder in einem oder mehreren Teilen davon durch Transformieren der Plastiden codiert wird, erhöht oder erzeugt;
(a3) die Aktivität eines YRP, z. B. eines Proteins gemäß Tabelle II, Spalte 3, oder das von den Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, in dem Chloroplasten einer Pflanze oder in einem oder mehreren Teilen davon durch Transformieren des Chloroplasten codiert wird, erhöht oder erzeugt;
(a4) die Aktivität eines YRP, z. B. eines Proteins gemäß Tabelle II, Spalte 3, oder das von den Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, in dem Mitochondrium einer Pflanze oder in einem oder mehreren Teilen davon durch Transformieren des Mitochondriums codiert wird, erhöht oder erzeugt.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel beruhend auf einem erhöhten oder verbesserten Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden Wildtyppflanze umfassend mindestens einen der Schritte ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(i) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Polypeptids umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II bzw. von Tabelle IV;
(ii) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Expressionsprodukts eines Nukleinsäuremoleküls umfassend ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, und
(iii) Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines funktionellen Äquivalents von (i) oder (ii).

Im Prinzip kann die für ein Transitpeptid codierende Nukleinsäuresequenz aus einem beliebigen Organismus wie Mikroorganismen wie Algen oder Pflanzen, die Plastide, vorzugsweise Chloroplasten, enthalten, isoliert werden. Bei einem „Transitpeptid” handelt es sich um eine Aminosäuresequenz, deren codierende Nukleinsäuresequenz zusammen mit dem entsprechenden Strukturgen translatiert wird. Dies bedeutet, dass das Transitpeptid ein integraler Teil des translatierten Proteins ist und eine aminoterminale Verlängerung des Proteins bildet. Beide werden als sogenanntes „Präprotein” translatiert. Im Allgemeinen wird das Transitpeptid während oder unmittelbar nach dem Importieren des Proteins in das korrekte Zellorganell wie z. B. einen Plastiden vom Präprotein abgespalten, wodurch man das reife Protein erhält. Das Transitpeptid sorgt für die korrekte Lokalisierung des reifen Proteins, indem es den Transport des Proteins durch intrazelluläre Membranen vermittelt.
Für ein Transitpeptid codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet werden, die für ein Protein codiert, welches schlussendlich im Plastid residiert und aus einem Organismus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Acetabularia, Arabidopsis, Brassica, Capsicum, Chlamydomonas, Cururbita, Dunaliella, Euglena, Flaveria, Glycine, Helianthus, Hordeum, Lemna, Lolium, Lycopersion, Malus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Oenotherea, Oryza, Petunia, Phaseolus, Physcomitrella, Pinus, Pisum, Raphanus, Silene, Sinapis, Solanum, Spinacea, Stevia, Synechococcus, Triticum und Zea, stammt.
Solche Transitpeptide, die im erfindungsgemäßen Verfahren förderlich zur Anwendung gelangen, sind beispielsweise von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet, die für ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ribulosebisphosphatcarboxylase/-oxygenase, 5-Enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatsynthase, Acetolactatsynthase, dem ribosomalen Chloroplastenprotein CS17, dem Cs-Protein, Ferredoxin, Plastocyanin, Ribulosebisphosphatcarboxylaseactivase, Tryptophansynthase, dem Acylträgerprotein, dem Chaperonin-60 aus Plastiden, Cytochrom c₅₅₂, dem 22-kDA Hitzeschockprotein, dem 33-kDa Oxygen-Evolving Enhancer Protein 1, der γ-Untereinheit von ATP-Synthase, der d-Untereinheit von ATP-Synthase, dem chlorophyll-a/b-bindenden Protein II-1, dem Oxygen-Evolving Enhancer Protein 2, dem Oxygen-Evolving Enhancer Protein 3, dem Photosystem I: P21, dem Photosystem I: P28, dem Photosystem I: P30, dem Photosystem I: P35, dem Photosystem I: P37, Glycerin-3-phosphatacyltransferasen, dem chlorophyll-a/b-bindenden Protein, dem CAB2-Protein, Hydroxymethylbilansynthase, Pyruvatorthophosphatdikinase, dem CAB3-Protein, dem Ferritin aus Plastiden, Ferritin, dem Early Light-Inducible Protein, Glutamat-1-semialdehydaminotransferase, Protochlorophyllidreduktase, der stärkekorngebundenen Amylasesynthase, dem lichtsammelnden chlorophyll-a/b-bindenden Protein des Photosystems II, dem Major Pollen Allergen Lol p 5a, der ClpB ATP-abhängigen Protease aus Plastiden, Superoxiddismutase, Ferredoxin-NADP-oxidoreduktase, dem 28-kDa Ribonukleoprotein, dem 31-kDa Ribonukleoprotein, dem 33-kDa Ribonukleoprotein, Acetolactatsynthase, der CF₀-Untereinheit 1 der ATP-Synthase, der CF₀-Untereinheit 2 der ATP-Synthase, der CF₀-Untereinheit 3 der ATP-Synthase, der CF₀-Untereinheit 4 der ATP-Synthase, Cytochrom f, ADP Glucosepyrophosphorylase, Glutaminsynthase, Glutaminsynthase 2, Carboanhydrase, dem GapA-Protein, dem Hitzeschockprotein hsp21, dem Phosphattranslokator, der ClpA ATP-abhängigen Protease aus Plastiden, dem ribosomalen Protein CL24 aus Plastiden, dem ribosomalen Protein CL9 aus Plastiden, dem ribosomalen Protein PsCL18 aus Plastiden, dem ribosomalen Protein PsCL25 aus Plastiden, DAHP-Synthase, Stärkephosphorylase, dem Acylträgerprotein II aus Wurzeln, Betainaldehyddehydrogenase, dem GapB-Protein, Glutaminsynthetase 2, Phosphoribulokinase, Nitritreduktase, dem ribosomalen Protein L12, dem ribosomalen Protein L13, dem ribosomalen Protein L21, dem ribosomalen Protein L35, dem ribosomalen Protein L40, dem Triosephosphat-3-phosphoglyeratphosphattranslokator, der ferredoxinabhängigen Glutamatsynthase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, der NADP-abhängigen Malatdecarboxylase und NADP-Malatdehydrogenase, codiert.
In einer Ausführungsform leitet sich die für ein Transitpeptid codierende Nukleinsäuresequenz von einer Nukleinsäuresequenz ab, die für ein Protein codiert, das schlussendlich im Plastiden residiert und aus einem Organismus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Arten Acetabularia mediterranea, Arabidopsis thaliana, Brassica campestris, Brassica napus, Capsicum annuum, Chlamydomonas reinhardtii, Cururbita moschata, Dunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, Euglena gracilis, Flaveria trinervia, Glycine max, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lemna gibba, Lolium perenne, Lycopersion esculentum, Malus domestica, Medicago falcata, Medicago sativa, Mesembryanthemum crystallinum, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Oenotherea hookeri, Oryza sativa, Petunia hybrida, Phaseolus vulgaris, Physcomitrella patens, Pinus tunbergii, Pisum sativum, Raphanus sativus, Silene pratensis, Sinapis alba, Solanum tuberosum, Spinacea oleracea, Stevia rebaudiana, Synechococcus, Synechocystis, Triticum aestivum und Zea mays, stammt.
Für Transitpeptide codierende Nukleinsäuresequenzen sind die von Heijne et al. (Plant Molecular Biology Reporter, 9 (2), 104, (1991)) offenbarten, die hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Erfindung werden. In Tabelle V sind einige Beispiele für die von Heijne et al. offenbarten Transitpeptidsequenzen gezeigt.
Gemäß der Offenbarung der Erfindung, insbesondere in den Beispielen, ist es dem Fachmann möglich, andere von Heijne et al. offenbarten, Nukleinsäuresequenzen mit den hierin offenbarten YRP-Genen oder ein YRP codierenden Genen in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleinsäuresequenzen in Verbindung zu setzen, z. B. für die Nukleinsäuremoleküle, für die in Spalte 6 der Tabelle I der Begriff „plastidär” angegeben ist.
Für Transitpeptide codierende Nukleinsäuresequenzen leiten sich von der Gattung Spinacia ab, wie das Chloroplasten-30S-Ribosomenprotein PSrp-1, das Acylträgerprotein II aus Wurzeln, das Acylträgerprotein, die γ-Untereinheit der ATP-Synthase, die d-Untereinheit der ATP-Synthase, Cytochrom f, Ferredoxin I, die Ferredoxin-NADP-oxidoreduktase (= FNR), die Nitritreduktase, die Phosphoribulokinase, Plastocyanin oder die Carboanhydrase. Dem Fachmann wird bewusst sein, dass sich verschiedene andere für Transitpeptide codierende Nukleinsäuresequenzen leicht aus in Plastiden befindlichen Proteinen, die als Vorstufen von nukleären Genen exprimiert werden, um dann in die Plastide zu wandern, isolieren lassen. Solche für Transitpeptide codierenden Sequenzen lassen sich für die Konstruktion anderer Expressionskonstrukte verwenden. Die im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendeten Transitpeptide, die zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und Proteinen zählen, haben typischerweise eine Länge von 20 bis 120 Aminosäuren, vorzugsweise 25 bis 110, 30 bis 100 oder 35 bis 90 Aminosäuren, besonders bevorzugt 40 bis 85 Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt 45 bis 80 Aminosäuren und wirken posttranslational, indem sie das Protein zum Plastiden, vorzugsweise dem Chloroplasten, dirigieren. Die für solche Transitpeptide codierenden Nukleinsäuresequenzen befinden sich upstream von der Nukleinsäuresequenz, die für das reife Protein codiert. Für die korrekte molekulare Anbindung der für das Transitpeptid codierenden Nukleinsäure an die für das Targetprotein codierende Nukleinsäure ist es manchmal erforderlich, zusätzliche Basenpaare an der benachbarten Position einzuführen, die Sequenzen bilden, die von Restriktionsenzymen erkannt werden, was für die molekulare Anbindung der verschiedenen Nukleinsäuremoleküle von Nutzen ist. Diese Vorgehensweise kann dazu führen, dass am N-Terminus des reifen importierten Proteins einige wenige zusätzliche Aminosäuren vorhanden sind, die gewöhnlich und vorzugsweise die Funktion des Proteins nicht beeinträchtigen. In jedem Fall sind die zusätzlichen Basenpaare an der benachbarten Position, die Sequenzen bilden, die von Restriktionsenzymen erkannt werden, mit Vorsicht auszuwählen, um die Bildung von Stoppcodons oder Codons, die für Aminosäuren mit einem starken Einfluss auf die Proteinfaltung wie z. B. Prolin, codieren, zu vermeiden. Vorzugsweise codieren diese zusätzlichen Codons für kleine, strukturell flexible Aminosäuren wie Glycin oder Alanin.
Wie oben erwähnt kann die für das YRP, z. B. für ein Protein gemäß Tabelle II, Spalte 3 oder 5, und seine wie in Tabelle I, Spalte 7, offenbarten Homologe codierende Nukleinsäuresequenz mit einer Nukleinsäuresequenz verbunden werden, die für ein Transitpeptid codiert, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 der Tabelle I der Begriff „plastidär” angegeben ist. Diese für ein Transitpeptid codierende Nukleinsäuresequenz sorgt für den Transport des Proteins zu dem betreffenden Organell, insbesondere dem Plastid. Die Nukleinsäuresequenz des zu exprimierenden Gens und die für das Transitpeptid codierende Nukleinsäuresequenz sind operativ miteinander verbunden. Das Transitpeptid ist daher leserastergerecht an die für ein YRP, z. B. ein Protein gemäß Tabelle II, Spalte 3 oder 5, und seine wie in Tabelle I, Spalte 7, offenbarten Homologe codierende Nukleinsäuresequenz gebunden, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 der Tabelle I der Begriff „plastidär” angegeben ist.
Erfindungsgemäß steht der Ausdruck „Organell” zum Beispiel für „Mitochondrien” oder „Plastid”. Erfindungsgemäß soll der Ausdruck ”Plastid” verschiedene Formen an Plastiden mit umfassen, einschließlich Proplastiden, Chloroplasten, Chromoplasten, Gerontoplasten, Leukoplasten, Amyloplasten, Elaioplasten und Etioplasten, vorzugsweise Chloroplasten. Alle haben als gemeinsamen Vorfahren die obenerwähnten Proplasten.
Andere Transitpeptide wurden von Schmidt et al. (J. Biol. Chem. 268 (36), 27447 (1993)), Della-Cioppa et al. (Plant. Physiol. 84, 965 (1987)), de Castro Silva Filho et al. (Plant Mol. Biol. 30, 769 (1996)), Zhao et al. (J. Biol. Chem. 270 (11), 6081 (1995)), Römer et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (3), 1414 (1993)), Keegstra et al. (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 471 (1989)), Lubben et al. (Photosynthesis Res. 17, 173 (1988)) und Lawrence et al. (J. Biol. Chem. 272 (33), 20357 (1997)) offenbart. Ein allgemeiner Übersichtsartikel über Targeting wurde von Kermode Allison R. in Critical Reviews in Plant Science 15 (4), 285 (1996) unter dem Titel "Mechanisms of Intracellular Protein Transport and Targeting in Plant Cells" veröffentlicht.
Bevorzugte Transitpeptidsequenzen, die beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung kommen und die zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zählen, sind im Allgemeinen reich an hydroxylierten Aminosäureresten (Serin und Threonin), wobei diese beiden Reste im Allgemeinen 20–35% des Ganzen ausmachen. Sie haben häufig eine aminoterminale Region ohne Gly und Pro und ohne geladene Reste. Weiterhin weisen sie eine Reihe kleiner hydrophober Aminosäuren wie Valin und Alanin auf, und im Allgemeinen fehlen saure Aminosäuren. Darüber hinaus haben sie im Allgemeinen eine mittlere Region, die reich an Ser, Thr, Lys und Arg ist. Insgesamt haben sie sehr häufig eine positive Nettoladung.
Alternativ dazu können für die Transitpeptide codierende Nukleinsäuresequenzen entweder teilweise oder ganz chemisch synthetisiert werden, gemäß der Struktur von im Stand der Technik offenbarten Transitpeptidsequenzen. Diese natürlichen oder chemisch synthetisierten Sequenzen können direkt oder über eine Linker-Nukleinsäuresequenz, die typischerweise eine Länge von weniger als 500 Basenpaaren, vorzugsweise weniger als 450, 400, 350, 300, 250 oder 200 Basenpaaren, besonders bevorzugt weniger als 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 oder 30 Basenpaaren und ganz besonders bevorzugt weniger als 25, 20, 15, 12, 9, 6 oder 3 Basenpaaren aufweist und sich im Leseraster mit der codierenden Sequenz befindet, an die für das reife Protein codierenden Sequenzen gebunden werden. Weiterhin bevorzugte, für Transitpeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können Sequenzen umfassen, die aus mehr als einer biologischen und/oder chemischen Quelle stammen, und können eine Nukleinsäuresequenz einschließen, die sich von der aminoterminalen Region des reifen Proteins ableitet, das in seinem nativen Zustand an das Transitpeptid gebunden ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat diese aminoterminale Region des reifen Proteins typischerweise eine Länge von weniger als 150 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 140, 130, 120, 110, 100 oder 90 Aminosäuren, besonders bevorzugt weniger als 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25 oder 20 Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt weniger als 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 oder 10 Aminosäuren. Es sind jedoch auch noch kürzere oder längere Abschnitte möglich. Darüber hinaus können auch Targetsequenzen, die den Transport von Proteinen zu anderen Zellkompartimenten wie der Vakuole, dem endoplasmischen Retikulum, dem Golgi-Komplex, Glyoxysomen, Peroxisomen oder Mitochondrien vermitteln, Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz sein.
Bei den aus diesen erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen translatierten Proteinen handelt es sich um eine Art von Fusionsproteinen, was bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenzen, die für das Transitpeptid, zum Beispiel eines der in Tabelle V gezeigten, z. B. das letzte der Tabelle, codieren, mit einem YRP-Gen, z. B. den in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleinsäuresequenzen verbunden sind, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 der Tabelle I der Begriff „plastidär” angegeben ist. Dem Fachmann ist es möglich, diese Sequenzen funktionell zu verbinden. Vorteilhafterweise wird der Transitpeptidteil während des Transports, vorzugsweise in die Plastide, von dem YRP, z. B. von dem in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Teil des Proteins abgespalten. Alle der in der letzten Zeile der Tabelle V gezeigten Produkte der Spaltung des bevorzugten Transitpeptids haben vorzugsweise die N-terminalen Aminosäuresequenzen QIA CSS oder QIA EFQLTT vor dem Start-Methionin des YRP, z. B. des in Tabelle II, Spalten 5 und 7, erwähnten Proteins. Es können sich auch andere kurze Aminosäuresequenzen mit einem Bereich von 1 bis 20 Aminosäuren, vorzugsweise 2 bis 15 Aminosäuren, besonders bevorzugt 3 bis 10 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt 4 bis 8 Aminosäuren, vor dem Start-Methionin des YRP, z. B. des in Tabelle II, Spalten 5 und 7, erwähnten Proteins befinden. Bei der Aminosäuresequenz QIA CSS stammen die drei Aminosäuren vor dem Start-Methionin aus der LIC-Kassette (LIC = ligation independent cloning). Diese kurze Aminosäuresequenz wird für die Expression von Escherichia coli-Genen bevorzugt. Bei der Aminosäuresequenz QIA EFQLTT stammen die sechs Aminosäuren vor dem Start-Methionin aus der LIC-Kassette. Diese kurze Aminosäuresequenz wird für die Expression von Saccharomyces cerevisiae-Genen bevorzugt. Dem Fachmann ist bekannt, dass sich auch andere kurze Sequenzen für die Expression der YRP-Gene, z. B. der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, erwähnten Gene eignen. Weiterhin ist sich der Fachmann der Tatsache bewusst, dass es bei der Expression der Gene solcher kurzen Sequenzen nicht bedarf.
Tabelle V: Beispiele für von von Heijne et al. offenbarte Transitpeptide
Alternativ zum Targeting des YRP, z. B. von Proteinen mit den Sequenzen gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, vorzugsweise von Sequenzen, die allgemein im Kern codiert sind, mit Hilfe der zum Beispiel in Tabelle V erwähnten Targetingsequenzen alleine oder in Kombination mit anderen Targetingsequenzen, vorzugsweise in die Plastiden, können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren direkt in das Plastidengenom, für das z. B. in Spalte 6 der Tabelle II der Begriff „plastidär” angegeben ist, eingeführt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden das YRP-Gen, z. B. die Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, daher direkt in Plastiden eingeführt und dort exprimiert, insbesondere, wenn in Spalte 6 der Tabelle I der Begriff „plastidär” angegeben ist.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck „eingeführt” das Einführen einer Nukleinsäuresequenz in den Organismus mittels einer „Transfektion”, „Transduktion” oder vorzugsweise durch „Transformation”.
Ein Plastid wie z. B. ein Chloroplast ist durch eine exogene (vorzugsweise fremde) Nukleinsäuresequenz „transformiert” worden, wenn die Nukleinsäuresequenz in den Plastiden eingeführt wurde, was bedeutet, dass diese Sequenz die Membran bzw. die Membranen des Plastiden durchdrungen hat. Die fremde DNA kann in die das Genom des Plastids bildende Plastiden-DNA integriert sein (kovalent daran gebunden sein) oder nicht integriert bleiben (z. B. indem sie einen Chloroplasten-Replikationsursprung einschließen). ”Stabil” integrierte DNA-Sequenzen sind die, die über Plastidenreplikation weitervererbt werden, wodurch neue Plastiden mit den Merkmalen der integrierten DNA-Sequenz an die Nachkommenschaft weitergegeben werden.
Für die Expression ist der Fachmann mit verschiedenen Methoden zur Einführung der Nukleinsäuresequenzen in verschiedene Organellen wie die bevorzugten Plastiden vertraut. Solche Methoden wurden zum Beispiel von Maiga P. (Annu. Rev. Plant Biol. 55, 289 (2004)), Evans T. ( WO 2004/040973 ), McBride K. E. et al. ( US 5,455,818 ), Daniell H. et al. ( US 5,932,479 und US 5,693,507 ) und Straub J. M. et al. ( US 6,781,033 ) offenbart. Eine bevorzugte Methode ist die Transformation von aus Mikrosporen gewonnenem Hypokotyl- oder Kotyledongewebe (die grün sind und zahlreiche Plastiden enthalten), Blattgewebe und die anschließende Regeneration von Sprossen aus diesem transformierten Pflanzenmaterial auf einem selektiven Medium. Als Transformationsmethoden sind der Beschuss des Pflanzenmaterials oder der Einsatz von unabhängig replizierenden Shuttle-Vektoren dem Fachmann gut bekannt. Eine durch PEG vermittelte Transformation der Plastide oder eine Agrobacterium-Transformation mit binären Vektoren ist jedoch ebenfalls möglich. Nützliche Marker für die Transformation von Plastiden sind positive Selektionsmarker, zum Beispiel die Gene für Chloramphenicol-, Streptomycin-, Kanamycin-, Neomycin-, Amikamycin-, Spectinomycin-, Triazin- und/oder Lincomycintoleranz. Für eine weitere Selektion eignen sich als zusätzliche Marker in der Literatur häufig als sekundäre Marker angeführte Gene, die für eine Toleranz gegenüber Herbiziden wie Phosphinothricin (= Glufosinat, BASTA^TM, Liberty^TM, codiert vom bar-Gen), Glyphosat (= N-(Phosphonomethyl)glycin, Roundup^TM, codiert vom 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegen = epsps), Sulfonylharnstoffe (wie Staple^TM, codiert vom Acetolactatsynthasegen (ALS-Gen)), Imidazolinone [= IMI, wie Imazethapyr, Imazamox, Clearfield^TM, codiert vom Acetohydroxysäuresynthasegen (AHAS-Gen), das auch als Acetolactatsynthasegen (ALS-Gen) bekannt ist], oder Bromoxynil (= Buctril^TM, codiert vom oxy-Gen) codieren, oder Gene, die für Antibiotika wie Hygromycin oder G418 codieren. Solche sekundären Marker eignen sich in den Fällen, bei denen die meisten Genomkopien transformiert sind. Darüber hinaus sind auch negative Selektionsmarker wie die bakterielle Cytosindeaminase (codiert durch das codA-Gen) für die Transformation von Plastiden geeignet.
In einer Ausführungsform wird also eine Aktivität, die im vorliegenden Text als von einem Polypeptid gemäß Tabelle II vermittelt beschrieben wird, dadurch erhöht oder erzeugt, dass das Polypeptid gemäß Tabelle II oder ein Polypeptid, das dieselbe Aktivität vermittelt, mit einem wie im vorliegenden Text beschriebenen Zielsteuerungssignal verbunden wird, wenn in Spalte 6 von Tabelle II der Begriff „plastidär” für dieses Polypeptid angeführt ist. So kann zum Beispiel das beschriebene Polypeptid mit dem Zielsteuerungssignal gemäß Tabelle VII verbunden werden.
Demgemäß codiert in dem Verfahren der Erfindung zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze, das Transformieren einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzenzellkerns oder eines Pflanzengewebes mit dem erwähnten Nukleinsäuremolekül umfasst, das Nukleinsäuremolekül, das aus der erwähnten Gruppe ausgewählt ist, für ein Polypeptid, das diese Aktivität vermittelt und das mit einem Zielsteuerungssignal wie hierin erwähnt, zum Beispiel wie in Tabelle VII erwähnt, verbunden ist, wenn zum Beispiel in Spalte 6 von Tabelle II der Begriff „plastidär” für das codierte Polypeptid angeführt ist.
Um die Möglichkeiten zur Identifizierung von Transformanten zu erhöhen, ist es außerdem wünschenswert, Reportergene zu verwenden, bei denen es sich nicht um die obenerwähnten Toleranzgene handelt, oder diese zusätzlich zu diesen Genen zu verwenden. Reportergene sind zum Beispiel die Gene für β-Galactosidase, β-Glucuronidase (GUS), alkalische Phosphatase und/oder für das grün fluoreszierende Protein (green-fluorescent Protein, GFP).
Durch Transformieren der Plastiden wird der Transgenfluss innerhalb der Art blockiert, da bei zahlreichen Arten wie Mais, Baumwolle und Reis die Plastiden einem streng mütterlichen Erbgang folgen. Dadurch, dass man das YRP-Gen, z. B. die Gene gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 der Tabelle I der Begriff „plastidär” angegeben ist, oder aktive Fragmente davon in die Plastiden von Pflanzen platziert, werden diese Gene nicht in den Pollen dieser Pflanzen vorliegen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von sogenannten „Chloroplastenlokalisierungssequenzen”, bei denen eine erste RNA-Sequenz bzw. ein erstes RNA-Molekül dazu fähig ist, eine zweite RNA-Sequenz wie z. B. eine von dem YRP-Gen, z. B. den Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, transkribierte RNA-Sequenz oder eine für ein YRP, z. B. das Protein gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, codierende Sequenz von einer externen Umgebung in eine Zelle oder von außerhalb eines Plastids in einen Chloroplasten zu transportieren bzw. zu begleiten („chaperoning”). Gemäß einer Ausführungsform ist das Chloroplastenlokalisierungssignal im Wesentlichen ähnlich oder komplementär zu einer vollständigen bzw. intakten Viroidsequenz, z. B. wenn für das Polypeptid in Spalte 6 der Tabelle II der Begriff ”plastidär” angegeben ist. Das Chloroplastenlokalisierungssignal kann durch eine DNA-Sequenz codiert sein, die in die Chloroplastenlokalisierung-RNA transkribiert wird. Der Ausdruck „Viroid” bezieht sich auf ein natürlich vorkommendes einzelsträngiges RNA-Molekül (Flores, C. R. Acad Sci III. 324 (10), 943 (2001)). Viroide enthalten in der Regel etwa 200–500 Nukleotide und liegen im Allgemeinen als ringförmige Moleküle vor. Beispiele für Viroide, die Chloroplastenlokalisierungssignale enthalten, schließen ASBVd, PLMVd, CChMVd und ELVd ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Die Viroidsequenz oder ein funktioneller Teil davon kann so mit einem YRP-Gen, z. B. den Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, oder einer für ein YRP, z. B. das Protein gemäß in Tabelle II, Spalten 5 und 7, codierenden Sequenz kondensiert sein, dass die Viroidsequenz eine aus einem YRP-Gen, z. B. der Sequenz gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, oder einer für ein YRP, z. B. das Protein gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, codierenden Sequenz transkribierte Sequenz in die Chloroplasten transportiert, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül oder Polynukleotid in Spalte 6 der Tabelle I oder II der Begriff „plastidär angegeben ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform verwendet man ein modifiziertes ASBVd (Navarro et al., Virology. 268 (1), 218 (2000)).
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform werden die in den Plastiden zu exprimierenden Proteine, wie das YRP, z. B. die Proteine gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 9, z. B. wenn für das Polypeptid in Spalte 6 der Tabelle II der Begriff „plastidär” angegeben ist, von unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert. Solch ein Verfahren ist in WO 2004/040973 beschrieben, das hiermit als durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen gilt. In der WO 2004/040973 wird ein Verfahren gelehrt, das sich auf die Translokation einer RNA, die einem Gen oder Genfragment entspricht, in den Chloroplasten mittels einer Chloroplastenlokalisierungssequenz bezieht. Die Gene, die in der Pflanze oder den Pflanzenzellen zu exprimieren sind, werden in Nukleinsäurefragmente gespalten, die in unterschiedliche Kompartimente der Pflanze, wie zum Beispiel den Zellkern, die Plastiden und/oder die Mitochondrien, eingeführt werden. Weiterhin werden Pflanzenzellen beschrieben, in denen der Chloroplast ein Ribozym enthält, das an einem Ende mit einer RNA fusieriert ist, die für ein Fragment eines Proteins, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, codiert, so dass das Ribozym die translozierte Fusions-RNA an die RNA, die für das Genfragment codiert, in trans spleissen kann, um die Nukleinsäurefragmente zu bilden bzw. gegebenenfalls zu einer intakten mRNA wiederzuvereinigen, welche für ein funtionelles Protein, zum Beispiel gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, codiert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte YRP-Gen, z. B, die Nukleinsäuremoleküle gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, z. B. wenn in Spalte 6 der Tabelle I der Begriff „plastidär” angegeben ist, in Plastiden transformiert, die metabolisch aktiv sind. Diese Plastiden sollten vorzugsweise in der interessierenden Pflanze bzw. im interessierenden Pflanzengewebe, ganz besonders bevorzugt in den in grünem Pflanzengewebe wie Blättern oder Kotyledonen oder in Samen anzutreffenden Chloroplasten, eine hohe Kopienzahl aufrechterhalten.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte YRP-Gen, z. B. die Nukleinsäuremoleküle gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, z. B. wenn in Spalte 6 der Tabelle I der Begriff „mitochondrisch” angegeben ist, in Mitochondrien transformiert, die metabolisch aktiv sind.
Um eine gute Expression in den Plastiden zu erzielen, wird das YRP-Gen, z. B. die Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, z. B. wenn in Spalte 6 der Tabelle I der Begriff „plastidär” angegeben ist, vorzugsweise unter Verwendung eines Promoters und eines Terminators, die in Plastiden aktiv sind, bevorzugt eines Chloroplastenpromoters, in eine Expressionskassette eingeführt. Beispiele für solche Promoter schließen den psbA-Promoter aus dem Gen von Spinat oder Erbse, den rbcL-Promoter und den atpB-Promoter aus Mais ein.
Gemäß der Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Pflanzenzelle” bzw. der Ausdruck „Organismus”, so wie er hier verstanden wird, immer auf eine Pflanzenzelle oder ein Organell davon, vorzugsweise einen Plastiden, besonders bevorzugt einen Chloroplasten.
So, wie der Begriff hier verwendet wird, soll „Pflanze” nicht nur eine ganze Pflanze sondern auch Teile davon einschließen, d. h. eine oder mehrere Zellen und Gewebe einschließlich zum Beispiel Blättern, Stängel, Sprosse, Wurzeln, Blüten, Früchte und Samen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die transgene Expression des Saccharomyces cerevisiae-), E. coli-, Synechocystis- oder A. thaliana-YRP, z. B. gemäß Tabelle II, Spalte 3 in einer Pflanze wie zum Beispiel A. thaliana der transgenen Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon verglichen mit einer entsprechenden, zum Beispiel nicht transformierten Wildtyppflanze einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, beispielsweise eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, erhöhte Toleranz gegenüber Dürre, Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder ein anderes erhöhtes Ertragsmerkmal verleiht Demgemäß wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel einer nichttransformierten, Wildtyppflanze vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids umfassend das mit dem Ertrag in Zusammenhang stehende Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 66 bzw. das von dem mit dem Ertrag in Zusammenhang stehenden Nukleinsäuremolekül (oder Gen) umfassend die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO.: 65 oder ein Homolog dieses Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. von Escherichia coli abstammend, codiert wird, erhöht oder erzeugt wird. So wird zum Beispiel die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv gemäß Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in der jeweils gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 oder das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 66 erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) wird in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere findet die Erhöhung plastidär statt.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niederer Temperatur, verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel einer nichttransformierten, Wildtyppflanze vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß Polypeptid SEQ ID NO.: 66 oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 oder zum Beispiel einem Nukleinsäuremolekül, das sich von dieser SEQ ID NO.: 65 durch Austausch des Stopp-Codons TAA gegen TGA unterscheidet, oder eines Homologs von diesem Nukleinsäuremolekül oder Polypeptid, zum Beispiel die Aktivität des Escherichia-coli-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 66 erhöht oder erzeugt wird, zum Beispiel wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv gemäß Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in der jeweils selben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 66 erhöht oder erzeugt wird, oder wenn die Aktivität ”phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt wird, insbesondere wenn das Polypeptid Plastidär lokalisiert ist.
So kann zum Beispiel eine mehr als 1,05-fache, zum Beispiel 1,1-fache bis 10-fache, Ertragserhöhung vermittelt werden. In den Beispielen wird unter Niedertemperaturbedingungen eine 1,222-fache Ertragserhöhung verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze vermittelt.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel einer nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 66 oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 oder einem Nukleinsäuremolekül, das sich von dieser SEQ ID NO.: 65 durch Austausch des Stopp-Codons TAA gegen TGA unterscheidet, oder eines Homologs von diesem Nukleinsäuremolekül oder Polypeptid, zum Beispiel hier die Aktivität des Escherichia-coli-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 66 erhöht oder erzeugt wird, zum Beispiel wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv gemäß Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in der jeweils selben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 66 erhöht oder erzeugt wird, oder wenn die Aktivität ”phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paar) in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt wird, insbesondere wenn das Polypeptid Plastidär lokalisiert ist. In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz vermittelt. So kann zum Beispiel eine mehr als 1,05-fache, zum Beispiel 1,1-fache bis 10-fache, Ertragserhöhung vermittelt werden. In den Beispielen wird unter Stickstoffmangelbedingungen eine 1,358-fache Ertragserhöhung verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze vermittelt.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel einer nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 66 oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 oder ein Nukleinsäuremolekül, das sich von dieser SEQ ID NO.: 65 durch Austausch des Stopp-Codons TAA gegen TGA unterscheidet, oder eines Homologs von diesem Nukleinsäuremolekül oder Polypeptid, zum Beispiel hier die Aktivität des Escherichia-coli-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 66 erhöht oder erzeugt wird, zum Beispiel wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv gemäß Tabelle I, II oder IV, Spalte 7 in der jeweils selben Zeile wie das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 66 erhöht oder erzeugt wird, oder wenn die Aktivität ”phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt wird, insbesondere wenn das Polypeptid Plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, zum Beispiel in Abwesenheit von Nährstoffmangel- sowie Stressbedingungen, vermittelt.
So kann zum Beispiel eine mehr als 1,05-fache, zum Beispiel 1,1-fache bis 10-fache, Ertragserhöhung vermittelt werden. In den Beispielen wird unter Standardbedingungen, zum Beispiel in Abwesenheit von Nährstoffmangel- sowie Stressbedingungen, verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze eine 1,217-fache Ertragserhöhung vermittelt.
Demgemäß wird in einer Ausführungsform ein erhöhter Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel einer nichttransformierten, Wildtyppflanze in dem erfindungsgemäßen Verfahren vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids umfassend das mit dem Ertrag in Zusammenhang stehende Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 150, oder das von dem mit dem Ertrag in Zusammenhang stehenden Nukleinsäuremolekül (oder Gen) umfassend die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO.: 149 codiert wird, oder eines Homologs dieses Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, z. B. von Escherichia coli abgeleitet, erhöht oder erzeugt wird. So wird zum Beispiel die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv gemäß Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in der jeweils gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 oder das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 150 erhöht oder erzeugt, oder die Aktivität „b3293-Protein” wird in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt, insbesondere findet die Erhöhung plastidär statt.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere eine erhöhte Toleranz gegenüber niederer Temperatur, verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel einer nichttransformierten, Wildtyppflanze vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß Polypeptid SEQ ID NO.: 150 oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 oder von einem Homolog dieses Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, zum Beispiel hier die Aktivität des Escherichia-coli-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 150, erhöht oder erzeugt wird, zum Beispiel wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv gemäß Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in der jeweils gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 150 erhöht oder erzeugt wird, oder wenn die Aktivität „b3293-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt wird, insbesondere wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist.
So kann zum Beispiel eine mehr als 1,05-fache, zum Beispiel 1,1-fache bis 10-fache, Ertragserhöhung vermittelt werden. In den Beispielen wird unter Niedertemperaturbedingungen eine 1,372-fache Ertragserhöhung verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze vermittelt.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel einer nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 150 oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 oder von einem Homolog dieses Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, zum Beispiel hier die Aktivität des Escherichia-coli-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 150, erhöht oder erzeugt wird, zum Beispiel wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv gemäß Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in der jeweils gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 150 erhöht oder erzeugt wird, oder wenn die Aktivität „b3293-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt wird, insbesondere wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird eine erhöhte Stickstoffnutzungseffizienz vermittelt.
So kann zum Beispiel eine mehr als 1,05-fache, zum Beispiel 1,1-fache bis 10-fache, Ertragserhöhung vermittelt werden. In den Beispielen wird unter Stickstoffmangelbedingungen eine 1,370-fache Ertragserhöhung verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze vermittelt.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein erhöhter intrinsischer Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel einer nichttransformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids gemäß dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 150 oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 oder von einem Homolog dieses Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, zum Beispiel hier die Aktivität des Escherichia-coli-Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 150, erhöht oder erzeugt wird, zum Beispiel wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv gemäß Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, in der jeweils gleichen Zeile wie das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 bzw. das Polypeptid gemäß SEQ ID NO.: 150 erhöht oder erzeugt wird, oder wenn die Aktivität „b3293-Protein” in einer Pflanzenzelle, Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder erzeugt wird, insbesondere wenn das Polypeptid plastidär lokalisiert ist. In einer Ausführungsform wird ein erhöhter Ertrag unter Standardbedingungen, zum Beispiel in Abwesenheit von Nährstoffmangel- sowie Stressbedingungen, vermittelt. So kann zum Beispiel eine mehr als 1,05-fache, zum Beispiel 1,1-fache bis 10-fache, Ertragserhöhung vermittelt werden. In den Beispielen wird unter Standardbedingungen, zum Beispiel in Abwesenheit von Nährstoffmangel- sowie Stressbedingungen eine 1,262-fache Ertragserhöhung verglichen mit einer entsprechenden nichtmodifizierten, zum Beispiel nichttransformierten, Wildtyppflanze vermittelt.
Die oben angegebenen Verhältnisse beziehen sich insbesondere auf einen erhöhten Ertrag, der tatsächlich als Erhöhung der Biomasse, insbesondere als Frischgewicht-Biomasse der oberirdischen Teile, gemessen wird.
Für die Zwecke der Erfindung ist es beabsichtigt, dass der Plural in der Regel den Singular einschließt und umgekehrt.
Wenn nicht anderweitig angegeben, sind die Begriffe ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäure” und ”Nukleinsäuremolekül” im vorliegenden Kontext austauschbar. Wenn nicht anderweitig angegeben, sind die Begriffe ”Peptid”, ”Polypeptid” und ”Protein” im vorliegenden Kontext austauschbar. Der Begriff ”Sequenz” kann Polynukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäuremoleküle, Peptide, Polypeptide und Proteine betreffen, abhängig vom Zusammenhang, in dem der Begriff ”Sequenz” verwendet wird. Die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden von beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide. Die Begriffe betreffen lediglich die Primärstruktur des Moleküls.
So schließen die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, doppel- und einzelsträngige DNA und/oder RNA ein. Sie beinhalten außerdem bekannte Arten von Modifikationen, zum Beispiel Methylierung, ”Caps” und Substitutionen von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog. Vorzugsweise umfasst die DNA- oder RNA-Sequenz eine Codiersequenz, die das hierin definierte Polypeptid kodiert.
Eine ”Codiersequenz” ist eine Nukleotidsequenz, welche in eine RNA transkribiert wird, z. B. eine regulatorische RNA, wie eine miRNA, eine ta-siRNA, ein Cosuppressionsmolekül, eine RNAi, ein ”Ribozym etc., oder in eine mRNA, die in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Steuerung von geeigneten regulatorischen Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der Codiersequenz werden von einem Translations-Startcodon am 5'-Terminus und einem Translations-Stoppcodon am 3'-Terminus festgelegt. Eine Codiersequenz kann, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, mRNA, cDNA, rekombinante Nukleotidsequenzen oder genomische DNA einschließen, während Introns unter gewissen Umständen ebenfalls vorhanden sein können.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, kann ein Nukleinsäuremolekül auch die untranslatierte Sequenz umfassen, die sich am 3'-Ende und am 5'-Ende der kodierenden Genregion befindet, beispielsweise mindestens 500, vorzugsweise 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts vom 5'-Ende der codierenden Region, und mindestens 100, vorzugsweise 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts vom 3'-Ende der codierenden Genregion. Für den Fall, dass zum Beispiel die Technologie mit Antisense, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym etc. angewandt wird, können sowohl kodierende Regionen als auch die 5'- und/oder 3'-Regionen vorteilhaft verwendet werden.
Allerdings ist es häufig vorteilhaft, für Klonierungs- und Expressionszwecke lediglich die kodierende Region zu wählen.
”Polypeptid” bezieht sich auf ein Aminosäurepolymer (Aminosäuresequenz) und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Moleküls. Somit fallen Peptide und Oligopeptide mit unter die Definition von Polypeptid. Dieser Begriff betrifft oder beinhaltet auch post-translationale Modifikationen des Polypeptids, zum Beispiel Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen. Innerhalb der Definition sind beispielsweise Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (einschließlich zum Beispiel unnatürlicher Aminosäuren, etc.), und Polypeptide mit substituierten Bindungen sowie sonstigen im Fachgebiet bekannten, sowohl natürlich vorkommenden als auch nicht-natürlich vorkommenden, Modifikationen inbegriffen.
Es versteht sich, dass der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle I” den Inhalt von Tabelle IA und Tabelle IB bezeichnet. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle II” soll herangezogen werden, um den Inhalt von Tabelle IIA und Tabelle IIB zu bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IA” soll herangezogen werden, um den Inhalt von Tabelle IA zu bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IB” soll den Inhalt von Tabelle IB bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IIA” soll den Inhalt von Tabelle IIA bezeichnen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IIB” soll den Inhalt von Tabelle IIB bezeichnen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle I” die Tabelle IB. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle II” die Tabelle IIB.
Die Begriffe ”umfassen” oder ”umfassend” und grammatikalische Variationen davon, falls in dieser Beschreibung verwendet, verstehen sich zur Bezeichnung des Vorliegens der angegebenen Merkmale, ganzen Zahlen, Schritte oder Komponenten oder Gruppen davon, aber schließen das Vorliegen oder die Hinzufügung von einem oder mehreren anderen Merkmalen, ganzen Zahlen, Schritten, Komponenten oder Gruppen davon nicht aus.
Gemäß der Erfindung hat ein Protein oder Polypeptid die ”Aktivität eines YRP, z. B. eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins”, wenn seine de novo-Aktivität oder seine erhöhte Expression direkt oder indirekt zu einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress; z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten Ertragsmerkmal verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanze davon führt und diese verleiht und das Protein die obenerwähnten Aktivitäten eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins hat. In der gesamten Beschreibung ist die Aktivität oder vorzugsweise die biologische Aktivität eines solchen Proteins oder Polypeptids oder eines für ein solches Protein oder Polypeptid kodierenden Nukleinsäuremoleküls bzw. einer für ein solches Protein oder Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz identisch oder ähnlich, wenn es noch über die biologische oder enzymatische Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins oder mindestens 10% der ursprünglichen enzymatischen Aktivität, vorzugsweise 20%, 30%, 40%, 50%, besonders bevorzugt 60%, 70%, 80%, ganz besonders bevorzugt 90%, 95%, 98%, 99% verfügt, verglichen mit einem wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Protein von S. cerevisiae oder E. coli oder Synechocystis sp. oder A. thaliana. Gemäß einer anderen Ausführungsform beträgt die biologische oder enzymatische Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins mindestens 101% der ursprünglichen enzymatischen Aktivität, vorzugsweise 110%, 120%, %, 150%, besonders bevorzugt 150%, 200%, 300%, verglichen mit einem wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Protein von S. cerevisiae oder E. coli oder Synechocystis sp. oder A. thaliana.
Die Ausdrücke „erhöht”, „verstärkt”, „ausgeweitet”, „gesteigert”, „verbessert” oder „erweitert” beziehen sich auf eine entsprechende Veränderung einer Eigenschaft in einer Pflanze, einem Organismus, einem Teil eines Organismus wie einem Gewebe, Samen, Wurzeln, Blättern, Blüten usw. oder in einer Zelle und sind austauschbar. Vorzugsweise ist die Gesamtaktivität im Volumen erhöht oder gesteigert in Fällen, bei denen die Erhöhung bzw. Steigerung mit der Erhöhung bzw. Steigerung einer Aktivität eines Genprodukts in Zusammenhang steht, unabhängig davon, ob die Menge an Genprodukt oder die spezifische Aktivität des Genprodukts oder beide erhöht oder gesteigert sind oder ob die Menge, Stabilität oder Translationseffizienz der für das Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenz bzw. des für das Genprodukt kodierenden Gens erhöht oder gesteigert ist.
Der Ausdruck „Erhöhung” bezieht sich auf eine entsprechende Veränderung einer Eigenschaft in einem Organismus oder in einem Teil einer Pflanze, einem Organismus wie einem Gewebe, Samen, Wurzeln, Blättern, Blüten usw. oder in einer Zelle. Vorzugsweise ist die Gesamtaktivität im Volumen erhöht in Fällen, bei denen die Erhöhung mit der Erhöhung einer Aktivität eines Genprodukts in Zusammenhang steht, unabhängig davon, ob die Menge an Genprodukt oder die spezifische Aktivität des Genprodukts oder beide erhöht oder verstärkt sind oder ob die Menge, Stabilität oder Translationseffizienz der für das Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenz bzw. des für das Genprodukt kodierenden Gens erhöht oder verstärkt ist.
Unter „Veränderung einer Eigenschaft” versteht man, dass die Aktivität, das Expressionsniveau oder die Menge eines Genprodukts oder der Metabolitengehalt in einem spezifischen Volumen im Verhältnis zu einem entsprechenden Volumen einer Kontrolle, einer Referenz oder eines Wildtyps verändert ist, einschließlich der de novo-Herstellung der Aktivität oder Expression.
Der Ausdruck „Erhöhung” schließt die Veränderung dieser Eigenschaft nur in Teilen des Gegenstands der vorliegenden Erfindung ein; so kann sich die Modifikation zum Beispiele in einem Kompartiment einer Zelle wie einer Organelle oder in einem Teil einer Pflanze wie Gewebe, Samen, Wurzeln, Blättern, Blüten usw. finden, jedoch nicht nachweisbar sein, wenn man den gesamten Gegenstand, d. h. die gesamte Zelle oder Pflanze, untersucht.
Dementsprechend bedeutet der Ausdruck „Erhöhung”, dass die spezifische Aktivität eines Enzyms sowie die Menge einer Verbindung oder eines Metaboliten, z. B. eines Polypeptids, eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder einer kodierenden mRNA oder DNA vom Volumen her erhöht sein kann.
Folglich sind die Begriffe „Wildtyp”, „Kontrolle” oder „Referenz” austauschbar und können eine Zelle oder ein Teil von Organismen, wie eine Organelle wie z. B. ein Chloroplast oder ein Gewebe, oder ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, sein, welche(r) nicht gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren gemäß der Erfindung modifiziert oder behandelt worden ist. Dementsprechend entspricht die Zelle oder ein Teil von Organismen wie eine Organelle wie z. B. ein Chloroplast oder ein Gewebe, oder ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, die/der als Wildtyp, Kontrolle oder Referenz verwendet wird, der Zelle, dem Organismus, der Pflanze oder dem Teil davon soweit wie möglich und ist in jeder anderen Eigenschaft mit Ausnahme des Ergebnisses des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Gegenstand der Erfindung so identisch wie möglich. Daher wird der Wildtyp, die Kontrolle oder die Referenz identisch oder bestmöglich identisch behandelt, womit besagt wird, dass nur Bedingungen oder Eigenschaften verschieden sein könnten, welche die Qualität der getesteten Eigenschaft nicht beeinflussen.
Vorzugsweise wird jeder Vergleich unter analogen Bedingungen durchgeführt. Der Ausdruck „analoge Bedingungen” bedeutet, dass alle Bedingungen wie zum Beispiel Kultivierungs- bzw. Wachstumsbedingungen, Boden, Nährstoff, Wassergehalt des Bodens, Temperatur, Feuchtigkeit oder Umgebungsluft oder Boden, Assaybedingungen (wie Pufferzusammensetzung, Temperatur, Substrate, Pathogenstamm, Konzentrationen und dergleichen) zwischen den zu vergleichenden Experimenten gleichgehalten werden.
Bei der ”Referenz”, ”Kontrolle” oder dem ”Wildtyp” handelt es sich vorzugsweise um ein Subjekt, z. B. eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe, einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, das nicht gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren der Erfindung modifiziert oder behandelt worden ist und in jedweder anderen Eigenschaft so ähnlich zum Gegenstand der Erfindung ist, wie möglich. Die Referenz, Kontrolle oder der Wildtyp ist hinsichtlich seines Genoms, Transkriptoms, Proteoms oder Metaboloms so ähnlich wie möglich zum Subjekt der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff „Referenz-”, „Kontroll-” oder „Wildtyp-”Organelle, -zelle, -gewebe oder -organismus, insbesondere -Pflanze, auf ein Organell, Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, welche (s, r) zu dem Organell, der Zelle, dem Gewebe oder Organismus, insbesondere Pflanze, der vorliegenden Erfindung, oder einem Teil davon, beinahe genetisch identisch ist, und zwar vorzugsweise zu 95%, weiter bevorzugt zu 98%, noch weiter bevorzugt zu 99,00%, insbesondere 99,10%, 99,30%, 99,50%, 99,70%, 99,90%, 99,99%, 99,999% oder mehr. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei der „Referenz”, der „Kontrolle” bzw. dem „Wildtyp” um ein Objekt, z. B. ein Organell, eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, die/das/der genetisch identisch ist mit dem Organismus, insbesondere der Pflanze, der Zelle, einem Gewebe oder einem Organell, der/die/das gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, wobei allerdings die verantwortlichen bzw. Aktivität verleihenden Nukleinsäuremoleküle oder das durch sie kodierte Genprodukt gemäß dem Verfahren der Erfindung ergänzt, manipuliert, ausgetauscht oder eingeführt ist/sind.
Kann eine Kontrolle, eine Referenz bzw. ein Wildtyp, die bzw. der sich vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung nur dadurch unterscheidet, dass sie/er nicht Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, nicht bereitgestellt werden, so kann es sich bei einer Kontrolle, einer Referenz bzw. einem Wildtyp um einen Organismus handeln, bei dem die Ursache für die Modulation einer die im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder einen erhöhten Ertrag verleihenden Aktivität oder die Expression des wie hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküls der Erfindung zurück- oder abgeschaltet worden ist, z. B. durch Eliminieren der Expression des verantwortlichen Genprodukts, z. B. durch Antisense-Inhibierung, durch Deaktivierung eines Aktivators oder Agonisten, durch Aktivierung eines Inhibitors oder Antagonisten, durch Inhibierung durch Zugabe hemmender Antikörper, durch Zugabe von Wirkstoffen wie z. B. Hormonen, durch Einführung negativ dominanter Mutanten usw. Eine Genproduktion kann zum Beispiel eliminiert werden, indem man deaktivierende Punktmutationen einführt, die eine Inhibierung der enzymatischen Aktivität oder eine Destabilisierung oder eine Inhibierung der Fähigkeit zur Bindung von Cofaktoren usw. zur Folge haben.
Folglich ist das bevorzugte Referenzsubjekt das Ausgangssubjekt des vorliegenden Verfahrens der Erfindung. Vorzugsweise werden die Referenz und der Gegenstand der Erfindung nach Standardisierung und Normalisierung z. B. auf die Menge an Gesamt-RNA, -DNA oder -Protein oder der Aktivität oder Expression von Referenzgenen wie Housekeeping-Genen wie z. B. Ubiquitin, Actin oder Ribosomen Proteinen miteinander verglichen.
Die Erhöhung bzw. Modulation gemäß der vorliegenden Erfindung kann konstitutiv sein, z. B. aufgrund einer stabilen permanenten transgenen Expression oder einer stabilen Mutation in dem entsprechenden endogenen Gen, das für das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert, oder einer Modulation der Expression oder des Verhaltens eines Gens, das die Expression des Polypeptids der Erfindung verleiht, oder transient, z. B. aufgrund einer transienten Transformation oder eines zeitweiligen Zusatzes eines Modulators wie einem Agonisten oder Antagonisten, oder induzierbar, z. B. nach einer Transformation mit einem induzierbaren Konstrukt, das das Nukleinsäuremolekül der Erfindung unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters trägt, und Zugabe des Induktors, z. B. Tetracyclin, oder wie hier unten beschrieben.
Die Erhöhung der Aktivität des Polypeptids beläuft sich in einer Zelle, einem Gewebe, einem Organell, einem Organ oder einem Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, oder einem Teil davon bevorzugt auf mindestens 5%, vorzugsweise auf mindestens 20% oder auf mindestens 50%, besonders bevorzugt auf mindestens 70%, 80%, 90% oder mehr, ganz besonders bevorzugt auf mindestens 100%, 150% oder 200%, am meisten bevorzugt auf mindestens 250% oder mehr im Vergleich zur Kontrolle, zur Referenz bzw. zum Wildtyp. Gemäß einer Ausführungsform bedeutet der Ausdruck Erhöhung die Erhöhung der Menge in Bezug auf das Gewicht des Organismus oder eines Teils davon (w/w).
Gemäß einer Ausführungsform tritt die Erhöhung der Aktivität des Polypeptids in einer Organelle wie einem Plastid auf. Gemäß einer anderen Ausführungsform tritt die Erhöhung der Aktivität des Polypeptids im Zytoplasma auf.
Die spezifische Aktivität eines durch ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kodierten Polypeptids oder des Polypeptids der vorliegenden Erfindung lässt sich wie in den Beispielen beschrieben untersuchen. Insbesondere die Expression eines betreffenden Proteins in einer Zelle, z. B. einer Pflanzenzelle, im Vergleich zu einer Kontrolle ist ein einfacher Test und kann wie im Stand der Technik beschrieben durchgeführt werden.
Der Ausdruck „Erhöhung” schließt ein, dass eine Verbindung oder eine Aktivität, insbesondere eine Aktivität, de novo in eine Zelle, das Zytoplasma oder ein subzelluläres Kompartiment oder eine Organelle eingeführt wird, oder dass die Verbindung oder die Aktivität, insbesondere eine Aktivität, zuvor nicht nachweisbar war, also in anderen Worten „erzeugt” wurde.
Dementsprechend umfasst im Folgenden der Ausdruck „Erhöhen” auch den Ausdruck „Erzeugen” oder „Stimulieren”. Die erhöhte Aktivität manifestiert sich in erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erhöhten Ertragsmerkmal verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon.
Die Sequenz von B1399 aus Escherichia coli, z. B. gemäß Spalte 5 von Tabelle I, wurde veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerivisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen aus E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Ihre Aktivität wurde als „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) beschrieben.
Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Herstellung der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität „‚phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein’ (paaX)” aus Escherichia coli oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon verleiht, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 von Tabelle I, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie das B1399 steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon gemäß Spalte 7 von Tabelle I, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent gemäß Spalte 7 von Tabelle IB, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie das B1399 steht, z. B. plastidär, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv gemäß Spalte 5 von Tabelle II beziehungsweise Spalte 7 von Tabelle IV, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie das B1399 steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon gemäß Spalte 7 von Tabelle II, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent gemäß Spalte 7 von Tabelle IIB, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie das B1399 steht, z. B. plastidär, umfassenden Polypeptids.

Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „‚phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein’ (paaX)” beschriebenen Aktivität handelt, plastidär erhöht oder erzeugt.
Die Sequenz von B3293 aus Escherichia coli, z. B. gemäß Spalte 5 von Tabelle I, wurde veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerivisiae wurden in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) veröffentlicht, Sequenzen aus E. coli wurden in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) veröffentlicht. Ihre Aktivität wurde als b3293-Protein beschrieben.
Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag gemäß einer Ausführungsform die Erhöhung oder Herstellung der Aktivität eines Genprodukts, das die Aktivität eines „b3293-Proteins” aus Escherichia coli oder einem funktionellen Äquivalent davon oder einem Homolog davon verleiht, z. B. die Erhöhung

(a) eines Genprodukts eines Gens, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 von Tabelle I, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie das B3293 steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon gemäß Spalte 7 von Tabelle I, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent gemäß Spalte 7 von Tabelle IB, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie das B3293 steht, z. B. plastidär, umfasst; oder
(b) eines ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv gemäß Spalte 5 von Tabelle II beziehungsweise Spalte 7 von Tabelle IV, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie das B3293 steht, oder ein funktionelles Äquivalent oder ein Homolog davon gemäß Spalte 7 von Tabelle II, vorzugsweise ein Homolog oder funktionelles Äquivalent gemäß Spalte 7 von Tabelle IIB, welches in der gleichen entsprechenden Zeile wie das B3293 steht, z. B. plastidär umfassenden Polypeptids.

Gemäß einer Ausführungsform wird das Molekül, dessen Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erhöhen ist und bei dem es sich um das Genprodukt mit einer als „b3293-Protein” beschriebenen Aktivität handelt, plastidär erhöht oder erzeugt.
Insbesondere wurde beobachtet, dass bei A. thaliana dieses Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das von einem Gen umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 65 codiert wird, zum Beispiel mit der Aktivität eines „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX), einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, vermittelte. Es wurde weiterhin beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit dieser Aktivität eines „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX), das von einem Gen umfassend die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 65 codiert wird, in A. thaliana eine Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel erhöhte Toleranz gegen niedere Temperatur, verglichen mit der Wildtypkontrolle vermittelte. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das von einem Gen umfassend die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 65 codiert wird, und das wie in Tabelle I, Spalte 6, lokalisiert ist, z. B. Plastider, in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) eine Toleranz gegenüber niederer Temperatur vermittelte.
Insbesondere wurde beobachtet, dass in A. thaliana dieses Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das von einem Gen umfassend das Nukleinsäuremolekül gemäß SEQ ID NO.: 149 codiert wird, zum Beispiel mit der Aktivität eines „b3293-Proteins” einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, vermittelte. Es wurde weiterhin beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts mit dieser Aktivität eines „b3293”-Proteins, das von einem Gen umfassend die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 149 codiert wird, in A. thaliana eine Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber niederer Temperatur, verglichen mit der Wildtypkontrolle vermittelte. Insbesondere wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines Genprodukts, das von einem Gen umfassend die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 149 codiert wird, und das wie in Tabelle I, Spalte 6, lokalisiert ist, z. B. Plastider, in A. thaliana, zum Beispiel mit der Aktivität eines „b3293-Proteins” eine Toleranz gegenüber niederer Temperatur vermittelte.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIIa gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von dem in Tabelle VIIIa gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls in A. thaliana eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, z. B. eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung, verglichen mit der Wildtypkontrolle, verleiht. Gemäß einer Ausführungsform wird somit ein in Tabelle VIIIa aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen in Tabelle I aufgeführtes Homolog oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Effizienz der Nährstoffausnutzung, z. B. der Erhöhung der Effizienz der Stickstoffausnutzung, der Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle eingesetzt.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIIb gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von einem in Tabelle VIIIb gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls in A. thaliana eine erhöhte Toleranz gegenüber Stress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, verglichen mit der Wildtypkontrolle, verleiht. Gemäß einer Ausführungsform wird somit ein in Tabelle VIIIb aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen in Tabelle I aufgeführtes Homolog oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Toleranz gegenüber Stress, z. B. der Erhöhung der Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, einer Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle eingesetzt.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIIc gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von einem in Tabelle VIIIc gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls in A. thaliana eine erhöhte Toleranz gegenüber Stress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber zyklischer Dürre, verglichen mit der Wildtypkontrolle, verleiht. Gemäß einer Ausführungsform wird somit ein in Tabelle VIIIc aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen in Tabelle I aufgeführtes Homolog oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Toleranz gegenüber Stress, z. B. der Erhöhung der Toleranz gegenüber zyklischer Dürre, einer Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle eingesetzt.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIId gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von einem in Tabelle VIIId gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls in A. thaliana einen erhöhten intrinsischen Ertrag, z. B. eine erhöhte Biomasse unter Standardbedingungen, z. B. eine erhöhte Biomasse unter Nicht-Mangel- oder Nicht-Stress-Bedingungen, verglichen mit der Wildtypkontrolle, verleiht. Gemäß einer Ausführungsform wird somit ein in Tabelle VIIId aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen in Tabelle I aufgeführtes Homolog oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung des intrinsischen Ertrags, z. B. zur Erhöhung des Ertrags unter Standardbedingungen, z. B. eine erhöhte Biomasse unter Nicht-Mangel- oder Nicht-Stress-Bedingungen, einer Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle eingesetzt.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIIa gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von einem in Tabelle VIIIa gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls in A. thaliana eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, z. B. eine erhöhte Effizienz der Stickstoffausnutzung, verglichen mit der Wildtypkontrolle, verleiht. Gemäß einer Ausführungsform wird somit ein in Tabelle VIIIa aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen in Tabelle I aufgeführtes Homolog oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Effizienz der Nährstoffausnutzung, z. B. der Erhöhung der Effizienz der Stickstoffausnutzung, der Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle eingesetzt.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIIb gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von einem in Tabelle VIIIb gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls in A. thaliana eine erhöhte Toleranz gegenüber Stress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, verglichen mit der Wildtypkontrolle, verleiht. Gemäß einer Ausführungsform wird somit ein in Tabelle VIIIb aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen in Tabelle I aufgeführtes Homolog oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Toleranz gegenüber Stress, z. B. der Erhöhung der Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, einer Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle eingesetzt.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIIc gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von einem in Tabelle VIIIc gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls in A. thaliana eine erhöhte Toleranz gegenüber Stress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber zyklischer Dürre, verglichen mit der Wildtypkontrolle, verleiht. Gemäß einer Ausführungsform wird somit ein in Tabelle VIIIc aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen in Tabelle I aufgeführtes Homolog oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Toleranz gegenüber Stress, z. B. der Erhöhung der Toleranz gegenüber zyklischer Dürre, einer Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle eingesetzt.
Es wurde weiterhin beobachtet, dass man durch Erhöhen oder Erzeugen der Aktivität eines in Tabelle VIIId gezeigten YRP-Gens, z. B. eines von einem in Tabelle VIIId gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleiteten Nukleinsäuremoleküls in A. thaliana einen erhöhten intrinsischen Ertrag, z. B. eine erhöhte Biomasse unter Standardbedingungen, z. B. eine erhöhte Biomasse unter Nicht-Mangel- oder Nicht-Stress-Bedingungen, verglichen mit der Wildtypkontrolle, verleiht. Gemäß einer Ausführungsform wird somit ein in Tabelle VIIId aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen in Tabelle I aufgeführtes Homolog oder das Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung des intrinsischen Ertrags, z. B. zur Erhöhung des Ertrags unter Standardbedingungen, z. B. eine erhöhte Biomasse unter Nicht-Mangel- oder Nicht-Stress-Bedingungen, einer Pflanze verglichen mit der Wildtypkontrolle eingesetzt.
Der Ausdruck ”Expression” bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation eines codogenen Gensegmentes oder Gens. In der Regel handelt es sich bei dem erhaltenen Produkt um eine mRNA oder ein Protein. Expressionsprodukte können jedoch auch funktionelle RNAs wie zum Beispiel Antisense, Nukleinsäuren, tRNAs, snRNAs, rRNAs, RNAi, siRNA, Ribozyme usw. einschließen. Die Expression kann systemisch, lokal oder zeitweilig erfolgen, zum Beispiel eingeschränkt auf bestimmte Zelltypen, Gewebe, Organe oder Organellen oder Zeitperioden.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere der folgenden Schritte

(a) die Stabilisierung eines Proteins, das die erhöhte Expression eines YRP, z. B. eines durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierten Proteins oder des Polypeptids der Erfindung mit der hier erwähnten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX), verleiht und erhöhten Ertrag, z. B. mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze vom Wildtyp oder einem Teil davon, verleiht;
(b) die Stabilisierung einer mRNA, die die erhöhte Expression eines durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierten Proteins oder dessen Homologe verleiht, oder einer mRNA, die für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung mit der hier erwähnten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in (a) erwähnten Aktivitäten aufweist, und einen erhöhten Ertrag, z. B. mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleiht;
(c) die Erhöhung der spezifischen Aktivität eines Proteins, das die erhöhte Expression eines YRP, z. B. eines durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierten Proteins oder des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verleiht oder die inhibitorische Regulation des Polypeptids der Erfindung vermindert;
(d) die Herstellung oder Erhöhung der Expression eines endogenen oder künstlichen Transkriptionsfaktors, der die Expression eines Proteins vermittelt, welches die erhöhte Expression eines YRP, z. B. eines durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierten Proteins oder des Polypeptids der Erfindung mit der hier erwähnten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in (a) erwähnten Aktivitäten aufweist, und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleiht;
(e) die Stimulierung der Aktivität eines Proteins, welches die erhöhte Expression eines YRP, z. B. eines durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kodierten Proteins oder eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit der hier erwähnten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in (a) erwähnten Aktivitäten aufweist, und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleiht durch Hinzufügen eines oder mehrerer exogener induzierender Faktoren zu dem Organismus oder Teilen davon;
(f) die Expression eines transgenen Gens, das für ein Protein kodiert, welches die erhöhte Expression eines YRP, z. B. eines durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kodierten Polypeptids oder eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit der hier erwähnten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in (a) erwähnten Aktivitäten aufweist, und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleiht; und/oder
(g) die Erhöhung der Kopienzahl eines Gens, welches die erhöhte Expression eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein YRP, z. B. ein durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiertes Polypeptid oder das Polypeptid der Erfindung mit der hier erwähnten Aktivität, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in (a) erwähnten Aktivitäten aufweist, und einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleiht;
(h) die Erhöhung der Expression des endogenen Gens, das für das YRP, z. B. ein Polypeptid der Erfindung oder seine Homologe kodiert, durch Zugabe von positiven Expressionselementen oder durch Entfernen von negativen Expressionselementen; so lassen sich z. B. mit homologer Rekombination entweder positive Regulationselemente, wie für Pflanzen der 35S-Enhancer, in den Promoter einführen oder Repressorelemente aus regulatorischen Regionen entfernen. Weiterhin lassen sich Methoden zur Genumwandlung anwenden, um Repressorelemente zu stören oder um die Aktivität positiver Elemente zu steigern – positive Elemente lassen sich durch T-DNA oder Transposonmutagenese ungezielt in Pflanzen einführen, und die Linien, bei denen die positiven Elemente in der Nähe eines erfindungsgemäßen Gens integriert worden sind und deren Expression daher gesteigert ist, können identifiziert werden; und/oder
(i) die Modulierung der Wachstumsbedingungen der Pflanze derart, dass die Expression oder Aktivität des für das YRP, z. B. ein Protein der Erfindung kodierenden Gens oder das Protein selbst gesteigert ist;
(j) die Auswahl von Organismen mit besonders hoher Aktivität der Protein der Erfindung aus natürlichen oder aus mutagenisierten Quellen und deren Züchtung in die Zielorganismen, z. B. die Elite-Kulturpflanzen.

Vorzugsweise wird die mRNA durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kodiert, und/oder das Protein, das die erhöhte Expression eines durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung alleine oder in Verbindung mit einer Transitnukleinsäuresequenz bzw. einer für das Transitpeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins oder des Polypeptids mit der hier erwähnten Aktivität verleiht, z. B. mit einem erhöhten Ertrag, z. B. mit einem erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon nach Erhöhen der Expression oder Aktivität des kodierten Polypeptids verleiht oder die Aktivität eines Polypeptids mit einer Aktivität wie das Protein II, gemäß Spalte 3 oder dessen Homologen hat.
Im Allgemeinen korreliert die Menge an mRNA oder Polypeptid in einer Zelle oder einem Kompartiment eines Organismus mit der Menge an kodiertem Protein und somit mit der Gesamtaktivität des kodierten Proteins in diesem Volumen. Diese Korrelation ist nicht immer linear, und die Aktivität in dem Volumen hängt von der Stabilität der Moleküle oder dem Vorhandensein aktivierender oder inhibierender Cofaktoren ab. Weiterhin sind Produkt- und Eduktinhibierungen von Enzymen gut bekannt und in Lehrbüchern, z. B. Stryer, Biochemistry, beschrieben.
Im Allgemeinen korreliert die Menge an mRNA, Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül in einer Zelle oder einem Kompartiment eines Organismus mit der Menge an kodiertem Protein und somit mit der Gesamtaktivität des kodierten Proteins in diesem Volumen. Diese Korrelation ist nicht immer linear, sondern die Aktivität in dem Volumen ist abhängig von der Stabilität der Moleküle, dem Abbau der Moleküle oder der Gegenwart von aktivierenden oder inhibierenden Cofaktoren. Weiterhin sind Produkt- und Eduktinhibierungen von Enzymen gut bekannt, z. B. Zinser et al. „Enzyminhibitoren"/Enzyme inhibitors".
Die Aktivität der obenerwähnten Proteine und/oder Polypeptide, die durch das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kodiert werden, lässt sich auf verschiedene Weisen erhöhen. So wird zum Beispiel die Aktivität in einem Organismus oder in einem Teil davon wie einer Zelle erhöht, indem man die Anzahl an Genprodukten erhöht, z. B. durch Erhöhen der Expressionsrate, wie der Einführung eines stärkeren Promoters, oder durch Erhöhen der Stabilität der exprimierten mRNA, wodurch die Translationsrate erhöht wird, und/oder durch Erhöhen der Stabilität des Genprodukts, wodurch die Anzahl der zerfallenen Proteine reduziert wird. Weiterhin kann man die Aktivität oder den Umsatz von Enzymen so beeinflussen, dass eine Abnahme oder Zunahme der Reaktionsrate oder eine Modifikation (Abnahme oder Zunahme) der Affinität zu den Substratergebnissen erreicht wird. Eine Mutation im katalytischen Zentrum eines Polypeptids der Erfindung, z. B. als Enzym, kann die Umsatzrate des Enzyms modulieren, ein Eliminieren einer essentiellen Aminosäure zum Beispiel kann eine verminderte oder vollständig abgeschaltete Aktivität des Enzyms zur Folge haben, oder die Deletion oder Mutation von Regulator-Bindungsstellen kann eine negative Regulation wie eine Rückkopplungsinhibierung (oder eine Substratinhibierung, wenn die Substratkonzentration ebenfalls erhöht wird) reduzieren. Die spezifische Aktivität eines Enzyms der vorliegenden Erfindung lässt sich so erhöhen, dass die Umsatzrate erhöht ist oder die Bindung eines Cofaktors verbessert ist. Durch eine Verbesserung der Stabilität der kodierenden mRNA oder des Proteins lässt sich auch die Aktivität eines Genprodukts erhöhen. Die Stimulierung der Aktivität fällt ebenfalls unter den Umfang des Ausdrucks ”erhöhte Aktivität”.
Außerdem kann man die Regulation der obenerwähnten Nukleinsäuresequenzen so modifizieren, dass die Genexpression erhöht wird. Dies lässt sich vorteilhaft mit Hilfe von heterologen regulatorischen Sequenzen erreichen, oder indem man die vorhandenen natürlichen regulatorischen Seqenzen modifiziert, zum Beispiel mutiert. Die vorteilhaften Methoden können auch miteinander kombiniert werden.
Im Allgemeinen lässt sich eine Aktivität eines Genprodukts in einem Organismus oder einem Teil davon, insbesondere in einer Pflanzenzelle oder einer Organelle einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Pflanzengewebe oder einem Teil davon oder in einem Mikroorganismus erhöhen, indem man die Menge an spezifisch kodierender mRNA oder des entsprechenden Proteins in diesem Organismus oder einem Teil davon erhöht. ”Menge an Protein oder mRNA” ist so zu verstehen, dass damit die Molekülzahl an Polypeptiden oder mRNA-Molekülen in einem Organismus, insbesondere einer Pflanze, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment gemeint ist. Eine ”Erhöhung” der Menge eines Proteins bedeutet die quantitative Erhöhung der Molekülzahl dieses Proteins in einem Organismus, insbesondere einer Pflanze, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment wie einer Organelle wie z. B. einem Plastid oder Mitochondrien oder einem Teil davon – zum Beispiel durch eine der hier unten beschriebenen Methoden – im Vergleich zu einem Wildtyp, einer Kontrolle oder einer Referenz.
Die Erhöhung der Molekülzahl beläuft sich vorzugsweise auf mindestens 1%, vorzugsweise auf mehr als 10%, besonders bevorzugt auf 30% oder mehr, insbesondere bevorzugt auf 50%, 70% oder mehr, ganz insbesondere bevorzugt auf 100%, ganz besonders bevorzugt auf 500% oder mehr. Eine de-novo-Expression wird jedoch ebenfalls als Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrachtet.
Eine Modifikation, d. h. eine Erhöhung, kann durch endogene oder exogene Faktoren bewirkt werden. So kann zum Beispiel eine Erhöhung der Aktivität in einem Organismus oder einem Teil davon herbeigeführt werden, indem man ein Genprodukt oder eine Vorstufe davon oder einen Aktivator oder einen Agonisten zum Medium oder der Nahrung gibt, oder sie kann herbeigeführt werden, indem man diese Gegenstände transient oder stabil in einen Organismus einführt. Weiterhin lässt sich eine solche Erhöhung durch die Einführung der erfinderischen Nukleinsäuresequenz oder des kodierten Proteins in das korrekte Zellkompartiment, zum Beispiel in den Kern oder das Zytoplasma oder in Plastide entweder durch Transformation und/oder durch Targeting erzielen.
Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck „zytoplasmatisch” bedeuten, dass die erfindungsgemäße Nukleinsäure ohne Zusatz einer nicht-natürlichen, für ein Transitpeptid Codiersequenz exprimiert wird. Eine nicht-natürliche, für ein Transitpeptid Codiersequenz ist eine Sequenz, die nicht ein natürlicher Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist, sondern vielmehr durch Schritte molekularer Manipulation, wie zum Beispiel in den Beispielen unter ”Expression mit Zielsteuerung an die Plastiden” beschrieben, angefügt wurde. Der Ausdruck „zytoplasmatisch” soll daher eine gezielte Lokalisierung der Produkte der erfinderischen Nukleinsäuresequenzen in einem beliebigen Zellkompartiment aufgrund ihrer natürlich vorkommenden Sequenzeigenschaften nicht ausschließen.
Gemäß einer Ausführungsform erreicht man den erhöhten Ertrag, z. B. erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle in der Wildtyppflanze oder einem Teil davon, z. B. in einer Zelle, einem Gewebe, einem Organ, einem Organell, dem Zytoplasma usw., indem man die endogene Konzentration des Polypeptids der Erfindung erhöht. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, bei dem man die Genkopienzahl eines für das Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierenden Gens erhöht. Weiterhin lässt sich die endogene Konzentration des Polypeptids der Erfindung zum Beispiel erhöhen, indem man die transkriptionelle oder translationale Regulation des Polypeptids modifiziert.
Gemäß einer Ausführungsform lässt sich der erhöhte Ertrag, z. B. erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal in der Pflanze oder einem Teil davon durch gezielte oder zufällige Mutagenese der endogenen erfindungsgemäßen Gene verändern. So lassen sich zum Beispiel mit homologer Rekombination entweder positive Regulationselemente, wie für Pflanzen der 35S-Enhancer, in den Promoter einführen oder Repressorelemente aus regulatorischen Regionen entfernen. Darüber hinaus können bei der Genumwandlung wie z. B. von Kochevenko und Willmitzer (Plant Physiol. 132 (1), 174 (2003)) und in den darin angeführten Literaturstellen beschriebene Methoden angewendet werden, um Repressorelemente zu stören oder um die Aktivität positiver regulatorischer Elemente zu steigern.
Weiterhin lassen sich positive Elemente durch T-DNA oder Transposonmutagenese ungezielt in (Pflanzen-)Genome einführen, und die Linien, bei denen die positiven Elemente in der Nähe eines erfindungsgemäßen Gens integriert worden sind und deren Expression daher gesteigert ist, können identifiziert werden. Die Aktivierung von Pflanzengenen durch statistische Integrationen von Enhancer-Elementen wurde von Hayashi et al. (Science 258, 1350 (1992)) oder Weigel et al. (Plant Physiol. 122, 1003 (2000)) und anderen dort aufgeführten beschrieben.
Reverse genetische Strategien zur Identifizierung von Insertionen (die gegebenenfalls die Aktivierungselemente tragen) in der Nähe der interessierenden Gene wurden verschiedentlich. beschrieben, z. B. Krysan et al. (Plant Cell 11, 2283 (1999)); Sessions et al. (Plant Cell 14, 2985 (2002)); Young et al. (Plant Physiol. 125, 513 (2001)); Koprek et al. (Plant J. 24, 253 (2000)); Jeon et al. (Plant J. 22, 561 (2000)); Tissier et al. (Plant Cell 11, 1841 (1999)); Speulmann et al. (Plant Cell 11, 1853 (1999)). Kurz gesagt, wird Material aus allen Pflanzen einer großen durch T-DNA oder Transposon mutagenisierten Pflanzenpopulation geerntet und genomische DNA wird präpariert. Die genomische DNA wird dann nach spezifischen Architekturen wie zum Beispiel in Krysan et al. (Plant Cell 11, 2283 (1999)) beschrieben gepoolt. Die Pools der genomischen DNAs werden dann mittels spezifischer Multiplex-PCR-Reaktionen, mit denen die Kombination des insertierten Mutagens (z. B. T-DNA oder Transposon) und des interessierenden Gens nachgewiesen wird, gescreent. Daher werden PCR-Reaktionen an den DNA-Pools mit spezifischen Kombinationen von T-DNA- oder Transposon-Border-Primern und genspezifischen Primern ausgeführt. Allgemeine Richtlinien für die Entwicklung von Primern finden sich wiederum bei Krysan et al. (Plant Cell 11, 2283 (1999)). Ein erneutes Screening von DNA-Pools mit geringeren Konzentrationen führt zur Identifizierung von einzelnen Pflanzen, bei denen das interessierende Gen durch das insertierte Mutagen aktiviert ist. Die Verstärkung von positiven regulatorischen Elementen oder die Störung oder Schwächung von negativen regulatorischen Elementen lässt sich auch durch herkömmliche Mutagenesetechniken erreichen: Die Herstellung von chemisch oder durch Strahlung mutierten Populationen ist ein herkömmliches, dem Fachmann bekanntes Verfahren. Methoden für Pflanzen wurden von Koorneef et al. (Mutat Res. Mar. 93 (1) (1982)) und in den darin angeführten Literaturstellen und von Lightner und Caspar in „Methods in Molecular Biology", Band 82, beschrieben. Bei diesen Techniken induziert man gewöhnlich Punktmutationen, die sich in jedem bekannten Gen unter Anwendung von Methoden wie TILLING (Colbert et al., Plant Physiol, 126, (2001)) identifizieren lassen.
Dementsprechend lässt sich das Expressionsniveau erhöhen, wenn die endogenen Gene, die für ein Polypeptid kodieren, das eine erhöhte Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verleiht, insbesondere Gene, die das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfassen, durch homologe Rekombination, Tilling-Ansätze oder Genumwandlung modifiziert werden. Es ist außerdem möglich, wie hier erwähnt den erfindungsgemßen Nukleinsäuresequenzen Targetingsequenzen zuzufügen.
Falls gewünscht sind regulatorische Sequenzen zusätzlich zu einer Targetsequenz oder einem Teil davon operativ an die kodierende Region eines endogenen Proteins gebunden und steuern dessen Transkription und Translation oder die Stabilität bzw. den Abbau der kodierenden mRNA oder des exprimierten Proteins. Zum Modifizieren und zur Steuerung der Expression kann man Promotor, UTRs, Spleißstellen, Verarbeitungssignale, Polyadenylierungsstellen, Terminatoren, Enhancer, Repressoren, posttranskriptionelle oder posttranslationale Modifikationstellen verändern, hinzufügen oder ergänzen. Die Aktivierung von Pflanzengenen durch statistische Integrationen von Enhancer-Elementen zum Beispiel wurde von Hayashi et al. (Science 258, 1350 (1992)) oder Weigel et al. (Plant Physiol. 122, 1003 (2000)) und anderen dort aufgeführten beschrieben. Man kann zum Beispiel die Expressionsniveaus des endogenen Proteins modulieren, indem man den endogenen Promoter durch einen stärkeren transgenen Promoter ersetzt oder die endogene 3'UTR durch eine 3'UTR ersetzt, die für eine bessere Stabilität sorgt, ohne dabei die kodierende Region zu ändern. Weiterhin lässt sich die transkriptionelle Regulation wie in den Beispielen beschrieben durch Einführen eines künstlichen Transkriptionsfaktors modulieren. Alternative Promoter, Terminatoren und UTR sind unten beschrieben.
Die Aktivierung eines endogenen Polypeptids mit der obenerwähnten Aktivität, z. B. mit der Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins oder des Polypeptids der Erfindung, z. B. die Verleihung erhöhten Ertrags, z. B. erhöhten Ertragsmerkmals, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, eines erhöhten intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, nach einer Expressionserhöhung oder Aktivitätserhöhung im Zytoplasma und/oder in einer Organelle wie z. B. einem Plastid lässt sich auch erhöhen, indem man einen synthetischen Transkriptionsfaktor einführt, der in unmittelbarer Nähe zur kodierenden Region des für das wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigte Protein kodierenden Gens bindet und dessen Transkription aktiviert. Es lässt sich ein chimäres Zinkfingerprotein konstruieren, welches eine spezifische DNA-bindende Domäne und eine Aktivierungsdomäne z. B. die VP16-Domäne des Herpes-Simplex-Virus umfasst. Die spezifische Bindungsdomäne kann an die regulatorische Region des für das wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigte Protein kodierenden Gens binden. Die Expression des chimären Transkriptionsfaktors in einem Organismus, insbesondere in einer Pflanze, hat eine spezifische Expression des wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten Proteins zur Folge. Die Methoden dafür sind dem Fachmann bekannt und/oder z. B. in WO01/52620 , Oriz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13290 (2002) oder Guan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 13296 (2002) offenbart.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung werden Organismen verwendet, bei denen eines der obenerwähnten Gene, oder eine der obenerwähnten Nukleinsäuren, auf eine Weise mutiert ist, dass die Aktivität des kodierten Genprodukts verglichen mit den nicht mutierten Proteinen weniger oder überhaupt nicht durch zelluläre Faktoren beeinflusst wird. Gut bekannte Regulationsmechanismen der Enzymaktivität sind zum Beispiel Substratinhibierung oder Rückkopplungsregulationsmechanismen. Wege und Techniken zur Einführung von Substitutionen, Deletierungen und Additionen einer oder mehrerer Basen, Nukleotide oder Aminosäuren einer entsprechenden Sequenz sind hier unten in den entsprechenden Absätzen und den dort angeführten Literaturstellen beschrieben, z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, NY, 1989. Dem Fachmann wird es möglich sein, Regulationsdomänen und Bindungsstellen von Regulatoren zu identifizieren, indem er die Sequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung oder des Expressionsprodukts davon mit Hilfe von Computersoftware, die Algorithmen zur Identifizierung von Bindungsstellen und regulatorischen Domänen umfasst, mit dem Stand der Technik vergleicht oder indem er systematisch Mutationen in ein Nukleinsäuremolekül oder in ein Protein einführt und Assays auf diese Mutationen, die eine erhöhte spezifische Aktivität oder eine erhöhte Aktivität pro Volumen, insbesondere pro Zelle, bewirken, durchführt.
Es kann daher von Vorteil sein, in einem Organismus ein von einem evolutionär entfernt verwandten Organismus abgeleitetes Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder ein Polypeptid der Erfindung zu exprimieren, wie z. B. bei der Verwendung eines prokaryontischen Gens in einem eukaryontischen Wirt, da in diesen Fällen die Regulationsmechanismen der Wirtszelle die Aktivität (zellular oder spezifisch) des Gens oder seines Expressionsprodukts nicht abschwächen.
Die Mutation wird so eingeführt, dass ein erhöhter Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, ein erhöhter intrinsischer Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, nicht beeinträchtigt werden.
Weniger Einfluss auf die Regulation eines Gens oder dessen Genprodukt ist so zu verstehen, dass damit eine verminderte Regulation der enzymatischen Aktivität gemeint ist, die eine erhöhte spezifische oder zelluläre Aktivität des Gens bzw. dessen Produkts zur Folge hat. Eine Erhöhung der enzymatischen Aktivität ist so zu verstehen, dass damit eine enzymatische Aktivität gemeint ist, die im Vergleich zum Ausgangsorganismus um mindestens 10%, vorteilhafterweise mindestens 20, 30 oder 40%, besonders vorteilhaft um mindestens 50, 60 oder 70% erhöht ist. Dies manifestiert sich in erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon.
Durch die Erfindung ist es möglich, die obigen Methoden so durchzuführen, dass der Ertrag, z. B. ein Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischer Ertrag und/oder andere erwähnte Ertragsmerkmale erhöht wird, wobei insbesondere die Toleranz gegenüber niedriger Temperatur erhöht wird. In einer weiteren Ausführungsform ist es durch die Erfindung möglich, die obigen Methoden so durchzuführen, dass Toleranz gegenüber abiotischem Stress, insbesondere die Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Wassernutzungseffizienz und gleichzeitig die Nährstoffnutzungseffizienz, insbesondere die Stickstoffnutzungseffizienz erhöht wird. In einer anderen Ausführungsform ist es durch die Erfindung möglich, die obigen Methoden so durchzuführen, dass der Ertrag in Abwesenheit von Nährstoffmängeln sowie in Abwesenheit von Stressbedingungen erhöht wird. In einer weiteren Ausführungsform ist es durch die Erfindung möglich, die obigen Methoden so durchzuführen, dass die Nährstoffausnutzungseffizienz, insbesondere die Stickstoffausnutzungseffizienz, und der Ertrag in Abwesenheit von Nährstoffmängeln und in Abwesenheit von Stressbedingungen erhöht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist es durch die Erfindung möglich, die obigen Methoden so durchzuführen, dass die Toleranz gegenüber abiotischem Stress, insbesondere die Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen und/oder die Wasserausnutzungseffizienz und gleichzeitig die Nährstoffausnutzungseffizienz, insbesondere die Stickstoffausnutzungseffizienz, und der Ertrag in Abwesenheit von Nährstoffmängeln sowie in Abwesenheit von Stressbedingungen erhöht werden.
Die Erfindung ist nicht auf spezifische Nukleinsäuren, spezifische Polypeptide, spezifische Zelltypen, spezifische Wirtszellen, spezifische Bedingungen oder spezifische Methoden usw. als solche eingeschränkt, sondern kann variieren, und zahlreiche Modifikationen und Variationen davon werden dem Fachmann offensichtlich sein. Es versteht sich außerdem, dass die hier verwendete Terminologie lediglich zum Zweck der Beschreibung spezifischer Ausführungsformen dient und nicht einschränkend verstanden werden soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem isolierte Nukleinsäuren, die ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid gemäß Spalte 7 von Tabelle IIB, Anwendung Nr. 1 kodiert;
(b) einem Nukleinmolekül gemäß Spalte 7 von Tabelle IB, Anwendung Nr. 1;
(c) einem Nukleinsäuremolekül, das, als Folge der Degeneration des genetischen Codes, von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anwendung Nr. 1, abgeleitet werden kann und, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, erhöhten Ertrag, z. B. erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal verleiht;
(d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, welches das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1, umfasst und, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, erhöhten Ertrag, z. B. erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal verleiht;
(e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens etwa 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c) oder (d) kodiert wird, kodiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1, umfasst und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöhten Ertrag, zum Beispiel erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal verleiht;
(f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c), (d) oder (e) hybridisiert und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, erhöhten Ertrag, z. B. erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal verleiht;
(g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a), (b), (c), (d),
(e) oder (f) kodiert wird und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1, umfasst, isoliert werden kann;
(h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV, Anwendung Nr. 1, umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Protein wiedergegeben wird, welches ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV, Anwendung Nr. 1, umfasst;
(i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II, Anwendung Nr. 1, wiedergegeben wird und verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöhten Ertrag, z. B. erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal verleiht;
(j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III, Anwendung Nr. 1, die vorzugsweise die Aktivität aufweisen, die durch ein Protein, welches ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV, Anwendung Nr. 1, umfasst, wiedergegeben wird, amplifiziert; und
(k) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäure-Bibliothek, insbesondere eine cDNA-Bibliothek und/oder eine genomische Bibliothek, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 750 nt oder 1000 nt, eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid kodiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II, Anwendung Nr. 1, umfassendes Protein wiedergegebenen wird, screent; umfassen.

In einer Ausführungsform unterscheidet sich das Nukleinsäuremolekül gemäß (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) und (k) mindestens durch ein oder mehrere Nukleotide von der Sequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA, Anwendung Nr. 1, und das vorzugsweise für ein Protein kodiert, das sich durch mindestens eine oder mehrere Aminosäuren von den Proteinsequenzen gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA, Anwendung Nr. 1, unterscheidet.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung Homologe der oben genannten Sequenzen, die vorteilhaft aus Hefe, Pilzen, Viren, Algen, Bakterien wie Acetobacter (Subgen. Acetobacter) aceti; Acidithiobacillus ferrooxidans; Acinetobacter sp.; Actinobacillus sp; Aeromonas salmonicida; Agrobacterium tumefaciens; Aquifex aeolicus; Arcanobacterium pyogenes; Aster yellows phytoplasma; Bacillus sp.; Bifidobacterium sp.; Borrelia burgdorferi; Brevibacterium linens; Brucella melitensis; Buchnera sp.; Butyrivibrio fibrisolvens; Campylobacter jejuni; Caulobacter crescentus; Chlamydia sp.; Chlamydophila sp.; Chlorobium limicola; Citrobacter rodentium; Clostridium sp.; Comamonas testosteroni; Corynebacterium sp.; Coxiella burnetii; Deinococcus radiodurans; Dichelobacter nodosus; Edwardsiella ictaluri; Enterobacter sp.; Erysipelothrix rhusiopathiae; E. coli; Flavobacterium sp.; Francisella tularensis; Frankia sp. CpI1; Fusobacterium nucleatum; Geobacillus stearothermophilus; Gluconobacter oxydans; Haemophilus sp.; Helicobacter pylori; Klebsiella pneumoniae; Lactobacillus sp.; Lactococcus lactis; Listeria sp.; Mannheimia haemolytica; Mesorhizobium loti; Methylophaga thalassica; Microcystis aeruginosa; Microscilla sp. PRE1; MorAchsella sp. TA144; Mycobacterium sp.; Mycoplasma sp.; Neisseria sp.; Nitrosomonas sp.; Nostoc sp. PCC 7120; Novosphingobium aromaticivorans; Oenococcus oeni; Pantoea citrea; Pasteurella multocida; Pediococcus pentosaceus; Phormidium foveolarum; Phytoplasma sp.; Plectonema boryanum; Prevotella ruminicola; Propionibacterium sp.; Proteus vulgaris; Pseudomonas sp.; Ralstonia sp.; Rhizobium sp.; Rhodococcus equi; Rhodothermus marinus; Rickettsia sp.; Riemerella anatipestifer; Ruminococcus flavefaciens; Salmonella sp.; Selenomonas ruminantium; Serratia entomophila; Shigella sp.; Sinorhizobium meliloti; Staphylococcus sp.; Streptococcus sp.; Streptomyces sp.; Synechococcus sp.; Synechocystis sp. PCC 6803; Thermotoga maritima; Treponema sp.; Ureaplasma urealyticum; Vibrio cholerae; Vibrio parahaemolyticus; Xylella fastidiosa; Yersinia sp.; Zymomonas mobilis, vorzugsweise Salmonella sp. oder E. coli, oder Pflanzen, vorzugsweise aus Hefen wie aus den Gattungen Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis oder Schizosaccharomyces oder aus Pflanzen wie A. thaliana, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Borretsch, Sonnenblume, Lein, Primel, Raps, Canola und Ölrübsen, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Solanacen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, buschartigen Pflanzen wie Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Bäumen wie Ölpalme, Kokosnuss, mehrjährigen Gräsern wie Weidelgras und Schwingel, sowie Futterkulturen wie Luzerne und Klee, sowie aus Fichte, Kiefer oder Tanne isoliert werden können. Stärker bevorzugt können Homologe der oben genannten Sequenzen aus S. cerevisiae, E. coli oder Synechocystis sp. oder Pflanzen, vorzugsweise Brassica napus, Glycine max, Zea mays, Baumwolle oder Oryza sativa, isoliert werden.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. So wird zum Beispiel ein für das Protein kodierendes Nukleinsäuremolekül in einen Expressionsvektor kloniert, zum Beispiel in einen binären Vektor, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingeführt, zum Beispiel den A. thaliana-Wildtyp NASC N906 oder eine andere wie unten in den Beispielen beschriebene Pflanzenzelle, und das Protein wird in dieser Wirtszelle exprimiert. Beispiele für binäre Vektoren sind pBIN19, pBI101, pBinAR, pGPTV, pCAMBIA, pBIB-HYG, pBecks, pGreen oder pPZP (Hajukiewicz, P. et al., Plant Mol. Biol. 25, 989 (1994), und Hellens et al, Trends in Plant Science 5, 446 (2000)).
Gemäß einer Ausführungsform wird das Protein der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in einem Kompartiment der Zelle, z. B. in den Plastiden, produziert. Wege zur Einführung von Nukleinsäuren in Plastide und zur Produktion von Proteinen in diesem Kompartiment sind dem Fachmann bekannt und werden ebenfalls in der vorliegenden Anmeldung beschrieben. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid um ein Protein, das nach der Expression wie in Spalte 6 von Tabelle II lokalisiert ist, z. B. nicht gezielt, in den Mitochondrien oder Plastiden oder beiden; für eine Lokalisierung in Plastiden wird es zum Beispiel wie oben beschrieben mit einem Transitpeptid kondensiert. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird das Protein der vorliegenden Erfindung ohne weiteres Zielsignal (z. B. wie hier genannt), z. B. im Zytoplasma der Zelle produziert. Wege zur Produktion von Proteinen im Zytoplasma sind dem Fachmann bekannt. Wege zur Produktion von Proteinen ohne künstliches Targeting sind dem Fachmann bekannt.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder das Genkonstrukt werden/wird vorteilhafterweise zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, die mittels eines Vektors oder direkt in das Genom in den Organismus eingeführt wird. Dieses Reportergen sollte ein leichtes Nachweisen über einen Wachstums-Assay, einen Fluoreszenz-Assay, einen chemischen Assay, einen Biolumineszenz-Assay oder einen Toleranz-Assay, oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Zu Beispielen für Reportergene, die zu erwähnen sind, zählen Gene für Toleranz gegenüber Antibiotika oder Herbiziden, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Zuckermetabolismusgene oder Nukleotidmetabolismusgene, oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen, das β-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-o-phosphat-phosphatase-Gen, das β-Glucuronidasegen, das β-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotransferasegen, ein Gen für eine mutierte Acetohydroxysäuresynthase (AHAS), das auch als Acetolactatsynthasegen (ALS-Gen) bekannt ist, ein Gen für ein D-Aminosäuren metabolisierendes Enzym oder das BASTA-Gen (= Glufosinattoleranzgen). Diese Gene ermöglichen die einfache Messung und Quantifizierung der Transkriptionsaktivität und somit der Expression der Gene. Auf diese Weise lassen sich Genompositionen identifizieren, die eine abweichende Produktivität zeigen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein Nukleinsäurekonstrukt, zum Beispiel eine Expressionskassette, upstream, d. h. am 5'-Ende der Codiersequenz, einen Promoter, und downstream, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal, und gegebenenfalls noch andere regulatorische Elemente, die operativ an die dazwischenliegende Codiersequenz mit einer der wie in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleinsäure-SEQ ID NO gebunden sind. Mit operativer Bindung ist die aufeinanderfolgende Anordnung von Promoter, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls anderen Elementen in einer solchen Weise, dass alle der regulatorischen Elemente ihre Funktion bei der Expression der Codiersequenz in angemessener Weise erfüllen können, gemeint. Die für die operative Bindung bevorzugten Sequenzen sind in einer Ausführungsform Targetingsequenzen, mit denen die subzelluläre Lokalisierung in Plastiden sichergestellt wird. Es können jedoch auch Targetingsequenzen, mit denen die subzelluläre Lokalisierung im Mitochondrium, im endoplasmatischen Retikulum (= ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder in anderen Kompartimenten sichergestellt wird, eingesetzt werden, ebenso wie Translationspromoter wie die 5'-Leitsequenz im Tabakmosaikvirus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 8693 (1987)).
Ein Nukleinsäurekonstrukt, zum Beispiel eine Expressionskassette, kann zum Beispiel einen konstitutiven Promoter oder einen gewebespezifischen Promoter (vorzugsweise den USP- oder Napin-Promoter) des zu exprimierenden Gens und das ER-Retentionssignal enthalten. Für das ER-Retentionssignal verwendet man vorzugsweise die KDEL-Aminosäuresequenz (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) oder die KKX-Aminosäuresequenz (Lysin-Lysin-X-Stop, wobei X jede andere bekannte Aminosäure bedeutet).
Zur Expression in einem Wirtsorganismus, zum Beispiel einer Pflanze, insertiert man die Expressionskassette vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise ein Plasmid, einen Phagen oder andere DNA, die eine optimale Expression von Genen in dem Wirtsorganismus erlaubt. Beispiele für geeignete Plasmide sind: in E. coli pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe wie z. B. pBR322, die pUC-Reihe wie z. B. pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI; in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361; in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214; in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667; in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116; andere vorteilhafte pilzliche Vektoren wurden von Romanos M. A. et al., Yeast 8, 423 (1992) und von van den Hondel, C. A. M. J. J. et al. [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi"] sowie in "More Gene Manipulations" in "Fungi" in Rennet J. W. & Lasure L. L., Hrsg., S. 396–428, Academic Press, San Diego, und in "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy J. F. et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge]. Beispiele für vorteilhafte Hefepromoter sind 2 μM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromoter sind pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L., Plant Cell Rep. 7, 583 (1988))). Die oben angeführten Vektoren bzw. Derivate der oben angeführten Vektoren sind eine kleine Auswahl aus den möglichen Plasmiden. Weitere Plasmide sind dem Fachmann gut bekannt und finden sich zum Beispiel in dem Buch "Cloning Vektors" (Hrsg. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Geeignete Pflanzenvektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press, Kap. 6/7, S. 71–119) beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind als Shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren bekannt, die in E. coli und Agrobacterium replizieren.
Mit Vektoren sind mit Ausnahme von Plasmiden alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren gemeint, wie zum Beispiel Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposonen, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert werden oder chromosomal repliziert werden, wobei die chromosomale Replikation bevorzugt ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Expressionskassette auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt und durch heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann sich aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus der Expressionskassette als Vektor oder den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zusammensetzen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz auch alleine in einen Organismus eingeführt werden.
Wenn zusätzlich zu der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz weitere Gene in den Organismus eingeführt werden sollen, können jeweils alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzelnen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in einem Vektor in den Organismus eingeführt werden, wodurch die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder nacheinander eingeführt werden können.
Der Vektor enthält vorteilhafterweise mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskassette (= Genkonstrukt).
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine für ein Polypeptid gemäß Tabelle II, Spalte 5 oder 7, kodierende Nukleinsäure umfasst, wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle zu einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhter Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, verglichen mit einer Wirtszellensorte vom Wildtyp führt.
So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck ”Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, das dazu in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, an die es gebunden wurde, zu transportieren. Ein Typ von Vektor ist ein ”Plasmid”, was sich auf eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein anderer Vektortyp ist ein viraler Vektor, bei dem zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in die sie eingeführt worden sind, in der Lage (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden, wenn sie in die Wirtszelle eingebracht werden, in das Genom einer Wirtszelle oder eine Organelle integriert, und werden dadurch zusammen mit dem Genom des Wirts bzw. des Organells expliziert. Außerdem sind bestimmte Vektoren dazu fähig, die Expression von Genen, mit denen sie operativ verbunden sind, zu steuern. Solche Vektoren werden hier als ”Expressionsvektoren” bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die bei rekombinanten DNA-Techniken von Nutzen sind, häufig in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können ”Plasmid” und ”Vektor” austauschbar verwendet werden, da es sich bei dem Plasmid um die am häufigsten verwendete Form von Vektor handelt. Die Erfindung soll jedoch auch solche anderen Formen von Expressionsvektoren wie virale Vektoren (z. B. replikationsdefektive Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren), die äquivalente Funktionen erfüllen, einschließen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung enthalten eine Nukleinsäure der Erfindung in einer Form, die für die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was heißt, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere auf Grundlage der für die Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählte regulatorische Sequenzen einschließen, die operativ mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verbunden sind. So, wie der Ausdruck hier in Bezug auf einen rekombinanten Expressionsvektor verwendet wird, soll „operativ gebunden” bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse auf eine Weise an die regulatorische(n) Sequenz(en) gebunden ist, die die Expression der Nukleotidsequenz (z. B. in einem in-vitro-Transkriptions/Translationssystem oder, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird, in einer Wirtszelle) erlaubt. Der Ausdruck „regulatorische Sequenz” soll Promoter, Enhancer und andere Elemente zur Steuerung der Expression (z. B. Polyadenylierungssignale) einschließen. Solche regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) und Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Hrsg. Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, CRC Press: Boca Raton, Florida einschließlich den darin aufgeführten Literaturstellen beschrieben. Zu den regulatorischen Sequenzen zählen die, die in vielen Arten von Wirtszellen die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz steuern, und die, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen oder unter bestimmten Bedingungen steuern. Dem Fachmann wird klar sein, dass die Entwicklung des Expressionsvektors von Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Expressionsniveau des Polypeptids usw. abhängen kann. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um so Polypeptide oder Peptide einschließlich Fusionspolypeptide oder -peptide zu produzieren, die durch wie hier beschriebene Nukleinsäuren kodiert werden (z. B. Fusionspolypeptide, „Yield Related Proteins” or „YRPs” usw.).
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für die Expression des Polypeptids der Erfindung in Pflanzenzellen entwickelt sein. So können zum Beispiel YRP-Gene in Pflanzenzellen exprimiert werden (siehe Schmidt R., und Willmitzer L., Plant Cell Rep. 7 (1988); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); White F. F., Jenes B. et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung und Wu R., 128–43, Academic Press: 1993; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991) und die darin angeführten Literaturstellen). Geeignete Wirtszellen werden weiter in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) diskutiert. Alternativ dazu kann man den rekombinanten Expressionsvektor in vitro transkribieren und translatieren, zum Beispiel unter Einsatz von regulatorischen Sequenzen des T7-Promoters und der T7-Polymerase.
Die Expression von Polypeptiden in Prokaryonten wird am häufigsten mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promoter enthalten, die die Expression entweder von Fusions- oder von Nicht-Fusionspolypeptiden steuern, durchgeführt. Fusionsvektoren addieren eine gewisse Anzahl an Aminosäuren an ein darin kodiertes Polypeptid, gewöhnlich am Aminoterminus des rekombinanten Polypeptids, jedoch auch am C-Terminus oder fusioniert in geeigneten Regionen in den Polypeptiden. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: 1) zur Erhöhung der Expression eines rekombinanten Polypeptids; 2) zur Erhöhung der Löslichkeit eines rekombinanten Polypeptids und 3) zur Unterstützung bei der Aufreinigung eines rekombinanten Polypeptids, indem sie als Ligand bei der Affinitätsaufreinigung wirken. Häufig wird bei Fusionsexpressionsvektoren eine Stelle für die proteolytische Spaltung an dem Verbindungspunkt zwischen der Fusionseinheit und dem rekombinanten Polypeptid eingeführt, um die Abtrennung des rekombinanten Polypeptids von der Fusionseinheit im Anschluss an die Aufreinigung des Fusionspolypeptids zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre entsprechenden Erkennungssequenzen schließen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase ein.
Die Pflanzenexpressionskassette kann beispielsweise in dem pRT-Transformationsvektor ((a) Toepfer et al., Methods Enzymol. 217, 66 (1993), (b) Toepfer et al., Nucl. Acids. Res. 15, 5890 (1987)) installiert werden. Alternativ dazu kann man einen rekombinanten Vektor (= Expressionsvektor) auch in vitro transkribieren und translatieren, z. B. unter Verwendung des T7-Promoters und der T7-RNA-Polymerase.
In Prokaryonten eingesetzte Expressionsvektoren bedienen sich häufig induzierbarer Systeme mit und ohne Fusionsproteine oder Fusionsoligopeptide, wobei diese Fusionen sowohl N-terminal als auch C-terminal oder in anderen brauchbaren Domänen eines Proteins erfolgen können. Solche Fusionsvektoren dienen gewöhnlich den folgenden Zwecken: 1) zur Erhöhung der RNA-Expressionsrate; 2) zur Erhöhung der erzielbaren Proteinsyntheserate; 3) zur Erhöhung der Löslichkeit des Proteins; 4) oder zur Vereinfachung der Aufreinigung mittels einer Bindungssequenz, die sich für die Affinitätschromatographie verwenden lässt. Stellen für eine proteolytische Spaltung werden häufig auch über Fusionsproteine eingeführt, was es erlaubt, einen Teil des Fusionsproteins abzuspalten und aufzureinigen. Solche Erkennungssequenzen für Proteasen werden erkannt, z. B. Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith D. B. und Johnson K. S., Gene 67, 31 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathion-S-transferase (GST), das Maltosebindungsprotein bzw. Protein A enthalten.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Codiersequenz des Polypeptids der Erfindung in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, wodurch ein Vektor geschaffen wird, der für ein Fusionspolypeptid kodiert, welches, vom N-Terminus zum C-Terminus, GST-Thrombinspaltstelle-X-Polypeptid enthält. Das Fusionspolypeptid kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathion-Agarose-Harz aufgereinigt werden. Rekombinantes PKYRP, das nicht mit GST fusioniert, lässt sich durch Spaltung des Fusionspolypeptids mit Thrombin zurückgewinnen. Andere Beispiele für E. coli-Expressionsvektoren sind pTrc- (Amann et al., Gene 69, 301 (1988)) und pET-Vektoren (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60–89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande).
Die Expression des Target-Gens vom pTrc-Vektor beruht auf der Wirts-RNA-Polymerasetranskription von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromoter. Die Expression des Target-Gens vom pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7 gn10-lac-Fusionspromoter, vermittelt durch eine gemeinsam exprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1). Diese virale Polymerase wird durch den Wirtsstamm BL21 (DE3) oder HMS174(DE3) aus einem residierenden l-Prophagen, der ein T7 gn1-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des lacUV 5-Promoters birgt, bereitgestellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die YRPs in Pflanzen und Pflanzenzellen wie einzelligen Pflanzenzellen (z. B. Algen) (siehe Falciatore et al., Marine Biotechnology 1 (3), 239 (1999) und die darin aufgeführten Literaturstellen) und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z. B. die Spermatophyten, wie Kulturpflanzen) exprimiert, zum Beispiel, um Pflanzen aus den Pflanzenzellen zu regenerieren. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß Tabelle II, Spalte 5 oder 7, das für YRP kodiert, lässt sich auf beliebige Weise einschließlich Transfektion, Transformation oder Transduktion, Elektroporation, Bombardierung mit Partikeln, Agroinfektion und dergleichen in eine Pflanzenzelle „einführen”. Eine dem Fachmann bekannte Transformationsmethode ist das Eintauchen einer blühenden Pflanze in eine Agrobacteria-Lösung, wobei das Agrobacterium die Nukleinsäure der Erfindung enthält, gefolgt vom Züchten der transformierten Gameten.
Andere geeignete Methoden zur Transformierung oder Transfizierung von Wirtszellen einschließlich Pflanzenzellen finden sich in Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, und anderen Laborhandbüchern wie Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Da eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder ein erhöhter Ertrag ein allgemeines Merkmal ist, das in einer Vielzahl verschiedener Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps und Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume und Tagetes, Solanaceen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine, und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, buschartigen Pflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäumen (Ölpalme, Kokosnuss), mehrjährigen Gräsern, und Futterpflanzen vererbt werden soll, sind diese Kulturpflanzen auch die bevorzugten Target-Pflanzen für einen genetischen Eingriff als eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Zu den Futterkulturpflanzen zählen, wobei diese Aufzählung nicht einschränkend ist, Quecke, Kanariengras, Respe, Blaustrandhafer, Rispengras, Wiesenknäuelgras, Luzerne, Haushechelklee, Gemeiner Hornklee, Schweden-Klee, Wiesenklee und Steinklee.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Transfektion eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Tabelle II, Spalte 5 oder 7, das für YRP kodiert, in eine Pflanze durch einen durch Agrobacterium vermittelten Gentransfer erzielt. Die durch Agrobacterium vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel, unter Verwendung des GV3101(pMP90)- (Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204, 383 (1986)) oder LBA4404-(Clontech)Stamms von Agrobacterium tumefaciens durchgeführt werden. Die Transformation kann gemäß Standardtransformations- und -regenerationstechniken erfolgen (Deblaere et al., Nucl. Acids Res. 13, 4777 (1994), Gelvin, Stanton B. und Schilperoort Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2. Auf 1. – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick Bernard R., Thompson John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Raps zum Beispiel kann durch Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation (Moloney et al., Plant Cell Report 8, 238 (1989); De Block et al., Plant Physiol. 91, 694 (1989)) transformiert werden. Die Verwendung von Antibiotika für Agrobacterium und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und dem Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion erfolgt normalerweise unter Einsatz von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker. Ein durch Agrobacterium vermittelter Gentransfer in Flachs kann zum Beispiel unter Anwendung einer von Mlynarova et al., Plant Cell Report 13, 282 (1994) beschriebenen Technik durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Transformation von Sojabohne zum Beispiel unter Anwendung einer in der europäischen Patentschrift Nr. 424 047 , US-Patentschrift Nr. 5,322,783 , europäischen Patentschrift Nr. 397 687 , US-Patentschrift Nr. 5,376,543 oder US-Patentschrift Nr. 5,169,770 beschriebenen Technik durchgeführt werden. Die Transformation von Mais lässt sich durch Partikelbombardierung, polyethylenglykolvermittelte DNA-Aufnahme oder durch die Siliziumcarbidfasertechnik (siehe zum Beispiel, Freeling und Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7) erreichen. Ein spezielles Beispiel einer Mais-Transformation findet sich in der US-Patentschrift Nr. 5,990,387 , und ein spezielles Beispiel einer Weizen-Transformation findet sich in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256 .
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das eingeführte Nukleinsäuremolekül gemäß Tabelle II, Spalte 5 oder 7, das für YRP kodiert, stabil in der Pflanzenzelle aufrechterhalten werden, wenn es in ein nicht-chromosomales autonomes Replikon eingebaut oder in die Pflanzenchromosomen oder das Genom der Organelle integriert wird. Alternativ dazu kann das eingeführte YRP auf einem extrachromosomalen, nicht replizierenden Vektor vorliegen und transient exprimiert werden bzw. transient aktiv sein.
Gemäß einer Ausführungsform kann man einen homologen rekombinanten Mikroorganismus herstellen, bei dem das YRP in ein Chromosom integriert ist, ein Vektor wird hergestellt, welcher mindestens einen Teil eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Tabelle II, Spalte 5 oder 7, das für YRP kodiert, enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt wurde, um so das YRP-Gen zu verändern, z. B. funktionell zu stören. Beispielsweise handelt es sich bei dem YRP-Gen um ein Hefegen, wie ein Gen von S. cerevisiae, oder von Synechocystis, oder ein bakterielles Gen, wie ein E. coli-Gen, es kann jedoch auch ein Homolog aus einer verwandten Pflanze oder sogar aus einer Säugetier- oder Insektenquelle sein. Der Vektor kann so beschaffen sein, dass bei der homologen Rekombination das endogene Nukleinsäuremolekül gemäß Tabelle II, Spalte 5 oder 7, das für YRP kodiert, mutiert oder anderweitig verändert wird, aber immer noch für ein funktionelles Polypeptid kodiert (z. B. kann die stromaufwärts befindliche regulatorische Region verändert sein, wodurch die Expression des endogenen YRP geändert wird). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die biologische Aktivität des Proteins der Erfindung bei der homologen Rekombination erhöht. Zur Bildung einer Punktmutation über eine homologe Rekombination kann man bei einer als Chimäraplastie bekannten Technik DNA-RNA-Hybride einsetzen (Cole-Strauss et al., Nucleic Acids Research 27 (5), 1323 (1999) und Kmiec, Gene Therapy American Scientist. 87 (3), 240 (1999)). Vorschriften für die homologe Rekombination in Physcomitrella patens sind ebenfalls im Stand der Technik gut bekannt und werden hier für eine Verwendung in Betracht gezogen.
Wogegen der veränderte Teil des Nukleinsäuremoleküls gemäß Tabelle II, Spalte 5 oder 7, das für YRP kodiert, im Vektor für die homologe Rekombination an seinem 5'- und 3'-Ende durch ein zusätzliches Nukleinsäuremolekül des YRP-Gens flankiert wird, um zu ermöglichen, dass eine homologe Rekombination zwischen dem auf dem Vektor befindlichen exogenen YRP-Gen und einem endogenen YRP-Gen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze stattfinden kann. Das zusätzliche flankierende YRP-Nukleinsäuremolekül weist eine Länge auf, die für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen ausreicht. Typischerweise schließt der Vektor mehrere hundert Basenpaare bis zu Kilobasen flankierender DNA ein (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende). Siehe z. B. Thomas K. R., und Capecchi M. R., Cell 51, 503 (1987) für eine Beschreibung von Vektoren für die homologe Rekombination oder Strepp et al., PNAS, 95 (8), 4368 (1998) zur cDNA-basierten Rekombination in Physcomitrella patens. Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle eingeführt (z. B. durch polyethylenglykolvermittelte DNA), und Zellen, in denen sich das eingeführte YRP-Gen homolog mit dem endogenen YRP-Gen rekombiniert hat, werden nach im Stand der Technik bekannten Methoden selektiert.
Ob es in einem extrachromosomalen, nicht replizierenden Vektor oder einem in ein Chromosom integrierten Vektor vorliegt, das Nukleinsäuremolekül gemäß Tabelle II, Spalte 5 oder 7, das für YRP kodiert, liegt vorzugsweise in einer Pflanzenexpressionskassette vor. Eine Pflanzenexpressionskassette enthält vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die dazu in der Lage sind, die Genexpression in Pflanzenzellen voranzutreiben und die operativ verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, zum Beispiel die Termination der Transkription durch Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens t-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835 (1984)) oder funktionelle Äquivalente davon, es eignen sich jedoch auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren. Da die Expression von Pflanzengenen sehr häufig nicht auf die transkriptionellen Ebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise auch andere operativ verbundene Sequenzen wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Polypeptid/RNA-Verhältnis steigert, enthält (Gallie et al., Nucl. Acids Research 15, 8693 (1987)). Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren schließen diejenigen, die in: Becker D. et al., Plant Mol. Biol. 20, 1195 (1992); und Bevan M. W., Nucl. Acid. Res. 12, 8711 (1984); und "Vectors for Gene Transfer in Higher Plants" in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 ausführlich beschrieben sind, ein.
”Transformation” ist hier als ein Verfahren zur Einführung von heterologer DNA in eine Pflanzenzelle, in Pflanzengewebe oder in eine Pflanze definiert. Sie kann unter natürlichen oder künstlichen Bedingungen stattfinden, unter Einsatz verschiedener im Stand der Technik gut bekannter Methoden. Transformation kann auf einer beliebigen bekannten Methode zur Insertion fremder Nukleinsäuresequenzen in eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle beruhen. Die Methode wird entsprechend der zu transformierenden Wirtszelle ausgewählt und kann, wobei dies nicht ausschließend ist, eine virale Infektion, eine Elektroporation, eine Lipofektion und eine Bombardierung mit Partikeln einschließen. Zu diesen ”transformierten” Zellen zählen stabil transformierte Zellen, bei denen die insertierte DNA dazu in der Lage ist, entweder als ein autonom replizierendes Plasmid oder als Teil des Wirtschromosoms zu replizieren. Sie schließen auch Zellen ein, die die insertierte DNA oder RNA über begrenzte Zeiträume transient exprimieren. Transformierte Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen sind so zu verstehen, dass sie nicht nur das Endprodukt des Transformationsprozesses umfassen, sondern auch die transgene Nachkommenschaft davon.
Die Ausdrücke ”transformiert,” ”transgen” und ”rekombinant” beziehen sich auf einen Wirtsorganismus, z. B. ein Bakterium oder eine Pflanze, in den ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingeführt wurde. Das Nukleinsäuremolekül kann stabil in das Genom des Wirts integriert sein oder das Nukleinsäuremolekül kann auch als extrachromosomales Molekül vorliegen. Ein solches extrachromosomales Molekül kann selbstreplizierend sein. Transformierte Zellen, Gewebe oder Pflanzen sind so zu verstehen, dass sie nicht nur das Endprodukt des Transformationsprozesses umfassen, sondern auch die transgene Nachkommenschaft davon. Ein ”nicht transformierter”, ”nicht transgener” oder ”nicht rekombinanter” Wirt bezieht sich auf einen Wildtyporganismus, z. B. ein Bakterium oder eine Pflanze, der das heterologe Nukleinsäuremolekül nicht enthält.
Der Ausdruck ”transgene Pflanze” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf eine Pflanze, die eine fremde Nukleotidsequenz enthält, die entweder in ihr nukleares Genom oder ein Organellengenom insertiert ist. Er umfasst weiterhin die Nachkommengenerationen, d. h. die T1-, T2- und sich daran anschließende Generationen oder die BC1-, BC2- und sich daran anschließende Generationen sowie Kreuzungen davon mit nicht transgenen oder anderen transgenen Pflanzen.
Der Wirtsorganismus (= transgene Organismus) enthält vorteilhafterweise mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts.
Im Prinzip lassen sich alle Pflanzen als Wirtsorganismus verwenden. Bevorzugte transgene Pflanzen sind zum Beispiel ausgewählt aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae, und vorzugsweise aus einer Pflanze, ausgewählt aus der Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae. Bevorzugt werden Kulturpflanzen, wie etwa Pflanzen, die in vorteilhafter Weise ausgewählt werden aus der Gruppe der Gattungen Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazie, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Sorghum und Hirse, Triticale, Reis, Gerste, Cassava, Kartoffel, Zuckerrübe, Aubergine, Luzerne und mehrjährige Gräser und Futterpflanzen, Ölpalme, Gemüsepflanzen (Kohlarten, Wurzelgemüse, Knollengemüse, Schotengemüse, Fruchtgemüse, Zwiebelgemüse, Blattgemüse und Stängelgemüse), Buchweizen, Topinambur, Saubohne, Wicken, Linse, Buschbohne, Lupine, Klee und Luzerne, um nur einige von ihnen zu erwähnen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind transgene Pflanzen aus der aus Getreide, Sojabohne, Raps (einschließlich Ölraps, insbesondere Canola und Winterraps), Baumwolle, Zuckerrohr und Kartoffel, insbesondere Mais, Soja, Raps (einschließlich Ölraps, insbesondere Canola und Winterraps), Baumwolle, Weizen und Reis bestehenden Gruppe ausgewählt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der transgenen Pflanze um eine gymnosperme Pflanze, insbesondere eine Fichte, Kiefer oder Tanne.
Gemäß einer Ausführungsform ist die Wirtspflanze aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae und vorzugsweise aus einer Pflanze, ausgewählt aus der Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae, ausgewählt. Bevorzugt als Wirtspflanzen sind Kulturpflanzen und insbesondere die obenerwähnten Pflanzen, wie die obenerwähnten Familien und Gattungen, zum Beispiel bevorzugt die Arten Anacardium occidentale, Calendula officinalis, Carthamus tinctorius, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Helianthus annus, Tagetes lucida, Tagetes erecta, Tagetes tenuifolia; Daucus carota; Corylus avellana, Corylus colurna, Borago officinalis; Brassica napus, Brassica rapa ssp., Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis, Brassica oleracea, Arabidopsis thaliana, Anana comosus, Ananas ananas, Bromelia comosa, Carica papaya, Cannabis sative, Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba, Convolvulus panduratus, Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva, Beta vulgaris var. esculenta, Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo, Cucurbita moschata, Olea europaea, Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta, Ricinus communis, Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile, Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia, Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida, Soja max, Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides, Oleum cocoas, Laurus nobilis, Persea americana, Arachis hypogaea, Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense, Linum trigynum, Punica granatum, Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium thurberi, Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp., Elaeis guineensis, Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium, Sesamum indicum, Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata, Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida, Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum [Hirse], Panicum militaceum, Zea mays, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare, Coffea spp., Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica, Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens, Capsicum annuum, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Solanum melongena, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium, Solanum lycopersicum Theobroma Kakao oder Camellia sinensis.
Anacardiaceae wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium, z. B. die Spezies Pistacia vera [Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew]; Asteraceae wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, z. B. die Spezies Calendula officinalis [Ringelblume], Carthamus tinctorius [Saflor], Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [Gemeine Wegwarte], Cynara scolymus [Artischocke], Helianthus annuus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Feldsalat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [Gewürztagetes]; Apiaceae wie die Gattungen Daucus, z. B. die Spezies Daucus carota [Karotte]; Betulaceae wie die Gattungen Corylus, z. B. die Spezies Corylus avellana oder Corylus colurna [Haselnuss]; Boraginaceae wie die Gattungen Borago, z. B. die Spezies Borago officinalis [Borretsch]; Brassicaceae wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, z. B. die Spezies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölraps, Rüben], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana; Bromeliaceae, wie die Gattung Ananas, Bromelia, z. B. die Spezies Ananas comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas]; Caricaceae, wie die Gattung Carica, z. B. die Spezies Carica papaya [Papaya]; Cannabaceae, wie die Gattung Cannabis, z. B. die Spezies Cannabis sativa [Hanf], Convolvulaceae, wie die Gattung Ipomea, Convolvulus, z. B. die Spezies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süsskartoffel, Prunkwinde, Wildkartoffel], Chenopodiaceae, wie die Gattung Beta, d. h. die Spezies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe]; Cucurbitaceae wie die Gattungen Cucurbita, z. B. die Spezies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Kürbis]; Elaeagnaceae wie die Gattungen Elaeagnus, z. B. die Spezies Olea europaea [Olive].; Ericaceae wie die Gattung Kalmia, z. B. die Spezies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Berglorbeer, Breitblättrige Lorbeerrose, Schmalblattrige Lorbeerrose, Alpen-Lorbeerrose Poleiblättrige Lorbeerrose, Sumpf-Kalmie]; Euphorbiaceae wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, z. B. die Spezies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Maniok, Pfeilwurz, Tapioka, Cassava] oder Ricinus communis [Rizinusbohne, Hundsbaum, Läusebaum, Kreuzbaum, Christuspalme, Wunderbaum]; Fabaceae wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicago, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, z. B. die Spezies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [Federbaum, Schirmakazie, Seidenakazie], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Luzerne], Glycine max, Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne]; Geraniaceae wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum, z. B. die Spezies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokosnuss]; Gramineae wie die Gattungen Saccharum, z. B. die Spezies Saccharum officinarum; Juglandaceae wie die Gattungen Juglans, Wallia, z. B. die Spezies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Echte Walnuss, Schwarznuss, Gemeine Walnuss, Persische Walnuss, Weiße Walnuss, Butternuss, Schwarze Walnuss]; Lauraceae wie die Gattungen Persea, Laurus, z. B. die Spezies Laurus nobilis [Lorbeerbaum, Echter Lorbeer, Gewürzlorbeer, Edler Lorbeer], Persea americana Persea americana, Persea gratissima oder Persea Persea [Avocado]; Leguminosae wie die Gattungen Arachis, z. B. die Spezies Arachis hypogaea [Erdnuss]; Linaceae wie die Gattungen Linum, Adenolinum, z. B. die Spezies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Flachs, Lein]; Lythrarieae wie die Gattungen Punica, z. B. die Spezies Punica granatum [Granatapfel]; Malvaceae wie die Gattungen Gossypium, z. B. die Spezies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle]; Musaceae wie die Gattungen Musa, z. B. die Spezies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane]; Onagraceae, wie die Gattung Camissonia, Oenothera, z. B. die Spezies Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Primel, Nachtkerze]; Palmae, wie die Gattung Elaeis, z. B. die Spezies Elaeis guineensis [Ölpalme]; Papaveraceae, wie die Gattung Papaver, z. B. die Spezies Papaver Orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn, Türkenmohn, Klatschmohn, Mohnblume, Feldmohn, Klatschrose, Feldmohn, Saat-Mohn, Ackermohn]; Pedaliaceae, wie die Gattung Sesamum, z. B. die Spezies Sesamum indicum [Sesam]; Piperaceae, wie die Gattung Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, z. B. die Spezies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata. [Cayenne-Pfeffer, Wilder Pfeffer]; Poaceae, wie die Gattung Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea, Triticum, z. B. die Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste, Graupen, Mähnengerste, Mäusegerste, Wiesengerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Hirse, Panicum militaceum [Sorghum, Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais], Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen, Ackerweizen, Gemeiner Weizen], Proteaceae, wie die Gattung Macadamia, z. B. die Spezies Macadamia intergrifolia [Macademia]; Rubiaceae, wie die Gattung Coffea, z. B. die Spezies Coffea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee]; Scrophulariaceae, wie die Gattung Verbascum, z. B. die Spezies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze, Schaben-Königskerze, Chaix-Königskerze, Großblutige Königskerze, Seidenhaar-Königskerze, Langblättrige Königskerze, Mehlige Königskerze, Schwarze Königskerze, Kandelaber-Königskerze, Windblumen-Königskerze, Violette Königskerze, Flockige Königskerze, Himmelbrand]; Solanaceae, wie die Gattung Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, z. B. die Spezies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [Pfeffer], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine], Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate]; Sterculiaceae, wie die Gattung Theobroma, z. B. die Spezies Theobroma cacao [Kakao]; Theaceae, wie die Gattung Camellia, z. B. die Spezies Camellia sinensis [Tee].
Die Einführung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen, zum Beispiel Pflanzen, kann im Prinzip nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen. Die Einführung der Nukleinsäuresequenzen führt zur Entstehung von rekombinanten bzw. transgenen Organismen.
Wenn nicht anders angegeben sind die Ausdrücke ”Polynukleotide”, ”Nukleinsäure” und ”Nukleinsäuremolekül”, so wie sie hier verwendet werden, austauschbar. Außer es ist anderslautend angegeben, sind die Begriffe ”Peptid”, ”Polypeptid” und ”Protein” im vorliegenden Kontext austauschbar. Der Begriff ”Sequenz” kann Polynukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäuremoleküle, Peptide, Polypeptide und Proteine betreffen, abhängig vom Zusammenhang, in dem der Begriff ”Sequenz” verwendet wird. Die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden von beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide. Die Begriffe betreffen lediglich die Primärstruktur des Moleküls.
Somit schließen die Ausdrücke ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” bzw. ”Nukleinsäuremolekül(e)”, so wie sie hier verwendet werden, doppel- und einzelsträngige DNA und RNA ein Sie beinhalten außerdem bekannte Arten von Modifikationen, zum Beispiel Methylierung, ”Caps” und Substitutionen von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog. Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße DNA- bzw. RNA-Sequenz eine Codiersequenz, die für ein hier definiertes Polypeptid kodiert.
Die erfindungsgemäßen Gene, die für eine Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) kodieren, werden auch als „YRP-Gen” bezeichnet.
Eine ”Codiersequenz” ist eine Nukleotidsequenz, die in mRNA transkribiert wird und/oder in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie sich unter der Kontrolle von entsprechenden regulatorischen Sequenzen befindet. Die Grenzen der Codiersequenzen werden von einem Translations-Startcodon am 5'-Terminus und einem Translations-Stoppcodon am 3'-Terminus festgelegt. Die Tripletts taa, tga und tag stellen die (üblichen) Stoppcodons dar, die gegeneinander austauschbar sind. Eine Codiersequenz kann, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, mRNA, cDNA, rekombinante Nukleotidsequenzen oder genomische DNA einschließen, während Introns unter gewissen Umständen ebenfalls vorhanden sein können.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird Transformation genannt. Bei der Ausführung derselbigen werden Verfahren, welche für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschrieben wurden, für die transiente oder stabile Transformation eingesetzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasttransformation durch poly(ethylenglykol)induzierte DNA-Aufnahme, die ”biolistische” Methode unter Einsatz der Genkanone – die als Partikelbombardierungsmethode bezeichnet wird, die Elektroporation, die Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Diese Methoden sind beispielhaft in Jenes B. et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung S. D und Wu R., Academic Press (1993) 128–143 und in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)). Durch einen derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf die bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, verwendet werden, beispielsweise durch Baden von verwundeten Blättern oder zerschnittenen Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. 16, 9877 (1988) beschrieben oder ist unter anderem aus White F. F., Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung S. D. und Wu R., Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
Durch einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können gleichermaßen in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie z. B. Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Sojabohne, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffeln, Tabak, Tomaten, Karotten, Paprika, Raps, Tapioka, Cassava, Pfeilwurz, Tagetes, Luzerne, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Rebenarten, insbesondere ölhaltigen Kulturpflanzen wie Sojabohne, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färberdistel (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne oder insbesondere in Mais, Weizen, Sojabohne, Reis, Baumwolle und Canola eingesetzt werden, zum Beispiel indem man verwundete Blätter oder geschnittene Blätter in einer Agrobakterium-Lösung badet und sie dann in geeigneten Medien kultiviert.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können nach allen dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Geeignete Methoden finden sich in den oben angeführten Publikationen von Kung S. D. und Wu R., Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Dementsprechend betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung transgene Organismen, die durch mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, mindestens eine erfindungsgemäße Expressionskassette oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile – wie zum Beispiel Blätter, Wurzeln usw. im Fall von Pflanzenorganismen – oder von solchen Organismen gewonnenes Reproduktionsmaterial. Die Ausdrücke ”Wirtsorganismus”, ”Wirtszelle”, ”rekombinanter (Wirts)Organismus” und ”transgene (Wirts)Zelle” werden hier austauschbar verwendet. Natürlich beziehen sich diese Ausdrücke nicht nur auf den betreffenden Wirtsorganismus oder die betreffende Target-Zelle, sondern auch auf die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Organismen bzw. Zellen. Da aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen in nachfolgenden Generationen bestimmte Modifikationen auftreten können, müssen diese Nachkommen nicht notwendigerweise mit der Elternzelle identisch sein, fallen jedoch dennoch unter den Ausdruck, so wie er hier verwendet wird.
Für die Zwecke der Erfindung bedeutet ”transgen” oder ”rekombinant” in Bezug zum Beispiel auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäurekonstrukt) oder einen Vektor, die/der die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthält, oder einen durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, die erfindungsgemäße Expressionskassette oder den erfindungsgemäßen Vektor transformierten Organismus alle die Konstruktionen, die durch gentechnische Methoden hergestellt wurden und in denen man entweder

(a) die Nukleinsäuresequenz gemäß Tabelle I, Anwendung Nr. 1, Spalte 5 oder 7, oder ihre Derivate oder Teile davon oder (b) eine funktionell an die Nukleinsäuresequenz gemäß (a) gebundene genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel eine 3'- und/oder 5'-genetische Kontrollsequenz wie einen Promoter oder Terminator, oder (c) (a) und (b);

Nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung findet oder diese durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei es sich bei der Modifikation beispielsweise um eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste handeln kann. Mit natürlich genetischer Umgebung ist der natürliche genome oder chromosomale Locus im Ursprungsorganismus oder im Wirtsorganismus oder das Vorkommen in einer genomischen Bibliothek gemeint. Bei einer genomischen Bibliothek bleibt die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise mindestens teilweise erhalten. Die Umgebung grenzt mindestens an einer Seite an die Nukleinsäuresequenz und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 Bp, vorzugsweise mindestens 500 Bp, besonders bevorzugt mindestens 1,000 Bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5,000 Bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promoters der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit dem entsprechenden Gen – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn man letzteres durch nicht natürliche synthetische (”künstliche”) Methoden wie zum Beispiel eine Mutagenation modifiziert. Geeignete Methoden sind beispielsweise in US 5,565,350 oder WO 00/15815 beschrieben.
Geeignete Organismen bzw. Wirtsorganismen für die Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor gemäß der Erfindung sind vorteilhafterweise im Prinzip alle Organismen, die sich für die Expression von wie oben beschriebenen rekombinanten Genen eignen. Als weitere Beispiele können Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Sojabohne, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Flachs, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färberdistel (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne erwähnt werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind die Wirtspflanzen für die Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor gemäß der Erfindung ausgewählt aus der Gruppe, die Mais, Soja, Raps (einschließlich Canola und Winterraps), Baumwolle, Weizen und Reis umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts, z. B. einer Expressionskassette, das eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die für ein oder mehrere in Tabelle II gezeigte Polypeptide kodieren, oder ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle gemäß Tabelle I enthält oder für damit hybridisierende DNA-Sequenzen kodiert, zur Transformation von Pflanzenzellen, Geweben oder Teilen von Pflanzen enthält.
Hierbei können je nach gewähltem Promoter die Nukleinsäuremoleküle oder Sequenzen gemäß Tabelle I oder II spezifisch in den Blättern, in den Samen, in den Wurzelknöllchen, in Wurzeln, im Stängel oder in anderen Teilen der Pflanze exprimiert werden. Diese transgenen Pflanzen, die Sequenzen, z. B. gemäß Tabelle I überproduzieren, und ihr Reproduktionsmaterial sind zusammen mit den Pflanzenzellen, Geweben oder Teilen davon ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder das erfindungsgemäße Konstrukt mit Nukleinsäuremolekülen Sequenzen gemäß Tabelle I kann/können außerdem zur Transformation der oben beispielhaft angeführten Organismen wie Bakterien, Hefen, Fadenpilze und Pflanzen eingesetzt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung betrifft erhöhter Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, ein erhöhter intrinsischer Ertrag und/oder ein anderes erwähnte Ertragsmerkmal, zum Beispiel das künstlich erworbene Merkmal erhöhter Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, ein erhöhter intrinsischer Ertrag und/oder ein anderes erwähnte Ertragsmerkmal, im Vergleich zu den nicht genetisch modifizierten Ausgangspflanzen, z. B. das durch genetische Modifikation erworbenen Merkmal des Zielorganismus, und aufgrund einer funktionellen Überexpression einer oder mehrerer Polypeptidsequenzen) der Tabelle II, die z. B. durch die entsprechenden Nukleinsäuremoleküle Tabelle I, Spalte 5 oder 7 kodiert werden, und/oder Homologen in den erfindungsgemäßen Organismen, vorteilhafterweise in der transgenen erfindungsgemäßen Pflanze, oder produziert gemäß dem Verfahren der Erfindung, mindestens für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Weiterhin ist eine konstitutive Expression der Polypeptidsequenzen der Tabelle II, kodiert durch das entsprechende Nukleinsäuremolekül gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7 und/oder Homologe vorteilhaft. Andererseits könnte auch eine induzierbare Expression wünschenswert sein. Die Expression der Polypeptidsequenzen der Erfindung kann entweder direkt in das Zytoplasma oder in die Organellen, vorzugsweise die Plastiden der Wirtszellen, vorzugsweise der Pflanzenzellen, erfolgen.
Die Effizienz der Expression der Sequenzen der Tabelle II, kodiert durch das entsprechende Nukleinsäuremolekül gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7 und/oder Homologe lässt sich zum Beispiel in vitro durch Sprossmeristempropagierung bestimmen. Darüber hinaus lassen sich eine Expression der Sequenzen der Tabelle II, kodiert durch das entsprechende Nukleinsäuremolekül gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7 und/oder bezüglich der Art und des Niveaus modifizierte Homologe und ihre Wirkung auf Ertrag, z. B. auf ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, aber auch auf die Leistungen der Stoffwechselwege, an Testpflanzen in, Gewächshausversuchen untersuchen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfasst transgene Organismen wie transgene Pflanzen, die durch eine Expressionskassette transformiert wurden, die erfindungsgemäßen Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, oder damit hybridisierende DNA-Sequenzen enthält, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Reproduktionsmaterial solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind in diesem Fall transgene Kulturpflanzen wie beispielsweise Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Sojabohne, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Raps und Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Distel, Kartoffeln, Tabak, Tomaten, Tapioka, Cassava, Pfeilwurz, Luzerne, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuss- und Rebenarten.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind transgene Pflanzen, die durch eine Expressionskassette transformiert wurden, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle oder Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 oder 7, insbesondere Tabelle IIB, oder damit hybridisierende DNA-Sequenzen enthält oder umfasst, aus der Mais, Soja, Raps (einschließlich Canola und Winterraps), Baumwolle, Weizen und Reis umfassenden Gruppe ausgewählt.
Für die Zwecke der Erfindung sind Pflanzen mono- und dikotyle Pflanzen, Moose oder Algen, insbesondere Pflanzen, zum Beispiel gemäß einer Ausführungsform monokotyle Pflanzen, oder zum Beispiel gemäß einer anderen Ausführungsform dikotyle Pflanzen. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform sind wie oben beschriebene transgene Pflanzen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette enthalten.
Transgen bedeutet jedoch auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sich in ihrer natürlichen Position im Genom eines Organismus befinden, dass die Sequenz, z. B. die Codiersequenz oder eine regulatorische Sequenz, zum Beispiel die Promotersequenz, jedoch im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist. Vorzugsweise ist transgen/rekombinant so zu verstehen, dass damit gemeint ist, dass die Transkription einer oder mehrerer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gemäß Tabelle I bzw. eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Moleküle gemäß Tabelle I an einer nicht-natürlichen Position im Genom auftritt. Gemäß einer Ausführungsform erfolgt die Expression der Nukleinsäuren bzw. Moleküle homolog. Gemäß einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Expression der Nukleinsäuren bzw. Moleküle heterolog. Diese Expression kann transient oder von einer stabil in das Genom integrierten Sequenz aus erfolgen.
Der gemäß der Erfindung verwendete Ausdruck ”transgene Pflanzen” bezieht sich auch auf die Nachkommenschaft einer transgenen Pflanze, zum Beispiel die T₁, T₂, T₃ und darauf folgende Pflanzengenerationen oder die BC₁, BC₂, BC₃ und darauf folgende Pflanzengenerationen Somit können die transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung herangezogen bzw. kultiviert und geselbstet oder mit anderen Individuen gekreuzt werden, um weitere transgene Pflanzen gemäß der Erfindung zu erhalten. Transgene Pflanzen können ebenfalls erhalten werden, indem man transgene Pflanzenzellen vegetativ vermehrt. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem transgenes Pflanzenmaterial, welches aus einer transgenen Pflanzenpopulation gemäß der Erfindung abgeleitet werden kann. Derartiges Material enthält Pflanzenzellen und bestimmte Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in allen ihren Ausprägungen, wie etwa Samen, Blätter, Antheren, Fasern, Knollen, Wurzeln, Wurzelhaare, Stängel bzw. Halme, Embryo, Kalli, Kotyledonen, Petiolen, abgeerntetes Material, Pflanzengewebe, Fortpflanzungsgewebe und Zellkulturen, welche aus der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet sind und/oder zum Hervorbringen der transgenen Pflanze verwendet werden können. Jedwede erfindungsgemäß erhaltene transformierte Pflanze kann in einem herkömmlichen Züchtungsschema oder in einer in-vitro-Pflanzenvermehrung verwendet werden, um mehr transformierte Pflanzen mit den gleichen Charakteristika herzustellen, und/oder kann verwendet werden, um das gleiche Charakteristikum in anderen Varietäten derselben oder einer verwandten Spezies einzuführen. Derartige Pflanzen sind ebenfalls Teil der Erfindung. Aus den transformierten Pflanzen erhaltene Samen umfassen genetisch ebenfalls dasselbe Charakteristikum und sind Teil der Erfindung. Wie bereits erwähnt ist die vorliegende Erfindung im Prinzip auf alle Pflanzen einschließlich Kulturpflanzen anwendbar, die sich mit einer dem Fachmann bekannten Transformationsmethode transformieren lassen.
Vorteilhafte induzierbare Pflanzenpromoter sind beispielsweise der PRP1-Promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22361 (1993)), ein durch Benzolsulfonamid induzierbarer Promoter ( EP 388 186 ), ein durch Tetracyclin induzierbarer Promoter (Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992)), ein durch Salicylsäure induzierbarer Promoter ( WO 95/19443 ), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promoter ( EP 335 528 ) und ein durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promoter ( WO93/21334 ). Andere Beispiele für Pflanzenpromoter, die vorteilhaft eingesetzt werden können, sind der Promoter der zytoplasmatischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI-Promoter aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)), der Promoter von Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank-Zugangsnummer U87999) oder ein nodienspezifischer Promoter, wie in EP 249 676 beschrieben.
Besonders vorteilhaft sind die Promoter, die eine Expression beim Einsetzen der Bedingungen von abiotischem Stress sicherstellen. Besonders vorteilhaft sind die Promoter, die eine Expression beim Einsetzen von Niedertemperaturbedingungen, z. B. beim Einsetzen von wie oben definierten kühlen Temperaturen und/oder Frosttemperaturen, sicherstellen, z. B. für die Expression von Nukleinsäuremolekülen gemäß Tabelle VIIIb. Vorteilhaft sind die Promoter, die eine Expression unter Bedingungen einer eingeschränkten Verfügbarkeit von Nährstoffen, z. B. dem Einsetzen von eingeschränkten Stickstoffquellen, wenn der Stickstoff des Bodens oder des Nährstoffs erschöpft ist, sicherstellen, z. B. für die Expression von Nukleinsäuremolekülen oder ihren Genprodukten gemäß Tabelle VIIIa. Besonders vorteilhaft sind die Promoter, die eine Expression beim Einsetzen von Wassermangel, wie oben definiert, sicherstellen, z. B. für die Expression von Nukleinsäuremolekülen oder ihren Genprodukten gemäß Tabelle VIIIc. Besonders vorteilhaft sind die Promoter, die eine Expression beim Einsetzen von Standard-Wachstumsbedingungen, z. B. unter Bedingungen ohne Stress und mangelnder Bereitstellung von Nährstoffen, sicherstellen, z. B. für die Expression von Nukleinsäuremolekülen oder ihren Genprodukten gemäß Tabelle VIIId.
Solche Promoter sind dem Fachmann bekannt oder lassen sich aus Genen isolieren, die unter den oben erwähnten Bedingungen induziert werden. Gemäß einer Ausführungsform können für monokotyle oder dikotyle Pflanzen samenspezifische Promoter verwendet werden.
Im Prinzip kann man alle natürlichen Promoter mit ihren Regulationssequenzen verwenden, wie die oben namentlich für die erfindungsgemäße Expressionskassette und die erfindungsgemäße Methode erwähnten. Darüber hinaus können auch synthetische Promoter vorteilhaft zur Anwendung gelangen. Bei der Herstellung einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass man eine Nukleotidsequenz erhält, die brauchbar in der richtigen Richtung liest und mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Zum Verbinden der DNA-Fragmente (= erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angebunden werden. Die Promoter- und die Terminatorregionen können zweckmäßigerweise in der Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker ausgestattet werden, der einen oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertierung dieser Sequenz enthält. Im Allgemeinen hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6, Restriktionsstellen. Im Allgemeinen beträgt die Größe des Linkers in der regulatorischen Region weniger als 100 Bp, häufig weniger als 60 Bp, jedoch mindestens 5 Bp. Der Promoter kann zum Wirtsorganismus, zum Beispiel zur Wirtspflanze, sowohl nativ bzw. homolog als auch fremd bzw. heterolog sein. In der 5'-3'-Transkriptionsrichtung enthält die Expressionskassette den Promoter, eine in Tabelle I gezeigte DNA-Sequenz und eine Region für die Termination der Transkription. Verschiedene Terminationsregionen können in jeder gewünschten Weise gegeneinander ausgetauscht werden.
So, wie sie hier auch verwendet werden, sollen die Ausdrücke ”Nukleinsäure” und ”Nukleinsäuremolekül” DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) und unter Verwendung von Nukleotidanaloga erzeugte Analoga der DNA oder RNA einschließen. Dieser Ausdruck umfasst auch nicht translatierte Sequenzen, die sich sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende der kodierenden Region des Gens befinden: mindestens etwa 1000 Nukleotide der Sequenz upstream vom 5'-Ende der kodierenden Region und mindestens etwa 200 Nukleotide der Sequenz downstream vom 3'-Ende der kodierenden Region des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist jedoch vorzugsweise doppelsträngige DNA.
Ein ”isoliertes” Nukleinsäuremolekül ist eines, das im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuremolekülen, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind, getrennt ist. Dies bedeutet, dass andere Nukleinsäuremoleküle in einer Menge von weniger als 5%, bezogen auf das Gewicht der gewünschten Nukleinsäure, vorzugsweise weniger als 2 Gew.-%, besonders bevorzugt weniger als 1 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt weniger als 0,5 Gew.-%, vorhanden sind. Vorzugsweise ist eine ”isolierte” Nukleinsäure frei von einigen der Sequenzen, die die Nukleinsäure natürlich flankieren (d. h. Sequenzen, die sich an dem 5'- und 3'-Ende der Nukleinsäure befinden) in der genomischen DNA des Organismus, von dem sich die Nukleinsäure ableitet. So kann zum Beispiel in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte, für das ertragserhöhende, zum Beispiel mit Resistenz und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur in Zusammenhang stehende Protein (YRP) kodierende Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen, die das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der sich die Nukleinsäure ableitet, natürlich flankieren, enthalten. Außerdem kann ein ”isoliertes” Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, frei von einigen der anderen zellulären Materialien, mit denen es natürlich assoziiert ist, oder Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wurde, oder chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde, sein.
Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, z. B. ein Nukleinsäuremolekül, das für ein YRP oder einen Teil davon, das in Pflanzen einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, z. B. eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder gesteigerte Toleranz gegenüber zyklischer Dürre verleiht, kodiert, kann unter Anwendung von molekularbiologischen Standardtechniken und den hier bereitgestellten Sequenzinformationen isoliert werden. So kann zum Beispiel eine für das YRP kodierende A. thaliana-cDNA aus einer A. thaliana-c-DNA-Bibliothek isoliert werden, oder eine für das YRP kodierende Synechocystis sp.-, Brassica napus-, Glycine max-, Zea mays- oder Oryza sativa-cDNA kann aus einer Synechocystis sp.-, Brassica napus-, Glycine max-, Zea mays- bzw. Oryza sativa-c-DNA-Bibliothek isoliert werden, wobei alle oder ein Teil einer der Sequenzen gemäß Tabelle I verwendet werden. Außerdem lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, das alle oder einen Teil einer der Sequenzen gemäß Tabelle I umfasst, durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von auf dieser Sequenz basierend entwickelten Oligonukleotidprimern isolieren. So kann man zum Beispiel mRNA aus Pflanzenzellen isolieren (z. B. durch die Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsvorschrift von Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)), und cDNA lässt sich unter Verwendung der reversen Transkriptase (z. B. Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) herstellen. Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion lassen sich auf Basis einer der Nukleinsäuresequenzen gemäß Tabelle I entwickeln. Ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung kann mit cDNA oder alternativ dazu mit genomischer DNA als Schablone und entsprechenden Oligonukleotidprimern gemäß Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Das so amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Weiterhin lassen sich einer für das YRP kodierenden Nukleotidsequenz entsprechende Oligonukleotide durch synthetische Standardtechniken, z. B. unter Einsatz eines automatischen DNA-Synthesizers, herstellen.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine der Nukleotidsequenzen oder Moleküle gemäß Tabelle I die für YRP kodierend (d. h. die ”kodierende Region”), sowie eine 5'-untranslatierte Sequenz und 3'-untranslatierte Sequenz.
Außerdem kann das Nukleinsäuremolekül der Erfindung nur einen Teil der Kodierregion einer der Sequenzen oder Moleküle einer Nukleinsäure gemäß Tabelle I, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, das für einen biologisch aktiven Teil eines YRP kodiert, umfassen.
Teile von Proteinen, die von den für YRP kodierenden Nukleinsäuremolekülen der Erfindung kodiert werden, sind vorzugsweise die hier beschriebenen biologisch aktiven Teile. So, wie er hier verwendet wird, soll der Ausdruck ”biologisch aktiver Teil von” einem YRP einen Teil, z. B. eine Domäne/ein Motiv, von einem Protein, das mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten oder gesteigerten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer erhöhten Resistenz und/oder Toleranz gegen niedere Temperatur, in Zusammenhang steht, beinhalten, der an einer gesteigerten Nährstoffnutzungseffizienz, zum Beispiel Stickstoffnutzungseffizienz, und/oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag in einer Pflanze beteiligt ist. Um zu bestimmen, ob ein YRP oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon zu einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten oder gesteigerten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einem gesteigerten Protein, das mit einer Resistenz und/oder Toleranz gegen niedere Temperaturen in Zusammenhang steht, das an einer gesteigerten Nährstoffnutzungseffizienz, zum Beispiel Stickstoffnutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischen Ertrag in einer Pflanze beteiligt ist, führt, kann eine Analyse einer Pflanze umfassend das YRP durchgeführt werden. Solche Analysemethoden sind dem Fachmann gut bekannt, wie in den Beispielen im Detail ausgeführt. Genauer gesagt kann man für biologisch aktive Teile eines YRP kodierende Nukleinsäurefragmente herstellen, indem man einen Teil einer der Sequenzen der Nukleinsäure aus Tabelle I isoliert, den kodierten Teil des YRP oder Peptids exprimiert (z. B. durch rekombinante Expression in vitro) und die Aktivität des kodierten Teils des YRP bzw. Peptids feststellt.
Biologisch aktive Teile eines YRP fallen unter den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung und schließen Peptide ein, die Aminosäuresequenzen enthalten, die sich von der Aminosäuresequenz eines für das YRP kodierenden Gens oder der Aminosäuresequenz eines zum YRP homologen Proteins ableiten, die weniger Aminosäuren einschließen als das vollständige Volllängen-YRP bzw. das zu einem YRP homologe Volllängenprotein und mindestens einen Teil der enzymatischen oder biologischen Aktivität eines YRP zeigt. Typischerweise umfassen biologisch aktive Teile (z. B. Peptide mit einer Länge von zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität eines YRP. Außerdem lassen sich andere biologisch aktive Teile, in denen andere Regionen des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken herstellen und auf eine oder mehrere der hier beschriebenen Aktivitäten auswerten. Vorzugsweise schließen die biologisch aktiven Teile eines YRP eine oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Teile davon mit biologischer Aktivität ein.
Der Ausdruck ”biologisch aktiver Teil” oder ”biologische Aktivität” bezeichnet ein Polypeptid gemäß Tabelle II, Spalte 3, oder einen Teil dieses Polypeptids, der immer noch über mindestens 10% oder 20%, vorzugsweise 30%, 40%, 50% oder 60%, besonders bevorzugt 70%, 75%, 80%, 90% oder 95%, der enzymatischen oder biologischen Aktivität des natürlichen bzw. Ausgangsenzyms bzw. -proteins verfügt.
In dem Verfahren gemäß der Erfindung können Nukleinsäuresequenzen oder -moleküle verwendet werden, welche, falls geeignet, synthetische, nicht-natürliche oder modifizierte Nukleotidbasen enthalten, die in DNA oder RNA eingebaut werden können. Die synthetischen, nicht-natürlichen oder modifizierten Basen können zum Beispiel die Stabilität des Nukleinsäuremoleküls außerhalb oder innerhalb einer Zelle erhöhen. Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können die gleichen Modifikationen wie oben erwähnt enthalten.
So, wie er im vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, kann der Ausdruck ”Nukleinsäuremolekül” auch die am 3'- und am 5'-Ende der kodierenden Genregion befindliche nicht translatierte Sequenz oder das nicht translatierte Molekül, zum Beispiel mindestens 500, vorzugsweise 200, besonders bevorzugt 100, Nukleotide der Sequenz upstream vom 5'-Ende der kodierenden Region und mindestens 100, vorzugsweise 50, besonders bevorzugt 20, Nukleotide der Sequenz stromabwärts vom 3'-Ende der kodierenden Genregion, einschließen. Es ist häufig vorteilhaft, für Klonierungs- und Expressionzwecke nur die kodierende Region auszuwählen.
Vorzugsweise ist das im Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül um das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül.
Ein ”isoliertes” Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül ist von anderen Polynukleotiden oder Nukleinsäuremolekülen getrennt, welche in der natürlichen Quelle des Nukleinsäuremoleküls vorhanden sind. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kann ein chromosomales Fragment von mehreren kb, oder, vorzugsweise, ein Molekül, das nur die kodierende Region des Gens umfasst, sein. Dementsprechend kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung chromosomale Regionen umfassen, die an 5' und 3' angrenzen, oder weitere angrenzende chromosomale Regionen, umfasst jedoch vorzugsweise keine solchen Sequenzen, die die Nukleinsäuremolekülsequenz im genomischen oder chromosomalen Kontext im Organismus, aus dem das Nukleinsäuremolekül stammt, natürlich flankieren (zum Beispiel Sequenzen, die an die für die 5'- und 3'-UTRs des Nukleinsäuremoleküls kodierenden Regionen angrenzen). In verschiedenen Ausführungsformen kann das im Verfahren gemäß der Erfindung verwendete, isolierte Nukleinsäuremolekül zum Beispiel weniger als ungefähr 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen umfassen, welche auf natürliche Weise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle flankieren, aus der das Nukleinsäuremolekül stammt.
Die in dem Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle, zum Beispiel die Polynukleotide der Erfindung oder ein Teil davon, lassen sich unter Anwendung von molekularbiologischen Standardtechniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformationen isolieren. Außerdem können beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzregionen auf DNA- oder Aminosäure-Ebene mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen identifiziert werden. Erstere kann/können als Hybridisierungssonden unter standardmäßigen Hybridisierungstechniken (zum Beispiel denjenigen, beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auf 1., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zum Isolieren weiterer Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, welche in diesem Verfahren nützlich sind.
Ein eine komplette Sequenz des im Verfahren eingesetzten Nukleinsäuremoleküls, zum Beispiel des Polynukleotids der Erfindung, umfassendes Nukleinsäuremolekül oder ein Teil davon lässt sich zusätzlich durch die Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei auf dieser Sequenz oder Teilen davon basierende Oligonukleotidprimer verwendet werden. So kann man zum Beispiel ein die komplette Sequenz oder einen Teil davon umfassendes Nukleinsäuremolekül durch Polymerasekettenreaktion unter Einsatz von Oligonukleotidprimern, die auf Grundlage eben dieser Sequenz erzeugt wurden, isolieren. Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen isolieren (zum Beispiel mittels der Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsmethode von Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)), und die cDNA lässt sich unter Verwendung der reversen Transkriptase (z. B. Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) herstellen.
Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifikation, z. B. wie in Tabelle III, Spalte 7 gezeigt, lassen sich mittels einer Polymerasekettenreaktion auf Basis der hier gezeigten Sequenz, zum Beispiel Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7 oder den von Tabelle II, Spalten 5 und 7 abgeleiteten Sequenzen, herstellen.
Außerdem ist es möglich, konserviertes Protein zu identifizieren, indem man Proteinsequenz-Alignments mit dem durch die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung kodierten Polypeptid, insbesondere mit den von dem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, kodierten Sequenzen durchführt, von denen sich konservierte Regionen und daraus wiederum degenerierte Primer ableiten lassen. Konservierte Regionen sind solche, welche die sehr geringe Variation an der Aminosäure in einer jeweiligen Position von mehreren Homologen unterschiedlicher Herkunft aufzeigen. Die Konsensussequenz und Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV werden aus diesen Alignments hergeleitet. Außerdem ist es möglich, konservierte Regionen von verschiedenen Organismen zu identifizieren, indem man Proteinsequenz-Alignments mit dem von der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung kodierten Polypeptid, insbesondere mit den Sequenzen, die von dem Polypeptidmolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II kodiert werden, durchführt, von denen sich konservierte Regionen und daraus wiederum degenerierte Primer ableiten lassen.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform wird in der Methode der vorliegenden Erfindung die Aktivität eines Polypeptids, das eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv gemäß Tabelle IV, Spalte 7, umfasst bzw. daraus besteht, erhöht, und in einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das eine Konsensussequenz oder ein in Tabelle IV, Spalte 7, gezeigtes Polypeptidmotiv umfasst bzw. daraus besteht, wobei 20 oder weniger, vorzugsweise weniger als 15 oder 10, vorzugsweise weniger als 9, 8, 7, oder 6, besonders, bevorzugt weniger als 5 oder 4, noch mehr bevorzugt weniger als 3, noch mehr bevorzugt weniger als 2, noch mehr bevorzugt 0 der angegebenen Aminosäurepositionen durch eine beliebige Aminosäure ersetzt werden können. Gemäß einer Ausführungsform sind nicht mehr als 15%, vorzugsweise 10%, noch mehr bevorzugt 5%, 4%, 3%, oder 2%, am meisten bevorzugt 1% oder 0% der durch einen Buchstaben bezeichneten Aminosäureposition durch eine andere Aminosäure ersetzt. Gemäß einer Ausführungsform sind 20 oder weniger, vorzugsweise weniger als 15 oder 10, vorzugsweise weniger als 9, 8, 7, oder 6, besonders bevorzugt weniger als 5 oder 4, noch mehr bevorzugt weniger als 3, noch mehr bevorzugt weniger als 2, noch mehr bevorzugt 0 Aminosäuren in eine Konsensussequenz oder ein Proteinmotiv insertiert.
Die Konsensussequenz wurde aus einem multiplen Alignment der Sequenzen, wie sie in Tabelle II aufgelistet sind, abgeleitet. Die Buchstaben stehen für den Ein-Buchstaben-Aminosäurekode und zeigen, dass die Aminosäuren in mindestens 80% der Proteine des Alignments konserviert sind, während der Buchstabe X für Aminosäuren steht, die nicht in mindestens 80% der Sequenzen des Alignments konserviert sind. Die Konsensussequenz beginnt mit der ersten konservierten Aminosäure in dem Alignment und endet mit der letzten konservierten Aminosäure in dem Alignment der untersuchten Sequenzen. Die Anzahl der angegebenen X gibt die Distanzen zwischen konservierten Aminosäureresten an, wobei Y-x(21, 23)-F beispielsweise bedeutet, dass konservierte Tyrosin- und Phenylalaninreste in Alignment durch minimal 21 und maximal 23 Aminosäurereste im Alignment aller betrachteten Sequenzen voneinander getrennt sind.
Konservierte Domänen wurden aus allen Sequenzen identifiziert und sind unter Anwendung einer Untergruppe der standardmäßigen Prosite-Notation beschrieben, wobei z. B. das Muster Y-x(21, 23)-[FW] bedeutet, dass ein konserviertes Tyrosin durch minimal 21 und maximal 23 Aminosäurereste von entweder einem Phenylalanin oder Tryptophan getrennt ist. Die Muster mussten mit mindestens 80% der untersuchten Proteine übereinstimmen. Die konservierten Muster wurden mit dem Software-Tool MEME Version 3.5.1 oder per Hand identifiziert. MEME wurde von Timothy L. Bailey und Charles Elkan, Dept. of Computer Science and Engineering, University of California, San Diego, USA entwickelt und wurde von Timothy L. Bailey und Charles Elkan (Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology, S. 28–36, AAAI Press, Menlo Park, Kalifornien, 1994) beschrieben. Der Quelltext für das Standalone-Programm ist vom San Diego Supercomputer Center (http://meme.sdsc.edu) öffentlich verfügbar. Zum Identifizieren von gemeinsamen Motiven in allen Sequenzen mit dem Software-Tool MEME wurden die folgenden Einstellungen verwendet: -maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0.001, -maxw 60, -distance 1e-3, -minsites, Anzahl von Sequenzen, die für die Analyse verwendet werden. Die Eingabesequenzen für MEME waren nicht-alignierte Sequenzen im Fasta-Format. Andere Parameter wurden in den Standardeinstellungen in dieser Softwareversion verwendet. Prosite-Muster für konservierte Domänen wurden mit dem Software-Werkzeug Pratt, Version 2.1, oder manuell erzeugt. Pratt wurde von Inge Jonassen, Dept. of Informatics, Universität Bergen, Norwegen, entwickelt und wurde von Jonassen et al. (I. Jonassen, J. F. Collins und D. G. Higgins, Finding flexible patterns in unaligned Protein sequences, Protein Science 4 (1995), S. 1587–1595; I. Jonassen, Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph, eingereicht bei CABIOS Febr. 1997] beschrieben. Der Quelltext (ANSI C) für das Standalone-Programm ist öffentlich verfügbar, z. B. bei etablierten Bioinformatik-Zentren, wie dem EBI (Europäisches Bioinformatik-Institut). Zum Erzeugen von Mustern mit dem Software-Tool Pratt wurden die folgenden Einstellungen verwendet: PL (max. Muster-Länge): 100, PN (max. Anz. an Mustersymbolen): 100, PX (max. Anz. aufeinanderfolgender x's): 30, FN (max. Anz. flexibler Spacer): 5, FL (max. Flexibilität): 30, FP (max. Flex. Produkt): 10, ON (max. Anzahl an Mustern): 50. Die Eingabesequenzen für Pratt waren einzelne Regionen der Proteinsequenzen, welche eine hohe Ähnlichkeit aufwiesen, wie identifiziert mit dem Software-Werkzeug MEME. Die Minimumanzahl an Sequenzen, welche mit den erzeugten Mustern übereinstimmen müssen (CM, min. Anz. von Seq., die Übereinstimmung zeigen müssen) wurde auf mindestens 80% der eingegebenen Sequenzen eingestellt. Hier nicht angeführte Parameter wurden in ihren vorgegebenen Einstellungen verwendet. Mit den Prosite-Mustern der konservierten Domänen kann man nach Proteinsequenzen, die diesem Muster entsprechen, suchen. Verschiedene etablierte Bioinformatik-Zentren bieten öffentliche Internetportale an, bei denen man mit diesen Mustern Datenbanksuchen durchführen kann (z. B. PIR (Protein Information Resource, am Georgetown University Medical Center) oder ExPASy (Expert Protein Analysis System)). Alternativ dazu ist eigenständige Software verfügbar, wie etwa das Programm Fuzzpro, welches ein Teil des EMBOSS-Software-Pakets ist. Beispielsweise gestattet das Programm Fuzzpro nicht nur die Suche nach einer exakten Muster-Protein-Übereinstimmung, sondern ermöglicht es auch, verschiedene Mehrdeutigkeiten bei der durchgeführten Suche vorzugeben bzw. einzustellen.
Das Alignment wurde mit der Software ClustalW (Version 1.83) durchgeführt und ist bei Thompson et al. (Nucleic Acids Research 22, 4673 (1994)) beschrieben. Der Quelltext für das Standalone-Programm ist vom European Molecular Biology Laboratory; Heidelberg, Deutschland, öffentlich verfügbar. Die Analyse wurde unter Verwendung der Standardparameter von ClustalW vl.83 durchgeführt (Lücken-Öffnungs-Strafwert: 10,0; Lücken-Erweiterungs-Strafwert: 0,2; Proteinmatrix: Gonnet; Protein/DNA endgap: –1; Protein/DNA-Lückendistanz: 4).
Degenerierte Primer können dann in der PCR zur Amplifizierung von Fragmenten neuer Proteine mit der obenerwähnten Aktivität, die z. B. erhöhten Ertrag, z. B. das erhöhte Ertragsmerkmal, insbesondere die gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, Toleranz gegenüber zyklischer Dürre, Wassernutzungseffizienz, Nutzungseffizienz für Nährstoff (z. B. Stickstoff) und/oder einen erhöhten intrinsischen Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleihen, nach Erhöhen der Expression oder Aktivität oder mit der Aktivität eines Proteins gemäß Tabelle II, Spalte 3, oder weiteren funktionellen Homologen des Polypeptids der Erfindung aus anderen Organismen Verwendung finden.
Diese Fragmente können dann als Hybridisierungssonde zum Isolieren der vollständigen Gensequenz verwendet werden. Als Alternative können die fehlenden 5'- und 3'-Sequenzen mit Hilfe von RACE-PCR isoliert werden. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA oder, als Alternative, genomischer DNA als Matrize und von geeigneten Oligonukleotid-Primern unter Befolgung von standardmäßigen PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Das derartig amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, welche einem der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle entsprechen, können durch standardmäßige Syntheseverfahren, zum Beispiel unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers, erzeugt werden.
Nukleinsäuremoleküle, welche für das Verfahren gemäß der Erfindung vorteilhaft sind, können basierend auf ihrer Homologie zu den hierin offenbarten Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon oder zur Herstellung einer Hybridisierungssonde und gemäß Standardhybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. In diesem Zusammenhang ist es zum Beispiel möglich, eine oder mehrere isolierte Nukleinsäuremoleküle mit einer Länge von mindestens 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 oder mehr Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 15, 20 oder 25 Nukleotiden, die unter stringenten Bedingungen mit den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, insbesondere mit denen, die eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls, das im Verfahren der Erfindung verwendet wird oder für ein in der Erfindung verwendetes Protein kodiert, oder des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung umfassen, einzusetzen. Nukleinsäuremoleküle mit 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden können ebenfalls verwendet werden.
Der Begriff ”Homologie” bedeutet, dass die jeweiligen Nukleinsäuremoleküle oder kodierten Proteine funktionell und/oder strukturell äquivalent sind. Die Nukleinsäuremoleküle, welche homolog zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen sind und welche Derivate der Nukleinsäuremoleküle sind, sind beispielsweise Variationen der Nukleinsäuremoleküle, welche Modifikationen mit der gleichen biologischen Funktion repräsentieren, insbesondere Proteine mit der gleichen oder im Wesentlichen der gleichen biologischen Funktion kodieren. Sie können natürlich vorkommende Variationen, wie Sequenzen aus anderen Pflanzenvarietäten oder -spezies, oder Mutationen sein. Diese Mutationen können natürlich vorkommen oder sie können durch Mutagenesetechniken erhalten werden. Die allelischen Variationen können natürlich vorkommende allelische Varianten sowie synthetisch hergestellte oder gentechnisch erzeugte Varianten sein. Strukturelle Äquivalente lassen sich zum Beispiel identifizieren, indem man die Bindung des Polypeptids an Antikörper testet, oder durch computergestützte Vorhersagen. Strukturäquivalente weisen ähnliche immunologische Charakteristika auf, wobei sie zum Beispiel ähnliche Epitope enthalten.
Mit ”Hybridisieren” ist gemeint, dass derartige Nukleinsäuremoleküle unter herkömmlichen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, hybridisieren, wie z. B. beschrieben von Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6.
Gemäß der Erfindung können sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle der Nukleinsäure der Erfindung als Sonden verwendet werden. Ferner können, als Matrize zur Identifizierung von funktionellen Homologen, sowohl Northern-Blot-Assays als auch Southern-Blot-Assays durchgeführt werden. Der Northern-Blot-Assay liefert vorteilhafterweise weitere Informationen über das exprimierte Genprodukt: z. B. Expressionsmuster, Auftreten der Verabreitungsschritte wie Spleißen und Capping, usw. Der Southern-Blot-Assay liefert zusätzliche Informationen über die chromosomale Lokalisierung und Organisation des für das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierenden Gens.
Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hydridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C, zum Beispiel bei 50°C, 55°C oder 60°C. Der Fachmann weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich in Abhängigkeit vom Typ der Nukleinsäure unterscheiden und, zum Beispiel wenn organische Lösungsmittel vorhanden sind, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers. Die Temperatur unter ”Standard-Hybridisierungsbedingungen” liegt zum Beispiel in Abhängigkeit vom Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 50°C in einem wässrigen Puffer mit einer Konzentration von 0,1 ×, 0,5 ×, 1 ×, 2 ×, 3 ×, 4 × oder 5 × SSC (pH 7,2). Wenn organische(s) Lösungsmittel im oben erwähnten Puffer vorhanden ist/sind, beispielsweise 50% Formamid, beläuft sich die Temperatur unter Standardbedingungen auf ungefähr 40°C, 42°C oder 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride sind beispielsweise bevorzugt 0,1 × SSC und 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C oder 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride sind beispielsweise bevorzugt 0,1 × SSC und 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C oder 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben erwähnten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure von ungefähr 100 Bp (= Basenpaare) Länge und mit einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid ermittelt. Der Fachmann weiß, wie man die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen mit der Hilfe von Lehrbüchern ermittelt, zum Beispiel denjenigen, welche oben erwähnt wurden, oder aus den folgenden Lehrbüchern: Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes und Higgins (Hrsg.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press bei Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press bei Oxford University Press, Oxford.
Ein weiteres Beispiel einer derartigen stringenten Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung bei 4 × SSC bei 65°C, gefolgt von Waschen in 0,1 × SSC bei 65°C während einer Stunde. Alternativ dazu erfolgt eine beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingung in 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C. Ferner können die Bedingungen während des Waschschrittes aus dem Bereich von Bedingungen ausgewählt werden, der von Niederstringenzbedingungen (ungefähr 2 × SSC bei 50°C) und Hochstringenzbedingungen (ungefähr 0,2 × SSC bei 50°C, vorzugsweise bei 65°C) begrenzt wird (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Zusätzlich kann die Temperatur während des Waschschritts von niederstringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, auf höherstringente Bedingungen bei ungefähr 65°C erhöht werden. Die Parameter Salzkonzentration und Temperatur können beide gleichzeitig variiert werden, oder ansonsten kann einer der beiden Parameter konstant gehalten werden, während man den anderen variiert. Denaturierungsmittel, zum Beispiel Formamid oder SDS, können ebenfalls während der Hybridisierung verwendet werden. In Gegenwart von 50% Formamid erfolgt die Hybridisierung vorzugsweise bei 42°C. Relevante Faktoren wie 1) Dauer der Behandlung, 2) Salzbedingungen, 3) Tensidbedingungen, 4) Kompetitor-DNA, 5) Temperatur und 6) gewählte Sonde können von Fall zu Fall kombiniert werden, so dass hier nicht alle Möglichkeiten aufgeführt erden können.
So werden in einer bevorzugten Ausführungsform Northern-Blots mit Rothi-Hybri-Quick-Puffer (Roth, Karlsruhe) 2 h bei 68°C vorhybridisiert. Die Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde erfolgt über Nacht bei 68°C. Die anschließenden Waschschritte werden bei 68°C mit 1 × SSC durchgeführt. Bei den Southern-Blot-Assays wird die Membran 2 h bei 68°C mit Rothi-Hybri-Quick-Puffer (Roth, Karlsruhe) vorhybridisiert. Die Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde erfolgt über Nacht bei 68°C. Anschließend wird der Hybridisierungspuffer verworfen und der Filter kurz mit 2 ×SSC; 0,1% SDS gewaschen. Nachdem der Waschpuffer verworfen wurde, wird neuer 2 × SSC; 0,1% SDS-Puffer zugegeben, und es wird 15 Minuten lang bei 68°C inkubiert. Dieser Waschschritt wird zweimal durchgeführt, woran sich ein zusätzlicher 10-minütiger Waschschritt mit 1 × SSC; 0,1% SDS bei 68°C anschließt.
Einige Beispiele für Bedingungen zur DNA-Hybridisierung (Southern-Blot-Assays) und Waschschritte sind unten gezeigt:

(1) Hybridisierungsbedingungen können zum Beispiel aus den folgenden Bedingungen ausgewählt werden:
(a) 4 × SSC bei 65°C,
(b) 6 × SSC bei 45°C,
(c) 6 × SSC, 100 mg/ml DNA aus denaturiertem fragmentiertem Fischsperma bei 68°C,
(d) 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 mg/ml DNA aus denaturiertem Lachssperma bei 68°C,
(e) 6 × SSC, 0,5% SDS, = 100 mg/ml DNA aus denaturiertem fragmentiertem Lachssperma, 50% Formamid bei 42°C,
(f) 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C,
(g) 50% (v/v) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphbsphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C,
(h) 2 × oder 4 × SSC bei, 50°C (niederstringente Bedingung), oder
(i) 30 bis 40% Formamid, 2 × oder 4 × SSC bei 42°C (niederstringente Bedingung).
(2) Waschschritte können beispielsweise aus den folgenden Bedingungen ausgewählt sein:
(a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% SDS bei 50°C.
(b) 0,1 × SSC bei 65°C.
(c) 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68°C.
(d) 0,1 × SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C.
(e) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C.
(f) 2 ×SSC bei 65°C (niederstringente Bedingung).

Polypeptide mit der obenerwähnten Aktivität, d. h. Polypeptide, die einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal wie hier erwähnt, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Stress, z. B. eine Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, z. B. mit erhöhter Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischem Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleihen und die aus anderen Organismen abgeleitet sind, können durch andere DNA-Sequenzen kodiert sein, die mit den Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, unter niederstringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und die bei der Expression für Peptide kodieren, die einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal wie hier erwähnt, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Stress, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur oder gesteigerte Kältetoleranz, z. B. mit erhöhter Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischem Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleihen
Weiterhin müssen einige Anwendungen bei niederstringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden, ohne dass sich dadurch irgendwelche Konsequenzen für die Spezifität der Hybridisierung ergeben. So könnte man zum Beispiel für eine Southern-Blot-Analyse der Gesamt-DNA als Sonde ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung verwenden und niederstringent waschen (55°C in 2 × SSPE, 0,1% SDS). Die Hybridisierungsanalyse könnte ein einfaches Muster nur mit Genen, die für Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder für im Verfahren der Erfindung verwendete Polypeptide kodieren, z. B. mit der hier erwähnten Aktivität der Steigerung des erhöhten Ertrags, z. B. eines erhöhten Ertragsmerkmals wie hier erwähnt, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber abiotischem Stress, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur oder gesteigerter Kältetoleranz, z. B. mit erhöhter Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischem Ertrag, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, offenbaren. Ein weiteres Beispiel für solche niederstringenten Hybridisierungsbedingungen ist 4 × SSC bei 50°C oder die Hybridisierung mit 30 bis 40% Formamid bei 42°C. Solche Moleküle schließen die ein, bei denen es sich um. Fragmente, Analoga oder Derivate des Polypeptids der Erfindung oder des im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptids handelt und die sich zum Beispiel in Bezug auf eine oder mehrere Aminosäuren- und/oder Nukleotiddeletionen, -insertionen, -substitutionen, -additionen und/oder -rekombinationen oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen entweder alleine oder in Kombination von den oben beschriebenen Aminosäuresequenzen oder ihrer/ihren zugrundeliegenden Nukleotidsequenz(en) unterscheiden. Bevorzugt wendet man jedoch hochstringente Hybridisierungsbedingungen an.
Die Hybridisierung sollte in vorteilhafter Weise mit Fragmenten von mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 oder 40 Bp, vorteilhafterweise mindestens 50, 60, 70 oder 80 Bp, vorzugsweise mindestens 90, 100 oder 110 Bp durchgeführt werden. Am stärksten bevorzugt sind Fragmente mit mindestens 15, 20, 25 oder 30 Bp. Bevorzugt sind auch Hybridisierungen mit mindestens 100 Bp oder 200, insbesondere bevorzugt mindestens 400 Bp Länge. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sollte die Hybridisierung mit der gesamten Nukleinsäuresequenz bei den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt werden.
Die Begriffe ”Fragment”, ”Fragment einer Sequenz” oder ”Teil einer Sequenz” bedeuten eine verkürzte Sequenz der betreffenden ursprünglichen Sequenz. Die verkürzte Sequenz (Nukleinsäure- oder Proteinsequenz) kann in ihrer Länge stark schwanken; die Mindestgröße ist eine Sequenz mit einer Größe, die ausreicht, um eine Sequenz bereitzustellen, die mindestens eine vergleichbare Funktion und/oder Aktivität der betreffenden ursprünglichen Sequenz oder des ursprünglichen moleküls aufweist oder mit dem Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder dem im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremolekül unter stringenten Bedingungen hybridisiert, während die maximal Größe nicht kritisch ist. Bei einigen Anwendungen ist die maximale Größe nicht wesentlich größer als die, die erforderlich ist, um die gewünschte Aktivität und/oder Funktion(en) der ursprünglichen Sequenz bereitzustellen.
Typischerweise wird die verkürzte Aminosäuresequenz bzw. das verkürzte Aminosäuremolekül im Bereich von etwa 5 bis etwa 310 Aminosäuren Länge liegen. Noch typischer wird die Sequenz jedoch eine Länge von maximal etwa 250 Aminosäuren, vorzugsweise maximal etwa 200 oder 100 Aminosäuren, aufweisen. Es ist gewöhnlich wünschenswert, Sequenzen mit mindestens etwa 10, 12 oder 15 Aminosäuren, bis zu einem Maximum von etwa 20 oder 25 Aminosäuren, auszuwählen.
Der Begriff ”Epitop” bezieht sich auf spezifische immunreaktive Stellen innerhalb eines Antigens, welche ebenfalls als antigene Determinanten bekannt sind. Diese Epitope können eine lineare Anordnung von Monomeren in einer polymeren Zusammensetzung – wie etwa Aminosäuren in einem Protein – sein oder aus einer komplexeren Sekundär- oder Tertiärstruktur bestehen, oder diese umfassen. Der Fachmann wird erkennen, dass immunogene (d. h. Substanzen, die zum Hervorrufen einer Immunantwort befähigt sind) Antigene sind; allerdings sind manche Antigene, wie etwa Haptene, keine Immunogene, sondern können durch Kopplung an ein Trägermolekül immunogen gemacht werden. Der Begriff ”Antigen” beinhaltet Bezugnahmen auf eine Substanz, gegen die ein Antikörper erzeugt werden kann und/oder gegen die der Antikörper spezifisch immunreaktiv ist.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Epitop des Polypeptids der vorliegenden Erfindung bzw. des im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptids und verleiht einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal wie hier erwähnt, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Stress, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur oder gesteigerte Kältetoleranz, z. B. mit erhöhter Nährstoffnutzungseffizienz, und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischem Ertrag usw., verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon.
Der Ausdruck ”eine oder mehrere Aminosäuren” bezieht sich auf mindestens eine Äminosäure, jedoch nicht mehr als die Anzahl an Aminosäuren, die eine Homalogie von unter 50% Identität zur Folge haben würde. Vorzugsweise ist die Identität mehr als 70% oder 80%, weiter bevorzugt sind 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% oder 95%, noch weiter bevorzugt sind 96%, 97%, 98% oder 99% Identität.
Weiterhin umfasst das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, bei dem es sich um ein Komplement zu einer der Nukleotidsequenzen der obenerwähnten Nukleinsäuremoleküle oder eines Teils davon handelt. Ein Nukleinsäuremolekül oder dessen Sequenz, das/die komplementär zu einem/einer der Nukleinsäuremoleküle oder -sequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, ist, ist eines, das ausreichend komplementär zu einem/einer der Nukleotidmoleküle oder -sequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7 ist, so dass es mit einer der Nukleotidsequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, unter Bildung eines stabilen Duplex hybridisieren kann. Vorzugsweise wird die Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt. Allerdings ist ein Komplement von einer der hierin offenbarten Sequenzen vorzugsweise ein Sequenzkomplement dazu, in Übereinstimmung mit der dem Fachmann gut bekannten Hasenpaarung von Nukleinsäuremolekülen. So paaren sich zum Beispiel die Basen A und G mit den Basen T und U bzw. C, und umgekehrt. Modifikationen der Basen können den Basenpaarungs-Partner beeinflussen.
Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst eine Nukleotidsequenz, die mindestens etwa 30%, 35%, 40% oder 45%, vorzugsweise mindestens etwa 50%, 55%, 60% oder 65%, besonders bevorzugt mindestens etwa 70%, 80% oder 90%, und ganz besonders bevorzugt mindestens etwa 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer Nukleotidsequenz gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, oder einem Teil davon ist und vorzugsweise die obenerwähnte Aktivität aufweist, insbesondere mit einer ertragserhöhenden Aktivität, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niederen Temperaturen und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, erhöhtem intrinsischem Ertrag und/oder einem sonstigen erwähnten Ertragsmerkmal nach Erhöhung der Aktivität oder einer Aktivität eines Gens gemäß Tabelle I oder eines Genprodukts, zum Beispiel gemäß Tabelle II, Spalte 3, zum Beispiel Expression im Cytosol oder Cytoplasma oder in einer Organelle wie einem Plastiden oder Mitochondrium oder beiden, vorzugsweise in Plastiden.
In einer Ausführungsform werden die Nukleinsäuremoleküle, die in Tabelle I, Spalte 6 mit „plastider” bezeichnet werden, oder Genprodukte, die von diesen Nukleinsäuremolekülen codiert werden, in Kombination mit einem Zielsteuerungssignal wie hierin beschrieben exprimiert.
Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst eine Nukleotidsequenz, die mit einer/einem der Nukleotidsequenzen oder -moleküle gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, oder einem Teil davon vorzugsweise unter wie hier definierten stringenten Bedingungen hybridisiert und für ein Protein mit der obenerwähnten Aktivität kodiert, welches verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, z. B. einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal verleiht, zum Beispiel durch Expression entweder im Cytosol oder in einem Organell wie einem Plastiden oder den Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, und gegebenenfalls die Aktivität, ausgewahlt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) davon verleiht.
Außerdem kann das Nukleinsäuremolekül der Erfindung nur einen Teil der kodierenden Region einer der Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, aufweisen, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann oder ein Fragment, das für einen biologisch aktiven Teil des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder eines im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptids kodiert, d. h. eines Polypeptids mit der obenerwähnten Aktivität, das z. B. einen erhöhten Ertrag, z. B. mit einem erhöhtem Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhter Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleiht, wenn dessen Aktivität erhöht wird, zum Beispiel durch Expression entweder im Cytosol oder in einem Organell wie einem Plastiden oder den Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden. Die durch Klonieren des vorliegenden, für das erfindungsgemäße Protein kodierenden Gens bestimmten Nukleotidsequenzen ermöglichen die Herstellung von Sonden und Primern, die auf die Identifizierung und/oder Klonierung ihrer Homologe in anderen Zelltypen und Organismen zugeschnitten sind. Die Sonde/der Primer umfasst typischerweise im Wesentlichen gereinigtes Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst typischerweise eine Region einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit mindestens etwa 12, 15, vorzugsweise etwa 20 oder 25, besonders bevorzugt etwa 40, 50 oder 75, aufeinanderfolgen den Nukleotiden eines Sense-Strangs einer der z. B. in Tabelle I, Spalten 5 und 7, angeführten Sequenzen, einer Antisense-Sequenz einer der z. B. in Tabelle I, Spalten 5 und 7, angeführten Sequenzen oder natürlich vorkommenden Mutanten davon hybridisiert. Auf einem Nukleotid der Erfindung basierende Primer können in PCR-Reaktionen zum Klonieren von Homologen des Polypeptids der Erfindung oder des im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptids verwendet werden, z. B. als die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Primer, z. B. wie in den Beispielen gezeigt. Eine PCR mit den Primern gemäß Tabelle III, Spalte 7, führt zu einem Fragment des Genprodukts gemäß Tabelle II, Spalte 3.
Primer-Sets sind austauschbar. Dem Fachmann ist bekannt, wie man diese Primer kombiniert, um zu dem gewünschten Produkt zu gelangen, z. B. in einem Vollängenklon oder einer Teilsequenz. Auf den Sequenzen des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder des im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls basierende Sonden lassen sich einsetzen, um Transkripte oder für diese kodierende genomische Sequenzen oder homologe Proteine nachzuweisen. Die Sonde kann ferner eine daran gebundene Markierungsgruppe umfassen, wobei die Markierungsgruppe z. B. ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Cofaktor sein kann. Solche Sonden können als Teil eines Testkits für genomische Marker zur Identifizierung von Zellen, die ein Polypeptid der Erfindung oder ein im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendetes Polypeptid exprimieren, verwendet werden, wie z. B. durch die Messung einer Konzentration eines kodierenden Nukleinsäuremoleküls in einer Probe von Zellen, z. B. indem man mRNA-Konzentrationen nachweist oder bestimmt, ob ein die Sequenz des Polynukleotids der Erfindung oder des in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Polynukleotids enthaltendes genomisches Gen mutiert oder deletiert worden ist.
Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodiert für ein Polypeptid oder einen Teil davon, der eine Aminosäuresequenz einschließt, die ausreichend homolog zu der Aminosäuresequenz gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, ist, so dass das Protein oder der Teil davon die Fähigkeit beibehält, zur Ertragserhöhung, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, beizutragen; dies schließt insbesondere die Erhöhung der wie oben erwähnten oder wie in den Beispielen beschriebenen Aktivität in Pflanzen ein.
So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck ”ausreichend homolog” auf Proteine oder Teile davon mit Aminosäuresequenzen, die eine Mindestzahl zu einer Aminosäuresequenz gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, identischen. oder äquivalenten Aminosäureresten (z. B. einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung) einschließen, so dass das Protein oder der Teil davon dazu fähig ist, zur Ertragserhöhung, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, beizutragen. Zum Beispiel mit der Aktivität eines wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigten und wie hier beschriebenen Proteins.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure, die für einen Teil des Proteins der vorliegenden Erfindung kodiert. Das Protein ist mindestens etwa 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens etwa 55%, 60%, 65% oder 70%, und besonders bevorzugt mindestens etwa 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% oder 94% und ganz besonders bevorzugt mindestens etwa 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer ganzen Aminosäuresequenz von Tabelle II, Spalten 5 und 7, und hat die obenerwähnte Aktivität, z. B. verleiht sie einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, zum Beispiel durch Expression entweder im Cytosol oder in einer Organelle wie einem Plastiden oder den Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden.
Teile von durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodierten Proteinen sind vorzugsweise biologisch aktiv, vorzugsweise mit der obenerwähnten kommentierten Aktivität, z. B. indem sie nach Erhöhung der Aktivität einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhter Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon verleihen.
Wie hier erwähnt soll der Ausdruck „biologisch aktiver Teil” einen Teil, z. B. eine Domäne/ein Motiv, einschließen, der einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhter Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleiht oder eine immunologische Aktivität aufweist, so dass er an einen Antikörper bindet, der spezifisch an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein im Verfahren der vorliegenden Erfindung für einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verwendetes Polypeptid bindet.
Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die sich aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von einer der Nukleotidsequenzen gemäß Tabelle IA, Spalten und 7, (und Teilen davon) unterscheiden und somit für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, insbesondere ein Polypeptid mit der obenerwähnten Aktivität, z. B. wie die durch die Sequenzen gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, wiedergegebenen Polypeptide oder die funktionellen Homologe, kodieren. Vorteilhafterweise umfasst oder, gemäß einer anderen Ausführungsform, hat das Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, umfasst oder, gemäß einer anderen Ausführungsform, hat, oder die funktionellen Homologen kodiert. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül der Erfindung für ein Volllängenprotein, das im Wesentlichen homolog zu einer Aminosäuresequenz gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, oder den funktionellen Homologen ist. In einer Ausführungsform jedoch besteht das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung nicht aus der Sequenz gemäß Tabelle I, vorzugsweise Tabelle IA, Spalten 5 und 7.
Darüber hinaus wird es der Fachmann auf dem Gebiet richtig verstehen, dass die DNA-Sequenzpolymorphismen, welche zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen führen, innerhalb einer Population vorkommen können. Solche genetischen Polymorphismen beim für das Polypeptid der Erfindung kodierenden oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung enthaltenden Gen können aufgrund der natürlichen Variation zwischen Individuen in einer Population vorhanden sein.
So, wie sie hier verwendet werden, beziehen sich die Ausdrücke ”Gen” und ”rekombinantes Gen” auf Nukleinsäuremoleküle, die einen offenen Leserahmen enthalten, der für das Polypeptid der Erfindung kodiert, oder die das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfassen oder die für das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid kodieren, vorzugsweise aus einer Kulturpflanze oder aus einem Mikroorganismus, der sich für das Verfahren der Erfindung eignet. Solche natürlichen Variationen können typischerweise eine 1–5%ige Varianz in der Nukleotidsequenz des Gens zur Folge haben. Alle diese Nukleotidvariationen und die resultierenden Aminosäurepolymorphismen in Genen, die für ein Polypeptid der Erfindung kodieren oder ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfassen, die auf die natürliche Variation zurückzuführen sind und die die beschriebene funktionelle Aktivität nicht verändern, sollen mit in den Schutzumfang der Erfindung fallen.
Nukleinsäuremoleküle, die den natürlichen Variantenhomologen eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung entsprechen und bei denen es sich auch um eine cDNA handeln kann, können auf Grundlage ihrer Homologie mit den hier offenbarten Nukleinsäuremolekülen isoliert werden, wobei man das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder einen Teil davon als eine Hybridisierungssonde gemäß den Standard-Hybridisierungtechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen verwendet.
Dementsprechend hat gemäß einer anderen Ausführungsform ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Länge von mindestens 15, 20, 25 oder 30 Nukleotiden. Vorzugsweise hybridisiert es unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung oder des im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls, z. B. vorzugsweise die Sequenz gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, umfasst. Das Nukleinsäuremolekül hat vorzugsweise eine Länge von mindestens 20, 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden.
Der Begriff ”hybridisiert unter stringenten Bedingungen” ist oben stehend definiert. Gemäß einer Ausführungsform soll der Ausdruck ”hybridisiert unter stringenten Bedingungen” Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, bei denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 30%, 40%, 50% oder 65% identisch zueinander sind, typischerweise miteinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen so, dass die Sequenzen, die mindestens etwa 70%, besonders bevorzugt mindestens etwa 75% oder 80%, und ganz besonders bevorzugt mindestens etwa 85%, 90% oder 95% oder mehr identisch zueinander sind, typischerweise miteinander hybridisiert bleiben.
Vorzugsweise entspricht das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das unter stringenten Bedingungen mit einer Sequenz gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül der Erfindung. So wie hier verwendet, bezieht sich ”natürlich vorkommendes” Nukleinsäuremolekül auf ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer in der Natur vorkommenden Nukleotidsequenz (die z. B. für ein natürliches Protein kodiert). Vorzugsweise kodiert das Nukleinsäuremolekül für ein natürliches Protein mit der obenerwähnten Aktivität, das nach der Erhöhung der Expression oder Aktivität davon oder der Aktivität eines Proteins der Erfindung oder eines im Verfahren der Erfindung verwendeten Proteins, zum Beispiel durch Expression der Nukleinsäuresequenz des Genprodukts im Cytosol und/oder in einer Organelle wie einem Plastiden oder den Mitochondrien, vorzugsweise in Plastiden, z. B. eine Ertragserhöhung, zum Beispiel eine Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel eine Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrages und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, verleiht.
Dem Fachmann wird weiterhin bewusst sein, dass zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Varianten der Sequenzen des Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls der Erfindung sowie des im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls, die in der Population vorhanden sein können, Veränderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz, des Nukleinsäuremoleküls, das für das Polypeptid der Erfindung oder das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid kodiert, eingeführt werden können, wodurch es zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids kommt, ohne dass die funktionelle Fähigkeit des Polypeptids beeinträchtigt wird und vorzugsweise die Aktivität nicht abnimmt.
So kann man zum Beispiel in einer Sequenz des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder eines im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls, z. B. Nukleotidsubstitutionen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, vornehmen, die zu Aminosäuresubstitutionen bei ”nicht essentiellen” Aminosäureresten führen.
Ein ”nicht essentieller” Aminosäurerest ist ein Rest, der in der Wildtyp-Sequenz geändert werden kann, ohne dass sich die Aktivität des Polypeptids ändert, während ein ”essentieller” Aminosäurerest für eine wie oben erwähnte Aktivität benötigt wird, was z. B. zu einer Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrages und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon in einem Organismus führt, nachdem die Aktivität des Polypeptids erhöht wurde. Andere Aminosäurereste jedoch (z. B. die, die in der Domäne mit der besagten Aktivität nicht konserviert oder nur teilweise konserviert sind) können nicht essentiell für die Aktivität sein und sind daher wahrscheinlich für Veränderungen zugänglich, ohne dass dabei die Aktivität verändert wird.
Ferner weiß der Fachmann auf dem Gebiet, dass sich die Codon-Verwendung zwischen Organismen unterscheiden kann. Daher kann er die Codon-Verwendung im Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung an die Verwendung des Organismus oder des Zellkompartiments, zum Beispiel des Plastids oder der Mitochondrien, in dem/in denen das Polynukleotid bzw. Polypeptid exprimiert wird, anpassen.
Dementsprechend betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für ein Polypeptid mit der obenerwähnten Aktivität kodieren, in einem Organismus oder Teilen davon, zum Beispiel durch Expression entweder im Cytosol oder in einem Organell wie einem Plastiden oder den Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, die Veränderungen bei den Aminosäureresten enthalten, die nicht essentiell für diese Aktivität sind. Solche Polypeptide unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer in den Sequenzen gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, enthaltenen Sequenz, haben aber immer noch die hier beschriebene Aktivität. Das Nukleinsäuremolekül kann eine für ein Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz umfassen, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens etwa 50% identisch zu einer Aminosäuresequenz gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, ist und nach der Erhöhung ihrer Aktivität dazu in der Lage ist, zu der Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrages und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, beizutragen, z. B. dessen Expression zum Beispiel durch Expression entweder im Cytosol oder in einem Organell wie einem Plastiden oder den Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden. Vorzugsweise ist das durch das Nukleinsäuremolekül kodierte Protein mindestens etwa 60% identisch mit der Sequenz gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, besonders bevorzugt mindestens etwa 70% identisch mit einer der Sequenzen gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, noch mehr bevorzugt mindestens etwa 80%, 90%; 95% homolog zu der Sequenz gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, und ganz besonders bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit der Sequenz gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität, hier austauschbar verwendet) von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuremolekülen werden die Sequenzen für einen optimalen Vergleich untereinander geschrieben (man kann zum Beispiel Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure einfügen, um eine optimale Ausrichtung mit dem anderen Protein bzw. der anderen Nukleinsäure zu erzielen).
Dann werden die Aminosäurereste oder Nukleinsäuremoleküle an den entsprechenden Aminosäurepositionen bzw. Nukleotidpositionen verglichen. Ist eine Position in einer Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest bzw. das gleiche Nukleinsäuremolekül wie die entsprechende Position in der anderen Sequenz belegt, so sind die Moleküle in dieser Position homolog (d. h. Aminosäure- oder Nukleinsäure”homologie” wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet entspricht einer Aminosäure- bzw. Nukleinsäure”identität”). Die prozentuale Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die von den Sequenzen geteilt werden (d. h. Homologie = Anzahl an identischen Positionen/Gesamtanzahl an Positionen × 100). Die Ausdrücke ”Homologie” und ”Identität” sind somit als Synonyme anzusehen.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität) von zwei oder mehr Aminosäuren oder von zwei oder mehr Nukleotidsequenzen wurden mehrere Computersoftware-Programme entwickelt. Die Homologie von zwei oder mehr Sequenzen lässt sich zum Beispiel mit der fasta-Software berechnen, die in der vorliegenden Erfindung in Version fasta 3 verwendet wurde (W. R. Pearson und D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988); W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 63 (1990); W. R. Pearson und D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988); W. R. Pearson, Enzymology 183, 63 (1990)). Ein anderes nützliches Programm für die Berechnung von Homologien verschiedener Sequenzen ist das standardmäßige Blast-Programm, welches in der Biomax-Pedant-Software (Biomax, München, Bundesrepublik Deutschland) enthalten ist. Dieses führt unglücklicherweise manchmal zu suboptimalen Ergebnissen, da Blast nicht immer vollständige Sequenzen der Datenbanksequenz (Subject) und der Suchsequenz (Query) beinhaltet. Da dieses Programm nichtsdestoweniger sehr effizient ist, kann es für den Vergleich einer gewaltigen Anzahl von Sequenzen verwendet werden. Die folgenden Einstellungen werden typischerweise für einen derartigen Vergleich von Sequenzen verwendet: -p Program Name [String]; -d Database [String]; default = nr; -i Query File [File In]; default = stdin; -e Expectation value (E) [Real]; default = 10.0; -m alignment view options: 0 = pairwise; 1 = query-anchored showing identities; 2 = query-anchored no identities; 3 = flat query-anchored, show identities; 4 = flat query-anchored, no identities; 5 = query-anchored no identities and blunt ends; 6 = flat query-anchored, no identities and blunt ends; 7 = XML Blast output; 8 = tabular; 9 tabular with comment lines [Integer]; default = 0; -o BLAST report Output File [File Out] Optional; default = stdout; -F Filter query sequence (DUST with blastn, SEG with others) [String]; default = T; -G cost to open a gap (zero invokes default behavior) [Integer]; default = 0; -E Cost to extend a gap (zero invokes default behavior) [Integer]; default = 0; -X X dropoff value for gapped alignment (in bits) (zero invokes default behavior); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, all others 15 [Integer]; default = 0; -I Show GI's in deflines [T/F]; default = F; -q Penalty for a nucleotide mismatch (blastn only) [Integer]; default = -3; -r Reward for a nucleotide match (blastn only) [Integer]; default = 1; -v Number of database sequences to show one-line descriptions for (V) [Integer]; default = 500; -b Number of database sequence to show alignments for (B) [Integer]; default = 250; -f Threshold for extending hits, default if zero; blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast 0 [Integer]; default = 0; -g Perfom gapped alignment (not available with tblastx) [T/F]; default = T; -Q Query Genetic code to use [Integer]; default = 1; -D DB Genetic code (for tblast [nx] only) [Integer]; default = 1; -a Number of processors to use [Integer]; default = 1; -O SeqAlign file [File Out] Optional; -J Believe the query defline [T/F]; default = F; -M Matrix [String]; default = BLOSUM62; -W Word size, default if zero (blastn 11, megablast 28, all others 3) [Integer]; default = 0; -z Effective length of the database (use zero for the real size) [Real]; default = 0; -K Number of best hits from a region to keep (off by default, if used a value of 100 is recommended) [Integer]; default = 0; -P 0 for multiple hit, 1 for single hit [Integer]; default = 0; -Y Effective length of the search space (use zero for the real size) [Real]; default = 0; -S Query strands to search against database (for blast [nx], and tblastx); 3 is both, 1 is top, 2 is bottom [Integer]; default = 3; -T Produce HTML Output [T/F]; default -F; -l Restrict search of database to list of GI's [String] Optional; -U Use lower case filtering of FASIA sequence [T/F] Optional; default F; -y X dropoff value for ungapped extensions in bits (0.0 invokes default behavior); blastn 20, megablast 10, all others 7 [Real]; default = 0.0; -Z X dropoff value for final gapped alignment in bits (0.0 invokes default behavior); blastn/megablast 50, tblastx 0, all others 25 [Integer]; default = 0; -R PSI-TBLASTN checkpoint file [File In] Optional; -n MegaBlast search [T/F]; default = F; -L Location an query sequence [String] Optional; -A Multiple Hits window size, default if zero (blastn/megablast 0, all others 40 [Integer]; default = 0; -w Frame shift penalty (OOF algorithm for blastx) [Integer]; default = 0; -t Length of the largest intron allowed in tblastn for linking HSPs (0 disables linking) [Integer]; default = 0.
Ergebnisse von hoher Qualität werden durch Verwenden des Algorithmus von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman erreicht. Deshalb werden Programme, die auf den genannten Algorithmen basieren, bevorzugt. Vorteilhafterweise können die Vergleiche von Sequenzen mit dem Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351 (1987), Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989)) oder vorzugsweise mit den Programmen „Gap” und „Needle”, welche beide auf den Algorithmen von Needleman und Wunsch basieren (J. Mol. Biol. 48; 443 (1970)), sowie „Best-Fit”, welches auf dem Algorithmus von Smith und Waterman basiert (Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981)), durchgeführt werden. „Gap” und „BestFit” sind Teil des GCG-Software-Pakets [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)), „Needle” ist Teil der The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS) (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)). Deshalb werden die Berechnungen zur Bestimmung der Prozentsätze der Sequenzhomologie vorzugsweise mit den Programmen ”Gap” oder ”Needle” über den gesamten Bereich der Sequenzen hinweg durchgeführt. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen wurden für ”Needle” verwendet: Matrix: EDNAFULL, Gap_penalty: 10,0, Extend_penalty: 0.5. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen wurden für ”Gap” verwendet: Lücken-Gewichtung: 50, Längen-Gewichtung: 3, mittlere Übereinstimmung: 10,000, mittlere Fehlpaarung: 0,000.
So ist zum Beispiel eine Sequenz, die 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 65 auf Nukleinsäureebene hat, so zu verstehen, dass hiermit. eine Sequenz gemeint ist, die beim Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 65 mittels des obigen Programms ”Needle” mit dem obigen Parametersatz 80% Homologie aufweist.
Homologie zwischen zwei Polypeptiden ist so zu verstehen, dass damit die Identität der Aminosäuresequenz über jeweils die gesamte Sequenzlänge gemeint ist, die durch Vergleich mit Hilfe des obigen ”Needle”-Programms unter Verwendung von Matrix: EBLOSUM62, Gap_penalty: 8.0, Extend_penalty: 2.0 berechnet wird.
Zum Beispiel versteht es sich, dass eine Sequenz, welche eine 80%ige Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 66 auf Proteinebene aufweist, eine Sequenz bedeutet, welche bei einem Vergleich zur Sequenz SEQ ID NO: 66 mittels des obigen Programms ”Needle” mit dem obigen Parametersatz 80% Homologie aufweist.
Von der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitete funktionelle Äquivalente haben eine Homologie von mindestens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, bevorzugt mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 85% oder 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, 97%, 98% oder 99% mit einem der erfindungsgemäßen Polypeptide gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, und kodieren für Polypeptide mit im Wesentlichen den gleichen Eigenschaften wie das Polypeptid gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7. Funktionelle Äquivalente, die sich durch Substitution, Insertion oder Deletion von einem der erfindungsgemäßen Polypeptide gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, ableiten, haben eine Homologie von mindestens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, bevorzugt mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 85% oder 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, 97%, 98% oder 99% mit einem der erfindungsgemäßen Polypeptide gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, und zeichnen sich durch im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie das Polypeptid gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, aus.
”Im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften” eines funktionellen Äquivalents ist vor allem so zu verstehen, dass das funktionelle Äquivalent die obenerwähnte Aktivität hat, zum Beispiel durch Expression entweder im Cytosol oder in einer Organelle wie einem Plastiden oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, und dabei die Menge an Protein, die Aktivität oder die Funktion dieses funktionellen Äquivalents in einem Organismus, z. B. einem Mikroorganismus, einer Pflanze oder pflanzlichem oder tierischem Gewebe, Pflanzen- oder Tierzellen oder einem Teil davon erhöht.
Ein Nukleinsäuremolekül, das für ein Homolog zu einer Proteinsequenz aus Tabelle II, Spalten 5 und 7 kodiert, lässt sich erzeugen, indem man eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung einführt, insbesondere aus Tabelle I, Spalten 5 und 7, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen bzw. -deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Mutationen lassen sich durch Standardtechniken wie ortsgerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese in die Codiersequenzen von Tabelle I, Spalten 5 und 7, einführen.
Vorzugsweise führt man bei einem oder mehren der vorhergesagten nicht essentiellen Aminosäurereste konservative Aminosäuresubstitutionen durch. Eine ”konservative Aminosäuresubstitution” ist eine solche, bei welcher der Aminosäurerest mit einem Aminosäurerest ersetzt wird, der eine ähnliche Seitenkette enthält. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind im Stand der Technik definiert. Diese Familien schließen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht polaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) ein.
Somit wird ein vorhergesagter nicht essentieller Aminosäurerest in einem Polypeptid der Erfindung oder einem im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptid vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Familie ersetzt. Alternativ dazu kann man gemäß einer anderen Ausführungsform Mutationen zufällig entlang einer Codiersequenz oder einem Teil davon eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder eines im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls einführen, zum Beispiel durch Sättigungsmutagene, und die erhaltenen Mutanten können auf im vorliegenden Text beschriebene Aktivität gescreent werden, um Mutanten zu identifizieren, die eine oben erwähnte Aktivität beibehalten oder sogar erhöhte oben erwähnte Aktivität aufweisen, wie solche, die z. B. einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, verleihen.
Nach der Mutagenese einer der hier gezeigten Sequenzen kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann zum Beispiel unter Anwendung von hier beschriebenen Assays (siehe Beispiele) bestimmt werden.
Die größte Homologie des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküls wurde für die folgenden Dateieinträge durch eine Gap-Suche gefunden.
Homologe der verwendeten Nukleinsäuresequenzen mit der Sequenz gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7, umfassen auch allelische Varianten mit mindestens ungefähr 30%, 35%, 40% oder 45% Homologie, vorzugsweise mindestens ungefähr 50%, 60% oder 70%, besonders bevorzugt mindestens ungefähr 90%, 91%, 92%, 93%, 94% oder 95% und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Homologie mit einer der gezeigten Nukleotidsequenzen oder der obenerwähnten abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen oder ihren Homologen, Derivaten oder Analoga oder Teilen von diesen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden der gezeigten Sequenzen, vorzugsweise aus Tabelle I, Spalten 5 und 7, oder von den abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen erhalten lassen, wobei jedoch die Enzymaktivität oder die biologische Aktivität der resultierenden synthetisierten Proteine vorteilhafterweise erhalten oder erhöht werden sollte.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül die Sequenzen gemäß einer der Spalten 5 und 7 von Tabelle I. Vorzugsweise umfasst das Nukleinsäuremolekül so wenig wie möglich andere, nicht in einer der Spalten 5 und 7 von Tabelle I gezeigte Nukleotide. Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50 oder 40 weitere Nukleotide. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 30, 20 oder 10 weitere Nukleotide. Gemäß einer Ausführungsform ist das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül identisch mit den Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7.
Ebenfalls bevorzugt kodiert das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid, das die Sequenz gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, umfasst. Gemäß einer Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül für weniger als 150, 130, 100, 80, 60, 50, 40 oder 30 weitere Aminosäuren. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das kodierte Polypeptid weniger als 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 oder 5 weitere Aminosäuren. Gemäß einer im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Ausführungsform ist das kodierte Polypeptid identisch zu den Sequenzen gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7.
Gemäß einer Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das im Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid, das die Sequenz gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, umfasst, und umfasst weniger als 100 weitere Nukleotide. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst dieses Nukleinsäuremolekül weniger als 30 weitere Nukleotide. Gemäß einer Ausführungsform ist das in dem Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül identisch zu einer Codiersequenz der Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalten 5 und 7.
Polypeptide (= Proteine), die noch über die essentielle biologische oder enzymatische Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verfügen und, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, Wildtyppflanze oder einem Teil davon, einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verleihen, d. h. deren Aktivität im Wesentlichen nicht reduziert ist, sind Polypeptide mit mindestens 10% oder 20%, vorzugsweise 30% oder 40%, besonders bevorzugt 50% oder 60%, ganz besonders bevorzugt 80% oder 90% oder mehr der biologischen Aktivität bzw. Enzymaktivität des Wildtyps; vorzugsweise ist die Aktivität im Vergleich mit der Aktivität eines Polypeptids gemäß Tabelle II, Spalten 5 und 7, exprimiert unter identischen Bedingungen, im Wesentlichen nicht reduziert.
Homologe von Tabelle I, Spalten 5 und 7 oder von den abgeleiteten Sequenzen von Tabelle II, Spalten 5 und 7 schließen auch verkürzte Sequenzen, cDNA, einzelsträngige DNA oder RNA der kodierenden und nicht kodierenden DNA-Sequenz ein. Homologe dieser Sequenzen sind auch so zu verstehen, dass damit Derivate gemeint. sind, die nicht kodierende Regionen enthalten, wie zum Beispiel UTRs, Terminatoren, Enhancer oder Promotervarianten. Die Promoter upstream von den angegebenen Nukleotidsequenzen können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen modifiziert sein, ohne dass jedoch die Funktionalität oder Aktivität der Promoter, der offenen Leserahmen (open reading frame, ORF) oder der 3'-regulatorischen Region wie Terminatoren oder andere 3'-regulatorische Regionen, die weit von ORF entfernt sind, beeinträchtigt ist. Es ist weiterhin möglich, dass die Aktivität der Promoter durch die Modifikation ihrer Sequenz erhöht ist, oder dass sie vollständig durch aktivere Promoter ersetzt sind, selbst Promoter aus heterologen Organismen. Geeignete Promoter sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind hierin nachstehend erwähnt.
Zusätzlich zu den für die oben beschriebenen YRPs kodierenden Nukleinsäuremolekülen betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung negative Regulatoren der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, ausgewählt aus der Gruppe gemäß Tabelle I, Spalten 5 und/oder 7, vorzugsweise Spalte 7. Man nimmt an, dass Antisense-Polynukleotide dazu die herunterregulierende Aktivität dieser negativen Regulatoren inhibieren, indem sie sich spezifisch an das Target-Polynukleotid binden und Transkription, Spleißen, Transport, Translation und/oder Stabilität des Target-Polynukleotids stören. Methoden zum Targeting des Antisense-Polynukleotids auf die chromosomale DNA, auf ein primäres RNA-Iranskript oder auf eine prozessierte mRNA sind im Stand der Technik beschrieben. Vorzugsweise schließen die Target-Regionen Spleißstellen, Translationsinitiationscodons, Translationsterminationscodons und andere Sequenzen im offenen Leseraster ein.
Der Ausdruck „antisense” bezieht sich für die Zwecke der Erfindung auf eine Nukleinsäure, die ein Polynukleotid umfasst, das ausreichend komplementär zu einem ganzen oder einem Teil eines Gens, primären Transkripts oder prozessierter mRNA ist, so dass die Expression des endogenen Gens gestört wird. „Komplementäre” Polynukleotide sind solche, die zur Basenpaarung gemäß den Standard-Komplementaritätsregeln von Watson-Crick fähig sind. Spezifisch bilden Purine Basenpaare mit Pyrimidinen unter Bildung einer Kombination von Guanin gepaart mit Cytosin (G:C) und Adenin gepaart mit entweder Thymin (A:T) im Fall von DNA oder Adenin gepaart mit Uracil (A:U) im Fall von RNA. Es versteht sich, dass zwei Polynukleotide miteinander hybridisieren können, selbst wenn sie nicht vollständig komplementär zueinander sind, vorausgesetzt, dass jedes mindestens eine Region aufweist, die im Wesentlichen komplementär zu der anderen ist. Der Ausdruck ”Antisense-Nukleinsäure” schließt einzelsträngige RNA sowie doppelsträngige DNA-Expressionskassetten ein, die transkribiert werden können, wodurch man eine Antisense-RNA erhält. ”Aktive” Antisense-Nukleinsäuren sind Antisense-RNA-Moleküle, die dazu in der Lage sind, selektiv mit einem negativen Regulator der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein Polypeptid mit mindestens 80% Sequenzidentität mit dem aus der Gruppe gemäß Tabelle II, Spalten 5 und/oder 7, vorzugsweise Spalte 7, ausgewählten Polypeptid kodiert, zu hybridisieren.
Die Antisense-Nukleinsäure kann komplementär zu einem ganzen negativen Regulatorstrang oder zu nur einem Teil davon sein. Gemäß einer Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül antisense zu einer „nicht kodierenden Region” des kodierenden Strangs einer für ein YRP kodierenden Nukleotidsequenz. Der Ausdruck ”nicht kodierende Region” bezieht sich auf die kodierende Region flankierende 5'- und 3'-Sequenzen, die nicht in Aminosäuren translatiert werden (d. h. die auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet werden) Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu nur einem Teil der nicht kodierenden Region der YRP-mRNA sein. So kann das Antisense-Oligonukleotid zum Beispiel komplementär zur die Translation-Startstelle der YRP-mRNA umgebenden Region sein. Ein Antisense-Oligonukleotid kann zum Beispiel eine Länge von etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden haben. Typischerweise enthalten die Antisense-Moleküle der vorliegenden Erfindung eine RNA mit 60–100% Sequenzidentität mit mindestens 14 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer nicht kodierenden Region einer der Nukleinsäuren aus Tabelle I. Vorzugsweise beträgt die Sequenzidentität mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% und ganz besonders bevorzugt 99%.
Eine Antisense-Nukleinsäure der Erfindung lässt sich durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen unter Anwendung von im Stand der Technik bekannnten Vorschriften konstruieren. So kann eine Antisense-Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) zum Beispiel unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder verschieden modifizierten Nukleotiden, die so beschaffen sind, dass sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen oder die physikalische Stabilität der zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuren gebildeten Duplex erhöhen, chemisch synthetisiert werden; man kann z. B. Phosphorthioatderivate und acridinsubstituierte Nukleotide einsetzen. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die zur Bildung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, schließen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-GalactosylQueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-MannosylQueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, acp3 und 2,6-Diaminopurin ein. Alternativ dazu kann man die Antisense-Nukleinsäure biologisch mit einem Expressionsvektor herstellen, in den eine Nukleinsäure in einer Antisense-Richtung subkloniert wurde (d. h. die von der insertierten Nukleinsäure transkribierte RNA hat eine Antisense-Orientierung zu einer betreffenden Target-Nukleinsäure, im nächsten Unterabschnitt eingehender beschrieben).
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung um ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifisch doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, bei welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al., Nucleic Acids. Res. 15, 6625 (1987)). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15, 6131 (1987)) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al., FEBS Lett. 215, 327 (1987)) enthalten.
Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung werden typischerweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA hybridisieren oder daran binden. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen oder, zum Beispiel im Fall eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, das an DNA-Duplexe bindet, über spezifische Wechselwirkungen in der Hauptfurche der Doppelhelix. Das Antisense-Molekül kann so modifiziert sein, dass es spezifisch an einen Rezeptor oder ein auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiertes Antigen bindet, z. B. indem man das Antisense-Nukleinsäuremolekül an ein Peptid oder einen Antikörper bindet, das/der an einen Zelloberflächenrezeptor oder -antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch mit den hier beschriebenen Vektoren an Zellen verabreicht werden. Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen der Antisense-Moleküle zu erreichen, sind Vektorkonstrukte, in denen sich das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken prokaryontischen, viralen oder eukaryontischen (einschließlich Pflanzen-) Promoters befindet, bevorzugt.
Als Alternative zu Antisense-Polynukleotiden kann man Ribozyme, Sense-Polynukleotide oder doppelsträngige RNA (dsRNA) einsetzen, um die Expression eines YRP-Polypeptids zu reduzieren. Mit ”Ribozym” ist ein katalytisches Enzym auf RNA-Basis mit Ribonukleaseaktivität gemeint, das dazu in der Lage ist, eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, zu der es eine komplementäre Region aufweist, zu spalten. Ribozyme (z. B. in Haselhoff und Gerlach, Nature 334, 585 (1988), beschriebene Hammerkopf-Ribozyme) lassen sich verwenden, um YRP-mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten und somit die Translation von YRP-mRNA zu inhibieren. Ein Ribozym mit Spezifität für eine für das YRP kodierende Nukleinsäure lässt sich auf Grundlage der wie hier offenbarten Nukleotidsequenz einer YRP-cDNA oder auf Grundlage einer gemäß in der vorliegenden Erfindung gelehrter Methoden isolierten heterologen Sequenz entwickeln. So kann man zum Beispiel ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS-RNA konstruieren, bei der die Nukleotidsequenz des aktiven Zentrums komplementär zur zu spaltenden Nukleotidsequenz in einer für das YRP kodierenden mRNA ist, siehe z. B. die US-Patentschriften Nr. 4,987,071 und 5,116,742 an Cech et al. Alternativ dazu kann man mit YRP-mRNA eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen selektieren, siehe z. B. Bartel D., und Szostak J. W., Science 261, 1411 (1993). Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält das Ribozym einen Teil mit mindestens 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 Nukleotiden und besonders bevorzugt 7 oder 8 Nukleotiden, der 100 komplementär zu einem Teil der Target-RNA ist. Methoden zur Herstellung von Ribozymen sind dem Fachmann bekannt, siehe z. B. die US-Patentschriften Nr. 6,028,167 ; 5,773,260 und 5,496,698 .
Der Ausdruck ”dsRNA” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf RNA-Hybride, die zwei Stränge RNA umfassen. Die dsRNAs können in der Struktur linear oder zirkulär sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die dsRNA spezifisch für ein Polynukleotid, das entweder für das Polypeptid gemäß Tabelle II oder ein Polypeptid mit mindestens 70% Sequenzidentität mit einem Polypeptid gemäß Tabelle II kodiert. Die hybridisierenden RNAs können im Wesentlichen oder vollständig komplementär sein. Mit ”im Wesentlichen komplementär” ist gemeint, dass, wenn die beiden hybridisierenden RNAs unter Verwendung des BLAST-Programms wie oben beschrieben optimal ausgerichtet sind, die hybridisierenden Teile mindestens 95% komplementär sind. Vorzugsweise hat die dsRNA eine Länge von mindestens 100 Basenpaaren. Typischerweise haben die hybridisierenden RNAs die gleiche Länge, ohne überhängende 5'- oder 3'-Enden und ohne Lücken. Es können jedoch bei den^, Methoden der Erfindung dsRNAs mit 5'- oder 3'-Überhängen von bis zu 100 Nukleotiden verwendet werden.
Die dsRNA kann Ribonukleotide oder Ribonukleotidanaloga wie 2'-O-Methyl-ribosylreste oder Kombinationen davon enthalten, siehe z. B. die US-Patentschriften Nr. 4,130,641 und 4,024,222 . Eine dsRNA-Polyriboinosinsäure:Polyribocytidylsäure ist in der US-Patentschrift 4,283,393 beschrieben. Methoden zur Herstellung und Anwendung von dsRNA sind im Stand der Technik bekannt. Eine Methode beinhaltet die gleichzeitige Transkription von zwei komplementären DNA-Strängen entweder in vivo oder in einer einzelnen in-vitro-Reaktionsmischung, siehe z. B. die US-Patentschrift Nr. 5,795,715 . Gemäß einer Ausführungsform kann dsRNA direkt durch Standard-Transformationsvorschriften in eine Pflanze oder Pflanzenzelle eingeführt werden. Alternativ dazu kann dsRNA in einer Pflanzenzelle exprimiert werden, indem man zwei komplementäre RNAs transkribiert.
Andere Methoden zur Inhibierung der endogenen Genexpression wie die Tripelhelixbildung (Moser et al., Science 238, 645 (1987), und Cooney et al., Science 241, 456 (1988)) und Kosuppression (Napoli et al., The Plant Cell 2,279 (1990)) sind im Stand der Technik bekannt. Teil-cDNAs und vollständige cDNAs wurden für die Cosuppression von endogenen Pflanzengenen verwendet, siehe z. B. die US-Patentschriften Nr. 4,801,340 , 5,034,323 , 5,231,020 , und 5,283,184 ; Van der Kroll et al., The Plant Cell 2, 291, (1990); Smith et al., Mol. Gen. Genetics 224, 477 (1990), und Napoli et al., The Plant Cell 2, 279 (1990).
Man nimmt an, dass bei der Sense-Suppression durch die Einführung eines Sense-Polynukleotids die Transkription des entsprechenden Target-Gens blockiert wird. Das Sense-Polynukleotid hat eine Sequenzidentität von mindestens 65% mit dem Gen oder der RNA der Target-Pflanze. Vorzugsweise beträgt die prozentuale Identität mindestens 80%, 90%, 95% oder mehr. Das eingeführte Sense-Polynukleotid braucht, bezogen auf das Target-Gen oder -Iranskript, nicht die volle Länge aufzuweisen. Vorzugsweise hat das Sense-Polynukleotid eine Sequenzidentität von mindestens 65% mit mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer der Nukleinsäuren gemäß Tabelle I, Anwendung Nr. 1. Die Identitätsregionen können Introns und/oder Exons und nicht translatierte Regionen umfassen. Das eingeführte Sense-Polynukleotid kann transient in der Pflanzenzelle vorhanden sein oder stabil in ein Pflanzenchromosom oder ein extrachromosomales Replikon integriert sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, welches ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II, Anwendung Nr. 1, kodiert;
(b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1;
(c) einem Nukleinsäuremolekül, das, als Folge der Degeneration des genetischen Codes, von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II abgeleitet sein kann und, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verleiht;
(d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, welches das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst und, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verleiht;
(e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mindestens 30% Identität, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, mit der Aminosäuresequenz des durch das Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c) oder (d) kodierten Polypeptids hat und die durch ein ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I ”umfassendes Nukleinsäuremolekül wiedergegebene Aktivität hat und, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verleiht;
(f) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c), (d) oder (e) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze- oder einem Teil davon, einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verleiht;
(g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) kodiertes Polypeptid isoliert werden kann und die durch das ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1, umfassendes Nukleinsäuremolekül wiedergegebene Aktivität hat;
(h) einem Nukleinsäuremolekül, das, für ein Polypeptid kodiert, das die Konsensussequenz oder eines oder mehrere der Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV, Anwendung Nr. 1, umfassendes Protein wiedergegebene Aktivität hat;
(i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II wiedergegebene Aktivität hat und, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, oder Pflanze oder einem Teil davon, einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verleiht;
(j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Protein, welches ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV, Anwendung Nr. 1, umfasst, wiedergegeben wird; und
(k) einem Nukleinsäuremolekül, das durch Screening einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek, insbesondere einer cDNA-Bibliothek und/oder einer genomischen Bibliothek, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 750 oder 1000 nt, eines Nukleinsäuremoleküls komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, die für ein Polypeptid mit der durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II, Anwendung Nr. 1, umfassendes Protein wiedergegebenen Aktivität kodiert, erhältlich ist, umfasst.

Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine für YRP kodierende Nukleinsäure wie oben beschrieben enthält, wobei die Expression des Vektors bzw. der für YRP kodierenden Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal verglichen mit dem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyp der Wirtszelle, führt. So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck ”Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, das dazu in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, an die es gebunden ist, zu transportieren. Ein Typ von Vektor ist ein ”Plasmid”, was sich auf eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein anderer Vektortyp ist ein viraler Vektor, bei dem zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Weitere mögliche Typen von Vektoren sind linearisierte Nukleinsäuresequenzen wie Transposons, bei denen es sich um Teile von DNA handelt, die sich kopieren und insertieren können. Es wurden 2 Typen von Transposons gefunden: einfache Transposons, die als Insertionssequenzen bekannt sind, und zusammengesetzte Transposons, die mehrere Gene zusätzlich zu den für die Transposition erforderlichen Genen aufweisen können. Bestimmte Vektoren sind zu einer autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in die sie eingeführt wurden, fähig (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden bei der Einführung in eine Wirtszelle in das Genom der Wirtszelle integriert und werden somit zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Außerdem sind bestimmte Vektoren dazu fähig, die Expression von Genen, mit denen sie operativ verbunden sind, zu steuern. Solche Vektoren werden hier als ”Expressionsvektoren” bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die bei rekombinanten DNA-Techniken von Nutzen sind, häufig in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können ”Plasmid” und ”Vektor” austauschbar verwendet werden, da es sich bei dem Plasmid um die am häufigsten verwendete Form von Vektor handelt. Die Erfindung soll jedoch auch solche anderen Formen von Expressionsvektoren wie virale Vektoren (z. B. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren) einschließen, die äquivalente Funktionen erfüllen.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die dazu in der Lage sind, die Genexpression in Pflanzenzellen voranzutreiben und die operativ verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, zum Beispiel die Terminierung der Transkription durch Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind die, die aus Agrobacterium tumefaciens-t-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835 (1984)) oder funktionelle Äquivalente davon, es eignen sich jedoch auch alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell aktiv sind. Da die Pflanzengenexpression sehr häufig nicht auf die transkriptionellen Ebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere operativ verbundene Sequenzen wie Translations-Enhancer wie z. B. die Overdrive-Sequenz, die die 5'-untranslatierte Leitsequenz aus dem Tabakmosaikvirus enthält und das Protein:RNA-Verhältnis verbessert (Gallie et al., Nucl. Acids Research 15, 8693 (1987)).
Die Pflanzengenexpression muss operativ mit einem geeigneten Promoter verbunden sein, der für die Genexpression in einer zeit-, zell- oder gewebespezifischen Weise verantwortlich ist. Bevorzugt sind Promoter, die für eine konstitutive Expression (Benfey et al., EMBO J. 8, 2195 (1989)) sorgen, wie die, die sich von Pflanzenviren wie 35S CaMV (Franck et al., Cell 21, 285 (1980)) oder 19S CaMV (siehe auch US-Patentschrift Nr. 5352605 und PCT-Anmeldung Nr. WO 84/02913 ) ableiten, oder Pflanzenpromoter wie die aus der kleinen Untereinheit von Rubisco, beschrieben in der US-Patentschrift Nr. 4,962,028.
Zusätzliche vorteilhafte regulatorische Sequenzen befinden sich zum Beispiel in Pflanzenpromoter wie CaMV/35S (Franck et al., Cell 21 285 (1980)), PRP1 (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361 (1993)), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos oder im Ubiquitin-, Napin- oder Phaseolin-Promoter. Ebenfalls vorteilhaft in diesem Zusammenhang sind induzierbare Promoter wie die in EP 388 186 (benzylsulfonamidinduzierbar), Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992) (tetracyclininduzierbar), EP-A-0 335 528 (abscisinsäureinduzierbar) oder WO 93/21334 (ethanol- oder cyclohexenolinduzierbar) beschriebenen Promoter. Weitere brauchbare Pflanzenpromoter sind der zytoplasmatische FBPase-Promoter oder der ST-LSI-Promoter der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)), der Phosphorybosylphyrophosphatamidotransferase-Promoter von Glycine max (Genbank Zugangs-Nr. U87999) oder der in EP-A-0 249 676 beschriebene nodienspezifische Promoter. Weitere besonders vorteilhafte Promoter sind samenspezifische Promoter, die für Monokotyledone oder Dikotyledone verwendet werden können und in US 5,608,152 (Napin-Promoter aus Raps), WO 98/45461 (Phaseolin-Promoter aus Arabidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin-Promoter aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promoter aus Brassica) und Baeumlein et al., Plant J., 2 (2), 233 (1992) (LEB4-Promoter aus Leguminosen) beschrieben sind. Diese Promoter eignen sich für dikotyledone Pflanzen. Die folgenden Promoter eignen sich zum Beispiel für Monokotyledone: der lpt-2-oder lpt-1-Promoter aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder der Hordein-Promoter aus Gerste. Andere brauchbare Promoter sind in WO 99/16890 beschrieben. Im Prinzip können alle natürlichen Promoter mit ihren regulatorischen Sequenzen wie die obenerwähnten für das neue Verfahren verwendet werden. Es ist außerdem möglich und vorteilhaft, zusätzlich synthetische Promoter einzusetzen.
Das Genkonstrukt kann auch weitere Gene umfassen, die in die Organismen zu insertieren sind und die zum Beispiel an der Toleranz gegenüber Stress und der Erhöhung des Ertrags beteiligt sind. Es ist möglich und vorteilhaft, regulatorische Gene wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, die durch ihre enzymatische Aktivität in die Regulation eingreifen, oder eines oder mehrere oder alle Gene eines Biosynthesepfades in Wirtsorganismen zu insertieren und exprimieren. Diese Gene können vom Ursprung her heterolog oder homolog sein. Die insertierten Gene können ihren eigenen Promoter haben oder sich ansonsten unter der Kontrolle des gleichen Promoters wie die Sequenzen der Nukleinsäure von Tabelle I oder ihrer Homologe befinden.
Das Genkonstrukt umfasst vorteilhafterweise, für die Expression der anderen vorhandenen Gene, zusätzliche 3'- und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder ausgewählten Genen für eine optimale Expression ausgewählt sind.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen wie oben erwähnt eine spezifische Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann je nach Wirtsorganismus zum Beispiel bedeuten, dass das Gen erst nach einer Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen oder Faktoren können außerdem vorzugsweise eine vorteilhafte Wirkung auf die Expression der eingeführten Gene haben und sie somit erhöhen. Es ist auf diese Weise möglich, die regulatorischen Elemente vorteilhaft auf der Ebene der Transkription zu verstärken, indem man starke Transkriptionssignale wie Promoter und/oder Enhancer einsetzt. Zusätzlich ist es auch möglich, die Translation zu verstärken, indem man zum Beispiel die Stabilität der mRNA verbessert.
Andere bevorzugte Sequenzen für eine Verwendung in Pflanzengenexpressionskassetten sind Targetingsequenzen, die benötigt werden, um das Genprodukt in sein entsprechendes Zellkompartiment (ein Übersichtsartikel findet sich bei Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15 (4), 285 (1996) und den darin angeführten Literaturstellen) wie die Vakuole, den Kern, alle Typen von Plastiden wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörperchen, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen zu lenken.
Die Pflanzengenexpression kann auch durch einen induzierbaren Promoter (ein Übersichtsartikel findet sich bei Gatz, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89 (1997)) begünstigt werden. Chemisch induzierbare Promoter sind dann insbesondere geeignet, wenn die Genexpression auf eine zeitspezifische Weise erfolgen soll.

In Tabelle VI sind mehrere Beispiele für Promoter aufgeführt, die zur Regulation der Transkription der kodierenden Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Tabelle VI: Beispiele für gewebespezifische und induzierbare Promoter in Pflanzen

Expression	Referenz
Cor78- kälte-, dürre-, salz-, ABA-, wundinduzierbar	Ishitani, et al., Plant Cell 9, 1935 (1997), Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki, Plant Cell 6, 251 (1994)
Rci2A – kälte-, austrocknungsinduzierbar	Capel et al., Plant Physiol 115, 569 (1997)
Rd22 – Dürre, Salz	Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki, Mol. Gen. Genet. 238, 17 (1993)
Cor15A – Kälte, Dehydratation, ABA,	Baker et al., Plant Mol. Biol. 24, 701 (1994)
GH3- auxininduzierbar	Liu et al., Plant Cell 6, 645 (1994)
ARSK1-Wurzel, salzinduzierbar	Hwang und Goodman, Plant J. 8, 37 (1995)
PtxA – Wurzel, salzinduzierbar	GenBank Zugangsnr. X67427
SbHRGP3 – wurzelspezifisch	Ahn et al., Plant Cell 8, 1477 (1998).
KST1 – schließzellenspezifisch	Plesch et al., Plant Journal. 28 (4), 455– (2001)
KATZ – schließzellenspezifisch	Plesch et al., Gene 249, 83 (2000), Nakamura et al., Plant Physiol. 109, 371 (1995)
salicylsäureinduzierbar	PCT-Anmeldung Nr. WO 95/19443
tetracyclininduzierbar	Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992)
ethanolinduzierbar	PCT-Anmeldung Nr. WO 93/21334
pathogeninduzierbar PRP1	Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361 (1993)
hitzeinduzierbar hsp80	US-Patent Nr. 5,187,267
kälteinduzierbar alpha-Amylase	PCT-Anmeldung Nr. WO 96/12814
wundinduzierbar pinII	europäisches Patent Nr. 375 091
RD29A – salzinduzierbar	Yamaguchi-Shinozalei et al. Mol. Gen. Genet. 236, 331 (1993)
plastidenspezifische virale RNA-Polymerase	PCT-Anmeldung Nr. WO 95/16783 , PCT-Anmeldung Nr. WO 97/06250

Andere Promoter, z. B. der Superpromoter (Ni et al., Plant Journal 7, 661 (1995)), der Ubiquitin-Promoter (Callis et al., J. Biol. Chem., 265, 12486 (1990); US 5,510,474 ; US 6,020,190 ; Kawalleck et al., Plant. Molecular Biology, 21, 673 (1993)) oder der 34S-Promoter (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) haben sich in ähnlicher Weise als brauchbar für die vorliegende Erfindung erwiesen und sind dem Fachmann bekannt. Promoter mit Entwicklungsstadiumpräferenz werden vorzugsweise in bestimmten Entwicklungsstadien exprimiert. Promoter mit Präferenz für Gewebe und Organe schließen die ein, die vorzugsweise in bestimmten Geweben oder Organen wie Blättern, Wurzeln, Samen oder Xylem exprimiert werden. Beispiele für Promoter mit Präferenz für Gewebe und Organe schließen, wobei diese Aufzählung nicht einschränkend ist, Promoter mit Präferenz für Früchte, Promoter mit Präferenz für das Ovolum, Promoter mit Präferenz für männliche Gewebe, Promoter mit Präferenz für Samen, Promoter mit Präferenz für das Integument, Promoter mit Präferenz für die Knolle, Promoter mit Präferenz für den Stengel, Promoter mit Präferenz für das Pericarp und Promoter mit Präferenz für das Blatt, Promoter mit Präferenz für die Stigmata, Promoter mit Präferenz für die Pollen, Promoter mit Präferenz für die Antheren, einen Promoter mit Präferenz für die Petalen, Promoter mit Präferenz für die Sepalen, Promoter mit Präferenz für die Blütenstiele, Promoter mit Präferenz für die Schoten, Promoter mit Präferenz für die Stiele, Promoter mit Präferenz für die Wurzeln und dergleichen ein. Promoter mit Präferenz für die Samen werden vorzugsweise während der Samenentwicklung und/oder -keimung exprimiert. Promoter mit Präferenz für die Samen können zum Beispiel Promoter mit Präferenz für die Embryonen, für das Endosperm und für die Samenhülle sein, siehe Thompson et al., BioEssays 10, 108 (1989). Zu Beispielen für Promoter mit Präferenz für die Samen zählen, jedoch ohne Einschränkung, Cellulosesynthase (celA), Cim1, gamma-lein, Globulin-1, Mais 19 kD-Zein (cZ19B1), und dergleichen.
Andere für die Expressionskassetten der Erfindung brauchbare Promoter schließen, wobei diese Aufzählung nicht einschränkend ist, den Promoter des Major Chlorophyll a/b Binding Proteins, die Histon-Promoter, den Ap3-Promoter, den β-Conglycin-Promoter, den Napin-Promoter, den Lectin-Promoter aus der Sojabohne, den 15 kD-Zein-Promoter aus Mais, den 22 kD-Zein-Promoter, den 27 kD-Zein-Promoter, den g-Zein-Promoter, die Waxy-, Shrunken-1-, Shrunken-2- und Bronze-Promoter, den Zm13-Promoter ( US-Patentschrift Nr. 5,086,169 ), die Polygalacturonase-Promoter (PG) aus Mais ( US-Patent Nr. 5,412,085 und 5,545,546 ), und den SGB6-Promoter ( US-Patent Nr. 5,470,359 ), sowie synthetische oder andere natürliche Promoter ein.
Eine zusätzliche Flexibilität bei der Steuerung der heterologen Genexpression in Pflanzen lässt sich durch die Verwendung von DNA-bindenden Domänen und Reaktionselementen aus heterologen Quellen (d. h. DNA-Bindungsdomänen aus nicht pflanzlichen Quellen) erzielen. Ein Beispiel für eine solche heterologe DNA-Bindungsdomaine ist die LexA-DNA-Bindungsdomäne (Brent und Ptashne, Cell 43, 729 (1985)).
Die Erfindung, stellt weiterhin einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein YRP-DNA-Molekül der Erfindung umfasst, das in einer Antisense-Orientierung in den Expressionsvektor kloniert ist. Das heißt, das DNA-Molekül ist operativ mit einer regulatorischen Sequenz auf eine Weise verbunden, die die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das antisense zu einer YRP-mRNA ist, erlaubt. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die operativ an ein Nukleinsäuremolekül gebunden sind, das in der Antisense-Orientierung kloniert wurde, und die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in verschiedenen Zelltypen steuern. So können zum Beispiel virale Promoter und/oder Enhancer, oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder eines attenuierten Virus vorliegen, in welchem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer hocheffizienten regulatorischen Region produziert werden. Die Aktivität der regulatorischen Region lässt sich mit dem Zelltyp bestimmen, in den der Vektor eingeführt wird. Eine Diskussion der Steuerung der Genexpression mit Antisense-Genen findet sich bei Weintraub H. et al., Reviews – Trends in Genetics, Band 1(1), 23 (1986) und Mol et al., FEBS Letters 268, 427 (1990).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte YRPs und biologisch aktive Teile davon. Ein „isoliertes” oder „aufgereinigtes” Polypeptid oder ein biologisch aktiver Teil davon ist frei von einigem des zellulären Materials, wenn die Produktion durch rekombinante DNA-Techniken erfolgte, oder chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde. Der Ausdruck „im Wesentlichen frei von zellulärem Material” schließt Präparate von YRP ein, bei denen das Polypeptid von einigen der zellulären Komponenten der Zelle, in denen es natürlich oder rekombinant produziert wird, abgetrennt ist. Gemäß einer Ausführungsform schließt der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von zellulärem Material” Zubereitungen von YRP mit weniger als etwa 30% (Trockengewicht) an Nicht-YRP-Material (hier auch als ein ”kontaminierendes Polypeptid” bezeichnet), besonders bevorzugt weniger als etwa 20% an Nicht-YRP-Material, weiter besonders bevorzugt weniger als etwa 10% an Nicht-YRP-Material, und ganz besonders bevorzugt weniger als etwa 5% an Nicht-YRP-Material, ein.
Wird das YRP oder der biologisch aktive Teil davon rekombinant produziert, so ist es ebenfalls vorzugsweise im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d. h. das Kulturmedium macht weniger als etwa 20%, besonders bevorzugt weniger als etwa 10%, und ganz besonders bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumens der Polypeptidzubereitung aus. Der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien” schließt Zubereitungen eines YRP ein, in denen das Polypeptid von chemischen Vorstufen oder anderen an der Synthese des Polypeptids beteiligten Chemikalien abgetrennt ist. Gemäß einer Ausführungsform schließt der Ausdruck „im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien” Zubereitungen eines YRP mit weniger als etwa 30% (Trockengewicht) an chemischen Vorstufen oder Nicht-YRP-Chemikalien, besonders bevorzugt weniger als etwa 20% an chemischen Vorstufen oder Nicht-YRP-Chemikalien, weiter besonders bevorzugt weniger als etwa 10% an chemischen Vorstufen oder Nicht-YRP-Chemikalien, und ganz besonders bevorzugt weniger als etwa 5% an chemischen Vorstufen oder Nicht-YRP-Chemikalien ein. Bei bevorzugten Ausführungsformen sind in den isolierten Polypeptiden oder biologisch aktiven Teilen davon keine kontaminierenden Polypeptide aus dem gleichen Organismus, aus dem das YRP abgeleitet ist, vorhanden. Typischerweise werden solche Polypeptide durch rekombinante Expression von zum Beispiel einem S. cerevisiae-, E. coli- oder Brassica napus-, Glycine max-, Zea mays- oder Oryza sativa-YRP in einem Mikroorganismus wie S. cerevisiae, E. coli, C. glutamicum, Celiaten, Algen, Pilzen oder Pflanzen produziert, mit der Maßgabe, dass das Polypeptid in einem Organismus rekombinant exprimiert wird, der sich vom Originalorganismus unterscheidet.
Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Polypeptide, Polypeptidhomologe, Fusionspolypeptide, Primer, Vektoren und Wirtszellen können bei einer oder mehreren der folgenden Methoden zur Anwendung kommen: Identifizierung von S. cerevisiae, E. coli or Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa und verwandten Organismen; Kartierung von Genomen von mit S. cerevisiae, E. coli verwandten Organismen; Identifizierung und Lokalisierung von interessierenden S. cerevisiae-, E. coli- oder Brassica napus-, Glycine max-, Zea mays- oder Oryza sativa-Sequenzen; Evolutionsstudien; Bestimmung der für die Funktion erforderlichen YRP-Regionen; Modulation einer YRP-Aktivität; Modulation des Metabolismus einer oder mehrerer Zellfunktionen; Modulation des transmembranen Transports einer oder mehrerer Verbindungen; Modulation des Ertrags, z. B. eines Ertragsmerkmals, z. B. der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, Toleranz gegenüber Dürre, Wassernutzungseffizienz, Nährstoffnutzungseffizienz und/oder des intrinsischen Ertrags; und Modulation der Expression von YRP-Nukleinsäuren.
Die YRP-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung eignen sich auch für Evolutionsstudien und Polypeptidstrukturuntersuchungen. Die metabolischen Vorgänge und Transportprozesse, bei denen die Moleküle der Erfindung eine Rolle spielen, werden von einer Vielzahl verschiedener prokaryontischer und eukaryontischer Zellen genutzt; durch einen Vergleich der Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung mit denen, die für ähnliche Enzyme aus anderen Organismen kodieren, kann man die evolutionären Verwandtschaftsbeziehungen der Organismen bewerten. In ähnlicher Weise erlaubt ein solcher Vergleich eine Abschätzung davon, welche Regionen der Sequenz konserviert sind und welche nicht, was dabei helfen kann, die Regionen des Polypeptids zu bestimmen, die für die Funktion des Enzyms wesentlich sind. Diese Art von Bestimmung ist bei Polypeptidentwicklungsstudien von Nutzen und kann darauf hindeuten, was das Polypeptid hinsichtlich einer Mutagenese tolerieren kann, ohne die Funktionsfähigkeit zu verlieren.
Eine Manipulation der YRP-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung kann zur Folge haben, dass SRPs produziert werden, die sich in ihrer Funktion von den YRPs des Wildtyps unterscheiden. Diese Polypeptide können eine verbesserte Effizienz oder Aktivität aufweisen, in einer größeren Anzahl als gewöhnlich in der Zelle vorhanden sein oder eine verminderte Effizienz oder Aktivität aufweisen.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die eine Abänderung eines YRP der Erfindung einen direkten Einfluss auf den Ertrag, z. B. Ertragsmerkmal, zum Beispiel Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal haben kann.
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen in Bezug auf den Ertrag, z. B. Ertragsmerkmal, zum Beispiel Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal lässt sich beurteilen, indem man die modifizierte Pflanze unter weniger als geeigneten Bedingungen heranzieht und dann die Wachstumscharakteristika und/oder den Metabolismus der Pflanze analysiert. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt und schließen Trockengewicht, Frischgewicht, Polypeptidsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirationsraten, allgemeine Erträge an Pflanze und/oder Erntegut, Blühleistung, Reproduktion, Samenansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten usw. ein (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim; Belter P. A. et al., 1988, Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy J. F., und Cabral J. M. S., 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz J. A. und Henry J. D., 1988, Biochemical separations, in Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band B3, Kapitel 11, Seite 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow F. J., 1989, Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
So kann man zum Beispiel Hefe-Expressionsvektoren, die die hier offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, unter Anwendung von Standardprotokollen konstruieren und in S. cerevisiae transformieren. Die erhaltenen transgenen Zellen können dann auf Herstellung oder Veränderung ihres Ertrags, z. B. ihrer Ertragsmerkmale, zum Beispiel Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, ihres intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals untersucht werden. In ähnlicher Weise können Pflanzen-Expressionsvektoren, die die hier offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, unter Anwendung von Standardprotokollen konstruiert und in eine geeignete Pflanzenzelle wie Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Baumwolle, Reis, Weizen, Medicago truncatula usw. transformiert werden. Die erhaltenen transgenen Zellen und/oder daraus abgeleiteten Pflanzen können dann auf Herstellung oder Veränderung ihres Ertrags, z. B. ihrer Ertragsmerkmale, zum Beispiel Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Nährstoffnutzungseffizienz, ihres intrinsischen Ertrags und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals untersucht werden.
Die gentechnische Manipulation eines oder mehrerer Gene gemäß Tabelle I, die für das YRP von Tabelle II der Erfindung kodieren, kann auch zu YRPs mit veränderten Aktivitäten führen, was eine indirekte und/oder direkte Auswirkung auf die Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress von Algen, Pflanzen, Ciliaten oder Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum hat.
Darüber hinaus kann man mit den hier offenbarten Sequenzen oder Fragmenten davon Knockout-Mutationen in den Genomen verschiedener Organismen wie Bakterien, Säugetierzellen, Hefezellen und Pflanzenzellen produzieren (Girke, T., The Plant Journal 15, 39 (1998)). Die erhaltenen Knockout-Zellen können dann auf ihre Fähigkeit bzw. Kapazität zur Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrages und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, ihre Reaktion auf verschiedene Bedingungen von abiotischem Umweltstress und die Auswirkung auf den Phänotyp und/oder Genotyp der Mutation untersucht werden. Zu anderen Methoden der Gendesaktivierung siehe US-Patent Nr. 6,004,804 und Puttaraju et al., Nature-Biotechnology 17, 246 (1999).
Die obenerwähnten Mutagenesestrategien für YRPs, die zu einer Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrages und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, führen, sollen nicht einschränkend sein; Variationen dieser Strategien werden für den Fachmann offensichtlich sein. Durch Anwendung solcher Strategien und unter Einbau der hier offenbarten Mechanismen können die Nukleinsäure- und Polypeptidmoleküle der Erfindung eingesetzt werden, um Algen, Ciliaten, Pflanzen, Pilze oder andere Mikroorganismen wie C. glutamicum, die mutierte YRP Nukleinsäure- und Polypeptidmoleküle exprimieren, zu erzeugen, so dass die Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder der Ertrag verbessert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Antikörper bereit, die spezifisch an ein von einer hier beschriebenen Nukleinsäure kodiertes YRP oder einen Teil davon binden. Antikörper lassen sich nach vielen gut bekannten Methoden herstellen (siehe z. B. Harlow und Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Kurz gesagt kann aufgereinigtes Antigen einem Tier in einer Menge und in zeitlichen Abständen, die ausreichen, um eine Immunreaktion auszulösen, injiziert werden. Antikörper können entweder direkt aufgereinigt werden, oder man kann aus dem Tier Milzzellen gewinnen. Die Zellen können dann mit einer unsterblichen Zelllinie fusioniert und auf Antikörpersekretion gescreent werden. Mit den Antikörpern kann man Bibliotheken von Nukleinsäureklonen auf das Antigen sezernierende Zellen screenen. Diese positiven Klone können dann sequenziert werden. Siehe zum Beispiel Kelly et al., Bio/Technology 10, 163 (1992); Bebbington et al., Bio/Technology 10, 169 (1992).
Die Begriffe ”selektiv binden” und ”spezifisch binden” beziehen sich beim Polypeptid auf eine Bindungsreaktion, die in Gegenwart des Polypeptids in einer heterogenen Population von Polypeptiden und anderen Biologika determinativ ist. Somit binden unter festgelegten Immunoassaybedingungen die spezifizierten, an ein bestimmtes Polypeptid gebundenen Antikörper nicht in signifikanter Menge an andere in der Probe vorhandene Polypeptide. Für eine selektive Bindung eines Antikörpers unter solchen Bedingungen kann ein Antikörper erforderlich sein, der auf Basis seiner Spezifität für ein bestimmtes Polypeptid ausgewählt wurde. Für die Auswahl von selektiv an ein bestimmtes Polypeptid bindenden Antikörpern stehen verschiedene Immunoassayformate zur Verfügung. So werden zum Beispiel Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig zur Selektion von mit einem Polypeptid selektiv immunreaktiven Antikörpern eingesetzt. Siehe Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988) für eine Beschreibung von Immunoassayformaten und Bedingungen, die angewendet werden können, um eine selektive Bindung zu bestimmen.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Wirten herzustellen. Eine Beschreibung von Techniken zur Herstellung solcher monoklonalen Antiköper findet sich in Stites et al., Hrsg., "Basic and Clinical Immunology," (Lange Medical Publications, Los Altos, Kalif., 4. Auflage) und den darin angeführten Literaturstellen, und in Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988).
Die Genexpression in Pflanzen wird reguliert durch die Wechselwirkung von Proteintranskriptionsfaktoren mit spezifischen Nukleotidsequenzen innerhalb der regulatorischen Region eines Gens. Ein Beispiel für Transkriptionsfaktoren sind Polypeptide, die Zinkfingermotive (ZF-Motive) enthalten. Jedes ZF-Modul ist ungefähr 30 Aminosäuren lang und um ein Zinkion herum gefaltet. Die DNA-Erkennungsdomäne eines ZF-Proteins ist eine a-Helix-Struktur, die sich in die Hauptfurche der DNA-Doppelhelix einschiebt. Das Modul enthält drei Aminosäuren, die an die DNA binden, wobei jede Aminosäure mit einem einzelnen Basenpaar in der Target-DNA-Sequenz in Kontakt steht. ZF-Motive sind in einer modular wiederholten Weise unter Ausbildung eines Satzes von Fingern, die eine benachbarte DNA-Sequenz erkennen, angeordnet. So erkennt zum Beispiel ein dreifingriges ZF-Motiv 9 Bp an DNA. Es wurde gezeigt, dass Hunderte von Proteinen ZF-Motive enthalten, mit zwischen 2 und 37 ZF-Modulen in jedem Protein (Isalan M. et al., Biochemistry 37 (35), 12026 (1998); Moore M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (4), 1432 (2001) und Moore M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (4), 1437 (2001); US-Patente US 6,007,988 und US 6,013,453 ).
Die regulatorische Region eines Pflanzengens enthält viele kurze DNA-Sequenzen (cis-acting elements), die als Erkennungsdomänen für Transkriptionsfaktoren einschließlich ZF-Proteinen dienen. Ähnliche Erkennungsdomänen in verschiedenen Genen ermöglichen die koordinierte Expression mehrerer für Enzyme in einem metabolischen Pfad kodierender Gene durch gemeinsame Transkriptionsfaktoren. Durch Variationen bei den Erkennungsdomänen zwischen Mitgliedern einer Genfamilie kommt es zu Unterschieden bei der Genexpression in der gleichen Genfamilie, zum Beispiel zwischen Geweben und Entwicklungsstadien und als Reaktion auf Umwelteinflüsse.
Typische ZF-Proteine enthalten nicht nur eine DNA-Erkennungsdomäne, sondern auch eine funktionelle Domäne, die es dem ZF-Protein ermöglicht, die Transkription eines spezifischen Gens zu aktivieren oder zu unterdrücken. Experimentell wurde mit einer Aktivierungsdomäne die Transkription des Target-Gens aktiviert ( US-Patent 5,789,538 und Patentanmeldung WO95/19431 ), es ist jedoch auch möglich, eine Transkriptionsrepressordomäne an den ZF anzubinden und somit die Transkription zu inhibieren (Patentanmeldungen WO00/47754 und WO01/002019 ). Es wurde beschrieben, dass eine enzymatische Funktion wie Nukleinsäurespaltung an den ZF gebunden werden kann (Patentanmeldung WO00/20622 ).
Die Erfindung stellt eine Methode bereit, die es dem Fachmann ermöglicht, die regulatorische Region eines oder mehrerer für das YRP kodierender Gene aus dem Genom einer Pflanzenzelle zu isolieren und an eine funktionelle Domäne, die mit der regulatorischen Region des Gens in Wechselwirkung tritt, gebundene Zinkfinger-Transkriptionfaktoren zu entwickeln. Die Wechselwirkung des Zinkfingerproteins mit dem Pflanzengen kann so zugeschnitten sein, dass die Expression des Gens abgeändert ist, wodurch vorzugsweise ein erhöhter Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verliehen wird.
Die Erfindung stellt insbesondere eine Methode zur Herstellung einer transgenen Pflanze einer für ein YRP kodierenden Nukleinsäure bereit, wobei die Expression der Nukleinsäure(n) in der Pflanze zu einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhter Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, verglichen mit einer Wildtyppflanze führt, bei dem man: (a) eine Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine für ein YRP kodierende Nukleinsäure umfasst, transformiert, und (b) aus der Pflanzenzelle eine transgene Pflanze mit einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer Wildtyppflanze erzeugt. Für eine solche Pflanzentransformation kann man sich binärer Vektoren wie pBinAR bedienen (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66, 221 (1990)). Geeignete binäre Vektoren sind außerdem zum Beispiel pBIN19, pBI101, pGPTV oder pPZP (Hajukiewicz P. et al., Plant Mol. Biol., 25, 989 (1994)).
Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in die t-DNA erfolgen. 5' zur cDNA aktiviert ein Pflanzenpromoter die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich 3' zur cDNA. Eine gewebespezifische Expression kann durch Einsatz eines wie oben angeführten gewebespezifischen Promoters erreicht werden. Darüber hinaus kann man auch alle anderen Promoterelemente verwenden. Für eine konstitutive Expression in der gesamten Pflanze kann man sich des CaMV 35S-Promoters bedienen. Das exprimierte Protein kann mit einem Signalpeptid an ein Zellkompartiment adressiert werden, zum Beispiel an Plastiden, Mitochondrien oder das endoplasmatische Retikulum (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 4 (15), 285 (1996)). Das Signalpeptid wird 5' im Leserahmen in die cDNA kloniert, um eine subzelluläre Lokalisierung des Fusionsproteins zu erreichen. Dem Fachmann wird bewusst sein, dass der verwendete Promoter operativ mit der Nukleinsäure verbunden sein sollte, so dass der Promoter die Transkription der Nukleinsäure bewirkt, was die Synthese einer mRNA zur Folge hat, die für ein Polypeptid kodiert.
Alternative Methoden zur Transfektion schließen den direkten Transfer von DNA in sich entwickelnde Blumen mittels Elektroporation oder durch Agrobacterium vermittelten Gentransfer ein. Die durch Agrobacterium vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung des GV3101(pMP90)-(Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204, 383 (1986)) oder LBA4404-(Ooms et al., Plasmid, 7, 15 (1982); Hoekema et al., Nature, 303, 179 (1983))Stamms von Agrobacterium tumefaciens durchgeführt werden. Die Transformation kann gemäß Standardtransformations- und -regenerationstechniken erfolgen (Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13, 4777 (1994); Gelvin und Schilperoort, Plant Molecular Biology Manual, 2. Auf 1. – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuch Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick B. R. und Thompson J. E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993. – 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Raps zum Beispiel kann durch Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation (Moloney et al., Plant Cell Reports 8, 238 (1989); De Block et al., Plant Physiol. 91, 694 (1989)) transformiert werden. Die Verwendung von Antibiotika für Agrobacterium und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und dem Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion erfolgt normalerweise unter Einsatz von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker. Ein durch Agrobacterium vermittelter Gentransfer auf Flachs kann zum Beispiel unter Anwendung einer von Mlynarova et al., Plant Cell Report 13, 282 (1994) beschriebenen Technik durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Transformation von Sojabohne zum Beispiel unter Anwendung einer in dem europäischen Patent Nr. 424 047 , US-Patent Nr. 5,322,783 , europäischen Patent Nr. 397 687 , US-Patent Nr. 5,376,543 oder US-Patent Nr. 5,169,770 beschriebenen Technik durchgeführt werden. Die Transformation von Mais lässt sich durch Partikelbombardierung, polyethylenglykolvermittelte DNA-Aufnahme oder durch die Siliciumcarbidfasertechnik (siehe zum Beispiel Freeling und Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7) erreichen. Ein spezielles Beispiel einer Mais-Transformation findet sich in der US-Patent Nr. 5,990,387 , und ein spezielles Beispiel einer Weizen-Transformation findet sich in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256 .
Durch Heranziehen der modifizierten Pflanzen unter Bedingungen mit definierter Stickstoffversorgung, bei einer besonderen Ausführungsform unter Bedingungen von abiotischem Umweltstress, und anschließendes Screening und Analysieren der Wachstumscharakteristika und/oder metabolischen Aktivität kann man die Wirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen auf Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrages und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, beurteilen. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt. Sie schließen neben Screening, (Römpp Lexikon Biotechnologie, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1992, "screening" S. 701) Trockengewicht, Frischgewicht, Proteinsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirationsraten, allgemeine Erträge an Pflanze und/oder Erntegut, Blühleistung, Reproduktion, Samenansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten usw. ein (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy J. F. und Cabral J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz J. A. und Henry J. D., 1988 Biochemical separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band B3, Kapitel 11, Seite 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Identifizierung eines Genprodukts, welches, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtypzelle in einer Zelle eines Organismus, zum Beispiel einer Pflanze, eine Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B.
Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrages und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, verleiht, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) In-Kontakt-Bringen, z. B. Hybridisieren, einiger oder aller Nukleinsäuremoleküle einer Probe, z. B. Zellen, Gewebe, Pflanzen oder Mikroorganismen oder einer Nukleinsäurebibliothek, welche ein Kandidatengen enthalten kann, das für ein Genprodukt kodiert, das eine Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung i, Ertrag verleiht, mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B oder einem funktionellen Homolog davon;
(b) Identifizieren der Nukleinsäuremoleküle, welche unter gelockerten stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisieren, insbesondere an die Nukleinsäuremolekülsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, und gegebenenfalls Isolieren des Volllängen-cDNA-Klons oder vollständigen genomischen Klons;
(c) Identifizieren der Kandidaten-Nukleinsäuremoleküle oder eines Fragments davon in Wirtszellen, vorzugsweise in einer Pflanzenzelle;
(d) Erhöhen der Expression der identifizierten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen, für die eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder ein erhöhter Ertrag gewünscht werden;
(e) Untersuchungen des Ausmaßes gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder eines gesteigerten Ertrags bei den Wirtszellen; und
(f) Identifizieren des Nukleinsäuremoleküls und seines Genprodukts, das der Wirtszelle verglichen mit dem Wildtyp einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedrigen Temperaturen und/oder eine erhöhte Effizienz der Nährstoffausnutzung, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein erhöhtes anderes erwähntes Ertragsmerkmal verleiht.

Milde Hybridisierungsbedingungen sind wie folgt: nach den Standard-Hybridisierungsvorschriften können Waschschritte bei nieder- bis mittelstringenten Bedingungen gewöhnlich mit Waschbedingungen von 40°–55°C und Salzbedingungen zwischen 2 × SSC und 0,2 × SSC mit 0,1% SDS im Vergleich zu stringenten Waschbedingungen wie z. B. 60° bis 68°C mit 0,1% SDS durchgeführt werden. Weitere Beispiele können in den oben aufgeführten Bezugsstellen für die stringenten Hybridisierungsbedingungen gefunden werden. Gewöhnlich werden Waschschritte mit zunehmender Stringenz und Dauer wiederholt, bis man ein brauchbares Signal:Rausch-Verhältnis feststellt, und hängen von vielen Faktoren wie dem Target, z. B. dessen Reinheit, GC-Gehalt, Größe usw., der Sonde, z. B. deren Länge, ob es eine RNA- oder eine DNA-Sonde ist, den Salzbedingungen, der Wasch- oder Hybridisierungstemperatur, der Wasch- oder Hybridisierungsdauer usw. ab.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Identifizierung eines Genprodukts, dessen Expression einer Zelle einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verleiht, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Identifizieren eines Nukleinsäuremoleküls in einem Organismus, das mindestens 20%, vorzugsweise 25%, stärker bevorzugt 30%, noch stärker bevorzugt 35%, 40% oder 50%, noch stärker bevorzugt 60%, 70% oder 80%, am stärksten bevorzugt 90% oder 95% oder mehr homolog ist zu dem Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein codiert, das das Polypeptidmolekül gemäß Spalte 5 oder 7 aus Tabelle II umfasst oder das eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst oder das von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1, codiert wird, oder ein Homolog davon wie hierin beschrieben, zum Beispiel mittels Homologiesuche in einer Datenbank;
(b) Steigern der Expression der identifizierten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen;
(c) Untersuchungen des Ausmaßes einer Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrages und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, bei den Wirtszellen; und
(d) Identifizieren der Wirtszelle, in welcher die gesteigerte Expression in der Wirtszelle im Vergleich zu einem Wildtyp eine Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Erhöhung der Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrages und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, vermittelt.

Ferner kann das hierin offenbarte Nukleinsäuremolekül, insbesondere das Nukleinsäuremolekül, gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, ausreichend homolog zu den Sequenzen aus verwandten Arten sein, sodass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in verwandten Organismen oder für Assoziationskartierung dienen können. Weiterhin können natürliche Variationen in den genomischen Regionen, die den hier offenbarten Nukleinsäuren, insbesondere dem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B, oder Homologen davon entsprechen, zu Variationen bei der Aktivität der hier offenbarten Proteine führen, insbesondere den Proteinen, die Polypeptide gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B umfassen oder die Konsensussequenz oder das Polypeptidmotiv gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfassen, und ihren Homologen, und in Folge zu natürlichen Variationen bei einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal führen.
Als Folge kommt es schließlich auch zu natürlichen Variationen in Form von stärker aktiver Allelvarianten, die bereits zu einer relativen Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung eines Ertragsmerkmals, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Nährstoffnutzungseffizienz und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, führen. Verschiedene Varianten des hier offenbarten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere der Nukleinsäure, die das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B umfasst, die verschiedenen Niveaus bezüglich eines erhöhten Ertrags, z. B. verschiedenen Niveaus bezüglich eines erhöhten Ertragsmerkmals, zum Beispiel verschiedener Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhter Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder Erhöhung der Nährstoffnutzungseffizienz und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals, entsprechen, lassen sich identifizieren und für die markergestützte Züchtung auf einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress anwenden.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Züchtung von Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder anot, bei der man

(a) eine erste Pflanzensorte mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder anot, basierend auf einer gesteigerten Expression einer wie hier offenbarten Nukleinsäure der Erfindung, insbesondere von einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B umfasst, oder einem Polypeptid, welches ein Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B umfasst oder eine Konsensussequenz oder ein Polypeptidmotiv gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst, oder einem Homolog davon wie hier beschrieben, auswählt;
(b) das Ausmaß des erhöhten Ertrags, z. B. erhöhten Ertragsmerkmals, zum Beispiel gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals mit dem Expressionsniveau oder der genomischen Struktur eines für dieses Polypeptid oder dieses Nukleinsäuremolekül kodierenden Gens assoziiert;
(c) die erste Pflanzensorte mit einer zweiten Pflanzesorte kreuzt, die in dem Ausmaß des erhöhten Ertrags, z. B. erhöhten Ertragsmerkmals, zum Beispiel gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals signifikant verschieden ist; und
(d) anhand des Expressionsniveaus des Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls oder der genomischen Struktur der Gene, die für dieses Polypeptid oder Nukleinsäuremolekül der Erfindung kodieren, feststellt, welche der Nachkommenschaftssorten ein erhöhtes Ausmaß an einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder eines anderen erwähnten Ertragsmerkmals hat.

Gemäß einer Ausführungsform ist das Expressionsniveau des Gens gemäß Schritt (b) erhöht.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, einer Pflanze oder einem Teil davon verleiht, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Kultivieren einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon, wodurch man eine Pflanze erhält, die das Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II codiert, oder von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I oder ein Homolog davon wie hierin beschrieben oder ein Polynukleotid codierend für dieses Polypeptid exprimiert und mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel mit einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. eine erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einer entsprechenden, zum Beispiel nicht transformierten, Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, verleiht, und Bereitstellen eines Ablesesystems, das dazu in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen, die eine Wechselwirkung des Polypeptids mit diesem Ablesesystem in Gegenwart einer chemischen Verbindung oder einer Probe, die eine Mehrzahl an chemischen Verbindungen enthält, erlauben, mit dem Polypeptid in Wechselwirkung zu treten und dazu in der Lage ist, ein nachweisbares Signal als Reaktion auf die Bindung einer chemischen Verbindung an das Polypeptid bereitzustellen, unter Bedingungen, die die Expression dieses Ablesesystems und des Proteins gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II oder des von einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, Anwendung Nr. 1, umfasst, kodierten Proteins oder eines Homolog davon wie hierin beschrieben ermöglichen; und
(b) Feststellen, ob es sich bei der chemischen Verbindung um einen wirksamen Agonisten handelt, indem man das Vorhandensein oder das Fehlen oder die Verminderung oder Zunahme eines durch dieses Ablesesystem produzierten Signals detektiert.

Die Verbindung kann chemisch synthetisiert oder mikrobiologisch hergestellt und/oder beispielsweise in Proben enthalten sein, z. B. Zellextrakten aus z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen, z. B. Pathogenen. Ferner kann/können die Verbindung(en) im Fachgebiet bekannt sein, wobei von ihr/ihnen jedoch bislang nicht bekannt war, dass sie fähig zum Unterdrücken des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist/sind. Die Reaktionsmischung kann ein zellfreier Extrakt sein oder kann eine Zell- oder Gewebekultur umfassen. Geeignete Anlagen für das Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung der Erfindung sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind zum Beispiel allgemein in Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, dritte Auflage (1994), insbesondere Kapitel 17, beschrieben. Die Verbindungen können z. B. der Reaktionsmischung, dem Kulturmedium, zugesetzt werden, in die Zelle injiziert werden oder auf die Pflanze aufgesprüht werden.
Wird in dem Verfahren eine Probe identifiziert, die eine Verbindung enthält, so ist es entweder möglich, die Verbindung aus der Originalprobe, von der festgestellt wurde, dass sie die Verbindung enthält, die dazu in der Lage ist, den Ertrag, z. B. Ertragsmerkmal, zum Beispiel verbesserte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, verglichen mit einem entsprechenden, z. B. nicht transformierten, Wildtyp zu aktivieren oder zu steigern oder zu erhöhen, zu isolieren, oder man kann die Originalprobe weiter unterteilen, zum Beispiel, wenn sie aus mehreren verschiedenen Verbindungen besteht, um die Anzahl verschiedener Substanzen pro Probe zu verringern, und die Methode mit den Unterteilungen der Originalprobe wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Proben können die oben beschriebenen Schritte mehrmals durchgeführt werden, vorzugsweise bis die gemäß dem Verfahren identifizierte Probe nur eine beschränkte Anzahl an Substanzen oder nur noch eine Substanz enthält. Vorzugsweise enthält die Probe Substanzen mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften, und am stärksten bevorzugt sind die Substanzen identisch. Vorzugsweise wird die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren identifizierte Verbindung, oder ihr Derivat, ferner in einer Form aufbereitet, die für die Anwendung in der Pflanzenzucht oder der Zell- und Gewebekultur von Pflanzen geeignet ist.
Bei den Verbindungen, die gemäß diesem Verfahren getestet und identifziert werden können, kann es sich um Expressionsbibliotheken, z. B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Hormone, Peptidomimetika, PNAs oder dergleichen handeln (Milner, Nature Medicine 1, 879 (1995); Hupp, Cell 83, 237 (1995); Gibbs, Cell 79, 193 (1994), und oben angeführte Literaturstellen). Die Verbindungen können außerdem funktionale Derivate oder Analoga von bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Methoden zur Herstellung chemischer Derivate und Analoga sind dem Fachmann gut bekannt und zum Beispiel in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer, New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 U. S. A. und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA, beschrieben. Ferner können die Derivate und Analoga hinsichtlich ihrer Effekte gemäß im Fachgebiet bekannter Methoden getestet werden. Darüber hinaus können Peptidomimetika und/oder computerunterstütztes Design von passenden Derivaten und Analoga, zum Beispiel gemäß der oben beschriebenen Methoden, eingesetzt werden. Die Zelle oder das Gewebe, welches im Verfahren verwendet werden kann, ist vorzugsweise eine Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe der Erfindung, welche(s) in den Ausführungsformen hierin oben beschrieben ist.
Somit betrifft die Erfindung gemäß einer weiteren Ausführungsform eine gemäß der Methode zur Identifizierung eines Agonisten der Erfindung erhaltene oder identifizierte Verbindung, wobei es sich bei dieser Verbindung um einen Antagonisten des Polypeptids der vorliegenden Erfindung handelt.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ferner eine Verbindung, identifiziert durch die Methode zum Identifizieren einer Verbindung der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Antikörper, der spezifisch die Verbindung oder den Agonisten der vorliegenden Erfindung erkennt.
Die Erfindung betrifft außerdem eine diagnostische Zusammensetzung, die mindestens eines aus den/dem/der zuvor erwähnten Nukleinsäuremolekülen, Antisense-Nukleinsäuremolekül, RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, Cosuppressionsmolekül, Ribozym, Vektoren, Proteinen, Antikörpern oder Verbindungen der Erfindung, und gegebenenfalls geeignete Nachweismittel umfasst.
Die diagnostische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist für die Isolierung von mRNA aus einer Zelle und das Inkontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit einer Sonde, einschließlich eine Nukleinsäuresonde, wie oben beschrieben, unter Hybridisierungsbedingungen, das Nachweisen der Gegenwart von an die Sonde hybridisierter mRNA, und dadurch das Nachweisen der Expression des Proteins in der Zelle geeignet. Weitere Methoden zum Nachweis der Gegenwart eines Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen im Fachgebiet allgemein bekannte Immuntechniken, zum Beispiel den Enzyme-Linked-Immunoadsorbent-Assay. Ferner ist es möglich, die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung als molekulare Marker oder Primer in der Pflanzenzucht zu verwenden. Geeignete Nachweismittel sind einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt, z. B. Puffer und Lösungen für Hybridisierungs-Assays, z. B. die obenerwähnten Lösungen und Puffer, und ferner sind Mittel für Southern-, Western-, Northern- etc. -Blots, wie z. B. beschrieben in Sambrook et al., bekannt. In einer Ausführungsform enthält die diagnostische Zusammensetzung PCR-Primer, entworfen zum spezifischen Nachweisen der Gegenwart oder der Expressionshöhe des Nukleinsäuremoleküls, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, oder zum Unterscheiden zwischen verschiedenen Varianten oder Allelen des Nukleinsuremoleküls der Erfindung, oder desjenigen, dessen Aktivität im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, welches das Nukleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle, das Polypeptid, oder das Antisense, die RNAi, die snRNA, die dsRNA, die siRNA, die miRNA, die ta-siRNA, das Kosuppressionsmolekül oder das Ribozymmolekül, oder das virale Nukleinsäuremolekül, den Antikörper, die Pflanzenzelle, die Pflanze oder das Pflanzengewebe, den erntbaren Teil, das Fortpflanzungsmaterial und/oder die Verbindung und/oder den Agonisten, identifiziert gemäß der Methode der Erfindung, umfasst.
Die Verbindungen des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern, wie Ampullen, gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein. Geeignetenfalls könnten eine oder mehrere der Komponenten in ein und demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten an einem festen Träger, wie z. B. einem Nitrozellulosefilter, einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, absorbiert sein. Das Kit kann für ein(e) beliebige(s) hierin beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen, z. B. für die Herstellung der Wirtszellen, transgenen Pflanzen, pharmazeutischen Zusammensetzungen, den Nachweis von homologen Sequenzen, die Identifizierung von Antagonisten oder Agonisten, als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Ergänzung davon, oder als Zusatz zum Behandeln von Pflanzen etc., zur Anwendung kommen. Weiterhin kann das Kit Anweisungen zur Anwendung des Kits bei einer dieser Ausführungsformen enthalten. In einer Ausführungsform umfasst das Kit ferner ein Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein oder mehrere des zuvor erwähnten Proteins und/oder einen Antikörper, einen Vektor, eine Wirtszelle, eine Antisense-Nukleinsäure, eine Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe oder eine Pflanze. Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst das Kit PCR-Primer zum Nachweis und zur Unterscheidung des im Verfahren der Erfindung zu vermindernden Nukleinsäuremoleküls, z. B. des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Herstellung einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, die das Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, den Vektor der Erfindung, das Antisense, die RNAi, die snRNA, die dsRNA, die siRNA, die miRNA, die ta-siRNA, das Kosuppressionsmolekül, das Ribozym oder den Antikörper der Erfindung, das virale Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der Erfindung bereitstellt oder die die Schritte der erfindungsgemäßen Methode zur Identifizierung dieser Verbindung oder dieses Agonisten umfasst; und die Formulierung des Nukleinsäuremoleküls, des Vektors oder des Polypeptids der Erfindung oder des Agonisten, oder der gemäß den Methoden bzw. Verfahren der vorliegenden Erfindung oder unter Verwendung des Gegenstands der vorliegenden Erfindung identifizierten Verbindung in einer als landwirtschaftliche Zusammensetzung für Pflanzen anwendbaren Form bereitstellt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Herstellung der Kulturzusammensetzung für Pflanzen, welche die Schritte der Methode der vorliegenden Erfindung umfasst; und die Formulierung der identifizierten Verbindung in einer als landwirtschaftliche Zusammensetzung annehmbaren Form.
Unter „als landwirtschaftliche Zusammensetzung annehmbar” versteht man, dass eine derartige Zusammensetzung in Übereinstimmung mit den Gesetzen steht, welche den Gehalt an Fungiziden, Pflanzennährstoffen, Herbiziden etc., regulieren. Vorzugsweise ist eine derartige Zusammensetzung für geschützte Pflanzen sowie Tiere (einschließlich Menschen), welche diese aufnehmen, gefahrlos.
In dieser Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen verwiesen. Die Offenbarungen aller dieser Veröffentlichungen und der in diesen Veröffentlichungen angeführten Literaturstellen werden hiermit in ihrer Gesamtheit durch Verweis zur eingehenderen Beschreibung des Stands der Technik, auf den sich diese Erfindung bezieht, Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Es versteht sich auch, dass das Obengesagte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betrifft und dass zahlreiche Änderungen und Variationen daran vorgenommen werden können, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, wobei diese in keiner Weise als einschränkend ausgelegt werden sollen. Es versteht sich vielmehr klar im Gegenteil, dass verschiedene andere Ausführungsformen, Modifikationen und Äquivalente davon, die für den Fachmann nach dem Lesen der vorliegenden Beschreibung naheliegend sind, nicht vom Gedanken der vorliegenden Erfindung und/oder dem Umfang der Ansprüche abweichen.
In einer Ausführungsform führt der erhöhte Ertrag zu einer Erhöhung der Produktion eines bestimmten Inhaltsstoffs, darunter, jedoch ohne Einschränkung, zu einem gesteigerten und/oder verbesserten Zuckergehalt bzw. zu einer gesteigerten und/oder verbesserten Zuckerzusammensetzung, zu einem gesteigerten und/oder verbesserten Stärkegehalt bzw. zu einer gesteigerten und/oder verbesserten Stärkezusammensetzung, zu einem gesteigerten und/oder verbesserten Ölgehalt bzw. zu einer gesteigerten und/oder verbesserten Ölzusammensetzung (wie zu einem gesteigerten Samenölgehalt), zu einem gesteigerten und/oder verbesserten Proteingehalt bzw. zu einer gesteigerten und/oder verbesserten Proteinzusammensetzung (wie zu einem gesteigerten Samenproteingehalt), zu einem gesteigerten und/oder verbesserten Vitamingehalt bzw. zu einer gesteigerten und/oder verbesserten Vitaminzusammensetzung, oder dergleichen.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin das Ernten der erzeugten oder angebauten Pflanze oder eines Teils der erzeugten oder angebauten Pflanze und das Herstellen von Treibstoff mit oder aus der geernteten Pflanze oder einem Teil davon. Weiterhin umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform das Ernten eines Pflanzenteils, der sich für das Isolieren von Stärke eignet, und das Isolieren von Stärke aus diesem Pflanzenteil, wobei es sich bei der Pflanze um eine Pflanze handelt, die sich für die Stärkeproduktion eignet, z. B. die Kartoffel. Weiterhin umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform das Ernten eines Pflanzenteils, der sich für das Isolieren von Öl eignet, und das Isolieren von Öl aus diesem Pflanzenteil, wobei es sich bei der Pflanze um eine Pflanze handelt, die sich für die Ölproduktion eignet, zum Beispiel um Raps oder Canola, Baumwolle, Soja oder Sonnenblume.
So zum Beispiel ist in einer Ausführungsform der Ölgehalt im Maissamen gesteigert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf die Herstellung von Maispflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Acre (erntbares Öl).
So zum Beispiel ist in einer Ausführungsform der Ölgehalt im Sojasamen gesteigert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf die Herstellung von Sojapflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Acre (erntbares Öl).
So zum Beispiel ist in einer Ausführungsform der Ölgehalt im Rapssamen gesteigert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf die Herstellung von Rapspflanzen mit einem erhöhten Ölgehalt pro Acre (erntbares Öl).
Zum Beispiel betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von Baumwollpflanzen mit einem gesteigerten Ölgehalt pro Acre (erntbares Öl).
Weiterhin werden die folgende Anmeldung durch Bezugnahme aufgenommen, von denen die vorliegende Anmeldungen Priorität beansprucht: EP07150175.3 sowie die entsprechende argentinische Patentanmeldung.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die keine Einschränkung darstellen sollen.
Beispiel 1
Gentechnische Entwicklung von Arabidopsis-Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz, einem erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal durch Überexprimieren von YRP-Genen, zum Beispiel durch Exprimieren der Gene der vorliegenden Erfindung.
Klonieren der erfindungsgemäßen Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 und 7, zur Expression in Pflanzen.
Wenn nicht anders angegeben, werden die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschriebenen Standardverfahren angewendet.
Die in der Tabelle I, Spalte 5, gezeigten erfindungsgemäßen Sequenzen wurden mittels PCR amplifiziert, wie in dem Protokoll für die Pfu Ultra-, Pfu Turbo- oder Herculase-DNA-Polymerase (Stratagene) beschrieben. Die Zusammensetzung für das Protokoll der Pfu Ultra-, Pfu Turbo- oder Herculase-DNA-Polymerase war wie folgt: 1 × PCR-Puffer (Stratagene), jeweils 0,2 mM der dNTP, 100 ng genomische DNA von Saccharomyces cerevisiae (Stamm S288C; Research Genetics, Inc., jetzt Invitrogen), E. coli (Stamm MG1655; Escherichia coli Genetic Stock Center), Synechocystis sp. (Stamm PCC6803), Azotobacter vinelandii (Stamm N. R. Smith, 16), Thermus thermophilus (HB8) oder 50 ng cDNA von verschiedenen Geweben und Entwicklungsstadien von Arabidopsis thaliana (Ökotyp Columbia), Physcomitrella patens, Glycine max (Sorte Resnick) oder Zea mays (Sorte B73, Mo17, A188), 50 pmol Vorwärts-Primer, 50 pmol Revers-Primer, mit oder ohne 1 M Betain, 2,5 u Pfu Ultra-, PfuTurbo- oder Herculase-DNA-Polymerase.
Die Amplifikationszyklen waren wie folgt:
1 Zyklus von 2–3 Minuten bei 94–95°C, gefolgt von 25–36 Zyklen von 30–60 Sekunden bei 94–95°C, 30–45 Sekunden bei 50–60°C, und 210–480 Sekunden bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 5–10 Minuten bei 72°C, dann 4–16°C – vorzugsweise für Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus.
Bei Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max Oryza sativa, Physcomitrella patens, Zea mays waren die Amplifikationszyklen wie folgt:
1 Zyklus von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 61°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 2 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 3 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 59°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 4 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 58°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 25 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 57°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 1 Zyklus von 10 Minuten bei 72°C, dann schließlich 4–16°C.
RNAs wurden mit dem RNeasy Plant Kit gemäß dem Standard-Protokoll (Qiagen) erzeugt, und die Superscript II Reverse Transkriptase wurde gemäß dem Standard-Protokoll (Invitrogen) für die Herstellung von doppelsträngiger cDNA eingesetzt. ORF-spezifische Primer-Paare für die zu exprimierenden Gene sind in Tabelle III, Spalte 7 dargestellt. Für Adaptersequenzen, die das Clonieren des ORF in die verschiedenen Vektoren, die die Resgen-Adapter enthalten, gestatten, siehe Tabellenspalte E von Tabelle VII.
Die folgenden Adaptersequenzen wurden für Klonierungszwecke zu Escherichia coli ORF-spezifischen Primern hinzugefügt:
Die Adaptersequenzen gestatten es, das ORF in die verschiedenen Vektoren, die die Colic-Adapter enthalten, zu clonieren; siehe Tabellenspalte E, Tabelle VII.
Zur Amplifikation und Klonierung von Escherichia coli SEQ ID NO: 65 wurden ein Primer, bestehend aus der Adaptersequenz iii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NO: 145, und ein zweiter Primer, bestehend aus der Adaptersequenz iiii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NO: 146, verwendet.

Anhand dieser Beispiele kann jede Sequenz, die in Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, beschrieben ist, kloniert werden, und zwar dadurch, dass man die Adaptersequenzen unter Verwendung der jeweiligen in Tabelle VII gezeigten Vektoren an die jeweiligen spezifischen Primersequenzen, wie sie in Tabelle III, Spalte 7, beschrieben sind, fusioniert. Table VII. Übersicht über die unterschiedlichen Vektoren, die für die Clonierung der ORFs verwendet werden, und zeigt ihre SEQ-IDs (Spalte A), ihre Vektorbezeichnungen (Spalte B), die Promoter für die Expression der ORFs, die sie enthalten (Spalte C), die zusätzliche künstliche Zielsteuerungssequenz (Spalte D), die Adaptersequenz (Spalte E), die von dem Promoter gemäß Spalte B vermittelte Expressionsart (Spalte F) und die Nummer der Figur (Spalte G).

A	B	C	D	E	F	G
SegID	Bezeichnung des Vektors	Bezeichnung des Promoters	Zielsteuerungssequenz	Adaptersequenz	Expressionsart	Figur
192	pMTX0270p	Super		Colic	nichtzielgesteuerte konstitutive Expression mit Bevorzugung für grüne Gewebe	2
12	VC-MME432-1qcz	Super	FNR	Colic	an die Plastiden zielgesteuerte konstitutive Expression mit Bevorzugung für grüne Gewebe	1

Beispiel 1a): Amplifikation der plastidären Zielsteuerungssequenz des FNR-Gens aus Spinacia oleracea und Konstruktion des Vektors für die an die Plastiden zielgesteuerte Expression mit Bevorzugung für grüne Gewebe oder mit Bevorzugung für Samen.
Zur Amplifizierung der Targetingsequenz des FNR-Gens aus S. oleracea, wurde genomische DNA aus Blättern von 4-Wochen alten S. oleracea-Pflanzen extrahiert (DNeasy Plant Mini Kit, Quiagen, Hilden). Die gDNA wurde als Matrize für eine PCR eingesetzt.
Zur Ermöglichung der Klonierung der Transitsequenz in den Vektor pMTX0270p wurde zu dem Vorwärts-Primer eine. PmeI-Restriktionsenzym-Erkennungssequenz hinzugefügt und zu dem Reverse-Primer eine NcoI-Stelle.
Die aus genomischer DNA von Spinat amplifizierte, resultierende Sequenz SEQ ID NO: 35 umfasste eine 5'UTR (Bp 1–165) und die kodierende Region (Bp 166–273 und 351–419). Die Codiersequenz ist durch eine Intronsequenz von Bp 274 bis Bp 350 unterbrochen:
Das mit den Primern FNR5PmeColic und FNR3NcoColic erhaltene PCR-Fragment wurde mit PmeI und NcoI verdaut und in den Vektor pMTX0270p, der mit SmaI und NcoI verdaut worden war, ligiert. Bei dem in diesem Ligationsschritt erzeugten Vektor handelte es sich um VC-MME432-1qcz.
Für die an die Plastiden zielgesteuerte konstitutive Expression mit Bevorzugung für grüne Gewebe wurde in Zusammenhang mit dem Vektor VC-MME432-1qcz für ORFs aus Escherichia coli ein künstlicher Promoter A(ocs)3AmasPmas-Promoter (Super-Promoter) (Ni et al., Plant Journal 7, 661 (1995), WO 95/14098 ) verwendet, was zu einer „leserastergerechten” Fusion der FNR-Zielsteuerungssequenz mit den ORFs führte.
Weitere nützliche binäre Vektoren sind dem Fachmann vertraut; eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung findet sich bei Hellens R., Mullineaux P. und Klee H., (Trends in Plant Science, 5 (10), 446 (2000)). Solche Vektoren müssen ebenfalls mit entsprechenden Promotern und Zielsteuerungssequenzen versehen werden.
Beispiel 1b): Clonieren von erfindungsgemäßen Sequenzen gemäß Tabelle I, Spalte 5 in die unterschiedlichen Expressionsvektoren.
Zum Klonieren der ORFs der SEQ ID NO: 65 aus Escherichia coli wurde die Vektor-DNA mit den Restriktionsenzymen PacI und NcoI gemäß dem Standardprotokoll (MBI Fermentas) behandelt. Die Reaktion wurde durch 20minütiges Inaktivieren bei 70°C gestoppt und der Ansatz wurde über QIAquick- oder NucleoSpin Extract II-Säulen gemäß dem Standardprotokoll (Qiagen oder Macherey-Nagel) aufgereinigt.
Dann wurde das PCR-Produkt, das den amplifizierten ORF mit den jeweiligen Adapter-Sequenzen und die Vektor-DNA darstellte, gemäß dem Standardprotokoll (MBI Fermentas) mit T4-DNA-Polymerase behandelt, wodurch man Einzelstrangüberhänge erhielt, und zwar mit den Parametern 1 Einheit T4-DNA-Polymerase bei 37°C für 2–10 Minuten für den Vektor und 1–2 u T4-DNA-Polymerase bei 15–17°C für 10–60 Minuten für das PCR-Produkt gemäß SEQ ID NO: 65.
Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von Puffer mit hoher Salzkonzentration gestoppt und über QIAquick- oder NucleoSpin Extract II-Säulen gemäß dem Standardprotokoll (Qiagen oder Macherey-Nagel) aufgereinigt.
Gemäß diesem Beispiel kann der Fachmann alle Sequenzen gemäß Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, klonieren.
Etwa 30–60 ng präparierter Vektor und eine definierte Menge des präparierten Amplifikats wurden gemischt und bei 65°C für 15 Minuten hybridisiert, gefolgt von 37°C 0,1°C/1 Sekunde, gefolgt von 37°C 10 Minuten, gefolgt von 0,1°C/1 Sekunde, dann 4–10°C.
Die ligierten Konstrukte wurden in dem gleichen Reaktionsgefäß durch Zugabe kompetenter E. coli-Zellen (Stamm DH5alpha) und Inkubation für 20 Minuten bei 1°C, und einem anschließenden Hitzeschock für 90 Sekunden bei 42°C sowie Abkühlen auf 1–4°C transformiert. Dann wurde Vollmedium (SOC) zugegeben und das Gemisch wurde für 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Das gesamte Gemisch wurde anschließend auf eine Agarplatte mit 0,05 mg/ml Kanamycin plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Das Ergebnis des Klonierungsschritts wurde durch Amplifikation mit Hilfe der Primer verifiziert, die stromaufwärts und stromabwärts der Integrationsstelle binden, so dass die Amplifikation der Insertion ermöglicht wurde. Die Amplifikationen erfolgten wie in dem Protokoll der Taq DNA-Polymerase (Gibco-BRL) beschrieben. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt:
1 Zyklus von 1–5 Minuten bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen mit jeweils 15–60 Sekunden bei 94°C, 15–60 Sekunden bei 50–66°C und 5–15 Minuten bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 10 Minuten bei 72°C, dann 4–16°C.
Mehrere Kolonien Wurden überprüft, jedoch wurde nur die Kolonie, für die ein PCR-Produkt mit der erwarteten Größe nachgewiesen wurde, in den folgenden Schritten verwendet.
Ein Teil dieser positiven Kolonie wurde in ein Reaktionsgefäß überführt, das mit Vollmedium (LB), mit Zusatz von Kanamycin, gefüllt war, und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die Plasmidzubereitung erfolgte gemäß Qiaprep- oder NucleoSpin Multi-96 Plus-Standardprotokoll (Qiagen oder Macherey-Nagel).
Herstellung transgener Pflanzen, die SEQ ID NO: 65 oder eine beliebige andere Sequenz gemäß Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, exprimieren
1–5 ng isolierte Plasmid-DNA wurde durch Elektroporation oder Transformation von Agrobacterium tumefaciens, Stamm GV 3101 pMP90 (Koncz und Schell, Mol. Gen. Gent. 204, 383, 1986), in kompetente Zellen transformiert. Danach wurde Vollmedium (YEP) zugegeben und das Gemisch wurde für 3 Stunden bei 28°C in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde das gesamte Reaktionsgemisch auf YEP-Agarplatten plattiert, die mit den entsprechenden Antibiotika, beispielsweise Rifampicin (0,1 mg/ml), Gentamycin (0,025 mg/ml) und Kanamycin (0,05 mg/ml), versetzt waren, und 48 Stunden lang bei 28°C inkubiert.
Die Agrobakterien, die das Plasmidkonstrukt enthielten, wurden dann zur Transformation von Pflanzen verwendet.
Mit Hilfe einer Pipettenspitze wurde eine Kolonie von der Agarplatte gepickt und in 3 ml flüssigem TB-Medium aufgenommen, das auch geeignete Antibiotika, wie oben beschrieben, enthielt. Die Vorkultur wurde 48 Std. bei 28°C und 120 U/min gezüchtet.
400 ml LB-Medium, das die gleichen Antibiotika wie oben enthielt, wurde für die Hauptkultur verwendet. Die Vorkultur wurde in die Hauptkultur überführt. Sie wurde 18 Std. bei 28°C und 120 U/min gezüchtet. Nach Zentrifugation bei 4000 U/min wurde das Pellet in Infiltrationsmedium (MS-Medium, 10% Saccharose) resuspendiert.
Zum Anziehen der Pflanzen für die Transformation wurden Wannen (Piki Saat 80, grün, mit Siebboden, 30 × 20 × 4,5 cm, von Wiesauplast, Kunststofftechnik, Deutschland) bis zur Hälfte mit einem GS 90-Substrat (Standardboden, Werkverband E. V., Deutschland) gefüllt. Die Wannen wurden über Nacht mit 0,05% Proplant-Lösung (Chimac-Apriphar, Belgien) gegossen. Samen von A. thaliana C24 (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK; NASC Stock N906) wurden über die Wanne verteilt, und zwar etwa 1000 Samen pro Wanne. Die Wannen wurden mit einer Haube abgedeckt und in der Stratifikationseinheit (8 h, 110 μmol/m²s¹, 22°C; 16 h, Dunkelheit, 6°C) untergebracht. Nach 5 Tagen wurden die Wannen in einer Klimakammer mit Kurztag (8 h, 130 μmol/m²s¹, 22°C; 16 Std., Dunkelheit, 20°C) untergebracht, wo sie etwa 10 Tage verblieben, bis sich die ersten echten Blätter gebildet hatten.
Die Keimlinge wurden in Töpfe überführt, die das gleiche Substrat enthielten (Teku Töpfe, 7 cm, LC Serie, Hersteller, Pöppelmann GmbH & Co, Deutschland). In jeden Topf wurden fünf Pflanzen pikiert. Die Töpfe wurden dann in die Klimakammer mit Kurztag zurückgestellt, damit die Pflanzen weiter wachsen konnten.
Nach 10 Tagen wurden die Pflanzen in die Gewächshauskammer (Zusatzlicht 16 h, 340 μE/m²s, 22°C; 8 h, Dunkelheit, 20°C) überführt, wo sie weitere 17 Tage wachsen gelassen wurden.
Für die Transformation wurden 6 Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen, die gerade zu blühen begonnen hatten, 10 Sekunden lang in die vorstehend beschriebene Agrobakteriensuspension getaucht, die vorher mit 10 μl Silwett L77 (Crompton S. A., Osi Specialties, Schweiz) behandelt worden war. Das entsprechende Verfahren ist in Clough J. C. und Bent A. F. (Plant J. 16, 735 (1998)) beschrieben.
Die Pflanzen wurden anschließend 18 Stunden lang in einer Feuchtkammer untergebracht. Danach wurden die Töpfe zurück in das Gewächshaus gestellt, damit die Pflanzen weiter wachsen konnten. Die Pflanzen verblieben weitere 10 Wochen im Gewächshaus, bis die Samen erntereif waren.
Je nach dem Toleranzmarker, der zur Selektion der transformierten Pflanzen verwendet wurde, wurden die geernteten Samen im Gewächshaus ausgepflanzt und einer Sprühselektion unterzogen oder ansonsten zuerst sterilisiert und dann auf Agarplatten gezüchtet, die mit dem entsprechenden Selektionsmittel versetzt waren. Da der Vektor das Bar-Gen als Toleranzmarker enthielt, wurden die Jungpflanzen viermal in einem Abstand von 2 bis 3 Tagen mit 0,02% BASTA^® besprüht, und man ließ die transformierten Pflanzen Samen bilden. Die Samen der transgenen A. thaliana-Pflanzen wurden in einem Gefrierschrank (bei –20°C) aufbewahrt.
Beispiel 1c): Screening von Pflanzen (Arabidopsis) auf Wachstum unter beschränkter Stickstoffverfügbarkeit
Für das Screening von transgenen Pflanzen (die wie in Beispiel 1a) erzeugt worden waren) wurde eine spezielle Kulturanlage verwendet. Für Hochdurchsatzzwecke wurden die Pflanzen auf Agarplatten mit einer beschränkten Stickstoffversorgung auf Biomasseproduktion gescreent (in Anlehnung an Estelle und Somerville, 1987).
Dieser Screening-Fluss besteht aus zwei Niveaus. Transgene Linien werden dann dem nächsten Niveau exponiert, wenn die Biomasseproduktion verglichen mit Wildtyppflanzen signifikant verbessert war. Mit steigendem Niveau wurde die Anzahl der Wiederholungen und die statistische Strenge erhöht.
Für die Aussaat wurden die Samen, die im Kühlschrank (bei –20°C) aufbewahrt worden waren, aus den Eppendorf-Röhrchen mit Hilfe eines Zahlstochers entfernt und auf die obenerwähnten Agarplatten mit einer begrenzten Stickstoffversorgung (0,05 mM KNO₃) umgesetzt. Insgesamt wurden ungefähr 15–30 Samen waagerecht auf jeder Platte verteilt (12 × 12 cm).
Nachdem die Samen ausgesät worden waren, werden die Platten 2–4 Tage im Dunklen bei 4°C stratifiziert. Nach der Stratifikation wurden die Testpflanzen 22 bis 25 Tage in einem 16-h-Licht/8-h-Dunkel-Rhythmus bei 20°C bei einer Luftfeuchtigkeit von 60% und einer CO₂-Konzentration von ungefähr 400 ppm herangezogen. Die verwendeten Lichtquellen erzeugen ein Licht, das dem Sonnenfarbspektrum ähnelt, mit einer Lichtintensität von ungefähr 100 μE/m²s.
Nach 10 bis 11 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Ein verbessertes Wachstum unter Stickstoffbegrenzungsbedingungen wurde anhand der Biomasseproduktion der Sprosse und Wurzeln der transgenen Pflanzen verglichen mit Wildtypkontrollpflanzen nach 20–25-tägigem Wachstum beurteilt.
Mit transgenen Linien mit einer signifikant verbesserten Biomasseproduktion verglichen mit Wildtyppflanzen wird der folgende Versuch des nächsten Niveaus durchgeführt:
Arabidopsis-thaliana-Samen werden in Töpfe gesät, die eine 1:1 (v:v)-Mischung aus nährstoffarmem Boden („Einheitserde Typ 0”, 30 Ton, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand enthalten. Die Keimung wird durch einen Zeitraum von 4 Tagen bei 4°C im Dunkeln induziert. Anschließend werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen (Fotoperiode mit 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, Photonenflussdichte 200 μE) herangezogen. Die Pflanzen werden herangezogen und kultiviert, unter anderem werden sie jeden zweiten Tag mit einer N-armen Nährlösung gegossen.

Die N-arme Nährlösung enthält zum Beispiel außer Wasser

Mineralnährstoff	Endkonzentration
KCl	3,00 mM
MgSO₄ × 7H₂O	0,5 mM
CaCl₂ × 6H₂O	1,5 mM
K₂SO₄	1,5 mM
NaH₂PO₄	1,5 mM
Fe-EDTA	40 μM
H₃BO₃	25 μM
MnSO₄ × H₂O	1 μM
ZnSO₄ × 7H₂O	0,5 μM
Cu₂SO₄ × 5H₂O	0,3 μM
Na₂MoO₄ × 2H₂O	0,05 μM

Nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Nach einer Gesamtzeit von 29 bis 31 Tagen werden die Pflanzen geerntet und aufgrund des Frischgewichts der oberirdischen Pflanzenteile bonitiert. Die Ergebnisse hiervon sind in Tabelle VIII-A zusammengestellt. Die Biomasseerhöhung wurde als Verhältnis des Frischgewichts der oberirdischen Teile der entsprechenden transgenen Pflanze zu der nicht transgenen Wildtyppflanze gemessen.
Biomasseproduktion von transgenen Arabidopsis thaliana, die unter Stickstofflimitierung herangezogen wurden, ist in Tabelle VIIIa dargestellt: Die Biomasseproduktion wurde durch Wiegen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Biomasseerhöhung wurde als das Verhältnis des Durchschnittsgewichts der transgenen Pflanzen im Vergleich zu dem Durchschnittsgewicht von Wildtypkontrollpflanzen desselben Versuchs berechnet. Die mittlere Biomasseerhöhung der transgenen Konstrukte ist angegeben (Signifikanzwert < 0,1). Tabelle VIII-A (Stickstoffnutzungseffizienz)

SeqID Ziel Locus Biomasseerhöhung

65 plastidär B1399 1,358

149 plastidär B3293 1,370
Beispiel 1d): (Arabidopsis) Screening von Pflanzen auf Wachstum unter Niedertemperaturbedingungen
In einem Standardversuch wird Boden als 3,5:1 (v/v)-Mischung aus nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand hergestellt. Töpfe wurden mit Bodenmischung befüllt und in Wannen gestellt. In die Wannen wurde Wasser gegeben, damit die Erdmischung eine angemessene Wassermenge für das Aussäen aufnehmen konnte. Die Samen für transgene Arabidopsis thaliana-Pflanzen (wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt) wurden in Töpfe (Durchmesser 6 cm) ausgesät. Die Töpfe wurden gesammelt, bis sie eine Wanne für die Wachstumskammer füllten. Dann wurde die befüllte Wanne mit einer transparenten Haube abgedeckt und in das Regalsystem der vorgekühlten (4°C–5°C) Wachstumskammer umgestellt. Die Stratifikation erfolgte für einen Zeitraum von 2–3 Tagen in Dunkelheit bei 4°C–5°C. Samenkeimung und Wachstum wurden bei einer Wachstumsbedingung 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, 16 h-Fotoperiode und Beleuchtung mit Fluoreszenzlicht bei 200 μmol/m²s initiiert. 7 Tage nach dem Säen wurden die Hauben entfernt. Die BASTA-Selektion erfolgte am 9. Tag nach dem Aussäen dadurch, dass man die Töpfe mit den Pflänzchen von oben her besprühte. Es wurde zu diesem Zweck eine 0,07%ige (v/v)-Lösung von BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinate-Ammonium) in Leitungswasser versprüht. Die transgenen Events und die Wildtypkontrollpflanzen wurden zufallsmäßig über die Kammer verteilt. Ab dem 7. Tag nach der Aussaat wurde der Standort der Wannen in den Kammern an Werktagen geändert. Alle 2 Tage wurde, nachdem die Hauben von den Wannen entfernt wurden, gegossen. Die Pflanzen wurden 12–13 Tage nach dem Säen durch Entfernen der überflüssigen Keimlinge vereinzelt, wobei ein Keimling pro Topf verblieb. 14 Tage nach dem Säen bis zum Ende des Versuchs wurde kältebehandelt (Abkühlen auf 11°C–12°C). Zum Messen der Biomasseleistung wurde das Pflanzenfrischgewicht zum Erntezeitpunkt (29–36 Tage nach dem Säen) bestimmt, und zwar durch Abschneiden und Wägen der Sprosse. Zusätzlich zu dem Wägen wurde im Fall von Pflanzen, die von der Wildtypkontrolle abwichen, eine Phänotypinformation hinzugefügt. Zum Erntezeitpunkt befanden sich die Pflanzen im Vorblütestadium und vor dem Wachstum des Blütenstands.
Die transgenen Pflanzen wurden mit den nicht transgenen Wildtypkontrollpflanzen verglichen, die am gleichen Tag geerntet wurden. Die Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasseveränderungen wurden durch Anwendung von Student's t-Test berechnet (Parameter: zweiseitig, ungleiche Varianz).
In aufeinanderfolgenden Versuchsstufen wurden bis zu fünf Linien pro transgenem Konstrukt getestet.
Nur Events mit positiver Leistung wurden der nächsten Versuchsstufe unterzogen. Die Ergebnisse hiervon sind in Tabelle VIII-B zusammengestellt.
Tabelle VIII-B: Biomasseproduktion von transgenen A. thaliana nach Behandlung mit Kältestress.
Die Biomasseproduktion wurde durch Wägen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Biomasseerhöhung wurde als Verhältnis des durchschnittlichen Gewichts von transgenen Pflanzen zu dem durchschnittlichen Gewicht von Wildtypkontrollpflanzen berechnet. Die mittlere Biomasseerhöhung der transgenen Konstrukte ist angegeben (Signifikanzwert < 0,1). Tabelle VIII-B: Niedrigtemperatur

SeqID Ziel Locus Bioasseerhöhung

65 plastidär B1399 1,222

149 plastidär B3293 1,372
Beispiel 1e): Screening von Pflanzen auf Wachstum unter zyklischen Dürrebedingungen
In einem zyklischen Dürre-Assay können Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt werden, ohne dass dieser zur Austrocknung führt. In einem Standardversuch wird Boden als 1:1 (v/v)-Mischung aus nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Quartzsand hergestellt. Töpfe (Durchmesser 6 cm) können mit dieser Mischung befüllt und in Wannen gestellt werden. Die Wannen können mit Wasser versetzt werden, damit die Erdmischung eine angemessene Menge Wasser für das Aussäen (Tag 1) aufnimmt, und anschließend können Samen von transgenen A. thaliana-Pflanzen und ihren Wildtypkontrollen in Töpfe gesät werden. Die gefüllten Wannen können dann mit einem transparenten Deckel abgedeckt und in eine vorgekühlte (4°C–5°C) und verdunkelte Wachstumskammer umgestellt werden. Eine Stratifikation kann für einen Zeitraum von 3 Tagen im Dunkeln bei 4°C–5°C oder alternativ dazu 4 Tage im Dunkeln bei 4°C erfolgen. Samenkeimen und Wachstum können bei einer Wachstumsbedingung von 20°C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, 16 h-Fotoperiode und Beleuchtung mit Fluoreszenzlicht bei ungefähr 200 μmol/m2s initiiert werden. 7–8 Tage nach dem Säen können die Hauben entfernt werden. Eine Selektion mit BASTA kann am 10. oder 11. Tag (9 oder 10 Tage nach dem Säen) dadurch erfolgen, dass man die Töpfe mit den Pflänzchen von oben besprüht. In dem Standardversuch kann eine 0,07%ige (v/v) Lösung von BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinate-Ammonium) in Leitungswasser einmal oder alternativ dazu kann eine 0,02%ige (v/v) Lösung von BASTA dreimal versprüht werden. Die Wildtypkontrollpflanzen können nur mit Leitungswasser (statt dass sie mit in Leitungswasser gelöstem BASTA besprüht werden) besprüht werden, können jedoch sonst identisch behandelt werden. Die Pflanzen können 13–14 Tage nach dem Aussäen dadurch vereinzelt werden, dass man die überschüssigen Keimlinge entfernt und nur einen Keimling in der Erde belässt. Transgene Events und Wildtypkontrollpflanzen können gleichmäßig über die Kammer verteilt werden.
Die Wasserzufuhr kann während des ganzen Versuchs limitiert werden, und die Pflanzen können Zyklen von Dürre und erneutem Gießen ausgesetzt werden. Das Gießen kann am 1. Tag (vor dem Aussäen), 14. Tag oder 15. Tag, 21. Tag oder 22. Tag und schließlich 27. Tag oder 28. Tag erfolgen. Zum Messen der Biomasseproduktion kann das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach dem letzten Gießen (28. Tag oder 29. Tag) bestimmt werden, und zwar dadurch, dass man die Sprosse abschneidet und sie wägt. Zusätzlich zu dem Wägen kann bei Pflanzen, die sich von der Wildtypkontrolle unterscheiden, eine Phänotyp-Information hinzugefügt werden. Die Pflanzen können zum Erntezeitpunkt im Vorblütestadium und vor dem Wachstum des Blütenstands sein. Die Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasseveränderungen können durch Anwendung von Student's t-Test berechnet werden (Parameter: zweiseitig, ungleiche Varianz).
In aufeinanderfolgenden Versuchsstufen (bis zu 4) können bis zu 5 Linien (Events) pro transgenem Konstrukt getestet werden. Nur Konstrukte mit einer positiven Leistung können der nächsten Versuchsstufe unterzogen werden. Üblicherweise können auf der ersten Stufe 5 Pflanzen pro Konstrukt getestet werden und in den anschließenden Stufen 30–60 Pflanzen. Die Biomasseleistung kann wie oben beschrieben ausgewertet werden. Es sind die Daten für Konstrukte, die in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Versuchsstufen eine erhöhte Biomasseleistung aufwiesen, gezeigt.
Die Biomasseproduktion kann durch Wägen der Pflanzenrosetten bestimmt werden. Die Biomasseerhöhung kann als Verhältnis des durchschnittlichen Gewichts der transgenen Pflanze im Vergleich zu dem durchschnittlichen Gewicht der Wildtypkontrollpflanzen aus demselben Versuch berechnet werden. Die mittlere Biomasseerhöhung der transgenen Konstrukte kann angegeben werden (Signifikanzwert < 0,3 und Biomasseerhöhung > 5% (Verhältnis > 1,05)).
Beispiel 1f): Screening von Pflanzen auf Ertragssteigerung unter standardisierten Wachstumsbedingungen
In diesem Versuch wurde ein Screening der Pflanzen auf Ertragserhöhung (im vorliegenden Fall Biomasseertragserhöhung) unter standardisierten Wachstumsbedingungen in Abwesenheit von nennenswertem abiotischem Stress durchgeführt. In einem Standardversuch wird Boden als 3,5:1 (v/v)-Mischung aus nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Quartzsand hergestellt. Alternativ dazu wurden Pflanzen auf nährstoffreichem Boden (GS90, Tantau, Deutschland) ausgesät. Töpfe wurden mit Bodenmischung befüllt und in Wannen gestellt. In die Wannen wurde Wasser gegeben, damit die Erdmischung eine angemessene Wassermenge für das Aussäen aufnehmen konnte. Die Samen für transgene A. thaliana-Pflanzen und ihre nichttransgenen Wildtypkontrollen wurden in Töpfe (Durchmesser 6 cm) ausgesät. Die Stratifikation erfolgte für einen Zeitraum von 3–4 Tagen im Dunkeln bei 4°C–5°C. Samenkeimung und Wachstum wurden bei einer Wachstumsbedingung von 20°C und ungefähr 60% relative Feuchtigkeit, 16 h-Fotoperiode und Beleuchtung mit Fluoreszenzlicht bei 150–200 μmol/m2s. Die BASTA-Selektion erfolgte am 10. oder 11. Tag (9 oder 10 Tage nach dem Aussäen) dadurch, dass man die Töpfe mit den Pflänzchen von oben her besprühte. In dem Standardversuch wurde eine 0,07%ige (v/v) Lösung von BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinate-Ammonium) in Leitungswasser einmal versprüht oder alternativ dazu wurde eine 0,02%ige (v/v) Lösung von BASTA dreimal versprüht. Die Wildtypkontrollpflanzen wurden nur mit Leitungswasser besprüht (statt dass sie mit in Leitungswasser gelöstem BASTA besprüht wurden), sonst jedoch gleich behandelt. 13–14 Tage nach dem Aussäen wurden die Pflanzen dadurch vereinzelt, dass man die überflüssigen Keimlinge entfernte und einen Keimling in der Erde beließ. Die transgenen Events und die Wildtypkontrollpflanzen wurden gleichmäßig über die Kammer verteilt.
In einem Standardversuch wurde alle zwei Tage nach Entfernung der Hauben oder alternativ dazu jeden Tag gegossen. Zur Bestimmung der Biomasseleistung wurde das Pflanzenfrischgewicht zum Erntezeitpunkt (24–29 Tage nach dem Säen) dadurch bestimmt, dass man die Sprosse abschnitt und wog. Alternativ dazu wurde 24–25 Tage nach dem Säen geerntet. Zum Erntezeitpunkt befanden sich die Pflanzen im Vorblütestadium und vor dem Wachstum des Blütenstands. Die transgenen Pflanzen wurden mit den nicht transgenen Wildtypkontrollpflanzen verglichen, die am gleichen Tag geerntet wurden. Die Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasseveränderungen wurden durch Anwendung von Student's t-Test berechnet (Parameter: zweiseitig, ungleiche Varianz).
Pro transgenem Konstrukt wurden 3–4 unabhängige transgene Linien (= Events) getestet (25–28 Pflanze pro Konstrukt) und die Biomasseleistung wurde wie oben beschrieben ausgewertet.
Tabelle VIII-C: Biomasseproduktion von transgenen A. thaliana, herangezogen unter Umweltwachstumsbedingungen. Die Biomasseproduktion wurde durch Wiegen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Biomasseerhöhung wurde als Verhältnis des durchschnittlichen Gewichts von transgenen Pflanzen zu dem durchschnittlichen Gewicht von Wildtypkontrollpflanzen desselben Versuchs berechnet (jeweils > 25 Pflanzen). Die mittlere Biomasseerhöhung der transgenen Konstrukte ist angegeben (Signifikanzwert < 0,005). Tabelle VIII-C: (Ertragssteigerung unter Standardbedingungen)

SeqID Ziel Locus Biomasseerhöhung

65 plastidär B1399 1,217

149 plastidär B3293 1,262
Beispiel 2:
Gentechnische Herstellung von Arabidopsis-Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzung und/oder einem sonstigen erwähnten Ertragsmerkmal durch Überexprimieren der Gene aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli, die für das ertragserhöhende, z. B. YRP-Protein, zum Beispiel Protein, das mit Resistenz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur in Zusammenhang steht, codieren, unter Verwendung von gewebespezifischen und/oder stressinduzierbaren Promotern.
Transgene Arabidopsis-Pflanzen werden wie in Beispiel 1 erzeugt, um die für das YRP, z. B. ertragserhöhende Protein, zum Beispiel Protein, das mit Resistenz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur im Zusammenhang steht, codierenden Transgene unter der Kontrolle eines gewebespezifischen und/oder stressinduzierbaren Promoters zu exprimieren.
Die Pflanzen der T2-Generation werden erzeugt und unter Stressbedingungen, vorzugsweise Niedertemperaturbedingungen, herangezogen. Die Biomasseproduktion wird nach einer Gesamtzeit von 29 bis 30 Tagen, beginnend mit der Aussaat, bestimmt. Die transgene Arabidopsis-Pflanze produziert mehr Biomasse als nichttransgene Kontrollpflanzen
Beispiel 3: Die Überexpression der Gene aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli, die mit dem ertragserhöhenden, z. B. YRP-Protein, zum Beispiel Protein, das mit Resistenz und/oder Toleranz gegenüber. niederer Temperatur in Zusammenhang steht, zum Beispiel im Zusammenhang mit Stress, in Zusammenhang stehen, führt zu Toleranz von mehrfachen abiotischen Stressfaktoren.
Pflanzen, die eine Toleranz gegenüber einem abiotischen Stress aufweisen, weisen häufig eine Toleranz gegenüber anderen Umweltstressfaktoren auf. Dieses Phänomen der Kreuztoleranz ist auf mechanistischem Niveau noch unklar (McKersie und Leshem, 1994). Es ist jedoch realistisch zu erwarten, dass Pflanzen mit einer gesteigerten Toleranz gegenüber niederer Temperatur, zum Beispiel Kältetemperaturen und/oder Gefriertemperaturen, aufgrund der Expression eines Transgens auch eine Toleranz gegenüber Dürrestress und/oder Salzstress und/oder sonstige abiotische Stressfaktoren aufweisen könnten. Unterstützt wird diese Hypothese dadurch, dass die Expression von mehreren Genen durch multiple abiotische Stressfaktoren, darunter niedere Temperatur, Dürre, Salz, Osmotikum, ABA usw. hinauf- oder hinunterreguliert wird (z. B. Hong et al., Plant Mol Biol 18, 663 (1992); Jagendorf und Takabe, Plant Physiol 127, 1827 (2001)); Mizoguchi et al., Proc Natl Acad Sci USA 93, 765 (1996); Zhu, Curr Opin Plant Biol 4, 401 (2001)).
Zur Bestimmung der Salztoleranz werden Samen von A. thaliana sterilisiert (100% Bleichmittel, 0,1% Triton X zweimal für fünf Minuten und fünfmaliges Spülen mit ddH₂O). Die Samen wurden auf nicht-selektive Medien (1/2 MS, 0,6% Phytagar, 0,5g/1 MES, 1% Saccharose, 2 μg/ml Benamyl) ausplattiert. Man lässt die Samen etwa 10 Tage lang auskeimen. Im 4–5-Blattstadium wurden transgene Pflanzen in Töpfe mit 5,5 cm Durchmesser eingetopft und man lieft sie etwa sieben Tage lang wachsen (22°C, Dauerlicht), wobei nach Bedarf gewässert wurde. Zu Beginn des Assays werden zwei Liter 100 mM NaCl und 1/8 MS zu der Wanne unter den Töpfen zugegeben. Zu der Wanne, die die Kontrollpflanzen enthält, werden drei Liter 1/8 MS hinzugefügt. Die Konzentrationen der NaCl-Anreicherung werden schrittweise alle 4 Tage um 50 mM bis auf 200 mM erhöht. Nach der Salzbehandlung mit 200 mM werden die Frische und das Überleben und die Biomasseproduktion der Pflanzen bestimmt.
Zur Bestimmung der Toleranz gegenüber Dürre werden Samen der transgenen Linien und Niedertemperaturlinien keimen gelassen und etwa 10 Tage bis zum 4–5-Blattstadium wie oben herangezogen werden. Die Pflanzen werden dann in Dürrebedingungen umgestellt und über das Blüte- und das Samenansatz-Entwicklungsstadium herangezogen. Die Photosynthese kann unter Verwendung der Chlorophyll-Fluoreszenz als Indikator für die Photosynthesefähigkeit und die Unversehrtheit der Photosysteme gemessen werden. Das Überleben und die Pflanzen-Biomasseproduktion werden als Indikatoren für den Samenertrag bestimmt.
Pflanzen, die eine Toleranz gegen Salinität oder niedrige Temperaturen besitzen, weisen höhere Überlebensraten und eine höhere Biomasseproduktion, einschließlich höherem Samenertrag und höherer Trockensubstanzproduktion, auf als empfindliche Pflanzen.
Beispiel 4: Gentechnische Herstellung von Luzernepflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, z. B gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion durch Überexpression von ertragserhöhenden, z. B. YRP-Protein-codierenden, z. B. mit Resistenz oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli.
Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird unter Anwendung von Methoden aus dem Stand der Technik (z. B. McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999)) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotyp-abhängig, und deswegen wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Sie können zum Beispiel aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder anderen im Handel erhältlichen Luzernesorten wie von Brown D. C. W. und Atanassov A. (Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 111 (1985)) beschrieben ausgewählt werden. Alternativ dazu wählt man die RA3-Sorte (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur (Walker et al., Am. J. Bot. 65, 654 (1978)).
Blattstielexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999)) oder LBA4404, die einen binären Vektor enthalten, cokultiviert. Für die Pflanzentransformation wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme beschrieben (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols, Methods in Molecular Biology, Band 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressonskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromoter, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patente 5,7673,666 und 6,225,105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotern das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation, der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel wird der 34S-Promoter (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet, um für die konstitutive Expression des Merkmalsgens zu sorgen.
Die Explantate werden 3 Tage lang im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält, kultiviert. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) von halber Stärke gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und geeignetem Antibiotikum zum Inhibieren des Wachstums von Agrobacterium, ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika, und 50 g/l Saccharose enthält, umgesetzt. Die somatischen Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Keimlinge werden in Blumentöpfe umgesetzt und in einem Gewächshaus herangezogen.
Es werden Pflanzen der T1- bzw. T2-Generation erzeugt und Niedrigtemperaturversuchen unterzogen, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Für die Beurteilung der Ertragserhöhung, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, wird Biomasseproduktion, intrinsischem Ertrag und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen.
Beispiel 5: Gentechnische Herstellung von Weidelgraspflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, z. B. gesteigerter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion durch Überexpression von ertragserhöhenden, z. B. YRP-Protein-codierenden, z. B. mit Toleranz gegenüber niedriger Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli
Als Explantatquellen für die Transformation können Samen von verschiedenen Weidelgrassorten, darunter der im Handel erhältlichen Sorte Gunne, von der Saatfirma Svalöf Weibull; oder die Sorte Affinity, verwendet werden Die Samen werden nacheinander 1 Minute lang mit 1% Tween-20 und 60 Minuten lang mit 100% Bleichmittel oberflächensterilisiert, 3mal jeweils 5 Minuten lang mit deionisiertem und destilliertem H₂O gespült und anschließend 3–4 Tage lang auf feuchtem, sterilem Filterpapier im Dunkeln keimen gelassen. Die Keimlinge werden weiterhin 1 Minute lang mit 1% Tween-20, 5 Minuten mit 75% Bleichmittel, sterilisiert und dreimal mit dd H₂O jeweils 5 Minuten lang gespült.
Die oberflächensterilisierten Samen werden auf das Kallusinduktionsmedium, das Murashige und Skoog-Basalsalze und Vitamine, 20 g/l Saccharose, 150 mg/l Asparagin, 500 mg/l Casein-Hydrolysat, 3 g/l Phytagel, 10 mg/l BAP und 5 mg/l Dicamba enthält, gelegt. Die Platten werden 4 Wochen lang im Dunkeln bei 25°C zwecks Samenkeimung und zur Induktion von embryogenem Kallus inkubiert.
Nach 4 Wochen auf dem Kallusinduktionsmedium werden die Sprosse und Wurzeln der Keimlinge abgeschnitten, der Kallus auf frisches Medium umgesetzt, weitere 4 Wochen lang kultiviert und dann 2 Wochen lang auf MSO-Medium ins Licht umgesetzt. Mehrere (11–17 Wochen alte) Kallusstückchen werden entweder durch ein 10-Mesh-Sieb gesiebt und auf Kallusinduktionsmedium gesetzt oder in 100 ml flüssiges Weidelgras-Kallusinduktionsmedium (dasselbe Medium wie für die Kallusinduktion, mit Agar) in einem 250 ml-Kolben kultiviert. Der Kolben wird in Folie eingewickelt und im Dunkeln bei 23°C eine Woche lang bei 175 U/min geschüttelt. Durch Sieben der Flüssigkultur durch ein 40-Mesh-Sieb wurden die Zellen gesammelt. Die auf dem Sieb gesammelte Fraktion wird auf festes Weidelgras-Kallusinduktionsmedium ausplattiert und darauf 1 Woche lang im Dunkeln bei 25°C kultiviert. Der Kallus wird dann auf MS-Medium mit 1% Saccharose umgesetzt und darauf 2 Wochen lang kultiviert.
Die Transformation kann entweder mit Agrobacterium oder mit Teilchenbeschussverfahren durchgeführt werden. Es wird ein Expressionsvektor, der einen konstitutiven Pflanzenpromoter und die cDNA des Gens in einem pUC-Vektor enthält, hergestellt. Die Plasmid-DNA wird aus E. coli-Zellen mit Hilfe des Qiagen-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert. Ungefähr 2 g embryogener Kallus wird in der Mitte eines sterilen Filterpapiers in einer Petrischale verteilt. Ein Aliquot flüssiges MSO mit 10 g/l Saccharose wird auf das Filterpapier gegeben. Goldpartikel (Größe 1,0 μm) werden mit der Plasmid-DNA entsprechend dem Verfahren von Sanford et al., 1993, beschichtet und in den embryogenen Kallus unter Verwendung der folgenden Parameter eingebracht: 500 μg Teilchen und 2 μg DNA je Schuß, 1300 psi und eine Zieldistanz von 8,5 cm von der Stopping-Platte zur Kallus-Platte, sowie 1 Schuß je Kallus-Platte.
Nach dem Beschuß werden die Kalli zurück auf frisches Kallus-Entwicklungsmedium umgesetzt und während eines Zeitraums von 1 Woche im Dunkeln bei Raumtemperatur gehalten. Der Kallus wird dann in Wachstumsbedingungen im Licht bei 25°C umgestellt, so dass die Differenzierung des Embryos mit dem geeigneten Selektionsmittel, z. B. 250 nM Arsenal, 5 mg/l PPT oder 50 mg/l Kanamycin eingeleitet wird. Sprosse, die gegen das Selektionsmittel resistent sind, erscheinen und werden nach der Bewurzelung in Erde umgesetzt.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet, um eine Digoxigenin-markierte Sonde durch PCR herzustellen, wobei es gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wird.
Transgene T0-Weidelgraspflanzen werden durch Exzision von Bestockungstrieben vegetativ vermehrt. Die transplantierten Bestockungstriebe werden 2 Monate lang im Gewächshaus gehalten, bis sie sich gut entwickelt haben. Die Sprosse werden entlaubt und 2 Wochen lang wachsen gelassen.
Es werden Pflanzen der T1- bzw. T2-Generation erzeugt und Niedrigtemperaturversuchen unterzogen, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Für die Beurteilung der Ertragserhöhung, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, wird Biomasseproduktion, intrinsischem Ertrag und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen.
Beispiel 6: Gentechnische Herstellung von Sojabohnenpflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, z. B. gesteigerter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion durch Überexpression von ertragserhöhenden, z. B. YRP-Protein-codierenden, z. B. mit Toleranz gegenüber niedriger Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli.
Soja wird gemäß der folgenden Modifikation des Verfahrens nach dem Texas A&M-Patent US 5,164,310 transformiert. Es eignen sich verschiedene im Handel erhältliche Sojabohnensorten für die Tranformation nach diesem Verfahren. Allgemein wird für die Transformation die Sorte Jack (von der Illinois Seed Foundation) verwendet Die Samen werden durch sechsminütiges Eintauchen. in 70%iges (v/v) Ethanol und zwanzigminütiges Eintauchen in 25%iges im Handel erhältliches Bleichmittel (NaOCl) mit einem Zusatz von 0,1% (v/v) Tween, wonach viermal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser gespült wird, sterilisiert. Sieben Tage alte Keimlinge werden vermehrt, indem von jedem Keimling die Keimwurzel, das Hypokotyl und ein Keimblatt entfernt werden. Dann wird das Epikotyl mit einem Keimblatt auf frisches Keimungsmedium in Petrischalen umgesetzt und bei 25°C unter einer 16-h-Photoperiode (ungefähr 100 μmol/m²s) drei Wochen lang inkubiert. Die Achselknoten (ungefähr 4 mm lang) wurden von 3–4 Wochen alten Pflanzen abgeschnitten. Die Achselknoten werden herauspräpariert und in Agrobacterium-LBA4404-Kultur inkubiert.
Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band. 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromoter, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patentschriften 5,7673,666 und 6,225,105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotern das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel kann mit dem 34S-Promoter (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt werden.
Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedium mit einem Zusatz von 500 mg/l Timentin umgesetzt. Die Sprosse werden herauspräpariert und auf Sproßelongationsmedium gesetzt. Sprosse mit einer Länge von über 1 cm werden für zwei bis vier Wochen auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bevor sie in Erde umgesetzt werden.
Die primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in der DNA- einer Elektrophorese auf einem einprozentigen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird zur Herstellung einer mit Digoxigenin markierten Probe mittels PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
Es werden Pflanzen der T1- oder T2-Generation erzeugt und Niedrigtemperaturversuchen unterzogen, zum Beispiel wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Für die Beurteilung der Ertragserhöhung, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, wird Biomasseproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen.
Beispiel 7: Gentechnische Herstellung von Raps/Canolapflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, z. B. gesteigerter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexpression von ertragserhöhenden, z. B. YRP-Protein-codierenden, z. B. mit Toleranz gegenüber niedriger Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli.
Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimpflanzen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (Plant Cell Rep 17, 183 (1998)) transformiert. Die im Handel erhältliche Varietät Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation verwendete Standardsorte, es können jedoch andere Sorten verwendet werden.
Agrobakterium tumefaciens LBA4404, das einen binären Vektor enthält, kann für die Transformation von Canola verwendet werden. Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An, G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band. 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele beruhen auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patentschriften 5,7673,666 und 6,225,105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotern das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel kann mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt werden.
Canolasamen werden 2 Minuten in 70%igem Ethanol und dann 10 Minuten in 30%igem Clorox mit einem Tropfen Tween-20 und anschließendem dreimaligem Spülen mit sterilisiertem destilliertem Wasser oberflächensterilisiert werden. Die Samen werden dann 5 Tage lang in vitro auf MS-Medium mit halber Stärke ohne Hormone, 1% Saccharose, 0,7% Phytagar bei 23°C, 16 h Licht keimen gelassen. Die Keimblattpetiolenexplantate mit den daran befindlichen Keimblättern werden von den in-vitro-Keimlingen herauspräpariert und dadurch mit Agrobacterium inokuliert, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar bei 23°C, 16 h Licht kultiviert. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobakterium werden die Petiolenexplantate dann 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel so lange kultiviert, bis Sprosse regenerieren. Wenn die Sprosse 5–10 mm lang waren, werden sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0,5, mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm werden zwecks Wurzelinduktion auf das Bewurzelungsmedium (MSO) umgesetzt.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in der DNA einer Elektrophorese auf einem einprozentigen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt Das PCR DIG Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird. zur Herstellung einer mit Digoxigenin markierten Sonde mittels PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
Es werden Pflanzen der T1- oder T2-Generation erzeugt und Niedrigtemperaturversuchen unterzogen, zum Beispiel wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Für die Beurteilung der Ertragserhöhung, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, wird Biomasseproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen.
Beispiel 8: Gentechnische Herstellung von Maispflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, z. B. gesteigerter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexpression von ertragserhöhenden, z. B. YRP-Protein-codierenden, z. B. mit Resistenz und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli.
Die Transformation von Mais (Zea Mays L.) wird mit einer Modifikation des von Ishida et al. (Nature Biotech 14745 (1996)) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezielle Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration geeignet. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation (Fromm et al. Biotech 8, 833 (1990)), aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Kolben werden ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) von Maispflanzen geerntet, wenn die Länge von unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche ”superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das super-binäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO94/00977 und WO95/06722 beschrieben. Vektoren wurden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patent 6,025,541 ). In ähnlicher Weise kann mit verschiedenen Promotern das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, gesteuert werden. Im vorliegenden Beispiel wurde mit dem 34S-Promoter (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann Maisregenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht 2–3 Wochen lang bei 25°C oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden der einzelnen Embryos auf Mais-Wurzelmedium überführt und 2–3 Wochen lang bei 25°C inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und in der PCR positiv für die Transgene sind.
Die transgenen T1-Pflanzen werden dann gemäß des im Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens auf ihre verbesserte Toleranz gegenüber Stress, wie Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhte Biomasseproduktion hin untersucht. Die T1-Generation von Pflanzen mit Insertionen der T-DNA an einem einzigen Locus spaltet für das Transgen in einem Verhältnis von 3:1 auf. Diejenigen Nachkommen, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten, sind gegenüber dem Imidazolinon-Herbizid tolerant und weisen einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine Steigerung der Toleranz gegenüber Stress, wie Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion als diejenigen Nachkommen, die die Transgene nicht enthalten, auf.
Es werden Pflanzen der T1- bzw. T2-Generation produziert und Niedrigtemperaturversuchen unterzogen, z. B. wie oben in Beispiel 2 beschrieben. Für die Beurteilung der Ertragserhöhung, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, wird Biomasseproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag zum Beispiel mit entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen.
Homozygote T2-Pflanzen zeigten ähnliche Phänotypen. Hybridpflanzen (F1-Nachkommenschaft) von homozygoten transgenen Pflanzen und nicht transgenen Pflanzen zeigten ebenfalls erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. gesteigerte Toleranz gegenüber Dürre und/oder eine erhöhte Nährstoffnutzungseffizienz und/oder ein anderes erwähntes Ertragsmerkmal, z. B. gesteigerte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur.
Beispiel 9: Gentechnische Herstellung von Weizenpflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. einer erhöhten Toleranz gegenüber Dürre und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz und/oder einem anderen erwähnten Ertragsmerkmal, z. B. gesteigerter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexpression von ertragserhöhenden, z. B. YRP-Protein-codierenden, z. B. mit Resistenz und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli.
Die Transformation von Weizen wird mit Hilfe des Verfahrens durchgeführt, das von Ishida et al. (Nature Biotech 14745 (1996)) beschrieben wurde. In der Transformation wird gewöhnlich das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CYMMIT, Mexiko) verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche ”superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO94/00977 und WO95/06722 beschrieben. Vektoren werden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patent 6,025,541 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotern das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel wurde mit dem 34S-Promoter (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen auf Kallusinduktionsmedium, dann Regenerationsmedium mit Imidazolinon als einem Selektionsmittel, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht 2–3 Wochen lang bei 25°C oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und 2–3 Wochen lang bei 25°C inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden von Pflanzen, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und in der PCR positiv für die Transgene sind, gewonnen.
Die transgenen T1-Pflanzen werden dann auf ihre gesteigerte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder erhöhte Biomasseproduktion nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren ausgewertet. Die T1-Generation mit Insertionen der T-DNA an einem einzigen Locus spaltet für das Transgen im Verhältnis 3:1 auf. Diejenigen Nachkommenschaften, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten, sind bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant und weisen einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit der Nachkommenschaft, die die Transgene nicht enthalten, auf. Homozygote T2-Pflanzen weisen ähnliche Phänotypen auf.
Für die Beurteilung der Ertragserhöhung, z. B. Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, wird Biomasseproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag zum Beispiel mit entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen. Beispielsweise können Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, z. B. gesteigerter Stresstoleranz, z. B. einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegenüber niedriger Temperatur bei niedriger Temperatur erhöhte Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag verglichen mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen zeigen.
Beispiel 10: Identifikation identischer und heterologer Gene
Gensequenzen können dazu verwendet werden, identische oder heterologe Gene aus cDNA- oder genomischen Bibliotheken zu identifizieren. Identische Gene (z. B. Volllängen-cDNA-Klone) können über Nukleinsäurehybridisierung isoliert werden, wobei zum Beispiel cDNA-Bibliotheken eingesetzt werden. Je nach der Häufigkeit des interessierenden Gens werden 100000 bis zu 1000000 rekombinante Bakteriophagen ausplattiert und auf Nylonmembranen übertragen. Nach Denaturierung mit Alkali wird die DNA auf der Membran immobilisiert, z. B. durch ÜV-Vernetzung. Die Hybridisierung erfolgt unter hochstringenten Bedingungen. In wässriger Lösung werden Hybridisierung und Waschen bei einer Innenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C durchgeführt. Die Hybridisierungssonden werden z. B. durch radioaktive (³²P) Nick-Transkriptionsmarkierung (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland) hergestellt. Die Signale werden durch Autoradiographie ermittelt.
Teilweise identische oder heterologe Gene, die verwandt, aber nicht identisch sind, können analog zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Hybridisierungs und Waschbedingungen mit niedriger Stringenz identifiziert werden. Für die wässrige Hybridisierung wird die Innenstärke in der Regel bei 1 M NaCl gehalten, während die Temperatur nach und nach von 68 auf 42°C gesenkt wird.
Die Isolation von Gensequenzen mit einer Homologie (oder Sequenzidentität/-ähnlichkeit) in nur einer bestimmten Domäne (zum Beispiel 10–20 Aminosäuren) kann unter Verwendung synthetischer radioaktiv markierter Oligonukleotidsonden erfolgen. Radioaktiv markierte Oligonukleotide werden durch Phosphorylierung des 5'-Endes zweier komplementärer Oligonukleotide mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werden aneinander hybridisiert und unter Bildung von Konkatemeren ligiert. Die doppelsträngigen Konkatemere werden dann beispielsweise mittels Nick-Transkription radioaktiv markiert. Die Hybridisierung erfolgt gewöhnlich bei niederstringenten Bedingungen mit hohen Oligonukleotidkonzentrationen.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:
6 × SSC; 0,01 M Natriumphosphat; 1 mM EDTA (pH 8); 0,5% SDS; 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA; 0,1 fettfreie Trockenmilch.
Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise bis auf 5–10°C unter die geschätzte T_m des Oligonukleotids oder bis auf Raumtemperatur gesenkt, worauf die Waschschritte und die Autoradiographie durchgeführt werden. Das Waschen erfolgt mit niedriger Stringenz, beispielsweise durch 3 Waschschritte mit 4 × SSC. Weitere Einzelheiten sind bei Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder Ausubel, F. M. et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, beschrieben.
Beispiel 11: Identifikation von identischen Genen durch Screening von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
Man kann cDNA-Klone dazu verwenden, um rekombinantes Polypeptid zum Beispiel in E. coli herzustellen (z. B. Qiagen QIAexpress pQE-System). Die rekombinanten Polypeptide werden dann gewöhnlich über Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitätsgereinigt. Die rekombinanten Polypeptide werden dann für die Herstellung spezifischer Antikörper verwendet, indem zum Beispiel Standardtechniken für die Immunisierung von Kaninchen eingesetzt werden. Die Antikörper werden unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule, die mit dem rekombinanten Antigen gesättigt wurde, wie von Gu et al., BioTechniques 17, 257 (1994). beschrieben, affinitätsgereinigt. Der Antikörper kann dann für das Screening von Expressions-cDNA-Bibliotheken verwendet werden, so dass identische oder heterologe Gene über ein immunologisches Screening identifiziert werden (Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
Beispiel 12: In-vivo-Mutagenese
Die in-vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann durch Passage von Plasmid-DNA (oder einer anderen Vektor-DNA) durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen, wie S. cerevisiae) erfolgen, bei denen die Fähigkeiten, die Unversehrtheit ihrer genetischen Information aufrecht zu erhalten, gestört sind. Übliche Mutator-Stämme haben Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem (z. B. mutHLS, mutD, mutT usw.; als Literaturstelle siehe Rupp W. D., DNA repair mechanisms, in: E. coli and Salmonella, S. 2277–2294, ASM, 1996, Washington): Solche Stämme sind dem Fachmann gut bekannt. Die Verwendung solcher Stämme ist zum Beispiel in Greener A. und Callahan M., Strategies 7, 32 (1994) veranschaulicht. Der Transfer mutierter DNA-Moleküle in Pflanzen erfolgt vorzugsweise nach einer Selektion und nach Testen in Mikroorganismen. Transgene Pflanzen werden anhand verschiedener Beispiele im Beispielteil dieses Dokuments hergestellt.
Beispiel 13: Gentechnische Herstellung von Arabidopsis-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von YRP-Codiergenen, z. B. aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa, unter Verwendung von gewebespezifischen stressinduzierbaren Promotern.
Transgene Arabidopsis-Pflanzen, die YRP-Gene, z. B. Protein-Codiergene, die mit Resistenz und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur in Zusammenhang stehen, aus zum Beispiel Brassica napus, Glycine max, Zea mays und Oryza sativa überexprimieren, werden wie in Beispiel 1 erzeugt, um die YRP-Codiertransgene unter der Kontrolle eines gewebespezischen oder stressinduzierbaren Promoters zu exprimieren. Pflanzen der T2-Generation werden unter Stress- oder Nicht-Stressbedingungen, z. B. Niedrigtemperaturbedingungen, erzeugt und herangezogen. Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, z. B. und/oder höherer Toleranz gegenüber Stress, z. B. niedriger Temperatur, oder mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, weisen verglichen mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen eine erhöhte Biomasseproduktion und/oder eine erhöhte Trockenmasseproduktion und/oder einen erhöhten Samenertrag unter Niedrigtemperaturbedingungen.
Beispiel 14: Gentechnische Herstellung von Luzernepflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz, gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von YRP-Genen, z. B. mit Resistenz und/oder Toleranz für niedrige Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen z. B. aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa.
Ein regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) kann unter Anwendung der Methode von McKersie et al., (Plant Physiol 119, 839 (1999)) transformiert werden. Die Regeneration und Transformation von Luzerne kann genotyp-abhängig sein, und deswegen kann eine regenerierende Pflanze benötigt werden. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Sie können zum Beispiel aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder beliebigen anderen im Handel erhältlichen Luzernesorten wie von Brown und Atanassov (Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 111 (1985)) beschrieben ausgewählt werden. Alternativ dazu kann man die RA3-Sorte (University of Wisconsin) für die Verwendung in der Gewebekultur (Walker et al., Am. J. Bot. 65, 54 (1978)) wählen.
Blattstielexplantate können mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999)) oder LBA4404, die einen binären Vektor enthalten, cokultiviert werden. Für die Pflanzentransformation wurden viele verschiedene binäre Vektorsysteme beschrieben (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols, Methods in Molecular Biology, Band 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele können auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschriebenen Vektor pBIN19 der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält, basieren. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromoter, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patente 5,7673,666 und 6,225,105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotern das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel kann der 34S-Promoter (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet werden, um für die konstitutive Expression des Merkmalsgens zu sorgen.
Die Explantate können 3 Tage lang im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringon enthält, kokultiviert werden. Die Explantate können in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) von halber Stärke gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und geeignetem Antibiotikum zum Inhibieren des Wachstums von Agrobacterium, ausplattiert werden. Nach mehreren Wochen können somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika, und 50 g/l Saccharose enthält, umgesetzt werden. Die somatischen Embryonen können anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen werden. Bewurzelte Keimlinge können in Blumentöpfe umgesetzt und in einem Gewächshaus herangezogen werden.
Die transgenen T0-Pflanzen können durch Nodienschnitte vermehrt und in Turface-Wachstumsmedium bewurzelt werden. Pflanzen der T1- oder T2-Generation. können produziert und Versuchen mit Stress- oder Nicht-Stressbedingungen, z. B. Niedrigtemperaturbedingungen wie in zuvorstehenden Beispielen beschrieben unterzogen werden.
Für die Beurteilung der Ertragserhöhung, zum Beispiel Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, können Biomasseproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag zum Beispiel mit entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen werden.
So können zum Beispiel Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel höherer Stresstoleranz, zum Beispiel mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag und zum Beispiel mit einer höheren Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, erhöhte Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder einen erhöhten Samenertrag bei niedriger Temperatur verglichen mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, zum Beispiel verglichen mit entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen, aufweisen.
Beispiel 15: Gentechnische Herstellung von Weidelgraspflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion durch Überexprimieren von YRP-Genen, z. B. mit Resistenz und/oder Toleranz für niedrige Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa.
Als Explantatquellen für die Transformation können Samen von verschiedenen Weidelgrassorten, darunter der im Handel erhältlichen Sorte Gunne, von der Saatfirma Svalöf Weibull, oder die Sorte Affinity, verwendet werden. Die Samen können nacheinander 1 Minute lang mit 1% Tween-20 und 60 Minuten lang mit 100% Bleichmittel oberflächensterilisiert, 3mal jeweils 5 Minuten lang mit deionisiertem und destilliertem H₂O gespült und anschließend 3–4 Tage lang auf feuchtem, sterilem Filterpapier im Dunkeln keimen gelassen werden. Die Keimlinge können weiterhin 1 Minute lang mit 1% Tween-20, 5 Minuten mit 75% Bleichmittel, sterilisiert und dreimal mit dd H₂O jeweils 5 Minuten lang gespült werden.
Die oberflächensterilisierten Samen können auf das Kallusinduktionsmedium, das Murashige und Skoog-Basalsalze und Vitamine, 20 g/l Saccharose, 150 mg/l Asparagin, 500 mg/l Casein-Hydrolysat, 3 g/l Phytagel, 10 mg/l BAP und 5 mg/l Dicamba enthält, gelegt werden. Die Platten können 4 Wochen lang im Dunkeln bei 25°C zwecks Samenkeimung und zur Induktion von embryogenem Kallus inkubiert werden.
Nach 4 Wochen auf dem Kallusinduktionsmedium können die Sprosse und Wurzeln der Keimlinge abgeschnitten, der Kallus auf frisches Medium umgesetzt, weitere 4 Wochen lang kultiviert und dann 2 Wochen lang auf MSO-Medium ins Licht umgesetzt werden. Mehrere (11–17 Wochen alte) Kallusstückchen können entweder durch ein 10-Mesh-Sieb gesiebt und auf Kallusinduktionsmedium gesetzt oder in 100 ml flüssiges Weidelgras-Kallusinduktionsmedium (dasselbe Medium wie für die Kallusinduktion, mit Agar) in einem 250 ml-Kolben kultiviert werden. Der Kolben kann in Folie eingewickelt und im Dunkeln bei 23°C eine Woche lang bei 175 U/min geschüttelt werden. Durch Sieben der Flüssigkultur durch ein 40-Mesh-Sieb wurden die Zellen gesammelt. Die auf dem Sieb gesammelte Fraktion kann auf festes Weidelgras-Kallusinduktionsmedium ausplattiert und darauf 1 Woche lang im Dunkeln bei 25°C kultiviert werden. Der Kallus kann dann auf MS-Medium mit 1% Saccharose umgesetzt und darauf 2 Wochen lang kultiviert werden.
Die Transformation kann entweder mit Agrobacterium oder mit Teilchenbeschussverfahren durchgeführt werden. Es kann ein Expressionsvektor, der einen konstitutiven Pflanzenpromoter und die cDNA des Gens in einem pUC-Vektor enthält, hergestellt werden. Die Plasmid-DNA kann aus E. coli-Zellen mit Hilfe des Qiagen-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert werden. Ungefähr 2 g embryogener Kallus kann in der Mitte eines sterilen Filterpapiers in einer Petrischale verteilt werden. Ein Aliquot flüssiges MSO mit 10 g/l Saccharose kann auf das Filterpapier gegeben werden. Goldpartikel (Größe 1,0 μm) können mit der Plasmid-DNA entsprechend dem Verfahren von Sanford et al., 1993, beschichtet und in den embryogenen Kallus unter Verwendung der folgenden Parameter eingebracht werden: 500 μg Teilchen und 2 μg DNA je Schuß, 1300 psi und eine Zieldistanz von 8,5 cm von der Stoppingplatte zur Kallus-Platte, sowie 1 Schuß je Kallus-Platte.
Nach dem Beschuß können die Kalli zurück auf frisches Kallus-Entwicklungsmedium umgesetzt und während eines Zeitraums von 1 Woche im Dunkeln bei Raumtemperatur gehalten werden. Der Kallus kann dann in Wachstumsbedingungen im Licht bei 25°C umgestellt werden, so dass die Differenzierung des Embryos mit dem geeigneten Selektionsmittel, z. B. 250 nM Arsenal, 5 mg/l PPT oder 50 mg/l Kanamycin eingeleitet wird. Sprosse, die gegen das Selektionsmittel resistent sind, können erscheinen und können nach der Bewurzelung in Erde umgesetzt werden.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) können mittels PCR analysiert werden, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse können durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt werden. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) kann verwendet werden, um eine Digoxigenin-markierte Sonde durch PCR herzustellen, wobei es gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wird.
Transgene T0-Weidelgraspflanzen können durch Exzision von Bestockungstrieben vegetativ vermehrt werden. Die transplantierten Bestockungstriebe können 2 Monate lang im Gewächshaus gehalten werden, bis sie sich gut entwickelt haben.
Es können Pflanzen der T1- bzw. T2-Generation produziert und Stress- oder Nicht-Stressbedingungen, z. B. Niedrigtemperaturversuchen, unterzogen werden, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben.
Für die Beurteilung der Ertragserhöhung, zum Beispiel Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, können Biomasseproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag zum Beispiel mit entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen werden. So können zum Beispiel Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel höherer Stresstoleranz, zum Beispiel mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag und zum Beispiel mit einer höheren Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, erhöhte Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder einen erhöhten Samenertrag bei niedriger Temperatur verglichen mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, zum Beispiel verglichen mit entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen, aufweisen.
Beispiel 16: Gentechnische Herstellung von Sojabohnenpflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von YRP-Genen, z. B. mit Resistenz und/oder Toleranz für niedrige Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa.
Soja kann gemäß der folgenden Modifikation des Verfahrens nach dem Texas A&M-Patent US 5,164,310 transformiert werden. Es können sich verschiedene im Handel erhältliche Sojabohnensorten für die Tranformation nach diesem Verfahren eignen. Allgemein kann für die Transformation die Sorte Jack (von der Illinois Seed Foundation) verwendet werden. Die Samen können durch sechsminütiges Eintauchen in 70%iges (v/v) Ethanol und zwanzigminütiges Eintauchen in 25%iges im Handel erhältliches Bleichmittel (NaOCl) mit einem Zusatz vom 0,1% (v/v) Tween, wonach viermal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser gespült wird, sterilisiert werden. Sieben Tage alte Keimlinge können vermehrt werden, indem von jedem Keimling die Keimwurzel, das Hypokotyl und ein Keimblatt entfernt werden. Dann kann das Epikotyl mit einem Keimblatt auf frisches Keimungsmedium in Petrischalen umgesetzt und bei 25°C unter einer 16-h-Photoperiode (ungefähr 100 μmol/ms) drei Wochen lang inkubiert werden. Die Achselknoten (ungefähr 4 mm lang) wurden von 3–4 Wochen alten Pflanzen abgeschnitten. Die Achselknoten können herauspräpariert und in Agrobacterium-LBA4404-Kultur inkubiert werden.
Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele können auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält, basieren. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromoter, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patentschriften 5,7673,666 und 6,225,105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotern das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel kann mit dem 34S-Promoter (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt werden.
Nach der Cokultivierungsbehandlung können die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedium mit einem Zusatz von 500 mg/l Timentin umgesetzt werden. Die Sprosse können herauspräpariert und auf Sprosselongationsmedium gesetzt werden. Sprosse mit einer Länge von über 1 cm können für zwei bis vier Wochen auf Bewurzelungsmedium gesetzt werden, bevor sie in Erde umgesetzt werden.
Die primären transgenen Pflanzen (T0) können mittels PCR analysiert werden, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse können durch Southern-Hybridisierung, in der DNA einer Elektrophorese auf einem einprozentigen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt werden. Das PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) kann zur Herstellung einer mit Digoxigenin markierten Probe mittels PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet werden.
Sojabohnenpflanzen, die YRP-Gene, zum Beispiel mit Resistenz und/oder Toleranz gegen niedrige Temperatur in Zusammenhang stehende Gene, aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa überexprimieren, weisen einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel höhere Samenerträge, auf.
Es können Pflanzen der T1- oder T2-Generation erzeugt und Stress- oder Nicht-Stressbedingungen, z. B.
Niedrigtemperaturversuchen, unterzogen werden, zum Beispiel wie oben in Beispiel 1 beschrieben.
Für die Beurteilung der Ertragserhöhung, zum Beispiel Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, können Biomasseproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag zum Beispiel mit entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen werden. So können zum Beispiel Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel höherer Stresstoleranz, zum Beispiel mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag und zum Beispiel mit einer höheren Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, erhöhte Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder einen erhöhten Samenertrag bei niedriger Temperatur verglichen mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, zum Beispiel verglichen mit entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen, aufweisen.
Beispiel 17: Gentechnische Herstellung von Raps/Canola-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von YRP-Genen z. B. mit Resistenz und/oder Toleranz für niedrige Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Keimblattpetiolen und Hypokotyle von 5–6-Tage alten jungen Keimpflanzen können als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (Plant Cell Rep 17, 183 (1998)) transformiert werden. Die im Handel erhältliche Varietät Westar (Agriculture Canada) kann die für die Transformation verwendete Standardsorte sein, es können jedoch andere Sorten verwendet werden.
Agrobakterium tumefaciens LBA4404, das einen binären Vektor enthält, kann für die Transformation von Canola verwendet werden. Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An, G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band. 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele können auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzengenexpressionskassette, flankiert von der rechten und linken Grenzsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, enthält, beruhen. Eine Pflanzengenexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem Pflanzenpromotor, der die Transkription der cDNA oder der genomischen DNA des Merkmalsgens reguliert. Man kann verschiedene Selektionsmarkergene verwenden, darunter das Arabidopsis-Gen, das für ein mutiertes Acetohydroxysäuresynthaseenzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patentschriften 5,7673,666 und 6,225,105 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotern das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription, sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel kann mit dem 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt werden.
Canolasamen können 2 Minuten in 70%igem Ethanol und dann 10 Minuten in 30%igem Clorox mit einem Tropfen Tween-20 und anschließendem dreimaligem Spülen mit sterilisiertem destilliertem Wasser oberflächensterilisiert werden. Die Samen können dann 5 Tage lang in vitro auf MS-Medium mit halber Stärke ohne Hormone, 1% Saccharose, 0,7% Phytagar bei 23°C, 16 h Licht keimen gelassen werden. Die Keimblattpetiolenexplantate mit den daran befindlichen Keimblättern können von den in-vitro-Keimlingen herauspräpariert und dadurch mit Agrobakterium inokuliert werden, dass man das Schnittende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension eintaucht. Die Explantate können dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar bei 23°C, 16 h Licht kultiviert werden. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium können die Petiolenexplantate dann 7 Tage lang auf MSBAP-3-Medium mit 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) umgesetzt und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel so lange kultiviert werden, bis Sprosse regenerieren. Wenn die Sprosse 5–10 mm lang waren, können sie abgeschnitten und auf Sprosselongationsmedium (MSBAP-0,5, mit 0,5 mg/l BAP). umgesetzt werden. Sprosse mit einer Länge von ungefähr 2 cm können zwecks Wurzelinduktion auf das Bewurzelungsmedium (MSO) umgesetzt werden.
Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) können mittels PCR analysiert, werden, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse können durch Southern-Hybridisierung, in der DNA einer Elektrophorese auf einem einprozentigen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt werden. Das PCR DIG Synthesis Kit (Roche Diagnostics) kann zur Herstellung einer mit Digoxigenin markierten Sonde mittels PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet werden.
Die transgenen Pflanzen können dann gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren auf ihren erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel höhere Toleranz gegenüber Stress, zum Beispiel erhöhte Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder erhöhte Biomasseproduktion ausgewertet werden. Es kann gefunden werden, dass transgene(r) Raps/Canola, die YRP-Gene, zum Beispiel Gene, die mit Resistenz und/oder Toleranz gegenüber niederer Temperatur in Zusammenhang stehen, aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa überexprimieren, einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel einen erhöhten Ertrag, zum Beispiel ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine höhere Toleranz gegenüber Stress, zum Beispiel mit erhöhter Toleranz gegenüber niederer Temperatur und/oder erhöhter Biomasseproduktion, aufweisen, verglichen mit Pflanzen ohne das Transgen, zum Beispiel entsprechenden nichttransgenen Kontrollpflanzen.
Beispiel 18: Gentechnische Herstellung von Maispflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von YRP-Genen, z. B. mit Toleranz für niedrige Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Die Transformation von Mais (Zea Mays L.) kann mit einer Modifikation des von Ishida et al. (Nature Biotech 14745 (1996)) beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezielle Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration geeignet. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter können gute Quellen für Donormaterial für die Transformation (Fromm et al. Biotech 8, 833 (1990)) sein, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Kolben können ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) von Maispflanzen geerntet werden, wenn die Länge der unreifen Embryonen etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen können mit Agrobacterium tumefaciens, welche ”superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert werden, und transgene Pflanzen können durch Organogenese gewonnen werden. Das super-binäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO94/00977 und WO95/06722 beschrieben. Vektoren können wie beschrieben konstruiert werden. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (ARAS-Enzym) kodiert ( US-Patent 6,025,541 ). In ähnlicher Weise kann mit verschiedenen Promotern das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, gesteuert werden. Im vorliegenden Beispiel wurde mit dem 34S-Promoter (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt.
Herauspräparierte Embryonen können auf Kallusinduktionsmedium, dann Maisregenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, wachsen gelassen werden. Die Petrischalen können im Licht 2–3 Wochen lang bei 25°C oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert werden. Die grünen Sprosse können von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und 2–3 Wochen lang bei 25°C inkubiert werden, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse können in Erde im Gewächshaus umgepflanzt werden. T1-Samen kann von Pflanzen gewonnen werden, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und in der PCR positiv für die Transgene sind.
Die transgenen T1-Pflanzen können dann gemäß der im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren auf einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, zum Beispiel eine höhere Toleranz gegenüber Stress, z. B. mit gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhte Biomasseproduktion hin untersucht werden. Die Ti-Generation von Pflanzen mit Insertionen der T-DNA an einem einzigen Locus spaltet für das Transgen in einem Verhältnis von 1:2:1 auf. Diejenigen Nachkommenschaften, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten (3/4 der Nachkommenschaft), können bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant sein und weisen einen erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, z. B. höhere Toleranz gegenüber Stress, z. B. mit gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit denjenigen Nachkommenschaften, denen die Transgene fehlen, auf. Die toleranten Pflanzen weisen höhere Samenerträge auf. Homozygote T2-Pflanzen wiesen ähnliche Phänotypen auf. Hybridpflanzen (F1-Nachkommenschaft) von homozygoten transgenen Pflanzen und nicht transgenen Pflanzen wiesen ebenfalls eine gesteigerte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhte Biomasseproduktion auf.
Beispiel 19: Gentechnische Herstellung von Weizenpflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von YRP-Genen z. B. mit Resistenz und/oder Toleranz für niedrige Temperatur in Zusammenhang stehenden Genen zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Die Transformation von Weizen kann mit Hilfe des Verfahrens durchgeführt werden, das von Ishida et al. (Nature Biotech. 14745 (1996)) beschrieben wurde. In der Transformation kann gewöhnlich das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CYMMIT, Mexiko) verwendet werden. Unreife Embryonen können mit Agrobacterium tumefaciens, welche ”superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert werden, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO94/00977 und WO95/06722 beschrieben. Vektoren können wie beschrieben konstruiert werden. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS-Enzym) kodiert ( US-Patent 6,025,541 ). In ähnlicher Weise lässt sich mit verschiedenen Promotern das Merkmalsgen, welches für eine konstitutive, entwicklungsgesteuerte, Gewebe- oder Umwelt-Regulation der Gentranskription sorgt, steuern. Im vorliegenden Beispiel kann mit dem 34S-Promoter (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) für die konstitutive Expression des Merkmalsgens gesorgt werden.
Nach Inkubation mit Agrobacterium können die Embryonen auf Kallusinduktionsmedium, dann Regenerationsmedium mit Imidazolinon als einem Selektionsmittel, herangezogen werden. Die Petrischalen können im Licht 2–3 Wochen lang bei 25°C oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert werden. Die grünen Sprosse können von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und 2–3 Wochen lang bei 25°C inkubiert werden, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse können in Erde im Gewächshaus umgepflanzt werden. T1-Samen können von Pflanzen, die eine Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufweisen und in der PCR positiv für die Transgene sind, gewonnen werden.
Die transgenen T1-Pflanzen können dann gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren auf ihren erhöhten Ertrag, z. B. ein erhöhtes Ertragsmerkmal, z. B. höhere Toleranz gegenüber Stress, z. B. mit gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhte Biomasseproduktion hin untersucht werden. Die T1-Generation von Pflanzen mit Insertionen der T-DNA an einem einzigen Locus spaltet für das Transgen in einem Verhältnis von 1:2:1 auf. Diejenigen Nachkommenschaften, die eine oder zwei Kopien des Transgens enthalten (3/4 der Nachkommenschaft), können bezüglich des Imidazolinon-Herbizids tolerant sein und weisen einen erhöhten Ertrag, ein erhöhtes Ertragsmerkmal, z. B. höhere Toleranz gegenüber Stress, z. B. mit gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion verglichen mit denjenigen Nachkommenschaften, denen die Transgene fehlen, auf.
Für die Beurteilung der Ertragserhöhung, zum Beispiel Toleranz gegenüber niederen Temperaturen, können Biomasseproduktion, intrinsischer Ertrag und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag mit zum Beispiel entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen verglichen werden. So können zum Beispiel Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, zum Beispiel einem erhöhten Ertragsmerkmal, zum Beispiel höherer Toleranz gegenüber Stress, zum Beispiel mit einer erhöhten Nährstoffnutzungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und zum Beispiel mit einer höheren Toleranz gegenüber niederen Temperaturen, verglichen mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, zum Beispiel verglichen mit entsprechenden nicht transgenen Wildtyppflanzen, eine erhöhte Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder einen erhöhten Samenertrag bei niederen Temperaturen zeigen.
Beispiel 20: Gentechnische Herstellung von Reispflanzen mit erhöhtem Ertrag unter Bedingungen von transientem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexprimieren von Stressgenen aus Saccharomyces cerevisiae oder E. coli oder Synechocystis
Reistransformation: Das Agrobacterium, das den Expressionsvektor der Erfindung enthält, kann für die Transformation von Oryza sativa-Pflanzen verwendet werden. Reife trockene Samen der Japonica-Reissorte Nipponbare können entspelzt werden. Die Sterilisation kann durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, wonach sechsmal je 15 Minuten lang mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wird, erfolgen. Anschließend können die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthält (Kallusinduktionsmedium), zur Keimung gebracht werden. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln können embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf demselben Medium vermehrt werden. Nach 2 Wochen können die Kalli durch Subkultur auf demselben Medium weitere 2 Wochen lang vermehrt oder vervielfacht werden. Embryogene Kallusstücke können auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultur subkultiviert werden (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
Für die Cokultur verwendet man den Agrobacterium-Stamm LBA4404. Agrobacterium kann auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert werden. Anschließend können die Bakterien gewonnen und in einem flüssigen Cokulturmedium auf eine Dichte (OD₆₀₀) von ungefähr 1 suspendiert werden. Die Suspension kann dann in eine Petrischale überführt werden und die Kalli können 15 Minuten lang in die Suspension eingetaucht werden. Die Kallusgewebe können dann auf einem Filterpapier trockengetupft und auf ein verfestigtes Cokulturmedium umgesetzt und 3 Tage lang im Dunkeln bei 25°C inkubiert werden. Die cokultivierten Kalli können 4 Wochen lang im Dunkeln bei 28°C auf 2,4-D-haltigem Medium in Gegenwart eines Selektionsmittels herangezogen werden. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation in Licht kann das embryogene Potential freigesetzt werden und es entwickelten sich in den nächsten 4 bis 5 Wochen Sprosse. Die Sprosse können aus dem Kallus herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert werden, von dem sie in Erde umgesetzt werden können. Abgehärtete Sprosse können im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen werden.
Pro Konstrukt können ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt werden. Die Primärtransformanten können von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt werden. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts können nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für das Selektionsmittel zurückbehalten werden, um T1-Samen zu ernten. Die Samen können dann drei bis fünf Monate nach dem Umsetzen geerntet werden. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50 (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Für den Assay mit zyklischer Dürre können die Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt werden, ohne dass dies zur Austrocknung führt. Während des Versuchs kann die Wasserversorgung eingeschränkt werden und die Pflanzen können Zyklen von Dürre und erneutem Gießen ausgesetzt werden. Zur Bestimmung der Biomasseproduktion kann das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach dem letzten Gießen bestimmt werden, und zwar dadurch, dass man die Sprosse abschneidet und wiegt.
Beispiel 21: Gentechnische Herstellung von Reispflanzen mit erhöhtem Ertrag unter Bedingungen von transientem und wiederholtem abiotischem Stress durch Überexprimieren von Ertrags- und Stressgenen, zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
Reistransformation: Das Agrobacterium, das den Expressionsvektor der Erfindung enthielt, kann für die Transformation von Oryza sativa-Pflanzen verwendet werden. Reife trockene Samen der Japonica-Reissorte Nipponbare können entspelzt werden. Die Sterilisation kann durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, wonach sechsmal je 15 Minuten lang mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wird, erfolgen. Anschließend können die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthält (Kallusinduktionsmedium), zur Keimung gebracht werden. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln können embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf demselben Medium vermehrt werden. Nach 2 Wochen können die Kalli durch Subkultur auf demselben Medium weitere 2 Wochen lang vermehrt oder vervielfacht werden. Embryogene Kallusstücke können auf frischem Medium 3 Tage vor der Cokultur subkultiviert werden (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
Für die Cokultur verwendet man den Agrobacterium-Stamm LBA4404. Agrobacterium kann auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert werden. Anschließend können die Bakterien gewonnen und in einem flüssigen Cokulturmedium auf eine Dichte (OD₆₀₀) von ungefähr 1 suspendiert werden. Die Suspension kann dann in eine Petrischale überführt werden und die Kalli können 15 Minuten lang in die Suspension eingetaucht werden. Die Callusgewebe können dann auf einem Filterpapier trockengetupft und auf ein verfestigtes Cokulturmedium umgesetzt und 3 Tage lang im Dunkeln bei 25°C inkubiert werden. Die cokultivierten Kalli können 4 Wochen lang im Dunkeln bei 28°C auf 2,4-D-haltigem Medium in Gegenwart eines Selektionsmittels herangezogen werden. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation in Licht kann das embryogene Potential freigesetzt werden und es entwickelten sich in den nächsten 4 bis 5 Wochen Sprosse. Die Sprosse können aus dem Kallus herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert werden, von dem sie in Erde umgesetzt werden können. Abgehärtete Sprosse können im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen werden.
Pro Konstrukt können ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt werden. Die Primärtransformanten können von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt werden. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts können nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen mit Toleranz für das Selektionsmittel zurückbehalten werden, um T1-Samen zu ernten. Die Samen können dann drei bis fünf Monate nach dem Umsetzen geerntet werden. Das Verfahren ergab Ein-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Für den Assay mit zyklischer Dürre können die Pflanzen wiederholtem Stress ausgesetzt werden, ohne dass dies zur Austrocknung führt. Während des Versuchs kann die Wasserversorgung eingeschränkt werden und die Pflanzen können Zyklen von Dürre und erneutem Gießen ausgesetzt werden. Zur Bestimmung der Biomasseproduktion kann das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach dem letzten Gießen bestimmt werden, und zwar dadurch, dass man die Sprosse abschneidet und wiegt. Bei einem äquivalenten Ausmaß an Trockenstress können tolerante Pflanzen fähig sein, wieder normales Wachstum aufzunehmen, während empfindliche Pflanzen abgestorben sind oder signifikant geschädigt wurden, was zu kürzeren Blattern und weniger Trockenmasse führt.
Figuren:
1. Vektor VC-MME432-1qcz (SEQ ID NO: 12), der für die Klonierung eines interessierenden Gens für die an die Plastiden zielgesteuerte Expression verwendet wird.
2. Vektor pMTX0270p (SEQ ID NO: 192), der zum Klonieren einer Targetingsequenz verwendet wird.
Zusammenfassung
Pflanzen mit erhöhtem Ertrag
Die hier beschriebene vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden Wildtyppflanze, umfassend das Erhöhen oder Erzeugen von einer oder mehreren Aktivitäten in einer Pflanze oder einem Teil davon. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die einen oder mehrere Merkmale einer transgenen Pflanze steigern oder verbessern, sowie Zellen, Nachkommenschaften, Samen und Pollen, die von solchen Pflanzen oder Teilen abstammen, sowie Verfahren zur Herstellung und Verfahren zur Verwendung von solch einer Pflanze(nzelle)(n), Nachkommenschaften, Samen oder Pollen. Insbesondere zeigt sich das verbesserte Merkmal bzw. zeigen sich die verbesserten Merkmale in einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise durch Verbessern von einem oder mehreren Ertragsmerkmal(en).

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2004/040973 [0155, 0161]
US 5455818 [0155]
US 5932479 [0155]
US 5693507 [0155]
US 6781033 [0155]
WO 01/52620 [0239]
EP 424047 [0272, 0442]
US 5322783 [0272, 0442]
EP 397687 [0272, 0442]
US 5376543 [0272, 0442]
US 5169770 [0272, 0442]
US 5990387 [0272, 0442]
WO 93/07256 [0272, 0442]
US 5565350 [0296]
WO 00/15815 [0296]
EP 388186 [0310, 0410]
WO 95/19443 [0310, 0417]
EP 335528 [0310]
WO 93/21334 [0310, 0410, 0417]
EP 249676 [0310]
US 4987071 [0401]
US 5116742 [0401]
US 6028167 [0401]
US 5773260 [0401]
US 5496698 [0401]
US 4130641 [0403]
US 4024222 [0403]
US 4283393 [0403]
US 5795715 [0403]
US 4801340 [0404]
US 5034323 [0404]
US 5231020 [0404]
US 5283184 [0404]
US 5352605 [0409]
WO 84/02913 [0409]
US 4962028 [0409]
EP 0335528 A [0410]
EP 0249676 A [0410]
US 5608152 [0410]
WO 98/45461 [0410]
US 5504200 [0410]
WO 91/13980 [0410]
WO 95/15389 [0410]
WO 95/23230 [0410]
WO 99/16890 [0410]
US 5187267 [0417]
WO 96/12814 [0417]
EP 375091 [0417]
WO 95/16783 [0417]
WO 97/06250 [0417]
US 5510474 [0418]
US 6020190 [0418]
US 5086169 [0419]
US 5412085 [0419]
US 5545546 [0419]
US 5470359 [0419]
US 6004804 [0431]
US 6007988 [0436]
US 6013453 [0436]
US 5789538 [0438]
WO 95/19431 [0438]
WO 00/47754 [0438]
WO 01/002019 [0438]
WO 00/20622 [0438]
EP 07150175 [0474]
WO 95/14098 [0490]
US 57673666 [0543, 0555, 0560, 0582, 0597, 0605]
US 6225105 [0543, 0555, 0560, 0582, 0597, 0605]
US 5164310 [0554, 0596]
WO 94/00977 [0564, 0569, 0609, 0612]
WO 95/06722 [0564, 0569, 0609, 0612]
US 6025541 [0564, 0569, 0609, 0612]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Boyer, Plant Productivity and Environment, Science 218, 443–448 (1982) [0002]
Bohnert et al., Adaptations to Environmental Stresses, Plant Cell 7 (7), 1099–1111 (1995) [0002]
Wang et al., 2003 [0003]
Emanuelsson et al., (2000), Predicting subcellular localization of Proteins based an their N-terminal amino acid sequence., J. Mol. Biol. 300, 1005–1016 [0130]
Emanuelsson et al. (1999), ChloroP, a neural network-based method for Predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites., Protein Science, 8: 978–984 [0130]
Emanuelsson et al. (2007), Locating Proteins in the cell using TargetP, Signale, and related tools., Nature Protocols 2, 953–971 [0130]
Heijne et al. (Plant Molecular Biology Reporter, 9 (2), 104, (1991)) [0143]
Heijne et al. [0144]
Schmidt et al. (J. Biol. Chem. 268 (36), 27447 (1993)) [0148]
Della-Cioppa et al. (Plant. Physiol. 84, 965 (1987)) [0148]
de Castro Silva Filho et al. (Plant Mol. Biol. 30, 769 (1996)) [0148]
Zhao et al. (J. Biol. Chem. 270 (11), 6081 (1995)) [0148]
Römer et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (3), 1414 (1993)) [0148]
Keegstra et al. (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 471 (1989)) [0148]
Lubben et al. (Photosynthesis Res. 17, 173 (1988)) [0148]
Lawrence et al. (J. Biol. Chem. 272 (33), 20357 (1997)) [0148]
Kermode Allison R. in Critical Reviews in Plant Science 15 (4), 285 (1996) unter dem Titel ”Mechanisms of Intracellular Protein Transport and Targeting in Plant Cells” [0148]
Maiga P. (Annu. Rev. Plant Biol. 55, 289 (2004)) [0155]
Flores, C. R. Acad Sci III. 324 (10), 943 (2001) [0160]
Navarro et al., Virology. 268 (1), 218 (2000) [0160]
Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) [0206]
Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) [0206]
Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996) [0209]
Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997) [0209]
Zinser et al. „Enzyminhibitoren”/Enzyme inhibitors” [0226]
Kochevenko und Willmitzer (Plant Physiol. 132 (1), 174 (2003)) [0234]
Hayashi et al. (Science 258, 1350 (1992)) [0235]
Weigel et al. (Plant Physiol. 122, 1003 (2000)) [0235]
Krysan et al. (Plant Cell 11, 2283 (1999)) [0236]
Sessions et al. (Plant Cell 14, 2985 (2002)) [0236]
Young et al. (Plant Physiol. 125, 513 (2001)) [0236]
Koprek et al. (Plant J. 24, 253 (2000)) [0236]
Jeon et al. (Plant J. 22, 561 (2000)) [0236]
Tissier et al. (Plant Cell 11, 1841 (1999)) [0236]
Speulmann et al. (Plant Cell 11, 1853 (1999)) [0236]
Koorneef et al. (Mutat Res. Mar. 93 (1) (1982)) [0236]
Lightner und Caspar in „Methods in Molecular Biology”, Band 82 [0236]
Colbert et al., Plant Physiol, 126, (2001) [0236]
Hayashi et al. (Science 258, 1350 (1992)) [0238]
Weigel et al. (Plant Physiol. 122, 1003 (2000)) [0238]
Oriz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13290 (2002) [0239]
Guan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 13296 (2002) [0239]
Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, NY, 1989 [0240]
Hajukiewicz, P. et al., Plant Mol. Biol. 25, 989 (1994) [0249]
Hellens et al, Trends in Plant Science 5, 446 (2000) [0249]
Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 8693 (1987) [0252]
Romanos M. A. et al., Yeast 8, 423 (1992) [0254]
van den Hondel, C. A. M. J. J. et al. [(1991) ”Heterologous gene expression in filamentous fungi”] [0254]
”More Gene Manipulations” in ”Fungi” in Rennet J. W. & Lasure L. L., Hrsg., S. 396–428, Academic Press, San Diego [0254]
”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi” [van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy J. F. et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge] [0254]
Schmidt, R. und Willmitzer, L., Plant Cell Rep. 7, 583 (1988) [0254]
”Cloning Vektors” (Hrsg. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) [0254]
”Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press, Kap. 6/7, S. 71–119) [0254]
Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) [0262]
Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Hrsg. Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, CRC Press: Boca Raton, Florida [0262]
Schmidt R., und Willmitzer L., Plant Cell Rep. 7 (1988) [0263]
Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993) [0263]
White F. F., Jenes B. et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung und Wu R., 128–43, Academic Press: 1993 [0263]
Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991) [0263]
Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) [0263]
Toepfer et al., Methods Enzymol. 217, 66 (1993) [0265]
Toepfer et al., Nucl. Acids. Res. 15, 5890 (1987) [0265]
Pharmacia Biotech Inc; Smith D. B. und Johnson K. S., Gene 67, 31 (1988) [0267]
Amann et al., Gene 69, 301 (1988) [0268]
Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60–89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande [0268]
Falciatore et al., Marine Biotechnology 1 (3), 239 (1999) [0270]
Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 [0271]
Laborhandbüchern wie Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey [0271]
Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204, 383 (1986) [0272]
Deblaere et al., Nucl. Acids Res. 13, 4777 (1994) [0272]
Gelvin, Stanton B. und Schilperoort Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2. Auf 1. – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4 [0272]
Glick Bernard R., Thompson John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2 [0272]
Moloney et al., Plant Cell Report 8, 238 (1989) [0272]
De Block et al., Plant Physiol. 91, 694 (1989) [0272]
Mlynarova et al., Plant Cell Report 13, 282 (1994) [0272]
Freeling und Walbot ”The maize handbook” Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7 [0272]
Cole-Strauss et al., Nucleic Acids Research 27 (5), 1323 (1999) [0274]
Kmiec, Gene Therapy American Scientist. 87 (3), 240 (1999) [0274]
Thomas K. R., und Capecchi M. R., Cell 51, 503 (1987) [0275]
Strepp et al., PNAS, 95 (8), 4368 (1998) [0275]
Gielen et al., EMBO J. 3, 835 (1984) [0276]
Gallie et al., Nucl. Acids Research 15, 8693 (1987 [0276]
Becker D. et al., Plant Mol. Biol. 20, 1195 (1992 [0276]
Bevan M. W., Nucl. Acid. Res. 12, 8711 (1984) [0276]
”Vectors for Gene Transfer in Higher Plants” in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 [0276]
Jenes B. et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung S. D und Wu R., Academic Press (1993) 128–143 [0291]
Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991) [0291]
Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984) [0291]
Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. 16, 9877 (1988) [0291]
White F. F., Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung S. D. und Wu R., Academic Press, 1993, S. 15–38 [0291]
Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22361 (1993) [0310]
Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992) [0310]
Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989) [0310]
Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979) [0316]
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auf 1., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 [0326]
Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979) [0327]
Timothy L. Bailey und Charles Elkan (Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology, S. 28–36, AAAI Press, Menlo Park, Kalifornien, 1994) [0332]
I. Jonassen, J. F. Collins und D. G. Higgins, Finding flexible patterns in unaligned Protein sequences, Protein Science 4 (1995), S. 1587–1595 [0332]
I. Jonassen, Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph, eingereicht bei CABIOS Febr. 1997 [0332]
Thompson et al. (Nucleic Acids Research 22, 4673 (1994)) [0333]
Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) [0338]
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6 [0338]
Sambrook et al., ”Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0340]
Harnes und Higgins (Hrsg.) 1985, ”Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press bei Oxford University Press, Oxford [0340]
Brown (Hrsg.) 1991, ”Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press bei Oxford University Press, Oxford [0340]
W. R. Pearson und D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988) [0377]
W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 63 (1990) [0377]
J. Mol. Evolution., 25, 351 (1987) [0378]
Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989) [0378]
J. Mol. Biol. 48; 443 (1970) [0378]
Smith und Waterman basiert (Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981)) [0378]
Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991) [0378]
Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)) [0378]
Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000) [0378]
Gaultier et al., Nucleic Acids. Res. 15, 6625 (1987) [0399]
Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15, 6131 (1987) [0399]
Inoue et al., FEBS Lett. 215, 327 (1987) [0399]
Haselhoff und Gerlach, Nature 334, 585 (1988) [0401]
Bartel D., und Szostak J. W., Science 261, 1411 (1993) [0401]
Moser et al., Science 238, 645 (1987) [0404]
Cooney et al., Science 241, 456 (1988) [0404]
Napoli et al., The Plant Cell 2,279 (1990) [0404]
Van der Kroll et al., The Plant Cell 2, 291, (1990) [0404]
Smith et al., Mol. Gen. Genetics 224, 477 (1990) [0404]
Napoli et al., The Plant Cell 2, 279 (1990) [0404]
Gielen et al., EMBO J. 3, 835 (1984) [0408]
Gallie et al., Nucl. Acids Research 15, 8693 (1987) [0408]
Benfey et al., EMBO J. 8, 2195 (1989) [0409]
Franck et al., Cell 21, 285 (1980) [0409]
Franck et al., Cell 21 285 (1980) [0410]
Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361 (1993) [0410]
Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992) [0410]
Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)) [0410]
Baeumlein et al., Plant J., 2 (2), 233 (1992) [0410]
Übersichtsartikel findet sich bei Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15 (4), 285 (1996) [0415]
Übersichtsartikel findet sich bei Gatz, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89 (1997) [0416]
Ishitani, et al., Plant Cell 9, 1935 (1997) [0417]
Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki, Plant Cell 6, 251 (1994) [0417]
Capel et al., Plant Physiol 115, 569 (1997) [0417]
Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki, Mol. Gen. Genet. 238, 17 (1993) [0417]
Baker et al., Plant Mol. Biol. 24, 701 (1994) [0417]
Liu et al., Plant Cell 6, 645 (1994) [0417]
Hwang und Goodman, Plant J. 8, 37 (1995) [0417]
Ahn et al., Plant Cell 8, 1477 (1998) [0417]
Plesch et al., Plant Journal. 28 (4), 455– (2001) [0417]
Plesch et al., Gene 249, 83 (2000) [0417]
Nakamura et al., Plant Physiol. 109, 371 (1995) [0417]
Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992) [0417]
Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361 (1993) [0417]
Yamaguchi-Shinozalei et al. Mol. Gen. Genet. 236, 331 (1993) [0417]
Ni et al., Plant Journal 7, 661 (1995) [0418]
Callis et al., J. Biol. Chem., 265, 12486 (1990) [0418]
Kawalleck et al., Plant. Molecular Biology, 21, 673 (1993) [0418]
Thompson et al., BioEssays 10, 108 (1989) [0418]
Brent und Ptashne, Cell 43, 729 (1985) [0420]
Weintraub H. et al., Reviews – Trends in Genetics, Band 1(1), 23 (1986) und Mol et al., FEBS Letters 268, 427 (1990) [0421]
Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17 [0428]
Rehm et al., 1993 Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim [0428]
Belter P. A. et al., 1988, Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons [0428]
Kennedy J. F., und Cabral J. M. S., 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons [0428]
Shaeiwitz J. A. und Henry J. D., 1988, Biochemical separations, in Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band B3, Kapitel 11, Seite 1–27, VCH: Weinheim [0428]
Dechow F. J., 1989, Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications [0428]
Girke, T., The Plant Journal 15, 39 (1998) [0431]
Puttaraju et al., Nature-Biotechnology 17, 246 (1999) [0431]
Harlow und Lane, ”Antibodies; A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988) [0433]
Kelly et al., Bio/Technology 10, 163 (1992) [0433]
Bebbington et al., Bio/Technology 10, 169 (1992) [0433]
Harlow und Lane, ”Antibodies, A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988) [0434]
Stites et al., Hrsg., ”Basic and Clinical Immunology,” (Lange Medical Publications, Los Altos, Kalif., 4. Auflage) [0435]
Harlow und Lane, ”Antibodies, A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988) [0435]
Isalan M. et al., Biochemistry 37 (35), 12026 (1998) [0436]
Moore M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (4), 1432 (2001) [0436]
Moore M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (4), 1437 (2001) [0436]
Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66, 221 (1990) [0440]
Hajukiewicz P. et al., Plant Mol. Biol., 25, 989 (1994) [0440]
Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 4 (15), 285 (1996) [0441]
Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204, 383 (1986) [0442]
Ooms et al., Plasmid, 7, 15 (1982) [0442]
Hoekema et al., Nature, 303, 179 (1983) [0442]
Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13, 4777 (1994) [0442]
Gelvin und Schilperoort, Plant Molecular Biology Manual, 2. Auf 1. – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuch Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4 [0442]
Glick B. R. und Thompson J. E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993. – 360 S., ISBN 0-8493-5164-2 [0442]
Moloney et al., Plant Cell Reports 8, 238 (1989) [0442]
De Block et al., Plant Physiol. 91, 694 (1989) [0442]
Mlynarova et al., Plant Cell Report 13, 282 (1994) [0442]
Freeling und Walbot ”The maize handbook” Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7 [0442]
Römpp Lexikon Biotechnologie, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1992, ”screening” S. 701 [0443]
Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17 [0443]
Rehm et al., 1993 Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim [0443]
Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons [0443]
Kennedy J. F. und Cabral J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons [0443]
Shaeiwitz J. A. und Henry J. D., 1988 Biochemical separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band B3, Kapitel 11, Seite 1–27, VCH: Weinheim [0443]
Dechow F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications [0443]
Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, dritte Auflage (1994) [0453]
Milner, Nature Medicine 1, 879 (1995) [0455]
Hupp, Cell 83, 237 (1995); Gibbs, Cell 79, 193 (1994) [0455]
Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer, New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 U. S. A. und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA [0455]
Sambrook et al., [0460]
Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989 [0477]
Ni et al., Plant Journal 7, 661 (1995) [0490]
Hellens R., Mullineaux P. und Klee H., (Trends in Plant Science, 5 (10), 446 (2000)) [0491]
Koncz und Schell, Mol. Gen. Gent. 204, 383, 1986) [0503]
Plant J. 16, 735 (1998) [0510]
Hong et al., Plant Mol Biol 18, 663 (1992); Jagendorf und Takabe [0538]
Plant Physiol 127, 1827 (2001) [0538]
Mizoguchi et al., Proc Natl Acad Sci USA 93, 765 (1996) [0538]
Zhu, Curr Opin Plant Biol 4, 401 (2001) [0538]
McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999) [0542]
Brown D. C. W. und Atanassov A. (Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 111 (1985)) [0542]
Walker et al., Am. J. Bot. 65, 654 (1978) [0542]
McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999) [0543]
Agrobacterium Protocols, Methods in Molecular Biology, Band 44, S. 47–62 [0543]
Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey [0543]
Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) [0543]
Sanford et al., 1993 [0549]
An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band. 44, S. 47–62 [0555]
Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey [0555]
Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984) [0555]
Babic et al. (Plant Cell Rep 17, 183 (1998)) [0559]
An, G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band. 44, S. 47–62 [0560]
Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey [0560]
Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) [0560]
Ishida et al. (Nature Biotech 14745 (1996)) [0564]
Fromm et al. Biotech 8, 833 (1990) [0564]
Ishida et al. (Nature Biotech 14745 (1996) [0569]
Sambrook, J. et al., 1989, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory Press [0577]
Ausubel, F. M. et al., 1994, ”Current Protocols in Molecular Biology,” John Wiley & Sons [0577]
Gu et al., BioTechniques 17, 257 (1994) [0578]
Sambrook, J. et al., 1989, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory Press [0578]
Ausubel, F. M. et al., 1994, ”Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons [0578]
Rupp W. D., DNA repair mechanisms, in: E. coli and Salmonella, S. 2277–2294, ASM, 1996, Washington [0579]
Greener A. und Callahan M., Strategies 7, 32 (1994) [0579]
McKersie et al., (Plant Physiol 119, 839 (1999)) [0581]
Brown und Atanassov (Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 111 (1985)) [0581]
Walker et al., Am. J. Bot. 65, 54 (1978) [0581]
McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999) [0582]
An G., in Agrobacterium Protocols, Methods in Molecular Biology, Band 44, S. 47–62 [0582]
Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey [0582]
Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984) [0582]
Sanford et al., 1993 [0590]
An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band 44, S. 47–62 [0597]
Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey [0597]
Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) [0597]
Babic et al. (Plant Cell Rep 17, 183 (1998)) [0604]
An, G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Band. 44, S. 47–62, Gartland K. M. A. und Davey M. R. Hrsg. Humana Press, Totowa, New Jersey [0605]
Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984) [0605]
Ishida et al. (Nature Biotech 14745 (1996)) [0609]
Fromm et al. Biotech 8, 833 (1990) [0609]
Ishida et al. (Nature Biotech. 14745 (1996)) [0612]
Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994 [0618]
Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994 [0622]

Claims

Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze oder eines Teils davon, das zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze oder einem Teil davon führt, dadurch, dass man eine oder mehrere Aktivitäten aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) erhöht oder erzeugt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze oder eines Teils davon, das zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze oder einem Teil davon führt, dadurch, dass man eine oder mehrere Aktivitäten von mindestens einem Polypeptid umfassend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) einem Polypeptid, umfassend ein Polypeptid, eine Konsensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv, gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II bzw. Tabelle IV; oder (ii) einem Expressionsprodukt eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynukleotid, gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I, (iii) einem funktionellen Äquivalent von (i) oder (ii) erhöht oder erzeugt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze oder eines Teils davon, das zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze oder einem Teil davon führt, dadurch, dass man eine oder mehrere Aktivitäten durch Erhöhen der Expression von mindestens einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, das für Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II codiert; (b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I; (c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II abgeleitet sein kann und verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30 Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst und verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30 Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codiert wird, codiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst und verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht; (f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) codiert wird und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II wiedergegeben wird, und verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht; (j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und (k) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, oder 500 nt eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird, screent, erhöht oder erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die eine oder mehrere Aktivitäten, die erhöht oder erzeugt werden, aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) ausgewählt ist.
Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder ein Teil davon mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon, hergestellt mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 5, abstammend von einer monokotylen Pflanze.
Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 5, abstammend von einer dikotylen Pflanze.
Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 5, wobei die entsprechende Pflanze aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, darunter Canola und Winterraps, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Flachs, Borretsch, Saflor, Lein, Nachtkerze, Raps, Rübsen, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, einschließlich Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate; Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Ölpalme, Kokosnuss, mehrjährige Gräser, Futterkulturen und Arabidopsis thaliana ausgewählt ist.
Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil davon nach Anspruch 5, wobei die entsprechende Pflanze aus der Gruppe bestehend aus Mais, Soja, Raps (einschließlich Canola und Winterraps), Baumwolle, Weizen und Reis ausgewählt ist.
Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze umfassend eine(n) oder mehrere dieser transgenen Pflanzenzellkerne oder Pflanzenzellen, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, die von einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 6 bis 9 stammen oder erzeugt werden.
Transgene Pflanze, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze umfassend eine(n) oder mehrere dieser transgenen Pflanzenzellkerne oder Pflanzenzellen, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, die von einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 6 bis 9 stammen oder erzeugt werden, wobei die transgene Pflanze, der transgene Pflanzenzellkern, die transgene Pflanzenzelle, Pflanze umfassend eine(n) oder mehrere solcher transgenen Pflanzenzellkerne oder Pflanzenzellen, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen für ein Transgen, das einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einen Teil davon vermittelt, genetisch homozygot ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ein Nukleinsäuremolekül umfassend aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, das für Polypeptid gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIB codiert; (b) einem Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IB; (c) einem Nukleinsäuremolekül, welches als Folge der Degeneration des genetischen Codes von einer Polypeptidsequenz gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle II abgeleitet sein kann und verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht; (d) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 30 Identität mit der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, das das Nukleinsäuremolekül gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle I umfasst und verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit mindestens 30 Identität mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codiert wird, codiert und die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst und verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht; (f) einem Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) hybridisiert und verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen ein Polypeptid, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) codiert wird und die Aktivität aufweist, die durch das Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle I umfasst, isoliert werden kann; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die Konsensussequenz oder ein oder mehrere Polypeptidmotive gemäß Spalte 7 von Tabelle IV umfasst und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül wiedergegeben wird, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein gemäß Spalte 5 von Tabelle II wiedergegeben wird, und verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht; (j) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid umfasst, das man erhält, indem man eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek unter Verwendung der Primer aus Spalte 7 von Tabelle III amplifiziert, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, die durch ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polynukleotid gemäß Spalte 5 von Tabelle II oder IV umfasst, wiedergegeben wird; und (k) einem Nukleinsäuremolekül, welches erhältlich ist, indem man eine geeignete Nukleinsäurebibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, die eine komplementäre Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls von (a) oder (b) umfasst, oder mit einem Fragment davon, mit mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt eines Nukleinsäuremoleküls, das komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz ist und für ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein ein Polypeptid gemäß Spalte 5 von Tabelle II umfassendes Protein wiedergegeben wird, screent; wobei das Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (k) mindestens in einem oder mehreren Nukleotiden von der in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA gezeigten Sequenz verschieden ist und vorzugsweise für ein Protein codiert, das sich mindestens in einer oder mehreren Aminosäuren von den Proteinsequenzen gemäß Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA unterscheidet.
Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 12 vermittelt, umfassend ein oder mehrere regulatorische Elemente, wobei die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon führt.
Vektor umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12 oder das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13, wobei die Expression der codierenden Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon führt.
Wirtskern oder Wirtszelle, der/die mit dem Vektor nach Anspruch 14 oder dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12 oder dem Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13 stabil oder transient transformiert worden ist und der/die aufgrund der Transformation einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei das Polypeptid in einem Wirtskern oder einer Wirtszelle nach Anspruch 15 exprimiert wird.
Polypepid, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 16 oder codiert von dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12, wobei sich das Polypeptid von der Sequenz gemäß Tabelle IIA durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheidet.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 17 bindet.
Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Pollen, Nachkommenschaft, Erntegut oder Pflanze, umfassend einen Wirtsnukleus oder eine Wirtszelle nach Anspruch 15.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die verglichen mit einer entsprechenden nicht transformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon in einer Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon einen erhöhten Ertrag verleiht, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivierung einer Pflanzenzelle; einer transgenen Pflanze oder eines Teils davon unter Aufrechterhaltung einer Pflanze exprimierend das Polypeptid, das von der Nukleinsäure nach Anspruch 12 codiert wird und das einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder eines Teils davon vermittelt; einer nichttransformierten Wildtyppflanze oder eines Teils davon und ein Ablesesystem, das fähig ist, mit dem Polypeptid unter geeigneten Bedingungen, die die Interaktion des Polypeptids mit dem Ablesesystem in Gegenwart einer Verbindung oder einer Probe umfassend eine Mehrzahl von Verbindungen gestatten, zu interagieren, und das fähig ist, ein nachweisbares Signal in Reaktion auf die Bindung einer Verbindung an das Polypeptid unter Bedingungen, die die Expression dieses Ablesesystems und des Polypeptids, das von dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12 codiert wird und das einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon, einer nichttransformierten Wildtyppflanze oder einem Teil davon, vermittelt, bereitzustellen; (b) Feststellen, ob es sich bei der Verbindung um einen wirksamen Agonisten handelt, indem man das Vorhandensein oder das Fehlen oder die Zunahme eines durch dieses Ablesesystem produzierten Signals nachweist.
Verfahren zur Herstellung einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, welches die Schritte des Verfahrens nach Anspruch 20 und das Formulieren der in Anspruch 20 identifizierten Verbindung in einer für eine Anwendung in der Landwirtschaft geeigneten Form umfasst.
Zusammensetzung, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12, das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13, den Vektor nach Anspruch 14, das Polypeptid nach Anspruch 17, die Verbindung nach Anspruch 20 und/oder den Antikörper nach Anspruch 18 und gegebenenfalls einen landwirtschaftlich unbedenklichen Träger.
Isoliertes Polypeptid gemäß Tabelle II, vorzugsweise Tabelle IIB, das aus Hefe, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae, oder E. coli ausgewählt ist.
Verfahren zum Herstellen eines transgenen Pflanzenzellkerns, einer transgenen Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder eines Teils davon mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon, wobei der erhöhte Ertrag durch die Expression eines Polypeptids erhöht wird, das von einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 12 codiert wird, was zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon führt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle oder eines Teils einer Pflanze mit einem Vektor nach Anspruch 14 und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze aus der Pflanzenzelle oder dem Teil einer Pflanze, was zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze führt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, das unter Niedrigtemperaturbedingungen zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze führt, durch Erzeugen oder Erhöhen von einer oder mehreren Aktivitäten ausgewählt aus der Gruppe „Yield Related Protein (YRP) bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX).
Verfahren nach Anspruch 25, das Folgendes umfasst: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle oder eines Teils einer Pflanze mit einem Vektor nach Anspruch 14 und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze aus der Pflanzenzelle oder dem Teil einer Pflanze, was zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanze führt.
Verwendung eines YRP-Codiernukleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Nukleinsäure nach Anspruch 12 zur Herstellung einer Pflanzenzelle, Pflanze oder eines Teils davon, was zu einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil einer Pflanze führt.
Verwendung eines YRP-Codiernukleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Nukleinsäure nach Anspruch 12 oder Teilen davon als Marker für die Selektion von Pflanzen oder Pflanzenzellen mit einem erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle; einer nichttransformierten Wildtyppflanze oder eines Teils davon.
Verwendung eines YRP-Codiernukleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Nukleinsäure nach Anspruch 12 oder Teilen davon als Marker für den Nachweis von Ertragserhöhung in Pflanzen oder Pflanzenzellen.
Transgene Pflanzenzelle umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das für ein YRP-Polypeptid mit einer Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus b3293-Protein und „phenylacetic acid degradation operon negative regulatory Protein” (paaX) codiert, wobei das Polypeptid einen erhöhten Ertrag verglichen mit einer entsprechenden nichttransformierten Wildtyppflanzenzelle, einer Pflanze oder eines Teils davon vermittelt, vorzugsweise wenn das Polypeptid überexprimiert wird.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 30, wobei der Ertrag dadurch verbessert wird, dass man ein oder mehrere Ertragsmerkmale verbessert.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 30, wobei der Ertrag dadurch verbessert wird, dass man die Nährstoffnutzungseffizienz und/oder Toleranz gegenüber (abiotischem) Stress verbessert.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach Anspruch 32, wobei es sich bei der verbesserten Nährstoffnutzungseffizienz um eine verbesserte Stickstoffnutzungseffizienz (NUE) handelt.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach Anspruch 32, wobei es sich bei der verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress um eine erhöhte Toleranz gegenüber niederer Temperatur handelt.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach Anspruch 34, wobei es sich bei der verbesserten Toleranz gegenüber niedriger Temperatur um Toleranz und/oder Resistenz gegen Kältestress und/oder Gefrierstress, vorzugsweise Kältestress, handelt.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 35, wobei sich die Toleranz gegenüber niedriger Temperatur darin zeigt, dass der Prozentsatz der Samen, die unter solchen Niedrigtemperaturbedingungen keimen, höher ist als bei dem (nichttransformierten) Ausgangs- oder Wildtyporganismus.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 35, wobei es sich bei der niedrigen Temperatur um solch eine Temperatur handelt, die bei einem (nichttransformierten) Ausgangs- oder Wildtyporganismus wachstumslimitierend wäre.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich die Ertragserhöhung auf eine Erhöhung des erntbaren Ertrags einer Pflanze bezieht.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich die Ertragserhöhung auf einen erhöhten Biomasseertrag, einen erhöhten Samenertrag und/oder einen erhöhten Ertrag bezüglich eines oder mehrerer spezifischer Inhaltsstoffe) einer ganzen Pflanze oder von Teilen davon oder von Pflanzensamen bezieht.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich der erhöhte Ertrag auf Trockengewichtbiomasseertrag und/oder Frischgewichtbiomasseertrag, jeweils bezüglich der oberirdischen und/oder unterirdischen Teile einer Pflanze berechnet als Frischgewicht, Trockengewicht oder auf feuchtigkeitskorrigierter Basis bezieht.
Verfahren, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze oder Teil davon, Nachkommenschaft, Samen oder Pollen, isoliertes Nukleinsäurekonstrukt, Vektor, Wirtszelle, Wirtszellkern, Verfahren, Polypeptid, Antikörper, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Erntegut oder -pflanze, Zusammensetzung, isoliertes Polypeptid oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ertragserhöhung auf pro-Pflanze-Grundlage oder in Bezug auf eine spezifische Anbaufläche berechnet wird.