DE112010003032T5 - Pflanzen mit erhöhtem Ertrag - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyp-Pflanze, wobei das Verfahren mindestens den folgenden Schritt umfasst: Erhöhen oder Herbeiführen in einer Pflanze oder einem Teil derselben von einer oder mehreren Aktivitäten eines Polypeptids, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungs-Regulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht.

Description

  • Die Erfindung, die hierin offenbart ist, stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyp-Pflanze bereit, welches das Erhöhen oder Herbeiführen von einer oder mehreren Aktivitäten in einer Pflanze oder einem Teil derselben umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuren, welche eine oder mehrere Eigenschaften einer transgenen Pflanze steigern oder verbessern, sowie Zellen, Nachkommen, Samen und Pollen, die aus derartigen Pflanzen oder Teilen abgeleitet sind, und Verfahren zur Herstellung und Verfahren zur Verwendung derartiger Pflanzenzelle(n) oder Pflanze(n), Nachkommen, Samen oder Pollen. Insbesondere werden die verbesserte(n) Eigenschaft(en) in einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise durch Verbessern einer oder mehrerer ertragsbezogener Eigenschaften, manifestiert.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Unter Feldbedingungen hängt die Pflanzenleistung, zum Beispiel in Hinsicht auf Wachstum, Entwicklung, Biomasseakkumulation und Samenerzeugung, von der Toleranz und dem Akklimatisierungsvermögen einer Pflanze gegenüber zahlreichen Umwelt-Bedingungen, -Änderungen und -Stressformen ab. Seit den Anfängen von Landwirtschaft und Gartenbau bestand eine Notwendigkeit zur Verbesserung von Pflanzeneigenschaften bei der Kultivierung von Nutzpflanzen. Züchtungsstrategien fördern Nutzpflanzeneigenschaften, um biotischen und abiotischen Stressformen zu begegnen, die Nährstoffverwertungseffizienz zu verbessern und andere intrinsische nutzpflanzenspezifische Ertragsparameter zu verändern, d. h. den Ertrag durch Anwendung technischer Fortschritte zu erhöhen. Pflanzen sind sessile Organismen und müssen daher verschiedene umweltbedingte Stressformen bewältigen. Biotische Stressformen, wie Pflanzenschädlinge und -pathogene, einerseits, und abiotische Umwelt-Stressformen andererseits sind bedeutende limitierende Faktoren für Pflanzen-Wachstum und -Produktivität, wodurch der Pflanzenanbau und die geographische Verbreitung eingeschränkt werden. Pflanzen, die verschiedenen Stressformen ausgesetzt sind, weisen in der Regel niedrige Erträge an pflanzlichem Material wie Samen, Früchten oder anderen Erzeugnissen auf. Nutzpflanzenverluste und Nutzpflanzen-Ertragsverluste, die durch abiotische und biotische Stressformen verursacht werden, repräsentieren einen signifikanten wirtschaftlichen und politischen Faktor und tragen, insbesondere in vielen unterentwickelten Ländern, zu Lebensmittelverknappungen bei.
  • Herkömmliche Methoden für Verbesserungen an Nutzpflanzen und im Gartenbau benutzen heutzutage selektive Züchtungstechniken zur Identifizierung von Pflanzen mit erwünschten Merkmalen. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es erlaubt, das Keimplasma von Pflanzen auf spezifische Weise zu modifizieren. Zum Beispiel führte die Modifikation eines einzelnen Gens in einigen Fällen zu einer signifikanten Erhöhung bei z. B. der Stresstoleranz als auch anderen ertragsbezogenen Eigenschaften.
  • Die landwirtschaftliche Biotechnologie hat versucht, den wachsenden Bedürfnissen der Menschheit durch genetische Modifikationen von Pflanzen zu begegnen, welche den Nutzpflanzen-Ertrag erhöhen konnten, zum Beispiel durch Herbeiführen besserer Antwortreaktionen hinsichtlich der Toleranz gegenüber abiotischem Stress oder durch Erhöhen der Biomasse.
  • Landwirtschafts-Biotechnologen verwenden Messungen von anderen Parametern, welche die potentielle Auswirkung eines Transgens auf den Nutzpflanzenertrag anzeigen. Für Viehfutternutzpflanzen wie Alfalfa, Silomais und Heu korreliert die Pflanzenbiomasse mit dem Gesamtertrag. Für Getreidenutzpflanzen müssen jedoch andere Parameter verwendet werden, um den Ertrag einzuschätzen, wie etwa die Pflanzengröße, gemessen als Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stängelvolumen, die Pflanzenhöhe, der Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Die Pfanzengröße bei einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze, und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht gewinnen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich der Pflanzengröße und Wachstumsrate, und daher besteht, für eine Auswahl an diversen Genotypen, wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen. Auf diese Weise wird eine Standardumgebung benutzt, um eine Annäherung an die vielfältigen und dynamischen Umgebungen vorzunehmen, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten angetroffen werden.
  • Pflanzen, welche Toleranz gegenüber einem abiotischen Stress zeigen, weisen oft Toleranz gegenüber einem weiteren Umweltstress auf. Dieses Phänomen der Kreuz-Toleranz ist auf einer mechanistischen Ebene nicht verstanden. Nichtsdestoweniger ist es vernünftig, zu erwarten, dass Pflanzen, die eine gesteigerte Toleranz gegenüber Niedertemperatur, z. B. Abkühlungstemperaturen und/oder Frosttemperaturen, wegen der Expression eines Transgens zeigen, auch Toleranz gegenüber Dürre und/oder Salz und/oder anderen abiotischen Stressformen zeigen können.
  • Einige Gene, die bei Stressantworten, Wassernutzung und/oder Biomasse bei Pflanzen beteiligt sind, wurden charakterisiert, aber bis heute war der Erfolg bei der Entwicklung transgener Nutzpflanzen mit verbessertem Ertrag begrenzt, und es sind keine derartigen Pflanzen auf den Markt gebracht worden.
  • Daher besteht eine Notwendigkeit, Gene zu identifizieren, welche Resistenz gegenüber verschiedenen Kombinationen von Stressformen verleihen oder welche einen verbesserten Ertrag unter optimalen und/oder suboptimalen Wachstumsbedingungen vermitteln.
  • Folglich stellt die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyp-Pflanze bereit, wobei das Verfahren mindestens den folgenden Schritt umfasst: Erhöhen oder Herbeiführen in einer Pflanze von einer oder mehreren Aktivitäten eines Polypeptids, gewählt aus der Gruppe, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht, in dem hierin nachstehend angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe.
  • Demzufolge sieht die Erfindung eine transgene Pflanze vor, welche ein isoliertes Polynukleotid, wie in Tabelle I identifiziert, oder ein Homolog davon, in dem hierin angegebenen subzellulären Kompartiment und Gewebe überexprimiert. Die transgene Pflanze der Erfindung zeigt einen verbesserten oder erhöhten erntefähigen Ertrag im Vergleich zu einer Wildtypvarietät der Pflanze.
  • Demgemäß sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyp-Pflanze vor, umfassend mindestens einen der Schritte, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (i) Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids, umfassend mindestens ein Polypeptidmotiv oder eine Consensussequenz, wie jeweils in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II bzw. der Tabelle IV aufgeführt; oder (ii) Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Expressionsprodukts von einem oder mehreren isolierten Polynukleotid(en), umfassend ein oder mehrere Polynukleotid(e), wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I aufgeführt.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Nutzpflanze bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Erhöhen oder Herbeiführen der Expression von mindestens einem Polynukleotid; und/oder (ii) Erhöhen oder Herbeiführen der Expression eines Expressionsprodukts, das von mindestens einem Polynukleotid codiert wird; und/oder (iii) Erhöhen oder Herbeiführen einer oder mehrerer Aktivitäten eines Expressionsprodukts, das von mindestens einem Polynukleotid codiert wird, wobei das Polynukleotid aus der Gruppe gewählt wird, bestehend aus:
    • (a) einem isolierten Polynukleotid, welches das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigte Polypeptid codiert;
    • (b) einem isolierten Polynukleotid, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigt ist;
    • (c) einem isolierten Polynukleotid, das, als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II aufgeführten Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (d) einem isolierten Polynukleotid, das 30 oder mehr, zum Beispiel 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% oder 99% (Prozent) oder mehr Identität zu der Sequenz eines in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigten Polynukleotids aufweist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (e) einem isolierten Polynukleotid, das ein Polypeptid mit 30 oder mehr, zum Beispiel 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Identität zu der Aminosäuresequenz des von dem isolierten Polynukleotid von (a) bis (c) codierten Polypeptids codiert und die Aktivität, repräsentiert durch ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt, aufweist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (f) einem isolierten Polynukleotid, das mit einem isolierten Polynukleotid von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (g) einem isolierten Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert, welches mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt wurden, das von einem der isolierten Polynukleotide von (a) bis (e) codiert wird, und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt;
    • (h) einem isolierten Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Consensussequenz oder ein oder mehr Polypeptidmotive, wie in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch oh Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt;
    • (i) einem isolierten Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (j) einem isolierten Polynukleotid, welches durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung von Primern, die aus den Polynukleotidsequenzen in Tabellen 1 oder 2 abgeleitet sind, erhalten wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt; und
    • (k) einem isolierten Polynukleotid, das erhältlich ist durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem isolierten Polynukleotid von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, aufweisend 15 nt oder mehr, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, oder 500 nt, 1000 nt, 1500 nt, 2000 nt oder 3000 nt oder mehr von einem Polynukleotid, komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Polynukleotidsequenz, und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein repräsentiert wird, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt.
  • Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzenzellkerns oder eines Pflanzengewebes, zur Herstellung einer derartigen Pflanze, mit einem isolierten Polynukleotid, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einem isolierten Polynukleotid, welches das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigte Polypeptid codiert;
    • (b) einem isolierten Polynukleotid, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigt ist;
    • (c) einem isolierten Polynukleotid, das, als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II aufgeführten Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (d) einem isolierten Polynukleotid, das 30% oder mehr, zum Beispiel 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Identität zu einem in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigten Polynukleotid aufweist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (e) einem isolierten Polynukleotid, das ein Polypeptid mit 30% oder mehr, zum Beispiel 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Identität zu der Aminosäuresequenz des von dem isolierten Polynukleotid von (a) bis (c) codierten Polypeptids codiert und die Aktivität, repräsentiert durch ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt, aufweist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (f) einem isolierten Polynukleotid, das mit einem isolierten Polynukleotid von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (g) einem isolierten Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert, welches mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt wurden, das von einem der isolierten Polynukleotide von (a) bis (e) codiert wird, und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt;
    • (h) einem isolierten Polynukleotid, des ein Polypeptid codiert, umfassend die Consensussequenz oder ein oder mehr Polypeptidmotive, wie in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt;
    • (i) einem isolierten Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (j) einem isolierten Polynukleotid, das durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung von aus den Polynukleotidsequenzen in den Tabellen 1 und 2 abgeleiteten Primern erhalten wird und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt; und
    • (k) einem isolierten Polynukleotid, das erhältlich ist durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem isolierten Polynukleotid von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, aufweisend mindestens 20, 30, 50, 100, 200, 300, 500 oder 1000 oder mehr nt von einem Polynukleotid, komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Polynukleotidsequenz, und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein repräsentiert wird, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt,
    und das Regenerieren einer transgenen Pflanze aus diesem transformierten Pflanzenzellkern, dieser transformierten Pflanzenzelle oder diesem transformierten Pflanzengewebe mit erhöhtem Ertrag.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Eine Reihe von ertragsbezogenen Phänotypen steht mit dem Ertrag von Pflanzen in Zusammenhang. In Übereinstimmung mit der Erfindung können die in Tabelle 1 identifizierten Gene, oder Homologe davon, deshalb verwendet werden, um einen beliebigen ertragsbezogenen Phänotyp zu verstärken. Ein erhöhter Ertrag kann in Feldversuchen an transgenen Pflanzen und geeigneten Kontrollpflanzen bestimmt werden. Alternativ dazu kann das Vermögen eines Transgens zur Erhöhung des Ertrags in einer Modell-Pflanze bestimmt werden. Ein Phänotyp mit erhöhtem Ertrag kann in dem Feldtest oder in einer Modell-Pflanze bestimmt werden, indem man einen beliebigen oder eine beliebige Kombination der folgenden Phänotypen im Vergleich zu einer Kontrollpflanze misst: Ertrag an trockenen erntefähigen Teilen der Pflanze, Ertrag an trockenen oberirdischen erntefähigen Teilen der Pflanze, Ertrag an unterirdischen trockenen erntefähigen Teilen der Pflanze, Ertrag an erntefähigen Frischgewicht-Teilen der Pflanze, Ertrag an oberirdischen erntefähigen Frischgewicht-Teilen der Pflanze, Ertrag an unterirdischen erntefähigen Frischgewicht-Teilen der Pflanze, Ertrag an den Früchten der Pflanze (sowohl frisch als auch getrocknet), Korn-Trockengewicht, Ertrag an Samen (sowohl frisch als auch trocken), und dergleichen.
  • Der grundsätzlichste ertragsbezogene Phänotyp ist ein erhöhter Ertrag, der mit dem Vorhandensein des Gens oder einem Homolog davon als einem Transgen in der Pflanze zusammenhängt, d. h. der intrinsische Ertrag der Pflanze. Die intrinsische Ertragskapazität einer Pflanze kann zum Beispiel in einem Feldtest oder in einem Modellsystem manifestiert sein durch Aufzeigen einer Verbesserung des Samenertrags (z. B. in Hinsicht auf erhöhte Samen/Korngröße, erhöhte Ährenzahl, erhöhte Samenzahl pro Ähre, Verbesserung der Samenfüllung, Verbesserung der Samenzusammensetzung, Embryo- und/oder Endospermverbesserungen, und dergleichen); Modifikation und Verbesserung von inhärenten Wachstums- und Entwicklungsmechanismen einer Pflanze (wie Pflanzenhöhe, Pflanzenwachstumsrate, Hülsenzahl, Hülsenposition auf der Pflanze, Anzahl an Internodien, Häufigkeit von Hülsenbruch, Effizienz der Nodulation und Stickstofffixierung, Effizienz der Kohlenstoffassimilation, Verbesserung der Sämlingswuchskraft/Frühwuchskraft, gesteigerte Effizienz der Keimung (unter nicht-stressbelasteten Bedingungen), Verbesserung der Pflanzenarchitektur.
  • Mit erhöhtem Ertrag zusamenhängende Phänotypen können auch gemessen werden, um die Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress zu bestimmen. Abiotische Stressformen schließen Dürre, niedrige Temperaturen, Salzgehalt, osmotischen Stress, Schatten, hohe Pflanzendichte, mechanische Stressarten und oxidativen Stress ein, und ertragsbezogene Phänotypen sind bei der Toleranz gegen solche abiotischen Stressformen mitinbegriffen. Weitere Phänotypen, welche verfolgt werden können, um eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress zu bestimmen, schließen, ohne Einschränkung darauf, Welken; Braunwerden des Blatts; Verlust des Turgors, was zum Abwurf von Blättern oder Nadelstielen und Blüten führt; Abfall und/oder Abwurf von Blättern oder Nadeln; die Blätter sind grün, aber das Blatt ist im Vergleich zu Kontrollen geringfügig zum Erdboden hin abgewinkelt; Blattspreiten beginnen sich nach innen einzufalten (einzurollen); verfrühte Seneszenz von Blättern oder Nadeln; Verlust von Chlorophyll in Blättern oder Nadeln und/oder Vergilbung ein. Jegliche der oben beschriebenen ertragsbezogenen Phänotypen können in Feldtests oder in Modellpflanzen überwacht werden, um zu zeigen, dass eine transgene Pflanze erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress aufweist. Gemäß der Erfindung können die Gene, die in Tabelle 1 angegeben sind, oder Homologe davon, verwendet werden, um die Toleranz gegenüber abiotischem umweltbedingten Stress in einer Pflanze zu steigern, was sich auf die Pflanze bezieht, wenn sie mit abiotischem Umweltstress konfrontiert wird.
  • Definitionen
  • Eine ”ertragserhöhende Aktivität” bezieht sich gemäß der Erfindung auf eine Aktivität, gewählt aus der Gruppe, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamylgamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht. Ein Polypeptid, das eine ertragserhöhende Aktivität vermittelt, kann von einer Nukleinsäuresequenz, wie sie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 gezeigt ist, codiert sein und/oder umfasst oder besteht aus einem Polypeptid, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 aufgeführt, und/oder kann mit dem in Tabelle III, Spalte 7, gezeigten Primersatz amplifiziert werden.
  • Eine ”transgene Pflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Pflanze, welche eine Fremd-Nukleotidsequenz enthält, die entweder in ihr nukleäres Genom oder Organellen-Genom inseriert ist. Sie schließt ferner die Nachkommengenerationen, d. h. die T1-, T2- und nachfolgenden Generationen, oder BC1-, BC2- und die nachfolgende Generation, sowie Kreuzungs-Züchtungen davon mit nicht-transgenen oder anderen transgenen Pflanzen ein.
  • ”Verbesserte Anpassung” an Umweltstress, wie z. B. Dürre, Hitze, Nährstoffverknappung, Gefrier- und/oder Abkühlungstemperaturen, bezieht sich hierin auf eine verbesserte Pflanzenleistung, die zu einem erhöhten Ertrag führt, insbesondere im Hinblick auf eine oder mehrere der ertragsbezogenen Eigenschaften, wie sie obenstehend ausführlicher definiert sind.
  • Eine Modifikation, d. h. eine Erhöhung, kann durch endogene oder exogene Faktoren verursacht werden. Zum Beispiel kann eine Erhöhung der Aktivität in einem Organismus oder einem Teil davon durch Zusetzen eines Genprodukts oder eines Vorläufers oder eines Aktivators oder eines Agonisten zu den Medien oder Nährmitteln verursacht werden oder kann durch transientes oder stabiles Einbringen dieser Objekte in einen Organismus verursacht werden. Darüber hinaus kann eine derartige Erhöhung durch die Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder des codierten Proteins im korrekten Zellkompartiment, zum Beispiel in den Zellkern oder cytoplasmatisch oder in Plastiden, entweder durch Transformation und/oder Targeting, erreicht werden.
  • Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung sollen die Begriffe ”cytoplasmatisch” und ”nicht-zielgelenkt” anzeigen, dass die Nukleinsäure der Erfindung ohne die Hinzufügung von ein nicht-natürliches Transitpeptid codierender Sequenz exprimiert wird. Eine für ein nicht-natürliches Transitpeptid codierende Sequenz ist eine Sequenz, welche nicht ein natürlicher Teil einer Nukleinsäure der Erfindung, z. B. der in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, angeführten Nukleinsäuren, ist, sondern vielmehr durch molekulare Manipulationsschritte, wie es beispielsweise in dem Beispiel unter ”Plastiden-zielgerichtete Expression” beschrieben ist, hinzugefügt wird. Deshalb sollen die Begriffe ”cytoplasmatisch” und ”nicht-zielgerichtet” eine zielgerichtete Lokalisierung auf jegliches Zellkompartiment für die Produkte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen durch ihre natürlich vorkommenden Sequenzeigenschaften innerhalb des Hintergrunds des transgenen Organismus nicht ausschließen. Die subzelluläre Lage des reifen Polypeptids, abgeleitet aus den beinhalteten Sequenzen, kann vom Fachmann für den Organismus (Pflanze) mit Hilfe von Software-Werkzeugen, wie TargetP (Emanuelsson et al., (2000), Predicting sub-cellular localization of Proteins based on their N-terminal amino acid sequence, J. Mol. Biol. 300, 1005–1016.), ChloroP (Emanuelsson et al. (1999), ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites., Protein Science, 8: 978–984) oder anderen Vorhersage-Software-Werkzeugen (Emanuelsson et al. (2007), Locating Proteins in the cell using TargetP, SignalP, and related tools., Nature Protocols 2, 953–971) vorausgesagt werden.
  • Der Begriff ”Organelle” gemäß der Erfindung soll zum Beispiel ”Mitochondrien” oder ”Plastide” bedeuten. Der Begriff ”Plastide” gemäß der Erfindung soll verschiedene Formen von Plastiden, einschließlich Proplastiden, Chloroplasten, Chromoplasten, Gerontoplasten, Leucoplasten, Amyloplasten, Elaioplasten und Etioplasten, vorzugsweise Chloroplasten, einschließen. Sie alle weisen als gemeinsamen Vorfahren die zuvor genannten Proplasten auf.
  • Der Begriff ”eingebracht” soll im Kontext dieser Beschreibung die Einführung einer Nukleinsäuresequenz in den Organismus mittels einer ”Transfektion”, ”Transduktion” oder vorzugsweise durch ”Transformation” bedeuten.
  • Eine Plastide, wie ein Chloroplast, ist durch eine exogene (vorzugsweise fremde) Nukleinsäuresequenz ”transformiert”, wenn Nukleinsäuresequenz in die Plastide eingebracht worden ist, was heißt, dass diese Sequenz die Membran oder die Membranen der Plastide durchquert hat. Die Fremd-DNA kann in Plastiden-DNA, welche das Genom der Plastide ausmacht, integriert (kovalent verknüpft) werden, oder sie kann nicht-integriert bleiben (z. B. durch Einschließen eines Chloroplasten-Replikationsursprungs). ”Stabil” integrierte DNA-Sequenzen sind diejenigen, welche durch Plastidenreplikation vererbt werden, wodurch bei neuen Plastiden die Merkmale der integrierten DNA-Sequenz auf die Nachkommen weitergegeben werden.
  • Wie hierin verwendet, soll ”Pflanze” nicht nur eine ganze Pflanze sondern auch einen Teil davon, d. h. eine oder mehrere Zellen und Gewebe, einschließlich zum Beispiel Blättern, Stängeln, Sprossen, Wurzeln, Blüten, Früchten und Samen, einschließen.
  • Der Begriff ”Ertrag”, wie hierin verwendet, bezieht sich im Allgemeinen auf einen messbaren Gewinn aus einer Pflanze, insbesondere einer Nutzpflanze. Ertrag und Ertragserhöhung (im Vergleich zu einer nicht-transformierten Ausgangs- oder Wildtyp-Pflanze) können auf zahlreichen Wegen gemessen werden, und es versteht sich, dass ein Fachmann in der Lage sein wird, die korrekte Bedeutung in Hinsicht auf die jeweiligen Ausführungsformen, die jeweilig betrachtete Nutzpflanze und den betrachteten spezifischen Anwendungszweck oder Gebrauch zu verwenden. Die Begriffe ”verbesserter Ertrag” oder ”erhöhter Ertrag” können austauschbar verwendet werden.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff ”verbesserter Ertrag” oder der Begriff ”erhöhter Ertrag” eine beliebige Verbesserung im Ertrag von einem beliebigen gemessenen Pflanzenprodukt, wie Getreide, Früchte oder Fasern. In Übereinstimmung mit der Erfindung können Änderungen bei verschiedenen phänotypischen Merkmalen den Ertrag verbessern. Zum Beispiel, und ohne Einschränkung, sind Parameter, wie Blütenorganentwicklung, Wurzel-Initiation, Wurzelbiomasse, Samenzahl, Samengewicht, Emteindex, Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, Blattbildung, Phototropismus, Apikaldominanz und Fruchtentwicklung, geeignete Messungen eines verbesserten Ertrags. Erhöhte Erträge schließen höhere Fruchterträge, höhere Samenerträge, höhere Frischmasseproduktion und/oder höhere Trockenmasseproduktion ein.
  • Jedwede Erhöhung im Ertrag ist ein verbesserter Ertrag in Übereinstimmung mit der Erfindung. Zum Beispiel kann die Verbesserung hinsichtlich des Ertrags eine Erhöhung von 0,1%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder mehr in einem beliebigen gemessen Parameter umfassen. Zum Beispiel ist eine Erhöhung im Scheffel/Morgen- bzw. ”bu/acre”-Ertrag von Sojabohnen oder Mais, abgeleitet aus einer Nutzpflanze, umfassend Pflanzen, welche transgen bezüglich der Nukleotide und Polypeptide von Tabelle I sind, im Vergleich zu dem ”bu/acre”-Ertrag von unter den gleichen Bedingungen angebauten, unbehandelten Sojabohnen oder Mais, ein verbesserter Ertrag in Übereinstimmung mit der Erfindung. Der erhöhte oder verbesserte Ertrag kann in Abwesenheit oder Gegenwart von Stressbedingungen erzielt werden.
  • Zum Beispiel bezieht sich ein gesteigerter oder erhöhter ”Ertrag” auf einen oder mehrere Ertragsparameter, gewählt aus der Gruppe, die aus Biomasse-Ertrag, Trockenbiomasse-Ertrag, oberirdischem Trockenbiomasse-Ertrag, unterirdischem Trockenbiomasse-Ertrag, Frischgewichtbiomasse-Ertrag, oberirdischem Frischgewichtbiomasse-Ertrag, unterirdischem Frischgewichtbiomasse-Ertrag; gesteigertem Ertrag von erntefähigen Teilen, entweder Trocken- oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides; gesteigertem Ertrag von Nutzpflanzenfrüchten, entweder Trocken- oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides; und vorzugsweise gesteigertem Ertrag an Samen, entweder Trocken- oder Frischgewicht oder beides, entweder oberirdisch oder unterirdisch oder beides, besteht.
  • ”Nutzpflanzenertrag” ist hierin als die Anzahl von Scheffeln des relevanten landwirtschaftlichen Produkts (wie Korn, Viehfutter oder Samen), das pro Morgen bzw. ”acre” geerntet wird, definiert. Der Nutzpflanzenertrag wird durch abiotische Stressformen, wie Dürre, Hitze, Salzgehalt und Kältestress, und durch die Größe (Biomasse) der Pflanze beeinflusst.
  • Der Ertrag einer Pflanze kann von der spezifischen Pflanze/Nutzpflanze von Interesse wie auch ihrer beabsichtigten Anwendung (wie Lebensmittelproduktion, Futterproduktion, Herstellung verarbeiteter Lebensmittel, Biokraftstoff-, Biogas- oder Alkoholproduktion oder dergleichen) von Interesse in jedem besonderen Fall abhängen. Somit kann, in einer Ausführungsform, der Ertrag als Ernteindex (ausgedrückt als ein Verhältnis des Gewichts der jeweiligen erntefähigen Teile, dividiert durch die Gesamtbiomasse), Gewicht erntefähiger Teile pro Fläche (”acre”, Quadratmeter oder dergleichen); und dergleichen berechnet werden. Der Ernteindex ist das Verhältnis von Ertragsbiomasse zur gesamten kumulativen Biomasse bei der Ernte. Der Ernteindex ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil, und so ist eine beständige Korrelation zwischen der Pflanzengröße und dem Kornertrag möglich. Wie bei der abiotischen Stresstoleranz sind Messungen der Pflanzengröße in der Frühentwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um potentielle Ertragsvorteile zu messen, die durch das Vorhandensein eines Transgens herbeigeführt werden.
  • Demzufolge kann der Ertrag einer Pflanze durch Verbessern von einem oder mehreren der ertragsbezogenen Phänotypen oder Merkmale erhöht werden.
  • Solche ertragsbezogenen Phänotypen oder Eigenschaften einer Pflanze, deren Verbesserung zu erhöhtem Ertrag führt, umfassen, ohne Einschränkung darauf, die Erhöhung der intrinsischen Ertragskapazität einer Pflanze, verbesserte Nährstoff-Verwertungseffizienz, und/oder erhöhte Stresstoleranz.
  • Zum Beispiel bezieht sich der Ertrag auf einen Biomasse-Ertrag, z. B. auf den Trockengewichtbiomasse-Ertrag und/oder Frischgewichtbiomasse-Ertrag. Der Biomasseertrag bezieht sich auf die oberirdischen oder unterirdischen Teile einer Pflanze, abhängig von den spezifischen Umständen (Testbedingungen, spezifische Nutzpflanze von Interesse, Anwendung von Interesse, und dergleichen). In einer Ausführungsform bezieht sich der Biomasseertrag auf die oberirdischen und die unterirdischen Teile. Der Biomasseertrag kann als Frischgewicht, Trockengewicht oder auf einer hinsichtlich der Feuchtigkeit angepassten Basis berechnet werden. Der Biomasseertrag kann auf einer Basis-pro-Pflanze oder in Bezug auf eine spezifische Fläche (z. B. Biomasseertrag pro Morgen/Quadratmeter/oder dergleichen) berechnet werden.
  • ”Ertrag” kann sich auch auf den Samenertrag beziehen, der durch einen oder mehrere der folgenden Parameter gemessen werden kann: Anzahl an Samen oder Anzahl gefüllter Samen (pro Pflanze oder pro Fläche (Morgen/Quadratmeter/oder dergleichen)); Samenfüllrate (Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen und der Gesamtzahl an Samen); Anzahl an Blüten pro Pflanze; Samenbiomasse oder Gesamtsamengewicht (pro Pflanze oder pro Fläche (Morgen/Quadratmeter/oder dergleichen)); Tausendkerngewicht (TKW; extrapoliert aus der Anzahl gezählter gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht; eine Erhöhung beim TKW kann durch eine erhöhte Samengröße, ein erhöhtes Samengewicht, eine erhöhte Embryogröße und/oder ein vergrößertes Endosperm verursacht werden). Andere Parameter, die die Messung des Samenertrags gestatten, sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt. Der Samenertrag kann auf einer Trockengewicht- oder auf einer Frischgewicht-Basis, oder typischerweise auf einer hinsichtlich der Feuchtigkeit angepassten Basis, z. B. bei 15,5 Prozent Feuchtigkeit, bestimmt werden.
  • Zum Beispiel bedeutet der Begriff ”erhöhter Ertrag”, dass die/eine Pflanze eine erhöhte Wachstumsrate, z. B. in Abwesenheit oder Gegenwart von abiotischem Umweltstress, im Vergleich zu der entsprechenden Wildtyppflanze, aufzeigt.
  • Eine erhöhte Wachstumsrate kann sich unter anderem durch eine erhöhte Biomasseproduktion der gesamten Pflanze, oder eine erhöhte Biomasseproduktion der oberirdischen Teile einer Pflanze, oder durch eine erhöhte Biomasseproduktion der unterirdischen Teile einer Pflanze, oder durch eine erhöhte Biomasseproduktion von Teilen einer Pflanze, wie Stängeln, Blättern, Blüten, Früchten und/oder Samen, widerspiegeln, oder sie vermittelt diese.
  • Ein verlängertes Wachstum umfasst das Überleben und/oder das fortgesetzte Wachstum der Pflanze in dem Moment, zu welchem der nicht-transformierte Wildtyporganismus sichtbare Symptome von Mangelerscheinung und/oder Tod zeigt.
  • Wenn die Pflanze der Erfindung eine Maispflanze ist, bedeutet erhöhter Ertrag für Maispflanzen zum Beispiel erhöhten Samenertrag, insbesondere für Maisvarietäten, die als Futter- oder Nahrungsmittel verwendet werden. Erhöhter Samenertrag von Mais bezieht sich auf ein(e) erhöhte(s) Korngröße oder -gewicht, eine erhöhte Kornzahl pro Ähre, oder vermehrte Ähren pro Pflanze. Alternativ oder zusätzlich dazu kann der Kolbenertrag erhöht sein, oder die Länge oder die Größe des Kolbens ist erhöht, oder das Verhältnis von Körnern pro Kolben ist verbessert.
  • Wenn die Pflanze der Erfindung eine Sojapflanze ist, bedeutet erhöhter Ertrag für Sojapflanzen einen erhöhten Samenertrag, insbesondere für Sojavarietäten, die für Futter- oder Nahrungsmittel verwendet werden. Erhöhter Samenertrag bei Soja bezieht sich zum Beispiel auf ein(e) erhöhte(s) Kerngröße oder -gewicht, eine erhöhte Kernzahl pro Hülse, oder vermehrte Hülsen pro Pflanze.
  • Wenn die Pflanze der Erfindung eine Ölsamenraps(OSR)-Pflanze ist, bedeutet erhöhter Ertrag für OSR-Pflanzen einen erhöhten Samenertrag, insbesondere für OSR-Varietäten, die für Futter- oder Nahrungsmittel verwendet werden. Erhöhter Samenertrag bei OSR bezieht sich auf erhöhte(s) Samengröße oder -gewicht, eine erhöhte Samenzahl pro Schote, oder vermehrte Schoten pro Pflanze.
  • Wenn die Pflanze der Erfindung eine Baumwollpflanze ist, bedeutet erhöhter Ertrag für Baumwollpflanzen einen erhöhten Ertrag an Flusen. Erhöhter Flusenertrag bei Baumwolle bezieht sich in einer Ausführungsform auf eine erhöhte Länge der Flusen.
  • Der erhöhte Ertrag kann typischerweise durch Steigern oder Verbessern von einer oder mehreren ertragsbezogenen Eigenschaften der Pflanze erzielt werden. Derartige ertragsbezogene Eigenschaften einer Pflanze umfassen, ohne Einschränkung darauf, die Erhöhung der intrinsischen Ertragskapazität einer Pflanze, eine verbesserte Nährstoffverwertungseffizienz und/oder eine erhöhte Stresstoleranz, insbesondere eine erhöhte abiotische Stresstoleranz.
  • Die intrinsische Ertragskapazität einer Pflanze kann zum Beispiel durch Verbesserung des spezifischen (intrinsischen) Samenertrags (z. B. in Hinsicht auf erhöhte Samen/Korngröße, erhöhte Ährenzahl, erhöhte Samenzahl pro Ähre, Verbesserung der Samenfüllung, Verbesserung der Samenzusammensetzung, Embryo- und/oder Endospermverbesserungen, oder dergleichen); Modifikation und Verbesserung von inhärenten Wachstums- und Entwicklungsmechanismen einer Pflanze (wie Pflanzenhöhe, Pflanzenwachstumsrate, Hülsenzahl, Hülsenposition auf der Pflanze, Anzahl an Internodien, Häufigkeit von Hülsenbruch, Effizienz der Nodulation und Stickstofffixierung, Effizienz der Kohlenstoffassimilation, Verbesserung der Sämlingswuchskraft/Frühwuchskraft, gesteigerte Effizienz der Keimung (unter stressbelasteten oder nicht-stressbelasteten Bedingungen), Verbesserung in der Pflanzenarchitektur, Zellzyklusmodifikationen, Photosynthese-Modifikationen, verschiedene Signalwegmodifikationen, Modifikation der transkriptionellen Regulierung, Modifikation der translationellen Regulierung, Modifikation von Enzymaktivitäten, und dergleichen); und/oder dergleichen manifestiert sein.
  • Die Verbesserung oder Erhöhung der Stresstoleranz einer Pflanze kann sich zum Beispiel durch eine Verbesserung oder Erhöhung der Toleranz einer Pflanze gegenüber Stress, insbesondere abiotischem Stress, manifestieren. In der vorliegenden Patentanmeldung bezieht sich abiotischer Stress im Allgemeinen auf abiotische Umweltbedingungen, mit denen eine Pflanze typischerweise konfrontiert wird, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Dürre (Toleranz gegen Dürre kann als Ergebnis einer verbesserten Wassernutzungseffizienz erzielt werden), Hitze, niedriger Temperaturen und Kältebedingungen (wie Frost- und Abkühlungsbedingungen), Salzgehalt, osmotischen Stresses, Schatten, hoher Pflanzendichte, mechanischen Stresses, oxidativen Stresses und dergleichen.
  • Der erhöhte Pflanzenertrag kann auch durch Erhöhen der ”Nährstoffverwertungseffizienz einer Pflanze” herbeigeführt werden, z. B. durch Verbessern der Verwertungseffizienz von Nährstoffen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Phosphor, Kalium und Stickstoff. Ferner können bei derzeitigen oder standardmäßigen Pegeln der Stickstoffverwendung höhere Erträge erhalten werden.
  • Im Allgemeinen kann der Begriff ”erhöhte Toleranz gegenüber Stress” als das Überleben von Pflanzen, und/oder die Produktion eines höheren Ertrags, unter Stressbedingungen im Vergleich zu einer nicht-transformierten Wildtyp- oder Ausgangspflanze definiert werden: Zum Beispiel ist die erfindungsgemäße oder nach dem Verfahren der Erfindung erzeugte Pflanze besser an die Stressbedingungen angepasst.
  • Während ihres Lebenszyklus ist eine Pflanze im Allgemeinen mit einer Vielzahl an Umweltbedingungen konfrontiert. Jegliche solchen Bedingungen, die unter gewissen Umständen eine Auswirkung auf den Pflanzenertrag haben können, werden hierin als ”Stress”-Bedingung bezeichnet. Umweltstressformen können im Allgemeinen in biotische und abiotische (umweltbedingte) Stressformen eingeteilt werden. Ungünstige Nährstoffbedingungen werden manchmal ebenfalls als ”Umweltstress” bezeichnet. Die vorliegende Erfindung betrachtet auch Lösungsansätze für diese Art von umweltbedingten Stressformen, z. B. im Hinblick auf eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz.
  • Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe ”gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Stress”, ”gesteigerte Resistenz gegenüber abiotischem Umweltstress”, ”gesteigerte Toleranz gegenüber Umweltstress”, ”verbesserte Anpassung an Umweltstress” und andere Variationen und Ausdrücke von ähnlicher Bedeutung austauschbar verwendet und beziehen sich, ohne Einschränkung, auf eine Verbesserung in der Toleranz gegenüber einer oder mehreren abiotischen Umweltstressform(en), wie hierin beschrieben und im Vergleich zu einer entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze oder einem Teil davon.
  • Der Begriff abiotische Stresstoleranz(en) bezeichnet zum Beispiel Niedertemperatur-Toleranz, Dürretoleranz oder verbesserte Wassernutzungseffizienz (WUE), Hitzetoleranz, Salzstress-Toleranz und andere. Untersuchungen der Antwort einer Pflanze auf Austrocknung, osmotischen Schock und Temperaturextreme werden ebenfalls angewandt, um die Toleranz oder Resistenz der Pflanze gegenüber abiotischen Stressformen zu bestimmen. Die Wassernutzungseffizienz (WUE) ist ein Parameter, der oft mit der Dürretoleranz korreliert ist. Beim Auswählen von Eigenschaften zur Verbesserung von Nutzpflanzen hätte eine Verringerung der Wasserverwendung, ohne Änderung beim Wachstum, einen besonderen Nutzen in einem bewässerten landwirtschaftlichen System, in welchem die Kosten des Wassereintrags hoch sind. Eine Erhöhung des Wachstums ohne einen entsprechenden sprunghaften Anstieg des Wasserverbrauchs wurde Anwendbarkeit bei allen landwirtschaftlichen Systemen linden. In vielen landwirtschaftlichen Systemen, bei denen die Wasserversorgung nicht limitierend ist, erhöht ein Anstieg des Wachstums, sogar wenn er auf Kosten einer Erhöhung des Wasserverbrauchs zu Stande käme, ebenfalls den Ertrag.
  • Dürrestress bedeutet jedweden Umweltstress, der zu einem Mangel an Wasser in Pflanzen oder zu einer Verminderung der Wasserzufuhr an Pflanzen führt, wobei ein sekundärer Stress durch niedrige Temperatur und/oder Salz, und/oder ein primärer Stress während der Dürre oder Hitze, z. B. Austrocknung etc., eingeschlossen ist.
  • Außer es ist anderslautend angegeben, sind die Begriffe ”Polynukleotide”, ”Nukleinsäure” und ”Nukleinsäuremolekül” im vorliegenden Kontext austauschbar. Außer es ist anderslautend angegeben, sind die Begriffe ”Peptid”, ”Polypeptid” und ”Protein” im vorliegenden Kontext austauschbar. Der Begriff ”Sequenz” kann sich auf Polynukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäuremoleküle, Peptide, Polypeptide und Proteine beziehen, abhängig von dem Kontext, in dem der Begriff ”Sequenz” verwendet wird. Die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden von beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide. Die Begriffe ”Gen(e)”, ”Polynukleotid”, ”Nukleinsäuresequenz”, ”Nukleotidsequenz” oder ”Nukleinsäuremolekül(e)”, wie hierin verwendet, schließen bekannte Typen von Modifikationen ein, zum Beispiel Methylierung, ”Caps”, Substitutionen von einem oder mehreren der natürlich vorkommender Nukleotide mit einem Analog. Vorzugsweise umfasst die DNA- oder RNA-Sequenz eine codierende Sequenz, welche das hierin definierte Polypeptid codiert.
  • Wie hierin ebenfalls verwendet, ist beabsichtigt, dass die Begriffe ”Nukleinsäure” und ”Nukleinsäuremolekül” DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) und Analoga der DNA oder RNA, die unter Verwendung von Nukleotidanalogen erzeugt werden, einschließen. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein.
  • Ein ”isoliertes” Nukleinsäuremolekül ist ein solches, das im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuremolekülen getrennt ist, welche in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind. Das bedeutet, dass andere Nukleinsäuremoleküle bei einer geringeren Menge als 5%, bezogen auf das Gewicht der Menge der gewünschten Nukleinsäure, vorzugsweise geringer als 2 Gew.-%, weiter bevorzugt geringer als 1 Gew.-%, am meisten bevorzugt geringer als 0,5 Gew.-%, vorhanden sind. Vorzugsweise ist eine ”isolierte” Nukleinsäure frei von einigen der Sequenzen, welche die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure abgeleitet ist, natürlicherweise flankieren (d. h. an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure gelegene Sequenzen). Zum Beispiel kann, in verschiedenen Ausführungsformen, das isolierte, ertragserhöhende, zum Beispiel für ein mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder Toleranz zusammenhängendes Protein codierende, Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, welche das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure abgeleitet ist, von Natur aus flankieren. Ferner kann ein ”isoliertes” Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, frei von einigem des anderen zellulären Materials, mit dem es natürlicherweise assoziiert ist, oder von Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder von chemischen Vorläufern oder sonstigen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird, sein.
  • Eine ”codierende Sequenz” ist eine Nukleotidsequenz, die in eine RNA, z. B. eine regulatorische RNA, wie eine miRNA, eine ta-siRNA, ein Cosuppressionsmolekül, eine RNAi, ein Ribozym, etc., oder in eine mRNA, die in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Steuerung von passenden regulatorischen Sequenzen gestellt wird, transkribiert wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden von einem Translations-Startcodon am 5'-Terminus und einem Translations-Stoppcodon am 3'-Terminus festgelegt. Eine codierende Sequenz kann, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, mRNA, cDNA, rekombinante Nukleotidsequenzen oder genomische DNA einschließen, wobei unter bestimmten Umständen auch Introns vorhanden sein können.
  • Wie im vorliegenden Kontext verwendet, kann ein Nukleinsäuremolekül auch die untranslatierte Sequenz beinhalten, welche am 3'- und am 5'-Ende der codierenden Genregion liegt, zum Beispiel 2000, vorzugsweise weniger, z. B. 500, vorzugsweise 200, besonders bevorzugt 100, Nukleotide der Sequenz stromaufwärts vom 5'-Ende der codierenden Region und zum Beispiel 300, vorzugsweise weniger, z. B. 100, vorzugsweise 50, besonders bevorzugt 20, Nukleotide der Sequenz stromabwärts vom 3'-Ende der codierenden Genregion.
  • ”Polypeptid” bezieht sich auf ein Aminosäurepolymer (Aminosäuresequenz) und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Moleküls. Daher sind Peptide und Oligopeptide innerhalb der Definition von Polypeptid eingeschlossen. Dieser Begriff betrifft oder beinhaltet auch posttranslationale Modifikationen des Polypeptids, zum Beispiel Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen. Innerhalb der Definition sind beispielsweise Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (einschließlich zum Beispiel unnatürlicher Aminosäuren, etc.), Polypeptide mit substituierten Bindungen sowie sonstige im Fachgebiet bekannte, sowohl natürlich vorkommende als auch nicht-natürlich vorkommende, Modifikationen inbegriffen. Ein ”isoliertes” Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül ist von anderen Polynukleotiden oder Nukleinsäuremolekülen getrennt, welche in der natürlichen Quelle des Nukleinsäuremoleküls vorhanden sind. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kann ein chromosomales Fragment von mehreren kb, oder vorzugsweise ein Molekül, das nur die codierende Region des Gens umfasst, sein. Demgemäß kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung chromosomale Regionen, welche 5' und 3' benachbart sind, oder weitere angrenzende chromosomale Regionen umfassen, aber umfasst vorzugsweise keine derartigen Sequenzen, welche natürlicherweise die Nukleinsäuremolekülsequenz im genomischen oder chromosomalen Zusammenhang in dem Organismus, aus welchem das Nukleinsäuremolekül stammt, flankieren (beispielsweise Sequenzen, welche angrenzend an die Regionen vorliegen, welche die 5'- und 3'-UTRs des Nukleinsäuremoleküls codieren). Ein ”isoliertes” oder ”gereinigtes” Polypeptid, oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon, ist frei von einigem des zellulären Materials, wenn es/er durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird, oder von chemischen Vorläufern oder sonstigen Chemikalien, wenn es/er chemisch synthetisiert wird. Der Ausdruck im Wesentlichen frei von zellulärem Material” schließt Präparationen eines Proteins ein, in denen das Polypeptid von einigen der zellulären Komponenten der Zellen, in denen es natürlicherweise oder rekombinant hergestellt wird, abgetrennt ist.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle I” oder ”Tabelle 1” ist als den Inhalt von Tabelle IA und Tabelle IB bezeichnend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle II” ist als den Inhalt von Tabelle IIA und Tabelle IIB bezeichnend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IA” ist als den Inhalt von Tabelle IA bezeichnend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IB” ist als den Inhalt von Tabelle IB bezeichnend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IIA” ist als den Inhalt von Tabelle IIA bezeichnend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle IIB” ist als den Inhalt von Tabelle IIB bezeichnend aufzufassen.
  • Die Begriffe ”umfassen” oder ”umfassend” und grammatikalische Variationen davon, falls in dieser Beschreibung verwendet, verstehen sich zur Bezeichnung des Vorliegens der angegebenen Merkmale, ganzen Zahlen, Schritte oder Komponenten oder Gruppen davon, aber schließen das Vorliegen oder die Hinzufügung von einem oder mehreren anderen Merkmalen, ganzen Zahlen, Schritten, Komponenten oder Gruppen davon nicht aus.
  • In Übereinstimmung mit der Erfindung weist ein Protein oder Polypeptid die ”Aktivität von einem Protein, wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigt” auf, wenn seine De-novo-Aktivität oder seine erhöhte Expression direkt oder indirekt zu erhöhtem Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischen Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperatur-Toleranz und/oder einem erhöhten Nährstoffverwertungseffizienzgrad, intrinsischen Ertrag und/oder einer anderen erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, führt und diesen vermittelt, und das Protein die oben erwähnten Aktivitäten eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigt, aufweist.
  • Überall in der Beschreibung ist die Aktivität oder vorzugsweise die biologische Aktivität eines solchen Proteins oder Polypeptides oder eines/einer Nukleinsäuremoleküls oder -sequenz, welche(s) ein solches Protein oder Polypeptid codiert, identisch oder ähnlich, wenn sie noch die biologische oder enzymatische Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigt, besitzt, oder wobei sie 10% oder mehr der originalen enzymatischen Aktivität, vorzugsweise 20%, 30%, 40%, 50%, besonders bevorzugt 60%, 70%, 80%, am speziellsten bevorzugt 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr, im Vergleich zu einem Protein, wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigt, von S. cerevisiae oder E. coli oder Synechocystis sp. oder A. thaliana, besitzt.
  • In einer anderen Ausführungsform weist die biologische oder enzymatische Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigt, 100% oder mehr der originalen enzymatischen Aktivität, vorzugsweise 110%, 120%, 130%, 150%, besonders bevorzugt 150%, 200%, 300% oder mehr, im Vergleich zu einem Protein, wie in Tabelle II, Spalte 3 gezeigt, von S. cerevisiae oder E. coli oder Synechocystis sp. oder A. thaliana auf.
  • Die Begriffe ”erhöht”, ”angehoben”, ”erweitert”, ”gesteigert”, ”verbessert” oder ”verstärkt” beziehen sich auf eine entsprechende Veränderung einer Eigenschaft in einer Pflanze, einem Organismus, einem Teil eines Organismus, wie einem Gewebe, Samen, Wurzel, Blatt, Blüte, etc., oder in einer Zelle und sind austauschbar. Vorzugsweise wird die Gesamt-Aktivität hinsichtlich des Volumens erhöht oder gesteigert in Fällen, wenn die Erhöhung oder Steigerung mit der Erhöhung oder Steigerung einer Aktivität eines Genprodukts zusammenhängt, und zwar unabhängig davon, ob die Menge an Genprodukt oder die spezifische Aktivität des Genprodukts, oder beides, erhöht oder gesteigert wird, oder ob die Menge, Stabilität oder Translationseffizienz der Nukleinsäuresequenz oder des Gens, welche(s) für das Genprodukt codiert, erhöht oder gesteigert wird.
  • Die Begriffe ”Erhöhung” beziehen sich auf eine entsprechende Veränderung einer Eigenschaft eines Organismus oder in einem Teil einer Pflanze, einem Organismus, wie etwa einem Gewebe, Samen, Wurzel, Blatt, Blüte, etc., oder in einer Zelle. Vorzugsweise wird die Gesamtaktivität im Volumen in Fällen erhöht, wo die Erhöhung mit der Erhöhung einer Aktivität eines Genprodukts zusammenhängt, und zwar unabhängig davon, ob die Menge an Genprodukt oder die spezifische Aktivität des Genprodukts oder beides erhöht oder herbeigeführt wird, oder ob die Menge, Stabilität oder Translationseffizienz der Nukleinsäuresequenz oder des Gens, welche(s) für das Genprodukt codiert, erhöht wird. Die Begriffe ”Erhöhung” schließen die Veränderung der Eigenschaft nur in Teilen des Subjekts der vorliegenden Erfindung ein, zum Beispiel kann die Modifikation in einem Kompartiment einer Zelle, wie einer Organelle, oder in einem Teil einer Pflanze, wie Gewebe, Samen, Wurzel, Blatt, Blüte etc., zu finden sein, aber ist nicht nachweisbar, wenn das gesamte Subjekt, d. h. die ganze Zelle oder Pflanze, getestet wird. Folglich bedeutet der Begriff ”Erhöhung”, dass die spezifische Aktivität eines Enzyms sowie die Menge einer Verbindung oder eines Metaboliten, z. B. eines Polypeptides, eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder einer codierenden mRNA oder DNA, in einem Volumen erhöht sein können. Der Begriff ”Erhöhen” beinhaltet, dass eine Verbindung oder eine Aktivität, speziell eine Aktivität, in eine Zelle, das Cytoplasma oder ein subzelluläres Kompartiment oder eine Organelle de novo eingebracht wird oder dass die Verbindung oder die Aktivität, speziell eine Aktivität, zuvor nicht detektiert worden ist, mit anderen Worten ”herbeigeführt” wird. Demgemäß umfasst der Begriff ”Erhöhen” im Folgenden auch den Begriff ”Herbeiführen” oder ”Stimulieren”. Die erhöhte Aktivität manifestiert sich in einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einem erhöhten Nährstoffverwertungseffizienzgrad, intrinsischen Ertrag und/oder einer anderen erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon.
  • Unter ”Veränderung einer Eigenschaft” versteht man, dass die Aktivität, die Expressionshöhe oder die Menge von einem Genprodukt oder der Metabolitgehalt in einem spezifischen Volumen im Vergleich zu einem entsprechenden Volumen einer Kontrolle, einer Referenz oder eines Wildtyps verändert wird, wobei eine De-novo-Herbeiführung der Aktivität oder Expression eingeschlossen ist.
  • Es versteht sich, dass ”Menge an Protein oder mRNA” die Molekülzahl von Polypeptiden oder mRNA-Molekülen in einem Organismus, insbesondere einer Pflanze, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment bedeutet. ”Erhöhen” der Menge eines Proteins bedeutet die quantitative Erhöhung der Molekülzahl des Proteins in einem Organismus, insbesondere einer Pflanze, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment, wie etwa einer Organelle, wie einer Plastide oder Mitochondrien oder einem Teil davon – zum Beispiel durch eines der hierin nachstehend beschriebenen Verfahren – im Vergleich zu einem Wildtyp, einer Kontrolle oder einer Referenz.
  • Die Erhöhung der Molekülzahl beträgt vorzugsweise 1% oder mehr, vorzugsweise 10% oder mehr, weiter bevorzugt 30% oder mehr, besonders bevorzugt 50%, 70% oder mehr, ganz besonders bevorzugt 100%, am meisten bevorzugt 500% oder mehr. Allerdings wird auch eine De-novo-Expression als Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrachtet.
  • Die Begriffe ”Wildtyp”, ”Kontrolle” oder ”Referenz” sind austauschbar und können eine Zelle oder ein Teil von Organismen, wie eine Organelle, wie ein Chloroplast, oder ein Gewebe, oder ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, sein, welche(r) nicht gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren nach der Erfindung modifiziert oder behandelt wurde. Folglich entspricht die Zelle oder ein Teil von Organismen, wie eine Organelle, wie ein Chloroplast oder ein Gewebe, oder ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, welche(r) als Wildtyp, Kontrolle oder Referenz verwendet wird, bestmöglich der Zelle, dem Organismus, der Pflanze oder dem Teil davon und ist hinsichtlich jeglicher anderen Eigenschaft, außer hinsichtlich des Ergebnisses des Verfahrens der Erfindung, so identisch wie möglich zum erfindungsgemäßen Subjekt. Somit wird der Wildtyp, die Kontrolle oder die Referenz identisch oder so identisch wie möglich behandelt, was bedeutet, dass nur Bedingungen oder Eigenschaften unterschiedlich sein könnten, welche die Qualität der getesteten Eigenschaft nicht beeinflussen.
  • Vorzugsweise wird jedweder Vergleich unter analogen Bedingungen durchgeführt. Der Begriff ”analoge Bedingungen” bedeutet, dass alle Bedingungen, wie zum Beispiel Kultur- oder Wachstumsbedingungen, Erdboden, Nährstoff, Wassergehalt des Bodens, Temperatur, Feuchtigkeit oder umgebende Luft oder Erde, Assaybedingungen (wie Pufferzusammensetzung, Temperatur, Substrate, Pathogenstamm, Konzentrationen und dergleichen) zwischen den zu vergleichenden Experimenten identisch gehalten werden.
  • Bei der ”Referenz”, ”Kontrolle” oder dem ”Wildtyp” handelt es sich vorzugsweise um ein Subjekt, z. B. eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe, einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, welche nicht gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren der Erfindung modifiziert oder behandelt wurde und hinsichtlich jeglicher anderen Eigenschaft so ähnlich wie möglich zum erfindungsgemäßen Subjekt bzw. Gegenstand der Erfindung ist. Die Referenz, die Kontrolle oder der Wildtyp ist hinsichtlich ihres/seines Genoms, Transkriptoms, Proteoms oder Metaboloms so ähnlich wie möglich zum Subjekt der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise betrifft der Begriff ”Referenz”-, ”Kontroll”- oder ”Wildtyp”-organelle, -zelle, -gewebe oder -organismus, insbesondere -pflanze, eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus, insbesondere eine Pflanze, welche(r) zu der Organelle, der Zelle, dem Gewebe oder dem Organismus, insbesondere der Pflanze, der vorliegenden Erfindung oder einem Teil davon nahezu genetisch identisch ist, und zwar vorzugsweise zu 90% oder mehr, z. B. 95%, weiter bevorzugt 98%, noch weiter bevorzugt 99,00%, insbesondere 99,10%, 99,30%, 99,50%, 99,70%, 99,90%, 99,99%, 99,999% oder mehr. Am meisten bevorzugt ist die ”Referenz”, die ”Kontrolle” oder der ”Wildtyp” ein Subjekt, z. B. eine Organelle, eine Zelle, ein Gewebe, ein Organismus, insbesondere eine Pflanze, welche genetisch identisch zu dem Organismus, insbesondere der Pflanze, der Zelle, einem Gewebe oder einer Organelle ist, welche(r) gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, außer dass die verantwortlichen oder Aktivität vermittelnden Nukleinsäuremoleküle oder das von ihnen codierte Genprodukt gemäß dem Verfahren der Erfindung verändert, manipuliert, ausgetauscht oder eingebracht werden. In dem Fall, dass eine Kontrolle, eine Referenz oder ein Wildtyp, die sich von dem Subjekt der vorliegenden Erfindung nur darin unterschieden, dass sie nicht Objekt des Verfahrens der Erfindung sind, nicht bereitgestellt werden können, kann es sich bei einer Kontrolle, einer Referenz oder einem Wildtyp um einen Organismus handeln, in welchem die Ursache für die Modulation einer Aktivität, welche die gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder den erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon vermittelt, oder die Expression des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, wie hierin beschrieben, zurück- oder abgeschaltet worden ist, z. B. durch Knockout der Expression des verantwortlichen Genprodukts, z. B. durch Antisense- oder RNAi- oder miRNA-Inhibition, durch Inaktivieren eines Aktivators oder Agonisten, durch Aktivieren eines Inhibitors oder Antagonisten, durch Inhibition mittels Hinzusetzen inhibitorischer Antikörper, durch Hinzusetzen aktiver Verbindungen, wie z. B. Hormonen, durch Einbringen von negativ-dominanten Mutanten, etc. Eine Genproduktion kann zum Beispiel durch Einbringen von inaktivierenden Punktmutationen ausgeknockt werden, welche zu einer Inhibition von enzymatischer Aktivität oder zu einer Destabilisierung oder einer Inhibition der Fähigkeit zum Binden an Cofaktoren etc. führen. Demgemäß ist ein bevorzugtes Referenzsubjekt das Ausgangssubjekt des vorliegenden Verfahrens der Erfindung. Vorzugsweise werden die Referenz und das Subjekt der Erfindung nach Standardisieren und Normalisieren, z. B. bezüglich der Menge an Gesamt-RNA, DNA oder Protein, oder der Aktivität oder Expression von Referenzgenen, wie Haushaltsgenen, wie Ubiquitin, Aktin oder ribosomalen Proteinen, verglichen.
  • Der Begriff ”Expression” bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation eines codogenen Gensegments oder Gens. In der Regel ist das resultierende Produkt eine mRNA oder ein Protein.
  • Die Erhöhung oder Modulation gemäß dieser Erfindung kann konstitutiv sein, z. B. aufgrund einer stabilen permanenten transgenen Expression oder einer stabilen Mutation in dem entsprechenden endogenen Gen, welches das Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert, oder einer Modulation der Expression oder des Verhaltens eines Gens, das die Expression des Polypeptids der Erfindung vermittelt, oder kann transient sein, z. B. aufgrund einer transienten Transformation oder einer vorübergehenden Hinzusetzung eines Modulators, wie eines Agonisten oder Antagonisten, oder kann induzierbar sein, z. B. nach Transformation mit einem induzierbaren Konstrukt, welches das Nukleinsäuremolekül der Erfindung unter der Steuerung eines induzierbaren Promotors trägt, und Zusetzen des Induktors, z. B. Tetracyclin, oder wie hierin nachstehend beschrieben.
  • Es versteht sich, dass ein geringerer Einfluss auf die Regulierung eines Gens oder seines Genprodukts eine verminderte Regulierung der enzymatischen Aktivität bedeuten soll, welche zu einer erhöhten spezifischen oder zellulären Aktivität des Gens oder seines Produkts führt. Es versteht sich, dass eine Erhöhung der enzymatischen Aktivität eine enzymatische Aktivität bedeutet, welche um. 10% oder mehr, in vorteilhafter Weise 20%, 30% oder 40% oder mehr, besonders vorteilhaft um 50%, 60% oder 70% oder mehr im Vergleich zum Ausgangs-Organismus erhöht ist. Dies führt zu erhöhtem Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einem erhöhten Nährstoffverwertungseffizienzgrad, intrinsischen Ertrag und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze oder einem Teil davon.
  • Die Erhöhung in der Aktivität des Polypeptids beträgt in einer Zelle, einem Gewebe, einer Organelle, einem Organ oder einem Organismus, vorzugsweise einer Pflanze oder einem Teil davon, vorzugsweise 5% oder mehr, bevorzugt 20% oder 50%, besonders bevorzugt 74%, 80%, 90% oder mehr, ganz besonders bevorzugt 100%, 150% oder 200%, am meisten bevorzugt 250% oder mehr im Vergleich zur Kontrolle, zur Referenz oder zum Wildtyp. In einer Ausführungsform bedeutet der Begriff Erhöhung die Erhöhung in der Menge im Verhältnis zum Gewicht des Organismus oder des Teils davon (w/w).
  • Mit ”Vektoren” sind, neben Plasmiden, alle sonstigen Vektoren gemeint, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA. Diese Vektoren können autonom in dem Wirtsorganismus repliziert werden oder chromosomal repliziert werden, wobei die chromosomale Replikation bevorzugt wird. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, das zum Transportieren einer anderen Nukleinsäure fähig ist, an die es verknüpft worden ist. Ein Typ von Vektor ist ein ”Plasmid”, was sich auf einen zirkulären doppelsträngigen DNA-Ring bezieht, in den zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein anderer Typ von Vektor ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle fähig, in die sie eingeführt werden (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugervektoren) werden nach der Einbringung in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle oder einer Organelle integriert und werden dadurch gemeinsam mit dem Wirts- oder Organellengenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren in der Lage zum Steuern der Expression von Genen, an welche sie operativ verknüpft sind. Derartige Vektoren werden hierin als ”Expressionsvektoren” bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren mit Anwendbarkeit in rekombinanten DNA-Techniken oft in der Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können ”Plasmid” und ”Vektor” austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form von Vektor ist. Allerdings ist beabsichtigt, dass die Erfindung solche anderen Formen von Expressionsvektoren, wie virale Vektoren (z. B. replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren), welche äquivalente Funktionen erfüllen, einschließt.
  • Wie hierin verwendet, soll ”operativ verknüpft” bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse an die regulatorischen Sequenz(en) auf eine Weise verknüpft ist, welche die Expression der Nukleotidsequenz (z. B. in einem In-vitro-Transkription/Translations-System oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist) zulässt. Der Begriff ”regulatorische Sequenz” soll beabsichtigermaßen Promotoren, Enhancer und andere Expressionssteuerungselemente (z. B. Polyadenylierungs-Signale) einschließen. Solche regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), sowie Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Hrsg. Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, CRC Press; Boca Raton, Florida, einschließlich der Referenzstellen darin, beschrieben. Regulatorische Sequenzen schließen jene ein, welche eine konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Typen von Wirtszellen steuern, und jene, welche die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen oder unter bestimmten Bedingungen steuern.
  • ”Transformation” ist hierin als ein Verfahren zur Einbringung heterologer DNA in eine Pflanzenzelle, ein Pflanzengewebe oder eine Pflanze definiert. Sie kann unter natürlichen oder künstlichen Bedingungen mit Hilfe verschiedener im Fachgebiet allgemein bekannter Verfahren erfolgen. Transformation kann auf jeglichem bekannten Verfahren zur Insertion von Fremd-Nukleinsäuresequenzen in eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle beruhen. Das Verfahren wird basierend auf der zu transformierenden Wirtszelle gewählt und kann, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, virale Infektion, Elektroporation, Lipofektion und Teilchen-Beschuss einschließen. Derartige ”transformierte” Zellen schließen stabil transformierte Zellen ein, in denen die eingeführte DNA zur Replikation entweder als ein autonom replizierendes Plasmid oder als Teil des Wirtschromosoms fähig ist. Sie schließen ebenfalls Zellen ein, welche die inserierte DNA oder RNA transient für begrenzte Zeitperioden exprimieren. Es versteht sich, dass transformierte Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen nicht nur das Endprodukt eines Transformationsverfahrens, sondern auch transgene Nachkommen davon einschließen.
  • Die Begriffe ”transformiert,” ”transgen” und ”rekombinant” beziehen sich auf einen Wirtsorganismus, wie ein Bakterium oder eine Pflanze, in welche ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingebracht worden ist. Das Nukleinsäuremolekül kann stabil in das Genom des Wirtes integriert sein, oder das Nukleinsäuremolekül kann auch als ein extrachromosomales Molekül vorhanden sein. Ein solches extra-chromosomales Molekül kann autoreplizierend sein. Es versteht sich, dass transformierte Zellen, Gewebe oder Pflanzen nicht nur das Endprodukt eines Transformationsverfahrens, sondern auch transgene Nachkommen davon einschließen. Ein ”nicht-transformierter”, ”nicht-transgener” oder ”nicht-rekombinanter” Wirt bezeichnet einen Wildtyp-Organismus, z. B. ein Bakterium oder eine Pflanze, welcher das heterologe Nukleinsäuremolekül nicht enthält.
  • Die Begriffe ”Wirtsorganismus”, ”Wirtszelle”, ”rekombinanter (Wirts-)Organismus” und ”transgene (Wirts-)Zelle” werden hier austauschbar benutzt. Selbstverständlich betreffen diese Begriffe nicht nur den jeweiligen Wirtsorganismus oder die jeweilige Zielzelle, sondern auch die Abkömmlinge oder potentiellen Nachkommen dieser Organismen oder Zellen. Da aufgrund von Mutation oder umweltbedingten Effekten bestimmte Modifikationen in nachfolgenden Generationen entstehen können, müssen diese Abkömmlinge nicht notwendigerweise identisch mit der parentalen Zelle sein, aber werden nichtsdestoweniger noch von dem Begriff, wie hier verwendet, eingeschlossen.
  • Für die Zwecke der Erfindung bedeutet ”transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Bezug auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäurekonstrukt) oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung enthält, oder einen Organismus, der durch die Nukleinsäuresequenzen, die Expressionskassette oder den Vektor gemäß der Erfindung transformiert ist, wobei alle diese Konstruktionen durch gentechnische Verfahren hergestellt werden, wobei entweder
    • (a) die Nukleinsäuresequenz, die in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 aufgeführt ist, oder ihre Derivate oder Teile davon; oder
    • (b) eine genetische Steuerungssequenz, die funktionell mit der unter (a) beschriebenen Nukleinsäuresequenz verbunden ist, zum Beispiel eine 3'- und/oder 5'- genetische Steuerungssequenz, wie ein Promotor oder Terminator, oder
    • (c) (a) und (b);
    nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung vorgefunden werden oder durch gentechnische Verfahren modifiziert worden sind, wobei die Modifikation zum Beispiel eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten sein kann.
  • ”Natürliche genetische Umgebung” bedeutet den natürlichen genomischen oder chromosomalen Lokus bzw. Genort im Herkunftsorganismus oder innerhalb des Wirtsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise wenigstens noch zum Teil bewahrt. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz mindestens auf einer Seite und besitzt eine Sequenzlänge von mindestens 50 Bp, vorzugsweise mindestens 500 Bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 Bp, sehr stark bevorzugt mindestens 5000 Bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung mit dem entsprechenden Gen – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn letztere durch unnatürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren, wie zum Beispiel eine Mutagenisierung, modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind beispielsweise in US 5 565 350 oder der WO 00/15815 beschrieben.
  • Der gemäß der Erfindung verwendete Begriff ”transgene Pflanzen” bezieht sich auch auf die Nachkommen einer transgenen Pflanze, zum Beispiel die T1, T2, T3 und nachfolgenden Pflanzengenerationen, oder die BC1, BC2, BC3 und nachfolgenden Pflanzengenerationen. So können die transgenen Pflanzen gemäß der Erfindung herangezogen und geselbstet oder mit anderen Individuen gekreuzt werden, um weitere transgene Pflanzen gemäß der Erfindung zu erhalten. Transgene Pflanzen können auch durch vegetatives Vermehren von transgenen Pflanzenzellen erhalten werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls transgenes Pflanzenmaterial, das aus einer transgenen Pflanzenpopulation gemäß der Erfindung abgeleitet werden kann. Derartiges Material schließt Pflanzenzellen und bestimmte Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in all ihren Manifestationen ein, wie etwa Samen, Blätter, Antheren, Fasern, Knollen, Wurzeln, Wurzelhaare, Stängel bzw. Halme, Embryo, Calli, Kotyledonen, Petiolen, geerntetes Material, Pflanzengewebe, Fortpflanzungsgewebe und Zellkulturen, welche aus der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet sind und/oder zum Hervorbringen der transgenen Pflanze verwendet werden können. Jedwede gemäß der Erfindung erhaltene transformierte Pflanze kann in einem herkömmlichen Züchtungsschema oder in einer In-vitro-Pflanzenvermehrung verwendet werden, um mehr transformierte Pflanzen mit den gleichen Charakteristika herzustellen, und/oder kann verwendet werden, um das gleiche Charakteristikum in anderen Varietäten derselben oder einer verwandten Spezies einzuführen. Derartige Pflanzen sind ebenfalls Teil der Erfindung. Aus den transformierten Pflanzen erhaltene Samen enthalten genetisch ebenfalls dasselbe Charakteristikum und sind Teil der Erfindung. Wie zuvor erwähnt, ist die vorliegende Erfindung im Prinzip auf jede Pflanze und Nutzpflanze anwendbar, welche mit einem beliebigen der, dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten, Transformationsverfahren transformiert werden kann.
  • Der Begriff ”Homologie” bedeutet, dass die jeweiligen Nukleinsäuremoleküle oder codierten Proteine funktionell und/oder strukturell äquivalent sind. Die Nukleinsäuremoleküle, welche zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen homolog sind und welche Derivate der Nukleinsäuremoleküle sind, sind beispielsweise Variationen der Nukleinsäuremoleküle, welche Modifikationen mit der gleichen biologischen Funktion repräsentieren, insbesondere Proteine mit der gleichen oder im Wesentlichen der gleichen biologischen Funktion codieren. Sie können natürlich vorkommende Variationen, wie Sequenzen aus anderen Pflanzenvarietäten oder -spezies, oder Mutationen sein. Diese Mutationen können natürlich vorkommen oder sie können durch Mutagenesetechniken erhalten werden. Die allelischen Variationen können natürlich vorkommende allelische Varianten sowie synthetisch hergestellte oder gentechnisch erzeugte Varianten sein. Strukturäquivalente können beispielsweise durch Testen der Bindung des Polypeptids an Antikörper oder durch computergestützte Vorhersagen identifiziert werden. Strukturäquivalente weisen ähnliche immunologische Charakteristika auf, wobei sie zum Beispiel ähnliche Epitope umfassen.
  • Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe ”Gen” und ”rekombinantes Gen” auf Nukleinsäuremoleküle, die einen offenen Leserahmen umfassen, der das Polypeptid der Erfindung codiert oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst oder das Polypeptid codiert, das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, vorzugsweise aus einer Nutzpflanze oder aus einem Mikroorgansimus, der für das Verfahren der Erfindung brauchbar ist. Derartige natürliche Variationen können typischerweise zu einer Varianz von 1 bis 5% in der Nukleotidsequenz des Gens führen. Jegliche und alle derartigen Nukleotidvariationen und resultierenden Aminosäurepolymorphismen in Genen, die ein Polypeptid der Erfindung codieren oder ein/das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfassen, welche das Ergebnis von natürlicher Variation sind und welche die funktionelle Aktivität, wie beschrieben, nicht verändern, liegen beabsichtigtermaßen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
  • Spezifische Ausführungsformen
  • Folglich stellt diese Erfindung Maßnahmen und Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag bereit, z. B. Gene, die eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperatur-Toleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder eine andere mit erhöhtem Ertrag zusammenhängende Eigenschaft, nach Expression oder Überexpression vermitteln. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Gene bereit, die aus Pflanzen abgeleitet sind. Im speziellen sind Gene aus Pflanzen in der Spalte 5 sowie in Spalte 7 der Tabellen I oder II beschrieben.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen, welche eine oder mehrere verbesserte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu der entsprechenden Ursprungs- oder der Wildtyp-Pflanze zeigen, sowie Verfahren zur Herstellung derartiger transgener Pflanzen mit erhöhtem Ertrag bereit. Ein oder mehrere, mit gesteigertem Ertrag zusammenhängende, Phänotypen werden gemäß der Erfindung durch das Erhöhen oder Herbeiführen einer oder mehrerer Aktivitäten in der transgenen Pflanze, wobei die Aktivität aus der Gruppe bestehend aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein ausgewählt ist, in einem subzellulären Kompartiment und/oder einem Gewebe der Pflanze erhöht, welches hierin, z. B. in Tabelle I, Spalte 6, aufgeführt ist.
  • Das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, oder das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, codiert ein Protein, welches eine Aktivität vermittelt, gewählt aus der Gruppe bestehend aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein, d. h. welches eine ”ertragserhöhende Aktivität” vermittelt. Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit einer ertragserhöhenden Aktivität codiert, welches von einer Nukleinsäuresequenz, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 gezeigt, codiert wird und/oder welches ein Protein ist, umfassend oder bestehend aus einem Polypeptid, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 aufgeführt, und/oder das mit dem in Tabelle III, Spalte 7 gezeigten Primersatz amplifiziert werden kann.
  • Das Erhöhen oder Herbeiführen von einer oder mehreren der ”Aktivitäten” wird zum Beispiel durch die Erhöhung der Aktivität oder der Menge, in einer Zelle oder einem Teil davon, von einem oder mehreren Expressionsprodukten des Nukleinsäuremoleküls, z. B. Proteinen, oder durch eine De-novo-Expression, d. h. durch das Herbeiführen der ”Aktivität” in der Pflanze, vermittelt.
  • In einer Ausführungsform werden eine oder mehrere der ertragserhöhenden Aktivitäten durch das Erhöhen der Menge und/oder der spezifischen Aktivität von einem oder mehr, in der Tabelle I, Spalte 5 oder 7 aufgelisteten, Proteinen in einem in der Tabelle I, Spalte 6 aufgeführten Kompartiment einer Zelle erhöht.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Ertrag der Pflanze der Erfindung durch Verbessern einer oder mehrerer der ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin definiert, erhöht. Der erhöhte Ertrag gemäß der vorliegenden Erfindung kann typischerweise durch Steigern oder Verbessern, im Vergleich zu einer Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze, von einer oder mehreren ertragsbezogenen Eigenschaften der Pflanze erzielt werden. Derartige ertragsbezogene Eigenschaften einer Pflanze, deren Verbesserung zu einem erhöhten Ertrag führt, umfassen, ohne Einschränkung darauf, die Erhöhung der intrinsischen Ertragskapazität einer Pflanze, eine verbesserte Nährstoffverwertungseffizienz und/oder erhöhte Stresstoleranz.
  • In einer Ausführungsform bezieht sich ein erhöhter Ertrag, überall in der Beschreibung, auf einen erhöhten intrinsischen Ertrag.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 23 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 22 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert, ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Arabidopsis thaliana abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 22 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 23 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Pyruvatkinase” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 22 oder SEQ ID NR: 23, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung plastidisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,344-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1031 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 1030 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, des aus Azotobacter vinelandii abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 1030 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 1031 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”50S-Ribosomenprotein L36” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 1030 oder SEQ ID NR: 1031, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,367-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1784 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 1783 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Escherichia coli abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 1783 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 1784 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 1783 oder SEQ ID NR: 1784, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,480-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1959 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 1958 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Escherichia coli abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 1958 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 1959 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen, z. B. ein Nukleinsäuremolekül, welches von der SEQ ID NR: 1958 durch Austauschen des Stoppcodons TAA durch TGA abweicht. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Tellurit-Resistenz-Protein” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 1958 oder SEQ ID NR: 1959, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,402-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt. Das Nukleinsäuremolekül kann von der SEQ ID NR: 1958 zum Beispiel durch den Austausch des Stoppcodons TAA durch TGA abweichen.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2022 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 2021 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Escherichia coli abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 2021 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 2022 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Kohlenstoffspeicherungsregulator” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 2021 oder SEQ ID NR: 2022, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,468-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2375 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend des in SEQ ID NR: 2374 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Escherichia coli abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 2374 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 2375 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Xanthin-Permease” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 2374 oder SEQ ID NR: 2375, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,514-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2676 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend des in SEQ ID NR: 2675 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Escherichia coli abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 2675 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 2676 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Phosphat-Transporter-Untereinheit” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 2675 oder SEQ ID NR: 2676, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,326-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, des in SEQ ID NR: 3154 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 3153 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 3153 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 3154 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”YAR047C-Protein” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3153 oder SEQ ID NR: 3154, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Tel davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung plastidisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,220-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3158 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 3157 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 3157 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 3158 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”mitochondrialer Präkursor von Lon-Protease-Homolog” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3157 oder SEQ ID NR: 3158, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,337-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3269 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 3268 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 3268 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 3269 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen, z. B. ein Nukleinsäuremolekül, welches von der SEQ ID NR: 3268 durch Austauschen des Stoppcodons TAG durch TAA abweicht. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Calmodulin” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3268 oder SEQ ID NR: 3269, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,203-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt. Das Nukleinsäuremolekül kann von der SEQ ID NR: 3268 durch den Austausch des Stoppcodons TAG durch TAA abweichen.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3883 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 3882 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 3882 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 3883 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt, wenn die Aktivität ”Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3882 oder SEQ ID NR: 3883, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird.
  • Es wurde festgestellt, dass die Erhöhung sowohl bei cytoplasmatischer als auch plastidischer Expression einer Expressionskassette auftritt, welche das Nukleinsäuremolekül, wie in SEQ ID Nr.: 3882 gezeigt, umfasst.
  • Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,522-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, als Ergebnis einer nicht-zielgelenkten Expression eines in SEQ ID NR: 3882 gezeigten Nukleinsäuremoleküls, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,232-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen (intrinsischer Ertrag), z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, als Ergebnis einer zielgelenkten Expression eines in SEQ ID NR: 3882 gezeigten Nukleinsäuremoleküls, das funktionell an ein Transitpeptid codierende Sequenz verknüpft ist oder anderweitig in den Plastiden der Zelle exprimiert wird, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Es wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Gens, das in Tabelle VIIId gezeigt ist, z. B. das Exprimieren eines Polypeptids, abgeleitet aus dem in Tabelle VIIId gezeigten Nukleinsäuremolekül in A. thaliana, eine Erhöhung des intrinsischen Ertrags, z. B. eine erhöhte Biomasse unter Standardbedingungen, wie erhöhte Biomasse unter Nicht-Mangel- oder Nicht-Stress-Bedingungen, im Vergleich zu der Referenz oder Wildtypkontrolle, vermittelte. So wird, in einer Ausführungsform, ein in Tabelle VIIId aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen Homolog, wie in Tabelle I aufgeführt, oder dessen Expressionsprodukt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Erhöhen des intrinsischen Ertrags, z. B. zum Erhöhen des Ertrags unter Standardbedingungen, z. B. zum Erhöhen der Biomasse unter Nicht-Mangel- oder Nicht-Stress-Bedingungen, der Pflanze im Vergleich zur Wildtypkontrolle verwendet.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3949 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 3948 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert, ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 3948 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 3949 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3948 oder SEQ ID NR: 3949, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,172-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, Z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3993 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 3992 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 3992 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 3993 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”MutS-Protein-Homolog” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3992 oder SEQ ID NR: 3993, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,178-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4293 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 4292 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 4292 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 4293 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Protein EFR3” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 4292 oder SEQ ID NR: 4293, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,358-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend des Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4323 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 4322 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 4322 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 4323 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”FK506-bindendes Protein” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 4322 oder SEQ ID NR: 4323, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,164-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4779 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 4778 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 4778 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 4779 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”autophagiebezogenes Protein” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 4778 oder SEQ ID NR: 4779, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,399-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4805 oder SEQ ID NR: 4837 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 4804 oder SEQ ID NR: 4836 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Arabidopsis thaliana abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 4804 oder 4836 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 4805 oder SEQ ID NR: 4837 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Hitzestress-Transkriptionsfaktor” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 4804 oder SEQ ID NR: 4836 oder SEQ ID NR: 4805 oder SEQ ID NR: 4837, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,217-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt. In einem Beispiel wird ein Polynukleotid, z. B. eine Expressionskassette, umfassend SEQ ID NR: 4836, oder codierend für SEQ ID NR: 4837, oder ein Homolog davon, wie hierin beschrieben, z. B. mit einer Identität von 70%, 80%, 90%, 95% 97%, oder 99% zu SEQ ID NR: 4836 oder SEQ ID NR: 4837, verwendet, wie hierin beschrieben.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4843 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 4842 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Escherichia coli abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 4842 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 4843 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”B0050-Protein” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 4842 oder SEQ ID NR: 4843, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,134-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 5242 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 5241 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Glycine max abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 5241 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 5242 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”GM02LC38418-Protein” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 5241 oder SEQ ID NR: 5242, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,369-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 5275 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 5274 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 5274 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 5275 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”26S-Proteasom-Untereinheit” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder des Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 5274 oder SEQ ID NR: 5275, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,215-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 5975 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 5974 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 5974 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 5975 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”mitochondrialer Präkursor von Lon-Protease-Homolog” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 5974 oder SEQ ID NR: 5975, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,337-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 6080 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 6079 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 6079 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 6080 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder II, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 6079 oder SEQ ID NR: 6080, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird.
  • Es wurde festgestellt, dass die Erhöhung sowohl bei cytoplasmatischer als auch plastidischer Expression einer Expressionskassette auftritt, welche das Nukleinsäuremolekül, wie in SEQ ID Nr.: 3882 gezeigt, umfasst.
  • Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,522-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, als Ergebnis einer nicht-zielgelenkten Expression eines in SEQ ID NR: 6079 gezeigten Nukleinsäuremoleküls, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Vorzugsweise tritt die Erhöhung plastidisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,232-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, als Ergebnis einer zielgelenkten Expression eines in SEQ ID NR: 6079 gezeigten Nukleinsäuremoleküls, das funktionell an ein Transitpeptid codierende Sequenz verknüpft ist, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 6146 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 6145 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 6145 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 6146 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 6145 oder SEQ ID NR: 6146, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,172-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhten intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 5942 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 5941 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Glycine max abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 5941 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 5942 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhter intrinsischer Ertrag, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”GM02LC38418-Protein” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 5941 oder SEQ ID NR: 5942, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,369-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. in Abwesenheit von Nährstoffmangel und/oder Stressbedingungen, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Es wurde ferner beobachtet, dass das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines in Tabelle VIIIc gezeigten Gens, z. B. eines Nukleinsäuremoleküls, das aus dem in Tabelle VIIIc gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleitet ist, in A. thaliana eine erhöhte Stresstoleranz, z. B. erhöhte Toleranz gegen periodische Dürre, im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle vermittelte. Daher wird, in einer Ausführungsform, ein in Tabelle VIIIc aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen Homolog, wie in Tabelle I aufgeführt, oder das Expressionsprodukt, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Erhöhen von Stresstoleranz, z. B. zum Erhöhen von Toleranz gegen periodische Dürre, einer Pflanze im Vergleich zur Wildtypkontrolle verwendet.
  • Die Toleranz einer Pflanze gegen Dürre kann durch Überwachen beliebiger der oben beschriebenen Phänotypen in einem Feld während einer Dürre, oder in einem Modellsystem in einem Dürre-Assay, wie einem Assay hinsichtlich perioischer Dürre oder Wassernutzungseffizienz, gemessen werden. Experimentauslegungen von Assays auf periodische Dürre und Wassernutzungseffizienz-Assays sind bekannt, wie zum Beispiel in Beispiel 1 geschildert. Exemplarische Assays auf periodische Dürre und auf Wassernutzungseffizienz sind im nachstehenden Beispiel 1 dargestellt. Eine erhöhte Dürretoleranz kann zum Beispiel durch das Überleben einer gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten transgenen Mais-, Soja-, Ölsamenraps- oder Baumwollpflanze unter Wasserbeschränkenden Bedingungen demonstriert werden, welche eine Kontrollpflanze der betreffenden Spezies hemmen oder zerstören würden.
  • Die Wassernutzungseffizienz (WUE) ist ein Parameter, der oft mit der Dürretoleranz korreliert ist. Eine Erhöhung der Biomasse bei geringer Wasserverfügbarkeit kann auf einer verhältnismäßig verbesserten Effizienz des Wachstums oder auf einem verringerten Wasserverbrauch beruhen. Beim Auswählen von Eigenschaften Zur Verbesserung von Nutzpflanzen hätte eine Verringerung der Wasserverwendung, ohne Änderung beim Wachstum, einen besonderen Nutzen in einem bewässerten landwirtschaftlichen System, in welchem die Kosten des Wassereintrags hoch sind. Eine Erhöhung des Wachstums ohne einen entsprechenden sprunghaften Anstieg des Wasserverbrauchs würde Anwendbarkeit bei allen landwirtschaftlichen Systemen finden. In vielen landwirtschaftlichen Systemen, bei denen die Wasserversorgung nicht limitierend ist, erhöht ein Anstieg des Wachstums, sogar wenn er auf Kosten einer Erhöhung des Wasserverbrauchs zu Stande kommt, ebenfalls den Ertrag.
  • Wenn das Bodenwasser erschöpft ist, oder wenn Wasser während Dürreperioden nicht verfügbar ist, werden die Nutzpflanzenerträge beschränkt. Ein pflanzliches Wasserdefizit entwickelt sich, wenn die Transpiration aus den Blättern heraus die Zufuhr an Wasser aus den Wurzeln übersteigt. Die verfügbare Wasserversorgung steht mit der Menge an Wasser, welche im Boden gehalten wird, und dem Vermögen der Pflanze, dieses Wasser mit ihrem Wurzelsystem zu erreichen, im Zusammenhang. Die Transpiration von Wasser aus Blättern ist mit der Fixierung von Kohlendioxid mittels Photosynthese durch die Stomata bzw. Spaltöffnungen verknüpft. Die zwei Prozesse sind positiv korreliert, so dass ein hoher Kohlendioxid-Einstrom durch Photosynthese eng mit dem Wasserverlust durch Transpiration gekoppelt ist. Wenn Wasser aus dem Blatt transpiriert, wird das Blatt-Wasser-Potential verringert, und die Stomata neigen dazu, sich in einem hydraulischen Prozess zu schließen, welcher das Ausmaß der Photosynthese begrenzt. Da der Nutzpflanzenertrag von der Fixierung von Kohlendioxid in der Photosynthese abhängig ist, sind die Wasseraufnahme und Transpiration Faktoren, welche zum Nutzpflanzenertrag beitragen. Pflanzen, welche in der Lage sind, weniger Wasser zu verwenden, um die gleiche Menge Kohlendioxid zu fixieren, oder welche in der Lage sind, bei einem geringeren Wasserpotential normal zu funktionieren, weisen das Potential auf, mehr Photosynthese auszuführen und dadurch mehr Biomasse und wirtschaftlichen Ertrag in vielen landwirtschaftlichen Systemen zu produzieren.
  • Zum Beispiel kann eine erhöhte Toleranz gegen Dürrebedingungen gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt und quantifiziert werden: Transformierte Pflanzen werden einzeln in Töpfen in einer Wachstumskammer (York Industriekälte GmbH, Mannheim, Deutschland) kultiviert. Die Keimung wird induziert. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden die ausgesäten Semen bei 4°C im Dunkeln 3 Tage lang gehalten, um die Keimung zu induzieren. Anschließend werden die Bedingungen 3 Tage lang zu 20°C/6°C Tages/Nacht-Temperatur mit einem 16/8h-Tag-Nacht-Zyklus bei 150 μE/m2s verändert. Anschließend werden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen herangezogen. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, sind die Standardwachstumsbedingungen folgende: Lichtperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit, 20°C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, und eine Photonenflussdichte von 200 μE. Die Pflanzen werden wachsen gelassen und kultiviert, bis sie Blätter entwickeln. In dem Fall, dass es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden sie täglich bewässert, bis sie ungefähr 3 Wochen alt waren. Beginnend zu dieser Zeit wurde eine Dürre durch Wasserentzug herbeigeführt. Nachdem die nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzen sichtbare Symptome einer Schädigung aufzeigen, beginnt die Auswertung, und die Pflanzen werden hinsichtlich Symptomen von Dürresymptomen und hinsichtlich des Biomasseproduktion-Vergleichs mit Wildtyp- und Nachbarpflanzen 5–6 Tage lang nacheinander bewertet. Die Toleranz gegen Dürre, z. B. die Toleranz gegen periodische Dürre, kann gemäß dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Die Toleranz gegen Dürre kann eine Toleranz gegen periodische bzw. zyklische Dürre sein.
  • Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, das die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Bestimmen, ob die Wasserzufuhr in dem Gelände für den Anbau optimal oder suboptimal für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze, z. B. einer Nutzpflanze, ist, und/oder Bestimmen der visuellen Symptome von Schäden der Pflanzen, welche in dem Gelände für den Anbau wachsen; und
    • (b1) Anbauen der Pflanze der Erfindung in dem Boden, wenn die Wasserzufuhr für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyppflanze suboptimal ist oder sichtbare Symptome für Dürre bei einer in dem Gelände wachsenden Standard-, Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze gefunden werden können; oder
    • (b2) Anbauen der Pflanze der Erfindung in dem Boden und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag einer Standard-, einer Ursprungs- oder einer Wildtyp-Pflanze, und Selektieren und Wachsenlassen der Pflanze, welche einen höheren oder den höchsten Ertrag zeigt, wenn die Wasserzufuhr für die Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze optimal ist.
  • Sichtbare Symptome von Schäden bzw. Verletzung lassen sich hinsichtlich einem, oder einer beliebigen Kombination von zwei, drei oder mehreren, der folgenden Merkmale feststellen: Welken; Braunwerden des Blatts; Verlust des Turgors, welcher zum Abwurf von Blättern oder Nadelstielen und Blüten führt; Abfallen und/oder Abwerfen von Blättern oder Nadeln; die Blätter sind grün, aber das Blatt ist im Vergleich zu Kontrollen geringfügig zum Erdboden hin abgewinkelt; Blattspreiten, die begannen haben, sich nach innen einzufalten (sich einzurollen); verfrühte Seneszenz von Blättern oder Nadeln; Verlust von Chlorophyll in Blättern oder Nadeln und/oder Vergilbung.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Dürretoleranz, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3883 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 3882 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 3882 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 3883 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte periodische Dürre, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt, wenn die Aktivität ”Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3882 oder SEQ ID NR: 3883, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung plastidisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,05-fach bis 1,351-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. unter abiotischen Stressbedingungen, z. B. unter Dürrebedingungen, insbesondere Bedingungen periodischer Dürre, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Die transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung zeigen erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Dürretoleranz, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, der vermittelt wird, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 6080 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 6079 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 6079 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 6080 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegen abiotischen Umweltstress, insbesondere erhöhte Toleranz gegenüber periodischer Dürre, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt, wenn die Aktivität ”Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 6079 oder SEQ ID NR: 6080, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung plastidisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,05-fach bis 1,351-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Standardbedingungen, z. B. unter abiotischen Stressbedingungen, z. B. unter Dürrebedingungen, insbesondere Bedingungen periodischer Dürre, im Vergleich zu einer entsprechenden Kontrolle, z. B. einer nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Ein anderer ertragsbezogener Phänotyp ist eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz. Die in Tabelle I identifizierten Gene, oder Homologe davon, können verwendet werden, um die Nährstoffverwertungseffizienz in transgenen Pflanzen zu steigern. Derartige transgene Pflanzen können einen gesteigerten Ertrag, wie durch beliebige der oben beschriebenen Phänotypen gemessen, bei derzeitigen kommerziellen Spiegeln der Düngeranwendung zeigen. Alternativ oder zusätzlich können transgene Pflanzen mit verbesserter Nährstoffverwertungseffizienz äquivalenten Ertrag oder verbesserten Ertrag bei verringertem Düngereintrag zeigen.
  • Ein besonders wichtiger Nährstoff für Pflanzen ist Stickstoff. Gemäß der Erfindung zeigen transgene Pflanzen, die ein in Tabelle I identifiziertes Gen oder ein Homolog davon umfassen, eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz (NUE), d. h. erhöhten erntefähigen Ertrag pro Einheit an Eintrags-Stickstoffdünger. Eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz kann durch Messen von beliebigen der oben beschriebenen ertragsbezogenen Phänotypen in Pflanzen bestimmt werden, welche unter Bedingungen von gesteuerten Stickstoff-Bodenkonzentrationen, sowohl auf dem Felde als auch in Modellsystemen, wachsen gelassen bzw. angebaut wurden. Ein exemplarischer Stickstoffverwertungseffizienz-Assay ist im nachstehenden Beispiel 1 dargestellt. Eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz einer transgenen Mais-, Soja-, Ölsamenraps- oder Baumwollpflanze gemäß der vorliegenden Erfindung kann, zum Beispiel, durch einen verbesserten oder erhöhten Proteingehalt des betreffenden Samens gezeigt werden, insbesondere bei Maissamen, die als Futtermittel verwendet werden. Erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz hängt auch mit einer erhöhten Kerngröße oder einer höheren Kernzahl pro Pflanze zusammen.
  • Es wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines in Tabelle VIIIa gezeigten Gens, z. B. eines Nukleinsäuremoleküls, das aus dem in Tabelle VIIIa gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleitet ist, in A. thaliana eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, z. B. eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz, im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle vermittelte. Daher wird, in einer Ausführungsform, ein in Tabelle VIIIa aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen Homolog, wie in Tabelle I aufgeführt, oder das Expressionsprodukt, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Erhöhen von Nährstoffverwertungseffizienz, z. B. zum Erhöhen der Stickstoffverwertungseffizienz, der Pflanze im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle verwendet.
  • Zum Beispiel, kann eine gesteigerte Stickstoffverwertungseffizienz der Pflanze gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt und quantifiziert werden: Transformierte Pflanzen werden in Töpfen in einer Wachstumskammer (Svalöf Weibull, Svalöv, Schweden) wachsen gelassen. Falls es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden Samen davon in Blumentöpfen ausgesät, welche eine 1:1 (v:v)-Mischung von Nährstoff-abgereichertem Erdboden (”Einheitserde Typ 0”, 30% Ton, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand enthalten. Die Keimung wird durch eine viertägige Periode bei 4°C im Dunklen induziert. Anschließend werden die Pflanzen unter standardmäßigen Wachstumsbedingungen wachsen gelassen. Falls es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, sind die Standard-Wachstumsbedingungen folgende: Lichtperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, und eine Photonenflussdichte von 200 μE. Falls es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden sie jeden zweiten Tag mit einer N-abgereicherten Nährstofflösung bewässert, und nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Nach einer Gesamtzeit von 29 bis 31 Tagen werden die Pflanzen geerntet und gemäß dem Frischgewicht der oberirdischen Teile der Pflanzen, vorzugsweise der Rosetten, bewertet.
  • Die Stickstoffverwertungseffizienz kann zum Beispiel gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Messen des Stickstoffgehalts im Boden, und (b) Bestimmen, ob der Stickstoffgehalt im Boden optimal oder suboptimal für das Wachstum einer Ursprungs- oder Wildtyppflanze, z. B. einer Nutzpflanze, ist und (c1) Anbauen der Pflanze der Erfindung in dem Boden, wenn der Stickstoffgehalt für das Wachstum der Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze suboptimal ist, oder (c2) Anbauen der Pflanze der Erfindung in dem Boden und Vergleichen des Ertrags mit dem Ertrag einer Standard-, einer Ursprungs- oder einer Wildtyp-Pflanze, unter Selektieren und Wachsenlassen der Pflanze, welche einen höheren oder den höchsten Ertrag zeigt, wenn der Stickstoffgehalt für die Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze optimal ist.
  • Pflanzen, welche die Stickstoffverwertungseffizienz verbessernde Gene (über)exprimieren, können zur Steigerung des Ertrags der Pflanzen verwendet werden und verbessern, z. B. reduzieren, den Stickstoffdüngerverbrauch oder machen diesen effizienter.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird demgemäß eine im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1959 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 1958 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Escherichia coli abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 1958 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 1959 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen, z. B. ein Nukleinsäuremolekül, welches von der SEQ ID NR: 1958 durch Austauschen des Stoppcodons TAA durch TGA abweicht. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, vermittelt, wenn die Aktivität ”Tellurit-Resistenz-Protein” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid bzw. die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 1958 oder SEQ ID NR: 1959, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Demgemäß wird, in einer Ausführungsform, eine erhöhte Stickstoffverwertungseffizienz vermittelt. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,338-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Bedingungen von Stickstoffmangel, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt. Das Nukleinsäuremolekül kann von der SEQ ID NR: 1958 durch den Austausch des Stoppcodons TAA durch TGA abweichen.
  • Allgemein kann die Anpassung an eine niedrige Temperatur in Abkühlungstoleranz und Frosttoleranz unterteilt werden. Verbesserte oder gesteigerte ”Frosttoleranz” oder Variationen davon bezieht sich hierin auf eine verbesserte Anpassung an Temperaturen nahe oder unter null, nämlich vorzugsweise Temperaturen von 4°C oder darunter, weiter bevorzugt 3°C oder 2°C oder darunter, und besonders bevorzugt bei oder 0 (null) °C oder –4°C oder tiefer, oder sogar extrem niedrige Temperaturen bis hinunter zu –10°C oder tiefer, die hierin nachstehend als ”Frosttemperatur” bezeichnet werden. Ferner kann eine erhöhte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur zum Beispiel durch eine frühe Wuchskraft gezeigt werden und gestattet das frühe Anpflanzen und Säen einer gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellten Mais-, Soja-, Ölsamenraps- oder Baumwollpflanze.
  • Es wurde beobachtet, dass das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines in Tabelle VIIIb gezeigten Gens, z. B. eines Nukleinsäuremoleküls, das aus dem in Tabelle VIII(b) gezeigten Nukleinsäuremolekül abgeleitet ist, in A. thaliana erhöhte Stresstoleranz, z. B. erhöhte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle vermittelte. Daher wird, in einer Ausführungsform, ein in Tabelle VIII(b) aufgeführtes Nukleinsäuremolekül oder dessen Homolog, wie in Tabelle I aufgeführt, oder das Expressionsprodukt, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Erhöhen von Stresstoleranz, z. B. zum Erhöhen niedriger Temperatur, einer Pflanze im Vergleich zur Wildtypkontrolle verwendet.
  • Die oben angeführten Verhältnisse beziehen sich insbesondere auf einen erhöhten Ertrag, der eigentlich als Erhöhung der Biomasse, speziell als Frischgewichtbiomasse von oberirdischen Teilen, gemessen wird.
  • Gesteigerte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur kann zum Beispiel gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt werden: Transformierte Pflanzen werden in Töpfen in einer Wachstumskammer (z. B. York, Mannheim, Deutschland) wachsen gelassen. Falls es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden Samen davon in Blumentöpfe gesät, welche eine 3,5:1 (v:v)-Mischung von nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf Deutschland) und Sand enthalten. Die Pflanzen werden unter standardmäßigen Wachstumsbedingungen wachsen gelassen. Falls es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, sind die Standard-Wachstumsbedingungen folgende: Lichtperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, und eine Photonenflussdichte von 200 μmol/m2s. Die Pflanzen werden wachsen gelassen und kultiviert. Falls es sich bei den Pflanzen um Arabidopsis thaliana handelt, werden sie an jedem zweiten Tag bewässert. Nach 9 bis 10 Tagen werden die Pflanzen vereinzelt. Kälte (z. B. Abkühlen bei 11–12°C) wird 14 Tage nach dem Säen bis zum Ende des Experiments angewandt. Nach einer Gesamt-Wachstumsdauer von 29 bis 31 Tagen werden die Pflanzen geerntet und gemäß dem Frischgewicht der oberirdischen Teile der Pflanzen, im Fall von Arabidopsis vorzugsweise den Rosetten, bewertet.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird eine im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1959 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 1958 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Escherichia coli abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 1958 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 1959 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen, z. B. ein Nukleinsäuremolekül, welches von der SEQ ID NR: 1958 durch Austauschen des Stoppcodons TAA durch TGA abweicht. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Tellurit-Resistenz-Protein” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder des Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 1958 oder SEQ ID NR: 1959, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,610-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Bedingungen niedriger Temperatur im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt. Das Nukleinsäuremolekül kann von der SEQ ID NR: 1958 durch den Austausch des Stoppcodons TAA durch TGA abweichen.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird eine im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3883 gezeigt oder von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 3882 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 3882 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. des in SEQ ID NR: 3883 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3882 oder SEQ ID NR: 3883, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,206-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Bedingungen von Niedrigtemperatur im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird eine im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, vermittelt, wenn die Aktivität eines Polypeptids, umfassend das Polypeptid, das in SEQ ID NR: 6080 gezeigt oder von einer Nukleinsäuremolekül, umfassend das in SEQ ID NR: 6079 gezeigte Nukleinsäuremolekül, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, erhöht oder herbeigeführt wird. Zum Beispiel wird die Aktivität eines entsprechenden Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erhöht oder herbeigeführt, welche vorzugsweise das in SEQ ID NR: 6079 gezeigte Nukleinsäuremolekül bzw. das in SEQ ID NR: 6080 gezeigte Polypeptid oder ein Homolog davon umfassen. Z. B. wird eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, insbesondere erhöhte Niedertemperaturtoleranz, im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze vermittelt, wenn die Aktivität ”Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease” oder wenn die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 6079 oder SEQ ID NR: 6080, jeweilig aufgeführt sind, in einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt wird. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Insbesondere wird eine Erhöhung des Ertrags von 1,1-fach bis 1,206-fach, zum Beispiel plus mindestens 100% desselben, unter Bedingungen von niedriger Temperatur im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-modifizierten, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, vermittelt.
  • Überraschend wurde festgestellt, dass die transgene Expression des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, das aus einem in Spalte 4 aufgeführten Organismus abgeleitet war, in einer Pflanze, wie A. thaliana, zum Beispiel erhöhten Ertrag vermittelte.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 23 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 22 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Arabidopsis thaliana abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Pyruvatkinase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 22 oder SEQ ID NR: 23, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung plastidisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1031 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 1030 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Azotobacter vinelandii abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”50S-Ribosomenprotein L36” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 1030 oder SEQ ID NR: 1031, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1784 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 1783 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Escherichia coli abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 1783 oder SEQ ID NR: 1784, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 1959 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 1958 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Escherichia coli abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Tellurit-Resistenz-Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 1958 oder SEQ ID NR: 1959, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2022 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 2021 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Escherichia coli abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Kohlenstoffspeicherungsregulator” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 2021 oder SEQ ID NR: 2022, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2375 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 2374 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Escherichia coli abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Xanthin-Permease” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 2374 oder SEQ ID NR: 2375, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 2676 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 2675 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Escherichia coli abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Phosphat-Transporter-Untereinheit” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 2675 oder SEQ ID NR: 2676, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3154 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 3153 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”YAR047C-Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3153 oder SEQ ID NR: 3154, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung plastidisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend des ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3158 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 3157 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”mitochondrialer Präkursor von Lon-Protease-Homolog” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3157 oder SEQ ID NR: 3158, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3269 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 3268 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, z. B. ein Nukleinsäuremolekül, das von der Seq ID No. 3268 durch Austausch des Stoppcodons TAG durch TAA abweicht. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Calmodulin” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3268 oder SEQ ID NR: 3269, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf. Des Nukleinsäuremolekül kann von der SEQ ID NR: 3268 durch den Austausch des Stoppcodons TAG durch TAA abweichen.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3883 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 3882 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3882 oder SEQ ID NR: 3883, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Es wurde festgestellt, dass die Ertragserhöhung sowohl bei cytoplasmatischer als auch plastidischer Expression einer Expressionskassette auftritt, welche das Nukleinsäuremolekül, wie in SEQ ID NR: 3882 gezeigt, umfasst.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3949 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 3948 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3948 oder SEQ ID NR: 3949, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 3993 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 3992 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”MutS-Protein-Homolog” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 3992 oder SEQ ID NR: 3993, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4293 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 4292 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Protein EFR3” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 4292 oder SEQ ID NR: 4293, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4323 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 4322 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”FK506-bindendes Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 4322 oder SEQ ID NR: 4323, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4779 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 4778 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”autophagiebezogenes Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 4778 oder SEQ ID NR: 4779, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4805 oder SEQ ID NR: 4837 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 4804 oder SEQ ID NR: 4836 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Arabidopsis thaliana abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Hitzestress-Transkriptionsfaktor” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 4804 oder SEQ ID NR: 4836 oder SEQ ID NR: 4805 oder SEQ ID NR: 4837, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 4843 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 4842 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Escherichia coli abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”B0050-Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 4842 oder SEQ ID NR: 4843, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 5242 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 5241 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Glycine max abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”GM02LC38418-Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 5241 oder SEQ ID NR: 5242, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 5275 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 5274 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”26S-Proteasom-Untereinheit” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 5274 oder SEQ ID NR: 5275, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 5975 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 5974 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”mitochondrialer Präkursor von Lon-Protease-Homolog” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 5974 oder SEQ ID NR: 5975, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Demgemäß wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 6080 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 6079 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird, in einer Ausführungsform, die Aktivität ”Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 6079, oder SEQ ID NR: 6080, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Es wurde festgestellt, dass die Ertragserhöhung sowohl bei cytoplasmatischer als auch plastidischer Expression einer Expressionskassette auftritt, welche das Nukleinsäuremolekül, wie in SEQ ID NR: 6079 gezeigt, umfasst.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 6146 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 6145 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 6145 oder SEQ ID NR: 6146, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Folglich wird, in einer Ausführungsform, ein im Vergleich zu einer entsprechend nicht-modifizierten, z. B. einer nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze erhöhter Ertrag gemäß dem Verfahren der Erfindung durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids vermittelt, umfassend das ertragsbezogene Polypeptid, das in SEQ ID NR: 5942 gezeigt oder von dem ertragsbezogenen Nukleinsäuremolekül (oder Gen), umfassend die in SEQ ID NR: 5941 gezeigte Nukleinsäure, codiert ist, oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids, das z. B. aus Glycine max abgeleitet ist. Somit wird in einer Ausführungsform die Aktivität ”GM02LC38418-Protein” oder die Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls oder eines Polypeptids, umfassend die Nukleinsäure oder das Polypeptid oder die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, die in Tabelle I, II oder IV, Spalte 7, jeweils gleiche Zeile wie SEQ ID NR: 5941 oder SEQ ID NR: 5942, jeweilig angeführt sind, in einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon erhöht oder herbeigeführt. Vorzugsweise tritt die Erhöhung cytoplasmatisch auf.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, welche erhöhten oder verbesserten Ertrag im Vergleich zu der entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze zeigt, durch Erhöhen oder Herbeiführen von einer oder mehrerer Aktivitäten, gewählt aus der Gruppe, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht, welche z. B. durch ein oder mehrere Polynukleotid(e), gewählt aus der Gruppe, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, gezeigt, oder durch ein oder mehrere Protein(e), die jeweils ein Polypeptid umfassen, das von einer oder mehreren Nukleinsäuresequenz(en), gewählt aus der Gruppe, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7 gezeigt, codiert wird, oder durch ein oder mehrere Protein(e), die jeweils ein Polypeptid umfassen, gewählt aus der Gruppe, wie in Tabelle II, Spalte 5 und 7 aufgeführt, oder ein Protein mit einer Sequenz, das der in Tabelle IV, Spalte 7, gezeigten Consensus-Sequenz entspricht, vermittelt wird, in der und (b) gegebenenfalls Wachsenlassen der Pflanzenzelle, Pflanze oder des Teils davon unter Bedingungen, welche die Entwicklung der Pflanzenzelle, der Pflanze oder des Teils davon gestatten, und (c) Regenerieren einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. mit einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperatur-Toleranz und/oder einem erhöhten Nährstoffverwertungseffizienzgrad, intrinsischen Ertrag und/oder einer anderen erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze oder einem Teil davon, bereit.
  • Folglich umfasst, in einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung einer Pflanze oder eines Teils davon für die Regeneration der Pflanze, wobei die Pflanze einen erhöhten Ertrag zeigt, das Verfahren (i) das Wachsenlassen der Pflanze oder eines Teils davon gemeinsam mit einer, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze unter Bedingungen von abiotischem Umweltstress oder Mangel; und (ii) das Auswählen einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, zum Beispiel nachdem die, z. B. nicht-transformierte, Wildtyp-Pflanze sichtbare Symptome von Mangel und/oder Tod aufzeigt.
  • Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze, z. B. einer transgenen Pflanze, das folgendes umfasst: (a) Erhöhen oder Herbeiführen, in einem Pflanzenzellkern, einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon, von einer oder mehreren Aktivitäten, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht, z. B. durch die hierin erwähnten Verfahren; und (b) Kultivieren oder Wachsenlassen der Pflanzenzelle, der Pflanze oder des Teils davon unter Bedingungen, welche die Entwicklung der Pflanzenzelle, der Pflanze oder des Teils davon gestatten; und (c) Wiedergewinnen einer Pflanze aus dem Pflanzenzellkern, der Pflanzenzelle, oder dem Pflanzenteil, welche(r) erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanze zeigt; und (d) gegebenenfalls Auswählen bzw. Selektieren der Pflanze oder eines Teils davon, welche(r) erhöhten Ertrag zeigt, zum Beispiel eine erhöhte oder verbesserte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine verbesserte Nährstoffverwertungseffizienz und/oder abiotische Stress-Resistenz, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle zeigt, die z. B. sichtbare Symptome von Mangel und/oder Tod zeigt.
  • Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, welches das Screenen einer Population von einem/einer oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon hinsichtlich der ”Aktivität”, das Vergleichen der Höhe der Aktivität mit dem Aktivitätsspiegel in einer Referenz; das Identifizieren von einem/einer oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon mit der im Vergleich zur Referenz erhöhten Aktivität, wahlweise das Herstellen einer Pflanze aus den identifizierten Pflanzenzellkernen, der Zelle oder dem Gewebe, umfasst.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Pflanze mit einem erhöhtem Ertrag, welches das Screenen einer Population von einem/einer oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon hinsichtlich des Expressionsspiegels einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid, welches die genannte Aktivität vermittelt, codiert, das Vergleichen des Spiegels der Expression mit einer Referenz; das Identifizieren von einem/einer oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon mit dem im Vergleich zur Referenz erhöhten Expressionsspiegel, wahlweise das Herstellen einer Pflanze aus den identifizierten Pflanzenzellkernen, der Zelle oder dem Gewebe, umfasst.
  • Folglich stellt die vorliegende Erfindung, in einer bevorzugten Ausführungsform, ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Zelle für die Regenerierung oder Produktion einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder einer anderen erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Zelle durch Erhöhen oder Herbeiführen einer oder mehrer Aktivitäten, gewählt aus der Gruppe, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht, bereit. Die Zelle kann zum Beispiel eine Wirtszelle, z. B. eine transgene Wirtszelle, sein. Eine Wirtszelle kann zum Beispiel ein Mikroorganismus, z. B. abgeleitet aus Pilzen oder Bakterien, oder eine Pflanzenzelle sein, die besonders nützlich zur Transformation ist. Darüber hinaus sieht die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, eine transgene Pflanze vor, welche eine oder mehrere erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft(en) im Vergleich zu der entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Ursprungs- oder Wildtyp-Pflanzenzelle oder -Pflanze zeigt, die eine erhöhte oder neu herbeigeführte eine oder mehrere, aus der oben erwähnten Gruppe von ”Aktivitäten” gewählte, ”Aktivitäten” in dem hierin angeführten subzellulären Kompartiment und Gewebe der Pflanze aufweist.
  • In einer Ausführungsform ist die Erhöhung der Aktivität des Polypeptids in einer Organelle, wie einer Plastide, bedeutsam. In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Aktivität des Polypeptids im Cytoplasma.
  • Die spezifische Aktivität eines Polypeptids, das von einem Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung codiert wird, oder des Polypeptids der vorliegenden Erfindung kann wie in den Beispielen beschrieben getestet werden. Im Besonderen ist die Expression eines betreffenden Proteins in einer Zelle, z. B. einer Pflanzenzelle, im Vergleich zu einer Kontrolle ein einfacher Test und kann wie im Stand der Technik beschrieben durchgeführt werden.
  • Die Sequenz von AT5G63680 aus Arabidopsis thaliana, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Pyruvatkinase beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Pyruvatkinase” aus Arabidopsis thaliana vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AT5G63680 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder eines funktionellen Äquivalents, wie es in Spalte 7 von Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AT5G63680 aufgeführt ist, z. B. plastidisch; oder
    • (b) eines Polypeptids, das ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AT5G63680 aufgeführt sind, umfasst, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AT5G63680 aufgeführt ist, z. B. plastidisch.
  • Die Sequenz von AVINDRAFT_2380 aus Azotobacter vinelandii, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als 50S-Ribosomenprotein L36 beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”50S-Ribosomenprotein L36” aus Azotobacter vinelandii vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AVINDRAFT_2380 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AVINDRAFT_2380 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AVINDRAFT_2380 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AVINDRAFT_2380 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von B1298 aus Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase” aus Escherichia coli vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B1298 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B1298 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B1298 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B1298 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von B1430 aus Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al. Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Tellurit-Resistenz-Protein beschrieben.
  • Folglich umfasst des Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Tellurit-Resistenz-Protein” aus Escherichia coli vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B1430 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B1430 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B1430 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B1430 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von B2696 aus Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Kohlenstoffspeicherungsregulator beschrieben.
  • Folglich umfasst des Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Kohlenstoffspeicherungsregulator” aus Escherichia coli vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend des Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B2696 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B2696 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B2696 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B2696 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von B2882 aus Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Xanthin-Permease beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Xanthin-Permease” aus Escherichia coli vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B2882 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B2882 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B2882 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B2882 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von B3728 aus Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Phosphat-Transporter-Untereinheit beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Phosphat-Transporter-Untereinheit” aus Escherichia coli vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B3728 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B3728 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B3728 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B3728 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YAR047C aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als YAR047C-Protein beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”YAR047C-Protein” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YAR047C aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YAR047C aufgeführt ist, z. B. in plastidischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YAR047C aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YAR047C aufgeführt ist, z. B. in plastidischer Weise.
  • Die Sequenz von YBL022C aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als mitochondrialer Präkursor von Lon-Protease-Homolog beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”mitochondrialer Präkursor von Lon-Protease-Homolog” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBL022C aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBL022C aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBL022C aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBL022C aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YBR109C aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Calmodulin beschrieben.
  • Folglich umfasst des Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Calmodulin” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBR109C aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBR109C aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBR109C aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBR109C aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YDR046C aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend des Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDR046C aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDR046C aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDR046C aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDR046C aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YEL036C aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YEL036C aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YEL036C aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YEL036C aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YEL036C aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YHR120W aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als MutS-Protein-Homolog beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”MutS-Protein-Homolog” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YHR120W aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YHR120W aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YHR120W aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YHR120W aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YMR212C aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Protein EFR3 beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Protein EFR3” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YMR212C aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YMR212C aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YMR212C aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YMR212C aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YNL135C aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als FK506-bindendes Protein beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”FK506-bindendes Protein” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YNL135C aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YNL135C aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YNL135C aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YNL135C aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YPR185W aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als autophagiebezogenes Protein beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”autophagiebezogenes Protein” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YPR185W aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YPR185W aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YPR185W aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie des YPR185W aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von AT5G54070 aus Arabidopsis thaliana, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Hitzestress-Transkriptionsfaktor beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Hitzestress-Transkriptionsfaktor” aus Arabidopsis thaliana vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AT5G54070 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AT5G54070 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AT5G54070 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AT5G54070 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Demgemäß umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in z. B. SEQ ID NR: 4804 oder 4836 gezeigt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, z. B. cytoplasmatisch; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in z. B. SEQ ID NR: 4805 oder 4837 gezeigt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 von Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das AT5G54070 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von B0050 aus Escherichia coli, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als B0050-Protein beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”B0050-Protein” aus Escherichia coli vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B0050 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B0050 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B0050 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das B0050 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von GM02LC38418 aus Glycine max, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als GM02LC38418-Protein beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”GM02LC38418-Protein” aus Glycine max vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das GM02LC38418 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das GM02LC38418 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das GM02LC38418 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das GM02LC38418 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YDL007W aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als 26S-Proteasom-Untereinheit beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”26S-Proteasom-Untereinheit” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDL007W aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDL007W aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie des YDL007W aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDL007W aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YBL022C 2 aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als mitochondrialer Präkursor von Lon-Protease-Homolog beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”mitochondrialer Präkursor von Lon-Protease-Homolog” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBL022C_2 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBL022C_2 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBL022C_2 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle II B aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YBL022C_2 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YDR046C_2 aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDR046C_2 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDR046C_2 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDR046C_2 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YDR046C_2 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von YEL036C_2 aus Saccharomyces cerevisiae, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit” aus Saccharomyces cerevisiae vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YEL036C_2 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YEL036C_2 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YEL036C_2 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das YEL036C_2 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Die Sequenz von GM02LC38418_2 aus Glycine max, z. B. wie in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt, ist veröffentlicht: Sequenzen aus S. cerevisiae sind in Goffeau et al., Science 274 (5287), 546 (1996), veröffentlicht worden, Sequenzen aus E. coli sind in Blattner et al., Science 277 (5331), 1453 (1997), veröffentlicht worden. Seine Aktivität wird als GM02LC38418-Protein beschrieben.
  • Folglich umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, in einer Ausführungsform, das Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines die Aktivität ”GM02LC38418-Protein” aus Glycine max vermittelnden Genprodukts oder seines funktionellen Äquivalents oder seines Homologs, z. B. die Erhöhung
    • (a) eines Genprodukts eines Gens, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie es in Spalte 5 von Tabelle I gezeigt und in der gleichen jeweiligen Zeile wie das GM02LC38418_2 aufgeführt ist, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle I aufgeführt gezeigt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IB aufgeführt gezeigt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das GM02LC38418_2 aufgeführt ist, z. B. in cytoplasmatischer Weise; oder
    • (b) eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie sie in Spalte 5 von Tabelle II oder Spalte 7 von Tabelle IV aufgeführt gezeigt sind, und welche in der gleichen jeweiligen Zeile wie das GM02LC38418_2 aufgeführt sind, oder eines funktionellen Äquivalents oder eines Homologen davon, wie in Spalte 7 von Tabelle II aufgeführt, vorzugsweise eines Homologen oder funktionellen Äquivalents, wie es in der Spalte 7 der Tabelle IIB aufgeführt ist, und welches in der gleichen jeweiligen Zeile wie das GM02LC38418_2 aufgeführt ist, z. B. cytoplasmatisch.
  • Demzufolge wird eine Aktivität, die aus der Gruppe gewählt ist, welche aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendes Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht in einem oder mehreren spezifischen Kompartiment(en) oder Organelle(n) einer Zelle oder Pflanze erhöht und vermittelt den erhöhten Ertrag, z. B. zeigt die Pflanze eine oder mehrere erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft(en). Zum Beispiel wird die Aktivität in dem Kompartiment einer Zelle, wie in Tabelle I oder II in Spalte 6 aufgeführt, erhöht, was zu einem erhöhten Ertrag der entsprechenden Pflanze führt. Zum Beispiel vermittelt die spezifische Lokalisierung der Aktivität eine verbesserte oder erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, wie in Tabelle VIIIA, B, C und/oder D gezeigt. Zum Beispiel kann die Aktivität in Plastiden oder Mitochondrien einer Pflanzenzelle erhöht sein, wodurch eine Erhöhung des Ertrags in einer entsprechenden Pflanze vermittelt wird.
  • In einer Ausführungsform wird eine Aktivität, wie sie hierin als durch eine/die Expression der hierin beschriebenen Gene oder ihr Expressionsprodukt, z. B. ein in Tabelle II gezeigtes Polypeptid, vermittelt offenbart ist, in der Plastide erhöht oder herbeigeführt, wenn in der Spalte 6 von jeder Tabelle I für das Polypeptid der Begriff ”plastidisch” aufgelistet ist.
  • In einer Ausführungsform wird eine Aktivität, wie sie hierin als durch eine/die Expression der hierin beschriebenen Gene oder ihr Expressionsprodukt, z. B. ein in Tabelle II gezeigtes Polypeptid, vermittelt offenbart ist, in den Mitochondrien erhöht oder herbeigeführt, wenn in der Spalte 6 von jeder Tabelle I für das Polypeptid der Begriff ”Mitochondrien” aufgelistet ist.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer, z. B. transgenen, Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. mit einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürre-Toleranz und/oder Niedertemperatur Toleranz und/oder einem erhöhten Nährstoffverwertungseffizienzgrad, intrinsischen Ertrag und/oder einer anderen erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, welches folgendes umfasst
    • (a) Erhöhen oder Herbeiführen von einer oder mehreren genannten ”Aktivitäten” gemäß der Erfindung im Cytoplasma einer Pflanzenzelle, und
    • (b) Wachsenlassen der Pflanze unter Bedingungen, welche die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. mit einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürre-Toleranz und/oder Niedertemperatur-Toleranz und/oder einem erhöhten Nährstoffverwertungseffizienzgrad, intrinsischen Ertrag und/oder einer anderen erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, gestatten.
  • In einer Ausführungsform wird eine Aktivität gemäß der Erfindung, wie sie von einem in Tabelle II gezeigten Polypeptid vermittelt wird, im Cytoplasma erhöht oder herbeigeführt, wenn in der Spalte 6 von jeder Tabelle I für das Polypeptid der Begriff ”cytoplasmatisch” aufgelastet ist.
  • Da die Begriffe ”cytoplasmatisch” und ”nicht-zielgerichtet” eine zielgerichtete Lokalisierung zu einem beliebigen Zellkompartiment für die Produkte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen durch ihre natürlich vorkommenden Sequenzeigenschaften innerhalb des Hintergrunds des transgenen Organismus nicht ausschließen sollen, wird, in einer Ausführungsform, eine Aktivität, wie hierin als von einem in Tabelle II gezeigten Polypeptid vermittelt offenbart, nicht-zielgerichtet erhöht oder herbeigeführt, wenn in der Spalte 6 von jeder Tabelle I für das Polypeptid der Begriff ”cytoplasmatisch” aufgelistet ist. Für die Zwecke der Beschreibung der vorliegenden Erfindung soll der Begriff ”cytoplasmatisch” anzeigen, dass die Nukleinsäure der Erfindung ohne die Addition einer ein nicht-natürliches Transitpeptid codierenden Sequenz exprimiert wird. Eine für nicht-natürliches transientes Peptid codierende Sequenz ist eine Sequenz, welche nicht ein natürlicher Teil einer Nukleinsäure der Erfindung Ist, sondern vielmehr durch molekulare Manipulationsschritte, wie beispielsweise in dem Beispiel unter ”Plastiden-zielgerichtete Expression” beschrieben, hinzugefügt wird. Deshalb soll der Begriff ”cytoplasmatisch” eine zielgerichtete Lokalisierung auf ein beliebiges Zellkompartiment für die Produkte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen durch ihre natürlich vorkommenden Sequenzeigenschaften nicht ausschließen.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer, z. B. transgenen, Pflanze mit erhöhtem Ertrag, oder eines Teils davon, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, welches folgendes umfasst
    • (a1) Erhöhen oder Herbeiführen von einer oder mehreren genannten Aktivitäten, z. B. der Aktivität des Gens oder des Genprodukt-Gens, z. B. einer Aktivität, gewählt aus der Gruppe, die aus 26S-Proteasom-Untereinheilt, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendes Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht, in einer Organelle einer Pflanzenzelle, oder
    • (a2) Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Proteins, wie es in Tabelle II, Spalte 3 gezeigt ist oder wie es codiert wird von den Nukleinsäuresequenzen, wie sie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, gezeigt sind und welches an eine Nukleinsäuresequenz, die ein Transitpeptid codiert, verknüpft ist, in der Pflanzenzelle; oder
    • (a3) Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Proteins, wie es in Tabelle II, Spalte 3 gezeigt ist oder wie es codiert wird von den Nukleinsäuresequenzen, wie sie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, gezeigt sind und welches an eine Nukleinsäuresequenz, die eine Organellen-Lokalisierungssequenz, speziell eine Chloroplasten-Lokalisierungssequenz codiert, verknüpft ist, in einer Pflanzenzelle,
    • (a4) Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Proteins, wie es in Tabelle II, Spalte 3 gezeigt ist oder wie es codiert wird von den Nukleinsäuresequenzen, wie sie in Tabelle 1, Spalte 5 oder 7, gezeigt sind und welches an eine Nukleinsäuresequenz, die eine Mitochondrion-Lokalisierungssequenz codiert, verknüpft ist, in einer Pflanzenzelle, und
    • (b) Regenerieren einer Pflanze aus der Pflanzenzelle;
    • (c) Wachsenlassen der Pflanze unter Bedingungen, welche die Entwicklung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag, z. B. mit einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürre-Toleranz und/oder Niedertemperatur-Toleranz und/oder eifern erhöhten Nährstoffverwertungseffizienzgrad, intrinsischen Ertrag und/oder einer anderen erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanze, gestatten.
  • Folglich wird, in einer weiteren Ausführungsform, in dem Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, die Aktivität erhöht oder herbeigeführt durch Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigt, das von den Nukleinsäuresequenzen, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, gezeigt, codiert wird,
    • (a1) in einer Organelle einer Pflanze durch die Transformation der Organelle, die in Spalte 6, für die Aktivität aufgeführt ist, oder
    • (a2) in der Plastide einer Pflanze, oder in einem oder mehreren Teilen davon, durch die Transformation der Plastiden, wenn es in Spalte 6 für die Aktivität aufgeführt ist;
    • (a3) in dem Chloroplast einer Pflanze, oder in einem oder mehreren Teilen davon, durch die Transformation des Chloroplasten, wenn es in Spalte 6 für die Aktivität aufgeführt ist,
    • (a4) in dem Mitochondrion einer Pflanze, oder in einem oder mehreren Teilen davon, durch die Transformation des Mitochondrions, wenn es in Spalte 6 für die Aktivität aufgeführt ist.
  • Gemäß der Offenbarung der Erfindung, insbesondere in den Beispielen, ist der Fachmann auf dem Gebiet in der Lage, Transitpeptid-Nukleinsäuresequenzen an die Nukleinsäuresequenzen zu verknüpfen, die in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigt sind, z. B. für die Nukleinsäuremoleküle, für die in der Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidisch” aufgeführt ist.
  • Gemäß den diversen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann jedwedes Transitpeptid zur Anwendung kommen. Zum Beispiel sind spezifische Nukleinsäuresequenzen, welche Transitpeptide codieren, bei von Heijne et al. (Plant Molecular Biology Reporter, 9 (2), 104, (1991)) offenbart, oder andere Transitpeptide sind bei Schmidt et al. (J. Biol. Chem. 268 (36), 27447 (1993)), Della-Cioppa et al. (Plant. Physiol. 84, 965 (1987)), de Castro Silva Filho et al. (Plant Mol. Biol. 30, 769 (1996)), Zhao et al. (J. Biol. Chem. 270 (11), 6081 (1995)), Römer et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (3), 1414 (1993)), Keegstra et al. (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 471 (1989)), Lubben et al. (Photosynthesis Res. 17, 173 (1988)) und Lawrence et al. (J. Biol. Chem. 272 (33), 20357 (1997))), welche hiermit durch den Bezug darauf einbezogen sind, offenbart. Ein allgemeiner Übersichtsartikel über Targeting ist von Kermode Allison R. in Critical Reviews in Plant Science 15 (4), 285 (1996) unter dem Titel "Mechanisms of Intracellular Protein Transport and Targeting in Plant Cells" beschrieben.
  • Weitere Nukleinsäuresequenzen, die ein Transitpeptid codieren, können aus einem beliebigen Organismus, wie etwa Mikroorganismen, wie Algen, oder Pflanzen mit Plastiden, vorzugsweise mit Chloroplasten, isoliert werden. Ein ”Transitpeptid” ist eine Aminosäuresequenz, deren codierende Nukleinsäuresequenz zusammen mit dem entsprechenden Strukturgen translatiert wird. Dies bedeutet, dass das Transitpeptid ein integraler Teil des translatierten Proteins ist und eine aminoterminale Verlängerung des Proteins bildet. Beide werden als sogenanntes ”Prä-Protein” translatiert. Im Allgemeinen wird das Transitpeptid während oder direkt nach dem Import des Proteins in die korrekte Zellorganelle, wie eine Plastide, von dem Prä-Protein abgespalten, wodurch das reife Protein entsteht. Das Transitpeptid gewährleistet die korrekte Lokalisierung des reifen Proteins durch Erleichtern des Transports von Proteinen durch intrazelluläre Membranen.
  • Zum Beispiel werden derartige Transitpeptide, die im Verfahren der Erfindung vorteilhaft verwendet werden, aus der Nukleinsäuresequenz abgeleitet, die ein Protein codiert, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Ribulosebisphosphat-Carboxylase/Oxygenase, 5-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat-Synthase, Acetolactat-Synthase, Chloroplasten-Ribosomenprotein CS17, Cs-Protein, Ferredoxin, Plastocyanin, Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivase, Tryptophan-Synthase, Acyl-Carrier-Protein, Plastiden-Chaperonin-60, Cytochrom-c552, 22-kDA Hitzeschockprotein, 33-kDa ”Oxygen-evolving Enhancer”-Protein 1, ATP-Synthase γ-Untereinheit, ATP-Synthase δ-Untereinheit, Chlorophyll-a/b-bindendes Protein-II-1, ”Oxygen-evolving Enhancer”-Protein 2, ”Oxygen-evolving Enhancer”-Protein 3, Photosystem I: P21, Photosystem I: P28, Photosystem I: P30, Photosystem I: P35, Photosystem I: P37, Glycerol-3-phosphat-Acyltransferasen, Chlorophyll a/b-bindendes Protein, CAB2-Protein, Hydroxymethyl-Bilan-Synthase, Pyruvat-Orthophosphat-Dikinase, CAB3-Protein, Plastiden-Ferritin, Ferritin, frühes Licht-induzierbares Protein, Glutamat-1-Semialdehyd-Aminotransferase, Protochlorophyllid-Reduktase, Stärke-Körnchen-gebunde Amylase-Synthase, ”Light-harvesting”-Chlorophyll a/b-bindendes Protein von Photosystem II, Hauptpollenallergen Lol p 5a, plastidäre ClpB ATP-abhängige Protease, Superoxid-Dismutase, Ferredoxin-NADP-Oxidoreduktase, 28-kDa Ribonukleoprotein, 31-kDa Ribonukleoprotein, 33-kDa Ribonukleoprotein, Acetolactat-Synthase, ATP-Synthase CF0-Untereinheit 1, ATP-Synthase CF0-Untereinheit 2, ATP-Synthase CF0-Untereinheit 3, ATP-Synthase CF0-Untereinheit 4, Cytochrom f, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, Glutaminsynthase, Glutaminsynthase 2, Carboanhydrase, GapA-Protein, Hitzeschockprotein hsp21, Phosphat-Translokator, plastidäre ClpA ATP-abhängige Protease, plastidäres ribosomales Protein CL24, plastidäres ribosomales Protein CL9, plastidäres ribosomales Protein PsCL18, plastidäres ribosomales Protein PsCL25, DAHP-Synthase, Stärkephosphorylase, Wurzel-Acyl-Carrier-Protein II, Betain-Aldehyd-Dehydrogenase, GapB-Protein, Glutaminsynthetase 2, Phosphoribulokinase, Nitritreduktase, ribosomales Protein L12, ribosomales Protein L13, ribosomales Protein L21, ribosomales Protein L35, ribosomales Protein L40, Triosephosphat-3-phosphoglycerat-Phosphat-Translokator, Ferredoxin-abhängige Glutamatsynthase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, NADP-abhängige Malat-Decarboxylase und NADP-Malat-Dehydrogenase, Chloroplasten-30S-Ribosomenprotein PSrp-1, und dergleichen, besteht.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass verschiedene andere, für Transitpeptide codierende Nukleinsäuresequenzen leicht aus Plastiden-lokalisierten Proteinen isoliert werden können, welche von nuklearen Genen als Präkursoren exprimiert werden und danach zu Plastiden zielgelenkt werden. Nukleinsäuresequenzen, die ein Transitpeptid codieren, können aus Organellen-zielgelenkten Proteinen von jedwedem Organismus isoliert werden. Vorzugsweise wird das Transitpeptid aus einem Organismus isoliert, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den Gattungen Acetabularia, Arabidopsis, Brassica, Capsicum, Chlamydomonas, Cururbita, Dunaliella, Euglena, Flaveria, Glycine, Helianthus, Hordeum, Lemna, Lolium, Lycopersion, Malus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Oenotherea, Oryza, Petunia, Phaseolus, Physcomitrella, Pinus, Pisum, Raphanus, Silene, Sinapis, Solanum, Spinacea, Stevia, Synechococcus, Triticum und Zea besteht. Weiter bevorzugt, wird die Nukleinsäuresequenz, welche das Transitpeptid codiert, aus einem Organismus isoliert, der aus der Gruppe gewählt ist, die aus den Spezies Acetabularia mediterranea, Arabidopsis thaliana, Brassica campestris, Brassica napus, Capsicum annuum, Chlamydomonas reinhardtii; Cururbita moschata, Dunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, Euglena gracilis, Flaveria trinervia, Glycine max, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lemna gibba, Lolium perenne, Lycopersion esculentum, Malus domestica, Medicago falcata, Medicago sativa, Mesembryanthemum crystallinum, Nicotiana plumbaginifolia, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Oenotherea hookeri, Oryza sativa, Petunia hybrida, Phaseolus vulgaris, Physcomitrella patens, Pinus tunbergii, Pisum sativum, Raphanus sativus, Silene pratensis, Sinapis alba, Solanum tuberosum, Spinacea oleracea, Stevia rebaudiana, Synechococcus, Synechocystis, Triticum aestivum und Zea mays besteht. Alternativ dazu können für Transitpeptide codierende Nukleinsäuresequenzen, entweder teilweise oder vollständig, gemäß der im Stand der Technik offenbarten Struktur von Transitpeptid-Sequenzen chemisch synthetisiert werden.
  • Solche, für Transitpeptide codierenden Sequenzen können für die Konstruktion von anderen Expressionskonstrukten verwendet werden. Die Transitpeptide, die vorteilhafterweise im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden und die ein Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und Proteine sind, weisen typischerweise eine Länge von 20 bis 120 Aminosäuren, Vorzugsweise 25 bis 110, 30 bis 100 oder 35 bis 90 Aminosäuren, weiter bevorzugt 40 bis 85 Aminosäuren und am meisten bevorzugt 45 bis 80 Aminosäuren, auf und funktionieren post-translational, um das Protein zur Plastide, vorzugsweise zum Chloroplasten, zu lenken. Die Nukleinsäuresequenzen, welche solche Transitpeptide codieren, liegen stromaufwärts von der Nukleinsäuresequenz, die das reife Protein codiert. Für die korrekte molekulare Verknüpfung der das Transitpeptid codierenden Nukleinsäure und der das, ins Ziel zu lenkende, Protein codierenden Nukleinsäure ist es manchmal notwendig, zusätzliche Basen paare an der Verknüpfungsposition einzubringen, wodurch Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen gebildet werden, die nützlich für das molekulare Verknüpfen der verschiedenen Nukleinsäuremoleküle sind. Diese Prozedur könnte zu sehr wenigen zusätzlichen Aminosäuren am N-Terminus des reifen importierten Proteins führen, welche üblicherweise und vorzugsweise die Proteinfunktion nicht stören. In jedem Fall müssen die die zusätzlichen Basenpaare an der Verknüpfungsposition, welche Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen bildet, mit Sorgfalt ausgewählt werden, damit die Bildung von Stoppcodons oder Codons, welche Aminosäuren mit einem starken Einfluss auf die Proteinfaltung, wie z. B. Prolin, codieren, vermieden wird. Es ist bevorzugt, dass solche zusätzlichen Codons kleine strukturell flexible Aminosäuren, wie Glycin oder Alanin, codieren.
  • Wie oben erwähnt, können die Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein, wie in Tabelle II Spalte 3 oder 5 gezeigt, codiert, und ihre Homologe, wie in Tabelle I, Spalte 7, offenbart, an eine ein Transitpeptid codierende Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidisch” aufgeführt wird. Die Nukleinsäuresequenz des zu exprimierenden Gens und die das Transitpeptid codierende Nukleinsäuresequenz sind funktionsfähig verknüpft. Deshalb ist das Transitpeptid im Leseraster an die Nukleinsäuresequenz, die ein Protein, wie in Tabelle II Spalte 3 oder 5 gezeigt, codiert, und ihre Homologe, wie in Tabelle I, Spalte 7 offenbart, fusioniert, wenn z. B. für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidisch” aufgeführt wird.
  • Die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen translatierten Proteine sind eine Art von Fusionsproteinen, was bedeutet, dass die das Transitpeptid codierenden Nukleinsäuresequenzen, zum Beispiel jene, gezeigt in Tabelle V, zum Beispiel die letzte von der Tabelle, an ein Gen, z. B. die in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleinsäuresequenzen, verknüpft sind, wenn z. B. für das Nukleinsäuremolekül in der Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidisch” aufgeführt ist. Der Fachmann auf dem Gebiet ist in der Lage, die Sequenzen in einer funktionalen Weise zu verknüpfen. Vorteilhafterweise wird der Transitpeptid-Teil von dem in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Proteinteil während des Transports, vorzugsweise in die Plastiden hinein, abgespalten. Alle Produkte der Spaltung des in der letzten Zeile von Tabelle V gezeigten, bevorzugten Transitpeptids weisen vorzugsweise die N-terminalen Aminosäuresequenzen QIA CSS oder QIA EFQLTT vor dem Start-Methionin des in Tabelle II, Spalten 5 und 7, erwähnten Proteins auf. Andere kurze Aminosäuresequenzen mit einer Erstreckung von 1 bis 20 Aminosäuren, vorzugsweise 2 bis 15 Aminosäuren, weiter bevorzugt 3 bis 10 Aminosäuren, am meisten bevorzugt 4 bis 8 Aminosäuren, sind vor dem Startmethionin des Gens, z. B. des in Tabelle II, Spalten 5 und 7, erwähnten Proteins, ebenfalls möglich. Im Fall der Aminosäuresequenz QIA CSS stammen die drei Aminosäuren vor dem Startmethionin aus der LIC(= Ligations-unabhängige Klonierung)-Kassette. Diese kurze Aminosäuresequenz wird im Fall der Expression von Escherichia coli-Genen bevorzugt. Im Fall der Aminosäuresequenz QIA EFQLTT stammen die sechs Aminosäuren vor dem Startmethionin aus der LIC-Kassette. Diese kurze Aminosäuresequenz wird im Fall der Expression von S. cerevisiae-Genen bevorzugt. Der Fachmann weiß, dass auch andere kurze Sequenzen bei der Expression der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, erwähnten Gene, nützlich sind. Außerdem ist sich der Fachmann über die Tatsache bewusst, dass keine Notwendigkeit für solche kurzen Sequenzen bei der Expression der Gene besteht.
  • Alternativ zum Targeting des Gens, z. B. von Proteinen mit den in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen, vorzugsweise von Sequenzen, die im Allgemeinen im Zellkern codiert werden, mit Hilfe der zum Beispiel in Tabelle V erwähnten Targetingsequenzen allein oder in Kombination mit anderen Targetingsequenzen, vorzugsweise in die Plastiden hinein, können die Nukleinsäuren der Erfindung direkt in das plastidäre Genom eingebracht werden, z. B. für jene, für die in Spalte 6 von Tabelle II der Begriff ”plastidisch” aufgeführt ist. Deshalb werden, in einer bevorzugten Ausführungsform, das Gen, z. B. die in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleinsäuresequenzen, direkt in Plastiden eingebracht und exprimiert, insbesondere, wenn in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidisch” aufgeführt ist.
  • Durch Transformieren der Plastiden wird der Intraspezies-spezifische Transgen-Fluss blockiert, weil zahlreiche Spezies, wie Mais, Baumwolle und Reis, eine strikte maternale Vererbung von Plastiden aufweisen. Durch das Platzieren des Gens, z. B. der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, angegebenen Gene, z. B. wenn für das Nukleinsäuremolekül in Spalte 6 von Tabelle I der Bergiff ”plastidisch” aufgeführt ist, oder aktiver Fragmente davon in den Plastiden von Pflanzen werden diese Gene nicht im Pollen der Pflanzen vorhanden sein.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden das Gen, z. B. die Nukleinsäuremoleküle, wie in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigt, z. B. wenn in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”mitochondrial” angegeben ist, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, in Mitochondrien hinein transformiert, welche metabolisch aktiv sind.
  • Für eine gute Expression in den Plastiden werden das Gen, z. B. die Nukleinsäuresequenzen, wie in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigt, z. B. wenn in Spalte 6 von Tabelle I der Begriff ”plastidisch” angegeben ist, in eine Expressionskassette eingebracht, welche vorzugsweise einen Promotor und Terminator, die in Plastiden aktiv sind, vorzugsweise einen Chloroplastenpromotor, verwendet. Beispiele solcher Promotoren schließen den psbA-Promotor aus dem Gen aus Spinat oder Erbse, den rbcL-Promotor und den atpB-Promotor aus Mais ein.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere der folgenden Schritte:
    • (a) Stabilisieren eines Proteins, das die erhöhte Expression eines durch das Nukleinsäuremolekül der Erfindung codierten Proteins oder des Polypeptids der Erfindung mit der hierin erwähnten Aktivität, gewählt aus der Gruppe, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendes Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht, bewirkt und erhöhten Ertrag, z. B. die Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinschen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon bewirkt;
    • (b) Stabilisieren einer mRNA, welche die erhöhte Expression eines Polynukleotids bewirkt, das ein Polypeptid, wie in (a) erwähnt, codiert;
    • (c) Erhöhen der spezifischen Aktivität eines Proteins, das die erhöhte Expression eines Polypeptids, wie in (a) erwähnt, bewirkt;
    • (d) Herbeiführen oder Erhöhen der Expression eines endogenen oder künstlichen Transkriptionsfaktors, der die Expression eines Proteins vermittelt, welches die erhöhte Expression eines Polypeptids, wie in (a) erwähnt, bewirkt;
    • (e) Stimulieren der Aktivität eines Proteins, welches die erhöhte Expression eines Polypeptids, wie in (a) erwähnt, bewirkt, durch Hinzusetzen von einem oder mehreren exogenen induzierenden Faktoren zu dem Organismus oder Teilen davon;
    • (f) Exprimieren eines transgenen Gens, das ein Protein codiert, welches die erhöhte Expression eines Polypeptids, wie in (a) erwähnt, bewirkt; und/oder
    • (g) Erhöhen der Kopienzahl eines Gens, was die erhöhte Expression eines Nukleinsäuremoleküls bewirkt, das ein Polypeptid, wie in (a) erwähnt, codiert;
    • (h) Erhöhen der Expression des endogenen Gens, welches ein Polypeptid, wie in (a) erwähnt, codiert, durch Hinzufügen von positiven Expressions- oder Entfernen von negativen Expressionselementen, wobei man z. B. homologe Rekombination anwenden kann, um entweder positive regulatorische Elemente, wie bei Pflanzen den 35S-Enhancer, in den Promotor einzubringen oder Repressorelemente aus regulatorischen Regionen zu entfernen. Weitere Genkonversions-Verfahren können angewandt werden, um Repressorelemente zu zerstören oder die Aktivität von positiven Elementen zu steigern – positive Elemente können statistisch durch T-DNA- oder Transposon-Mutagenese in Pflanzen eingeführt werden, und es können Linien identifiziert werden, in denen die positiven Elemente in der Nähe zu einem Gen der Erfindung integriert worden sind, dessen Expression dadurch gesteigert wird; und/oder
    • (i) Modulieren der Wachstumsbedingungen der Pflanze in einer solchen Weise, dass die Expression oder Aktivität des Gens, das ein Polypeptid, wie in (a) erwähnt, codiert, oder des Proteins selbst gesteigert wird;
    • (j) Auswählen von Organismen mit besonders hoher Aktivität eines Polypeptids, wie in (a) erwähnt, aus natürlichen oder aus mutagenisierten Resourcen und Heranzüchten derselben zu den Zielorganismen, z. B. den Elite-Nutzpflanzen.
  • Vorzugsweise wird von dem Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung die mRNA und/oder das Protein, welche(s) die erhöhte Expression eines von dem Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung allein, oder verknüpft an eine Transit-Nukleinsäuresequenz oder eine Transitpeptid-codierende Nukleinsäuresequenz, codierten Proteins bewirkt, oder das Polypeptid codiert, welche(s) die hierin erwähnte Aktivität aufweist, z. B. vermittelnd einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon, nach Erhöhen der Expression oder Aktivität des codierten Polypeptids, oder die Aktivität eines Polypeptids aufweist, das eine Aktivität wie das Protein, wie in Tabelle II Spalte 3 gezeigt, oder dessen Homologe aufweist.
  • Im Allgemeinen korreliert die Menge an mRNA oder Polypeptid in einer Zelle oder einem Kompartiment eines Organismus mit der Menge an codiertem Protein und daher mit der Gesamtaktivität des codierten Proteins in dem Volumen. Diese Korrelation ist nicht immer linear, die Aktivität in dem Volumen ist von der Stabilität der Moleküle oder der Gegenwart von aktivierenden oder inhibierenden Cofaktoren abhängig. Die Aktivität der oben erwähnten Proteine und/oder Polypeptide, die von dem Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung codiert sind, kann auf verschiedenen Wegen erhöht werden. Zum Beispiel wird die Aktivität in einem Organismus oder in einem Teil davon, wie einer Zelle, durch Erhöhung der Genproduktanzahl, z. B. durch Erhöhung der Expressionsrate, wie bei Einbringen eines stärkeren Promotors, oder durch Erhöhung der Stabilität der exprimierten mRNA, wodurch die Translationsrate angehoben wird, und/oder Erhöhung der Stabilität des Genprodukts, wodurch der Abbau der Proteine verringert wird, erhöht. Ferner kann die Aktivität oder der Turnover bzw. Umsatz von Enzymen auf eine solche Weise beeinflusst werden, dass eine Verringerung oder Erhöhung der Reaktionsrate oder eine Modifikation (Verringerung oder Erhöhung) der Affinität zum Substrat resultiert, erreicht wird. Eine Mutation im katalytischen Zentrum eines Polypeptids der Erfindung, z. B. wie einem Enzym, kann die Turnover-Rate des Enzyms modulieren, z. B. kann ein Knockout einer essentiellen Aminosäure zu einer Reduktion oder zum völligen Knockout der Aktivität des Enzyms führen, oder die Deletion oder Mutation von Regulatorbindungsstellen kann eine Negativregulierung, wie eine Rückkopplungs-Inhibition (oder eine Substrathemmung, wenn der Substratspiegel ebenfalls erhöht wird), vermindern. Die spezifische Aktivität eines Enzyms der vorliegenden Erfindung kann so erhöht werden, dass die Turnover-Rate erhöht ist oder die Bindung eines Cofaktors verbessert wird. Die Verbesserung der Stabilität der codierenden mRNA oder des Proteins kann ebenfalls die Aktivität eines Genprodukts erhöhen. Die Stimulation der Aktivität fällt ebenfalls unter den Umfang des Begriffs ”erhöhte Aktivität”.
  • Darüber hinaus kann die Regulierung der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen so modifiziert werden, dass die Genexpression erhöht wird. Dies kann in vorteilhafter Weise mittels heterologer regulatorischer Sequenzen oder durch Modifizieren, zum Beispiel Mutieren, der natürlichen regulatorischen Sequenzen, welche vorhanden sind, erreicht werden. Die vorteilhaften Verfahren können auch miteinander kombiniert werden.
  • Im Allgemeinen kann eine Aktivität eines Genprodukts in einem Organismus oder einem Teil davon, insbesondere in einer Pflanzenzelle oder einer Organelle einer Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Pflanzengewebe oder einem Teil davon oder in einem Mikroorganismus, durch Erhöhen der Menge der spezifischen codierenden mRNA oder des entsprechenden Proteins in dem Organismus oder einem Teil davon erhöht werden.
  • Eine Modifikation, d. h. eine Erhöhung, kann durch endogene oder exogene Faktoren verursacht werden. Zum Beispiel kann eine Erhöhung in der Aktivität in einem Organismus oder einem Teil davon durch Hinzusetzen eines Genprodukts oder eines Vorläufers oder eines Aktivators oder eines Agonisten zu den Medien oder Nährmitteln verursacht werden oder kann durch transientes oder stabiles Einbringen dieser Objekte in einen Organismus verursacht werden. Darüber hinaus kann eine solche Erhöhung durch das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder des codierten Proteins in das korrekte Zellkompartiment, zum Beispiel jeweils in den Zellkern oder das Cytoplasma oder in Plastiden, entweder durch Transformation und/oder Targeting erreicht werden.
  • In einer Ausführungsform wird der erhöhte Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder ein(e) erhöhte(r) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischer Ertrag und/oder eine andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, in der Pflanze oder einem Teil davon, z. B. in einer Zelle, einem Gewebe, einem Organ, einer Organelle, dem Cytoplasma etc., durch Erhöhung des endogenen Spiegels des Polypeptids der Erfindung erzielt.
  • Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren, worin die Genkopienzahl eines Gens, welches das Polynukleotid oder Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert, erhöht wird. Ferner kann der endogene Spiegel des Polypeptids der Erfindung zum Beispiel durch Modifizieren der transkriptionellen oder translationalen Regulierung des Polypeptids erhöht werden.
  • In einer Ausführungsform kann der erhöhte Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder ein(e) erhöhte(r) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischer Ertrag und/oder eine andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft der Pflanze oder eines Teils davon durch zielgerichtete oder zufällige Mutagenese der endogenen Gene der Erfindung verändert werden. Zum Beispiel kann man eine homologe Rekombination anwenden, um entweder positive regulatorische Elemente, wie bei Pflanzen den 35S-Enhancer, in den Promotor einzubringen oder Repressorelemente aus regulatorischen Regionen zu entfernen. Weiterhin können Genkonversions-Verfahren, wie etwa Verfahren, die bei Kochevenko und Willmitzer (Plant Physiol. 132 (1), 174 (2003)) und den Zitierstellen darin beschrieben sind, angewandt werden, um Repressorelemente zu zerstören oder die Aktivität von positiven regulatorischen Elementen zu steigern.
  • Ferner können positive Elemente statistisch durch T-DNA- oder Transposon-Mutagenese in (Pflanzen) genome eingeführt werden, und es kann hinsichtlich Linien gescreent werden, in denen die positiven Elemente in der Nähe zu einem Gen der Erfindung integriert worden sind, dessen Expression dadurch gesteigert wird. Die Aktivierung von Pflanzengenen durch Zufalls-Integrationen von Enhancer-Elementen ist bei Hayashi et al. (Science 258,1350 (1992)) oder Weigel et al. (Plant Physiol. 122, 1003 (2000)) und anderen, die darin zitiert werden, beschrieben worden. Die Verstärkung von positiven regulatorischen Elementen oder die Disruption oder Schwächung von negativen regulatorischen Elementen kann auch durch übliche Mutagenesetechniken erreicht werden: Die Herstellung von chemisch oder durch Strahlung mutierten Populationen ist eine gewöhnliche Technik und dem Fachmann bekannt. Verfahren für Pflanzen sind bei Koorneef et al. (Mutat Res. Mar. 93 (1) (1982)) und den Zitäten darin und bei Lightner und Caspar in ”Methods in Molecular Biology” Bd. 82 beschrieben. Diese Techniken induzieren üblicherweise Punktmutationen, welche in einem beliebigen bekannten Gen identifiziert werden kämen, wobei Verfahren wie TILLING (Colbert et al., Plant Physiol, 126, (2001)) zur Anwendung kommen.
  • Demgemäß kann der Expressionsspiegel erhöht werden, wenn die endogenen Gene, welche ein Polypeptid codieren, das eine erhöhte Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung bewirkt, insbesondere Gene, welche das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfassen, mittels homologer Rekombination, Tilling-Vorgehensweisen oder Gen-Konversion modifiziert werden. Es ist, wie hierin erwähnt, ebenfalls möglich, Targeting-Sequenzen an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen anzufügen.
  • Regulatorische Sequenzen, falls gewünscht zusätzlich zu einer Target-Sequenz oder einem Teil davon, können operativ mit der codierenden Region eines endogenen Proteins verknüpft werden und deren Transkription und Translation oder die Stabilität oder den Abbau der codierenden mRNA oder des exprimierten Proteins steuern. Um die Expression zu modifizieren und zu steuern, können Promotor, UTRs, Spleißstellen, Prozessierungssignale, Polyadenylierungsstellen, Terminatoren, Enhancer, Repressoren, posttranskriptionale oder posttranslationale Modifikationsstellen ausgewechselt, hinzugefügt oder verändert werden. Zum Beispiel ist die Aktivierung von Pflanzengenen durch Zufallsintegrationen von Enhancer-Elementen bei Hayashi et al. (Science 258, 1350 (1992)) oder Weigel et al. (Plant Physiol. 122, 1003 (2000)) und anderen, die darin zitiert werden, beschrieben worden. Zum Beispiel kann der Expressionsspiegel des endogenen Proteins durch Ersetzen des endogenen Promotors mit einem stärkeren transgenen Promotor oder durch Ersetzen der endogenen 3'UTR mit einer 3'UTR, die mehr Stabilität vorsieht, ohne Verändern der codierenden Region, moduliert werden. Ferner kann die transkriptionelle Regulierung durch Einbringung eines künstlichen Transkriptionsfaktors, wie in den Beispielen beschrieben, moduliert werden. Alternative Promotoren, Terminatoren und UTR sind nachstehend beschrieben.
  • Die Aktivierung eines endogenen Polypeptids mit der oben erwähnten Aktivität, z. B. mit der Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigt, oder des Polypeptids der Erfindung, welche z. B. einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder eine andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon nach Erhöhung der Expression oder Aktivität im Cytoplasma und/oder in einer Organelle, wie einer Plastide, vermittelt, kann auch durch Einbringen eines synthetischen Transkriptionsfaktors erhöht werden, welcher nahe der codierenden Region des Gens bindet, welches das Protein, wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigt, codiert, und dessen Transkription aktiviert.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung werden Organismen verwendet, in denen eines der oben erwähnten Gene, oder eine der oben erwähnten Nukleinsäuren, auf eine Weise mutiert ist, dass die Aktivität der codierten Genprodukte im Vergleich zu den nicht-mutierten Proteinen durch zelluläre Faktoren weniger, oder überhaupt nicht, beeinflusst wird. Zum Beispiel sind allgemein bekannte Regulierungsmechanismen der Enzymaktivität Substratinhibitions- oder Rückkopplungs-Regulierungsmechanismen. Wege und Techniken zur Einführung von Substitution, Deletionen und Additionen von einer oder mehreren Base, Nukleotiden oder Aminosäuren einer entsprechenden Sequenz sind hierin nachstehend in den entsprechenden Textabschnitten und den darin aufgelisteten Referenzen, z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, NY, 1989, beschrieben Der Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, Regulationsdomänen und Bindungsstellen von Regulatoren durch Vergleichen der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung oder des Expressionsprodukts davon mit dem Stand der Technik durch Computersoftware-Methoden, welche Algorithmen zum Identifizieren von Bindungsstellen und Regulationsdomänen umfassen, oder durch systematisches Einführen von Mutationen in ein Nukleinsäuremolekül oder in ein Protein und Testen hinsichtlich derjenigen Mutationen, welche zu einer erhöhten spezifischen Aktivität oder einer erhöhten Aktivität pro Volumen, insbesondere pro Zelle, führen, zu identifizieren.
  • Es kann daher vorteilhaft sein, in einem Organismus ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder ein Polypeptid der Erfindung, das aus einem evolutionär entfernt verwandten Organismus abgeleitet ist, wie z. B. unter Verwendung eines prokaryotischen Gens in einem eukaryotischen Wirt, zu exprimieren, da in diesen Fällen der Regulationsmechanismus der Wirtszelle die (zelluläre oder spezifische) Aktivität des Gens oder seines Expressionsprodukts nicht abschwächen kann.
  • Die Mutation wird auf solche Weise eingebracht, dass ein erhöhter Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder ein(e) erhöhte(r) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischer Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft nicht nachteilig beeinflusst werden.
  • Die Erfindung sieht vor, dass die oben genannten Verfahren so durchgeführt werden können, dass gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischer Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaften erhöht werden, wobei insbesondere die Toleranz gegenüber niedriger Temperatur erhöht wird.
  • Die Erfindung ist nicht auf spezifische Nukleinsäuren, spezifische Polypeptide, spezifische Zelltypen, spezifische Wirtszellen, spezifische Bedingungen oder spezifische Verfahren etc. als solches eingeschränkt, sondern kann variieren, und zahlreiche Modifikationen und Variationen daran werden dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein. Es versteht sich ebenso, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich zum Zwecke der Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen dient und nicht als einschränkend beabsichtigt ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls isolierte Nukleinsäuren, die ein Nukleinsäuremolekül umfassen, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einem Nukleinsäuremolekül, welches das in Spalte 7 von Tabelle IIB gezeigte Polypeptid codiert;
    • (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 7 von Tabelle IB gezeigt ist,
    • (c) einem Nukleinsäuremolekül, das, als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II aufgeführten Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann und erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (d) einem Nukleinsäuremolekül, das 30% oder mehr, vorzugsweise 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, oder oder mehr Identität zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigte Nukleinsäuremolekül, aufweist und erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (e) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit 30% oder mehr, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% oder mehr Identität zu der Aminosäuresequenz des von dem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c) oder (d) codierten Polypeptids codiert, und die Aktivität, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle 1 aufgeführt, aufweist und einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (f) Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c), (d) oder (e) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (g) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt wurden, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) codiert wird, und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie es in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt ist;
    • (h) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches die Consensussequenz oder ein oder mehr Polypeptidmotive umfasst, wie in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, umfassend ein Polypeptid, wie es in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt ist;
    • (i) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie es in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt ist, und erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (j) Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, welches durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erhalten wird und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt; und
    • (k) einem Nukleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek, speziell einer cDNA-Bibliothek und/oder einer genomischen Bibliothek, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, aufweisend 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 750 nt oder 1000 nt oder mehr von einem Nukleinsäuremolekül, komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein repräsentiert wird, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt.
  • In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül gemäß (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) und (k) wenigstens in einem oder mehreren Nukleotiden verschieden zu der Sequenz, die in der Spalte 5 oder 7 der Tabelle IA aufgeführt ist, und codiert vorzugsweise ein Protein, das sich wenigstens in einer oder mehreren Aminosäuren von den Proteinsequenzen, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA aufgeführt sind, unterscheidet. Zum Beispiel ist das Nukleinsäuremolekül gemäß (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) und (k) aus der Tabelle IB.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung Homologe der oben erwähnten Sequenzen, welche in vorteilhafter Weise aus Hefe, Pilzen, Viren, Algen, Bakterien, wie Acetobacter (subgen. Acetobacter) acet;i Acidithiobacillus ferrooxidans; Acinetobacter sp.; Actinobacillus sp; Aeromonas salmonicida; Agrobacterium tumefaciens; Aquifex aeolicus; Arcanobacterium pyogenes; Aster yellows phytoplasma; Bacillus sp.; Bifidobacterium sp.; Borrelia burgdorferi; Brevibacterium linens; Brucella melitensis; Buchnera sp.; Butyrivibrio fibrisolvens; Campylobacter jejuni; Caulobacter crescentus; Chlamydia sp.; Chlamydophila sp.; Chlorobium limicola; Citrobacter rodentium; Clostridium sp.; Comamonas testosteroni; Corynebacterium sp.; Coxiella burnetii; Deinococcus radiodurans; Dichelobacter nodosus; Edwardsiella ictaluri, Enterobacter sp.; Erysipelothrix rhusiopathiae; E. coli; Flavobacterium sp.; Francisella tularensis; Frankia sp. Cpl1; Fusobacterium nucleatum; Geobacillus stearothermophilus; Gluconobacter oxydans; Haemophilus sp.; Helicobacter pylori; Klebsiella pneumoniae; Lactobacillus sp.; Lactococcus lactis; Listeria sp.; Mannheimia haemolytica; Mesorhizobium loti; Methylophaga thalassica; Microcystis aeruginosa; Microscilla sp. PRE1; Moraxella sp. TA144; Mycobacterium sp.; Mycoplasma sp.; Neisseria sp.; Nitrosomonas sp.; Nostoc sp. PCC 7120; Novosphingobium aromaticivorans; Oenococcus oeni; Pantoea citrea; Pasteurella multocida; Pediococcus pentosaceus; Phormidium foveolarum; Phytoplasma sp.; Plectonema boryanum; Prevotella ruminicola; Propionibacterium sp.; Proteus vulgaris; Pseudomonas sp.; Ralstonia sp.; Rhizobium sp.; Rhodococcus equi; Rhodothermus marinus; Rickettsia sp.; Riemerella anatipestifer; Ruminococcus flavefaciens; Salmonella sp.; Selenomonas ruminantium; Serratia entomophila; Shigella sp.; Sinorhizobium meliloti; Staphylococcus sp.; Streptococcus sp.; Streptomyces sp.; Synechococcus sp.; Synechocystis sp. PCC 6803; Thermotoga maritima; Treponema sp.; Ureaplasma urealyticum; Vibrio cholerae; Vibrio parahaemolyticus; Xylella fastidiosa; Yersinia sp.; Zymomonas mobilis, vorzugsweise Salmonella sp. oder E. coli oder Pflanzen, vorzugsweise aus Hefen, wie aus den Gattungen Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis oder Schizosaccharomyces, oder Pflanzen, wie zum Beispiel A. thaliana, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Borretsch, Sonnenblume, Leinsamen, Primel, Raps, Canola und Rübsen, Maniok, Pfeffer/Paprika, Sonnenblume, Tagetes, Nachtschattengewächsen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Strauchpflanzen, wie Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, Bäumen, wie Ölpalme, Kokosnuss, perennierendem Gras, wie Ray- bzw. Weidelgras und Schwingel, und Futterpflanzen, wie Alfalfa und Klee und aus Fichte, Kiefer oder Tanne, isoliert werden können. Weiter bevorzugt können Homologe der vorangehend erwähnten Sequenzen aus S. cerevisiae, E. coli oder Synechocystis sp. oder Pflanzen, vorzugsweise Brassica napus, Glycine max, Zea mays, Baumwolle oder Oryza sativa isoliert werden.
  • Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Zum Beispiel wird ein Nukleinsäuremolekül, welches das Protein codiert, in einen Expressionsvektor, zum Beispiel in einen binären Vektor, kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle, zum Beispiel die A. thaliana Wildtyp NASC N906 oder eine beliebige andere Pflanzenzelle, wie in den Beispielen, siehe unten, beschrieben, eingebracht, und das Protein wird in der Wirtszelle exprimiert. Beispiel für binäre Vektoren sind pBIN19, pBI101, pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66, 221 (1990)), pGPTV, pCAMBIA, pBIB-HYG, pBecks, pGreen oder pPZP (Hajukiewicz, P., et al., Plant Mal. Biol. 25, 989 (1994), und Hellens et al., Trends in Plant Science 5, 446 (2000)).
  • In einer Ausführungsform wird das Protein der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in einem Kompartiment der Zelle, z. B. in den Plastiden, produziert. Wege zum Einführen von Nukleinsäuren in Plastiden und Erzeugen von Proteinen in diesem Kompartiment sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind auch in dieser Anmeldung beschrieben worden. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid der Erfindung ein Protein, das nach der Expression, wie in Spalte 6 von Tabelle II angegeben, z. B. nicht-zielgelenkt, mitochondrial oder plastidisch lokalisiert wird, wobei es zum Beispiel an ein Transitpeptid fusioniert ist, wie es oben für plastidische Lokalisierung beschrieben ist. In einer anderen Ausführungsform wird das Protein der vorliegenden Erfindung ohne weiteres Targetingsignal (z. B. wie hierin erwähnt), z. B. im Cytoplasma der Zelle, produziert. Wege zum Produzieren von Proteinen im Cytoplasma sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Wege zum Produzieren von Proteinen ohne künstliches Targeting sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
  • In vorteilhafter Weise werden die Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung oder das Genkonstrukt zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, welche über einen Vektor in den Organismus oder direkt in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte den einfachen Nachweis über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemikalien-, Biolumineszenz- oder Toleranz-Assay oder durch eine photometrische Messung erlauben. Beispiele von Reportergenen, welche erwähnt werden können, sind Antibiotikum- oder Herbizid-Toleranzgene, Hydrolase-Gene, Fluoreszenz-Protein-Gene, Biolumineszenz-Gene, Zucker- oder Nukleotid-Stoffwechsel-Gene oder Biosynthese-Gene, wie das Ura3-Gen, das IIv2-Gen, das Luziferase-Gen, das β-Galactosidase-Gen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6-phosphat-Phosphatase-Gen, das β-Glucuronidase-Gen, β-Lactamase-Gen, das Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das Hygromycin-Phosphotransferase-Gen, ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase(AHAS)-Gen (auch bekannt als Acetolactat-Synthase(ALS)-Gen), ein Gen für ein D-Aminosäure-metabolisierendes Enzym oder das BASTA(= Gluphosinat-Toleranz)-Gen. Diese Gene erlauben die einfache Messung und Quantifizierung der Transkriptionsaktivität und somit der Expression der Gene. Auf diese Weise können Genompositionen identifiziert werden, welche unterschiedliche Produktivität aufzeigen. Für die Expression ist ein Fachmann auf dem Gebiet mit verschiedenen Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuresequenzen in verschiedene Organellen, wie etwa die bevorzugten Plastiden, vertraut. Solche Verfahren sind zum Beispiel bei Maiga P. (Annu. Rev. Plant Biol. 55, 289 (2004)), Evans T. ( WO 2004/040973 ), McBride K. E. et al. ( US 5 455 818 ), Daniell H. et al. ( US 5 932 479 und US 5 693 507 ) und Straub J. M. et al. ( US 6 781 033 ) offenbart. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Transformation von Mikrosporenabgeleitetem Hypokotyl- oder Kotyledonen-Gewebe (welche grün sind und daher zahlreiche Plastiden enthalten), Blattgewebe, und danach die Regeneration von Sprossen aus dem transformierten Pflanzenmaterial auf einem selektiven Medium. Als Verfahren für die Transformation sind dem Fachmann das Beschießen des Pflanzenmaterials oder die Verwendung von unabhängig replizierenden Shuttle-Vektoren allgemein bekannt. Aber auch eine PEG-vermittelte Transformation der Plastiden oder eine Agrobacterium-Transformation mit binären Vektoren ist möglich. Nützliche Marker für die Transformation von Plastiden sind positive Selektionsmarker, zum Beispiel die Chloramphenicol-, Streptomycin-, Kanamycin-, Neomycin-, Amikamycin-, Spectinomycin-, Triazin- und/oder Lincomycin-Toleranz-Gene. Als zusätzliche Marker, die in der Literatur oft als sekundäre Marker genannt werden, sind Gene, codierend für die Toleranz gegen Herbizide, wie Phosphinothricin (= Glufosinat, BASTATM LibertyTM, codiert von dem bar-Gen), Glyphosat(= N-(Phosphonomethyl)glycin, RoundupTM, codiert von dem 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Gen = epsps), Sulfonylharnstoffe (wie StapleTM, codiert von dem Acetolactat-Synthase(ALS)-Gen), Imidazolinone [= IMI, wie Imazethapyr, Imazamox, ClearfieldTM, codiert von dem Acetohydroxysäure-Synthase(AHAS)-Gen, auch bekannt als Acetolactat-Synthase(ALS)-Gen] oder Bromoxynil (= BuctrilTM, codiert von dem oxy-Gen), oder Gene, die für Antibiotika, wie Hygromycin oder G418, codieren, für eine weitere Selektion brauchbar. Derartige sekundäre Marker sind in dem Fall nützlich, wenn die meisten Genomkopien transformiert werden. Darüber hinaus sind auch negative Selektionsmarker, wie die bakterielle Cytosin-Deaminase (codiert von dem codA-Gen), für die Transformation von Plastiden nützlich.
  • Um die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung von Transformanten zu erhöhen, ist es ebenfalls wünschenswert, Reportergene, verschieden von den oben erwähnten Toleranzgenen, oder zusätzlich zu den Genen, zu verwenden. Reportergene sind zum Beispiel β-Galactosidase-, β-Glucuronidase(GUS)-, Alkalische-Phosphatase- und/oder Grün-Fluoreszierendes-Protein(GFP)-Gene.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Nukleinsäurekonstrukt, zum Beispiel eine Expressionskassette, stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der codierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls andere regulatorische Elemente, welche funktionsmäßig an die dazwischenliegende codierende Sequenz mit einer der Nukleinsäuren mit einer SEQ ID NR:, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7, aufgeführt, verknüpft sind. Mit einer funktionsmäßigen bzw. operativen Verknüpfung wird die sequentielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls anderen regulatorischen Elementen auf eine solche Weise gemeint, dass jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz in angemessener Weise erfüllen kann. In einer Ausführungsform sind die Sequenzen, die für die funktionsmäßige Verknüpfung bevorzugt werden, Targeting-Sequenzen zur Sicherstellung der subzellulären Lokalisierung in Plastiden. Allerdings können auch Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung einer subzellulären Lokalisierung im Mitochondrium, im endoplasmatischen Retikulum (= ER), im Zellkern, in Ölkorpuskeln oder anderen Kompartimenten verwendet werden, ebenso wie Translationsförderer, wie etwa die 5'-Lead-Sequenz im Tabakmosaikvirus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 8693 (1987)).
  • Ein Nukleinsäurekonstrukt, zum Beispiel eine Expressionskassette, kann zum Beispiel einen konstitutiven Promotor oder einen gewebespezifischen Promotor (vorzugsweise den USP- oder Napin-Promotor), das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthalten. Für das ER-Retentionssignal wird vorzugsweise die KDEL-Aminosäuresequenz (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) oder die KKX-Aminosäuresequenz (Lysin-Lysin-X-Stopp, wobei X jegliche andere bekannte Aminosäure bedeutet) verwendet.
  • Für die Expression in einem Wirtsorganismus, zum Beispiel einer Pflanze, wird die Expressionskassette in vorteilhafter Weise in einen Vektor inseriert, wie zum Beispiel ein Plasmid, einen Phagen oder eine sonstige DNA, die eine optimale Expression der Gene im Wirtsorganismus zulässt. Beispiele von geeigneten Plasmiden sind folgende: in E. coli pLG338, pACYC184, pBR-Serie, wie z. B. pBR322, pUC-Serie, wie pUC18 oder pUC19, M113mp-Series, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 oder pBdCl; in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361; in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214; in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667; in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116; andere vorteilhafte Pilzvektoren sind bei Romanos, M. A., et al., Yeast 8, 423 (1992) und bei van den Hondel, C. A. M. J. J., et al. [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi"] sowie in "More Gene Manipulations" in "Fungi" in Bennet J. W. & Lasure L. L., Hrsg., S. 396–428, Academic Press, San Diego, und in "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [van den Handel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Hrsg.: Peberdy, J. F. et al., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Beispiele von vorteilhaften Hefepromotoren sind 2 μM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Beispiele von Algen- oder Pflanzenpromotoren sind pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R., und Willmitzer, L., Plant Cell Rep. 7, 583 (1988)). Die oben identifizierten Vektoren oder Derivate der oben identifizierten Vektoren sind eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide. Weitere Plasmide sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und können, zum Beispiel, in "Cloning Vectors" (Hrsg.: Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) gefunden werden. Geeignete Pflanzenvektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press, Kap. 6/7, S. 71–119) beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind als Shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren bekannt, welche in E. coli und Agrobacterium replizieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Vektors kann die Expressionskassette gemäß der Erfindung auch vorteilhaft in der Form einer linearen DNA in die Organismen eingebracht und mittels heterologer oder homologer Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus der Expressionskassette als Vektor oder den Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung aufgebaut sein.
  • Eine Nukleinsäuresequenz kann auch für sich allein in einen Organismus eingeführt werden.
  • Wenn zusätzlich zu der Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung weitere Gene in den Organismus eingeführt werden sollen, können alle gemeinsam mit einem Reportergen auf einem einzigen Vektor eingeführt werden, oder jedes einzelne Gen kann mit einem Reportergen auf einem Vektor für jeden Fall in den Organismus eingeführt werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder nacheinander eingebracht werden können.
  • Der Vektor enthält vorteilhafterweise mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung und/oder der Expressionskassette (= Genkonstrukt) gemäß der Erfindung.
  • Die Erfindung stellt ferner einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine Nukleinsäure umfasst, die ein Polypeptid, wie in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, aufgeführt, codiert, wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienzgrad, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer Wildtypvarietät der Wirtszelle, herbeiführt.
  • Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen eine Nukleinsäure der Erfindung in einer zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeigneten Form, was heißt, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen einschließen, gewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, welche an die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz funktionsfähig bzw. operativ verknüpft ist/sind. Der Fachmann auf dem Gebiet wird es richtig einschätzen, dass der Entwurf des Expressionsvektors von solchen Faktoren, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Spiegel der Expression des Polypeptids, etc., abhängen kann. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingebracht werden, um dadurch Polypeptide oder Peptide zu produzieren, einschließlich Fusionspolypeptiden oder -peptiden, welche von Nukleinsäuren, wie hierin beschrieben, codiert sind.
  • Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können zur Expression des Polypeptids der Erfindung in Pflanzenzellen ausgelegt sein. Zum Beispiel können Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung in Pflanzenzellen exprimiert werden (siehe Schmidt, R., und Willmitzer, L., Plant Cell Rep. 7 (1988); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); White, F. F., Jenes, B., et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung und Wu R., 128–43, Academic Press: 1993; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991) und darin zitierte Bezugsstellen). Geeignete Wirtszellen sind weiterhin in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990), erörtert. Als Beispiel kann die Pflanzen-Expressionskassette im pRT-Transformationsvektor installiert werden ((a) Toepfer et al., Methods Enzymol. 217, 66 (1993), (b) Toepfer et al., Nucl. Acids. Res. 15, 5890 (1987)). Alternativ kann ein rekombinanter Vektor (= Expressionsvektor) auch in vitro transkribiert und translatiert werden, z. B. unter Verwendung des T7-Promotors und der T7-RNA-Polymerase.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung in Pflanzen und Pflanzenzellen, wie unizellulären Pflanzenzellen (z. B. Algen) (siehe Falciatore et al, Marine Biotechnology 1 (3), 239 (1999) und Bezugsstellen darin) und Pflanzenzellen von höheren Pflanzen (z. B. den Spermatophyten, wie Nutzpflanzen), zum Beispiel zum Regenerieren von Pflanzen aus den Pflanzenzellen, exprimiert. Ein Nukleinsäuremolekül, das in der Tabelle II, Spalte 5 oder 7, aufgeführt ist, kann in eine Pflanzenzelle durch beliebige Methoden ”eingebracht” werden, einschließlich Transfektion, Transformation oder Transduktion, Elektroporation, Partikel-Beschuss, Agroinfektion, und dergleichen. Ein dem Fachmann auf dem Gebiet bekanntes Transformationsverfahren ist das Eintauchen eines blühenden Teils in eine Agrobakterien-Lösung, wobei die Agrobakterien die Nukleinsäure der Erfindung enthalten, wonach sich das Aufzüchten der transformierten Gameten anschließt. Andere geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, kann man in Sambrook et al., siehe oben, und sonstigen Laboratoriums-Handbüchern, wie etwa "Methods in Molecular Biology", 1995, Bd. 44, "Agrobacterium protocols", Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, finden.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Transfektion eines Nukleinsäuremoleküls, codierend für ein Nukleinsäuremolekül, das in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, aufgeführt ist, in eine Pflanze durch Agrobacterium-vermittelten Gentransfer erreicht. Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens-Stamms GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204, 383 (1986)) oder LBA4404 (Clontech) durchgeführt werden. Die Transformation kann durch standardmäßige Transformations- und Regenerationstechniken (Deblaere et al., Nucl. Acids Res. 13, 4777 (1994), Gelvin, Stanton B. und Schilperoort Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl. – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick Bernard R., Thompson John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2) durchgeführt werden. Zum Beispiel kann Raps durch Kotyledon- oder Hypokotyl-Transformation (Moloney et al., Plant Cell Report 8, 238 (1989); De Block et al., Plant Physiol. 91, 694 (1989)) transformiert werden. Die Verwendung von Antibiotika für Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem binären Vektor und dem Agrobacterium-Stamm ab, die für die Transformation verwendet werden. Raps-Selektion wird normalerweise unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzen-Marker durchgeführt. Agrobacterium-vermittelter Gentransfer zu Flachs kann, zum Beispiel, mit Hilfe einer bei Mlynarova et al., Plant Cell Report 13, 282 (1994) beschriebenen Technik durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Transformation von Sojabohne zum Beispiel mit Hilfe einer im Europäischen Patent Nr. 424 047 , U.S.-Patent Nr. 5 322 783 , Europäischen Patent Nr. 397 687 , U.S.-Patent Nr. 5 376 543 oder U.S.-Patent Nr. 5 169 770 beschriebenen Technik durchgeführt werden. Die Transformation von Mais kann durch Partikelbeschuss, Polyethylenglycol-vermittelte DNA-Aufnahme oder mittels der Siliziumcarbidfasertechnik erreicht werden (siehe zum Beispiel, Freeling und Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezifisches Beispiel von Maistransformation findet man im U.S.-Patent Nr. 5 990 387 , und ein spezifisches Beispiel von Weizentransformation kann in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256 gefunden werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das eingebrachte Nukleinsäuremolekül, das für ein in der Tabelle II, Spalte 5 oder 77, aufgeführtes Polypeptid(e) oder Homologe davon codiert, stabil in der Pflanzenzelle gehalten werden, wenn es in ein nicht-chromosomales autonomes Replikon eingebunden oder in die Pflanzenchromosomen oder das Organellen-Genom integriert wird. Alternativ dazu kann das eingebrachte Nukleinsäuremolekül auf einem extrachromosomalen nicht-replizierenden Vektor vorliegen und transient exprimiert werden oder transient aktiv sein.
  • In einer Ausführungsform kann ein homolog-rekombinanter Mikroorganismus erzeugt werden, wobei das Nukleinsäuremolekül in ein Chromosom integriert wird, ein Vektor hergestellt wird, welcher mindestens einen Teil eines Nukleinsäuremoleküls enthält, das für ein Protein codiert, das in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, aufgeführt ist, in welches eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt worden ist, um dadurch das Gen zu ändern, z. B. funktional zu disruptieren. Zum Beispiel ist das Gen ein Hefegen, wie ein Gen von S. cerevisiae, oder aus Synechocystis, oder ein bakterielles Gen, wie ein E. coli-Gen, aber es kann ein Homolog aus einer verwandten Pflanze oder sogar aus einer Säuger- oder Insektenquelle sein. Der Vektor kann so entworfen sein, dass, nach einer homologen Rekombination, das endogene Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein codiert, das in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, aufgeführt ist, mutiert oder anderweitig verändert ist, aber noch ein funktionales Polypeptid codiert (z. B., kann die stromaufwärts gelegene regulatorische Region verändert werden, um dadurch die Expression des endogenen Nukleinsäuremoleküls zu verändern). In einer bevorzugten Ausführungsform wird die biologische Aktivität des Proteins der Erfindung nach einer homologen Rekombination erhöht. Zur Erzeugung einer Punktmutation durch homologe Rekombination können DNA-RNA-Hybride in einer Technik verwendet werden, die als Chimäraplastie bekannt ist (Cole-Strauss et al., Nucleic Acids Research 27 (5), 1323 (1999), und Kmiec, Gene Therapy American Scientist. 87 (3), 240 (1999)). Prozeduren für homologe Rekombination in Physcomitrella patens sind ebenfalls im Fachgebiet allgemein bekannt und werden zur Verwendung hierin in Betracht gezogen.
  • Im Homologe-Rekombinations-Vektor wird der veränderte Abschnitt des Nukleinsäuremoleküls, das für ein Protein codiert, das in Tabelle II, Spalte 5 oder 7, aufgeführt ist, dabei an seinen 5'- und 3'-Enden von einem zusätzlichen Nukleinsäuremolekül des Gens flankiert, um das Stattfinden einer homologen Rekombination zwischen dem von dem Vektor getragenen exogenen Gen und einem endogenen Gen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze zu gestatten. Das zusätzliche flankierende Nukleinsäuremolekül ist von ausreichender Länge für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen. Typischerweise sind mehrere hundert Basenpaare bis zu Kilobasen von flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch 3'-Enden) in dem Vektor eingeschlossen. Siehe z. B. Thomas K. R., und Capecchi M. R., Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung von Homologe-Rekombination-Vektoren, oder Strepp et al., PNAS, 95 (8), 4368 (1998), für cDNA-basierte Rekombination in Physcomitrella patens. Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle (z. B. durch Polyethylenglycol-vermittelte DNA) eingebracht, und Zellen, in denen das eingebrachte Gen mit dem endogenen Gen homolog rekombiniert hat, werden mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Techniken selektiert.
  • Ungeachtet dessen, ob es in einem extrachromosomalen nicht-replizierenden Vektor oder einem Vektor, der in ein Chromosom integriert ist, vorliegt, befindet sich das Nukleinsäuremolekül, das für ein in der Tabelle II, Spalte 5 oder 7, aufgeführtes Nukleinsäuremolekül(e) codiert, vorzugsweise in einer Pflanzen-Expressionskassette. Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise zum Steuern der Genexpression in Pflanzenzellen fähige regulatorische Sequenzen, welche operativ verknüpft sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, zum Beispiel Termination der Transkription durch Polyadenylierungssignale, erfüllen kann. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind jene, die aus t-DNA von Agrobacterium tumefaciens stammen, wie etwa dem als Octopin-Synthase bekannten Gen3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835 (1984)), oder funktionelle Äquivalente davon, wobei aber auch alle anderen Terminatoren, welche in Pflanzen funktionsmäßig aktiv sind, geeignet sind. Da die Pflanzen-Genexpression sehr oft nicht auf transkriptioneller Ebene limitiert ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere operativ verknüpfte Sequenzen, wie etwa Translationsenhancer, wie die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz von Tabakmosaikvirus enthält, die das Polypeptid-pro-RNA-Verhältnis erhöht (Gallie et al., Nuc1. Acids Research 15, 8693 (1987)). Beispiele von Pflanzen-Expressionsvektoren schließen jene eine, welche ausführlich geschildert sind in: Becker, D., et al., Plant Mol. Biol. 20, 1195 (1992); und Bevan, M. W., Nucl. Acid. Res. 12, 8711 (1984); und "Vectors for Gene Transfer in Higher Plants" in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und Wu R., Academic Press, 1993, S. 15–38.
  • Der Wirtsorganismus (= transgener Organismus) enthält vorteilhafterweise mindestens eine Kopie der Nukleinsäure gemäß der Erfindung und/oder des Nukleinsäurekonstrukts gemäß der Erfindung.
  • Da eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder Ausbeute ein allgemeines Merkmal ist, das erwünschtermaßen an eine breite Vielzahl von Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps und Canola, Maniok, Pfeffer/Paprika, Sonnenblume und Tagetes, Nachtschattengewächse, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Strauchpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss), perennierendes Gras und Futterpflanzen, vererbt werden soll, sind diese Nutzpflanzen auch bevorzugte Ziel-Pflanzen für einen gentechnischen Eingriff als einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Futterpflanzen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Weizengras, Kanariengras, Trespe, Wild-Weidelgras bzw. Strandroggen, Rispengras, Knäuelgras, Alfalfa, Salfoin, Hornklee, Schweden-Klee, Wiesen-Klee und Steinklee ein.
  • Im Prinzip können alle Pflanzen als Wirtsorganismus verwendet werden. Bevorzugte transgene Pflanzen werden zum Beispiel aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae und vorzugsweise aus einer Pflanze ausgewählt, die aus der Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae gewählt ist. Bevorzugt sind Nutzpflanzen, wie Pflanzen, die in vorteilhafter Weise aus der Gruppe der Gattung Erdnuss, Ölsamenraps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avocado, Lorbeer, Kürbis/Gartenkürbis, Leinsamen, Soja, Pistazie, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Sorghum und Hirse, Triticale, Reis, Gerste, Maniokstrauch, Kartoffel, Zuckerrübe, Aubergine, Alfalfa und winterharten Grassorten und Viehfutterpflanzen, Ölpalme, Gemüsepflanzen (Kohlarten, Wurzelgemüse, Knollengemüse, Bohnengemüse bzw. Hülsenfrüchte, Fruchtgemüse, Zwiebelgemüse, Blattgemüse und Stängelgemüse), Buchweizen, Jerusalem-Artischocke, Saubohne, Wicken, Linsen, Buschbohne, Lupine, Klee und Luzerne ausgewählt sind, um nur einige von ihnen zu nennen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden transgene Pflanzen aus der Gruppe gewählt, die Getreide, Sojabohne, Raps (einschließlich Ölsamenraps, insbesondere Canola und Winter-Ölsamenraps), Baumwolle, Zuckerrohr, Zuckerrübe und Kartoffel, speziell Mais, Soja, Raps (einschließlich Ölsamenraps, insbesondere Canola und Winter-Ölsamenraps), Baumwolle, Weizen und Reis, umfasst.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die transgene Pflanze eine Gymnospermen-Pflanze, insbesondere eine Fichte, Kiefer oder Tanne.
  • In einer Ausführungsform wird die Wirtszelle aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae und vorzugsweise aus einer Pflanze ausgewählt, die aus der Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae gewählt ist. Bevorzugt sind Nutzpflanzen und insbesondere hierin oben als Wirtspflanzen erwähnte Pflanzen, wie etwa die oben erwähnten Familien und Gattungen, zum Beispiel vorzugsweise die Spezies Anacardium occidentale, Calendula officinalis, Carthamus tinctorius, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Helianthus annus, Tagetes lucida, Tagetes erecta, Tagetes tenuifolia, Daucus carota, Corylus avellana, Corylus colurna, Borago officinalis, Brassica napus, Brassica rapa ssp., Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis, Brassica oleracea, Arabidopsis thaliana, Anana comosus, Ananas ananas, Bromelia comosa, Carica papaya, Cannabis sative, Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba, Convolvulus panduratus, Beta vulgaris. Beta vulgaris var, altissima, Beta vulgaris var. vulgaris. Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva, Beta vulgaris var. esculenta, Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo, Cucurbita moschata, Olea europaea, Manihot utilissima, Janipha manihot,, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta, Ricinus communis, Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile, Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia, Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida, Soja max, Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides, Oleum cocoas, Laurus nobilis, Persea americana, Arachis hypogaea, Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense, Linum trigynum, Punica granatum, Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium thurberi, Musa nana, Muse acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp., Elaeis guineensis, Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium, Sesamum indicum, Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata, Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida, Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum millet, Panicum militaceum, Zea mays, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare, Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea liberica, Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens, Capsicum annuum, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Solanum melongena, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium, Solanum lycopersicum Theobroma cacao oder Camellia sinensis,
  • Anacardiaceae, wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium, z. B. die Spezies Pistacia vera [Pistachios, Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew]; Asteraceae, wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, z. B. die Spezies Calendula officinalis [Ringelblume], Carthamus tinctorius [Saflor], Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [blau-blühende Wegwarte], Cynara scolymus [Artischocke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Kopfsalat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [Studentenblume]; Apiaceae, wie die Gattung Daucus, z. B. die Spezies Daucus carota [Karotte]; Betulaceae, wie die Gattung Corylus, z. B. die Spezies Corylus avellana oder Corylus colurna [Haselnuss]; Boraginaceae, wie die Gattung Borago, z. B. die Spezies Borago officinalis [Borretsch]; Brassicaceae, wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, z. B. die Spezies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsamen], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana; Bromeliaceae, wie die Gattungen Anana, Bromelia, z. B. die Spezies Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas]; Caricaceae, wie die Gattung Carica, z. B. die Spezies Carica papaya [Papaya]; Cannabaceae, wie die Gattung Cannabis, z. B. die Spezies Cannabis sativa [Hanf], Convolvulaceae, wie die Gattungen Ipomea, Convolvulus, z. B. die Spezies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süsskartoffel, Prunkwinde, Wildkartoffel], Chenopodiaceae, wie die Gattung Beta, d. h. die Spezies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe]; Cucurbitaceae, wie die Gattung Cucubita, z. B. die Spezies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Gartenkürbis, Kürbis]; Elaeagnaceae, wie die Gattungen Elaeagnus, z. B. die Spezies Olea europaea [Olive]; Ericaceae, wie die Gattung Kalmia, z. B. die Spezies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Amerikanischer Lorbeer, Breitblättrige Lorbeerrose, Calico-Busch, Berglorbeer, Schaf-Berglorbeer bzw. Schmalblättrige Lorbeerrose, Alpen-Lorbeerrose, Sumpf-Lorbeerrose, Kleinblättrige Lorbeerrose, Poleiblättrige Lorbeerrose]; Euphorbiaceae, wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, z. B. die Spezies Manihot utilissima, Janipha manihot,, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Maniok, Pfeilwurz, Tapioka, Cassava] oder Ricinus communis [Rizinus, Rizinusbusch, Kastoröl-Pflanze, Palma Christi, Wunderbaum]; Fabaceae, wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, z. B. die Spezies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cafhormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [Blauholzbaum, Seidenbaum, Lebbekbaum], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Alfalfa] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne]; Geraniaceae, wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum, z. B. die Spezies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokosnuss]; Gramineae, wie die Gattung Saccharum, z. B. die Spezies Saccharum officinarum; Juglandaceae, wie die Gattungen Juglans, Wallia, z. B. die Spezies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Walnuss, Schwarzwalnuss, Echte Walnuss, Persische Walnuss, Weiße Walnuss, Butternuss, Schwarznuss]; Lauraceae, wie die Gattungen Persea, Laurus, z. B. die Spezies Lorbeer Laurus nobilis [Lorbeerbaum, Lorbeer, Echter Lorbeer, Gewürzlorbeer], Persea americana Persea americana, Persea gratissima oder Persea persea [Avocado]; Leguminosae, wie die Gattung Arachis, z. B. die Spezies Arachis hypogaea [Erdnuss]; Linaceae, wie die Gattungen Linum, Adenolinum, z. B. die Spezies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Flachs, Leinsamen]; Lythrarieae, wie die Gattung Punica, z. B. die Spezies Punica granatum [Granatapfel]; Malvaceae, wie die Gattung Gossypium, z. B. die Spezies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle]; Musaceae, wie die Gattung Musa, z. B. die Spezies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane]; Onagraceae, wie die Gattungen Camissonia, Oenothera, z. B. die Spezies Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Primel, Nachtkerze]; Palmae, wie die Gattung Elacis, z. B. die Spezies Elaeis guineensis [Ölpalme]; Papaveraceae, wie die Gattung Papaver, z. B. die Spezies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn, Türkenmohn, Klatschmohn, Mohnblume, Feldmohn, Klatschrose, Saat-Mohn, Ackermohn]; Pedaliaceae, wie die Gattung Sesamum, z. B. die Spezies Sesamum indicum [Sesam]; Piperaceae, wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, z. B. die Spezies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [Cayenne-Pfeffer, Wilder Pfeffer]; Poaceae, wie die Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea, Triticum, z. B. die Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste, Graupen, Mähnengerste, Mäusegerste, Wiesengerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum Hirse, Panicum militaceum [Sorghum, Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen, Ackerweizen, Gemeiner Weizen], Proteaceae, wie die Gattung Macadamia, z. B. die Spezies Macadamia intergrifolia [Macadamia]; Rubiaceae, wie die Gattung Coffea, z. B. die Spezies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee]; Scrophulariaceae, wie die Gattung Verbascum, z. B. die Spezies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze, Schaben-Königskerze, Chaix-Königskerze, Großblütige Königskerze, Seidenhaar-Königskerze, Langblättrige Königskerze, Mehlige Königskerze, Schwarze Königskerze, Kandelaber-Königskerze, Windblumen-Königskerze, Violette Königskerze, Flockige Königskerze, Himmelbrand]; Solanaceae, wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solarium, Lycopersicon, z. B. die Spezies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [Pfefferschote], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solarium melongena [Aubergine] (Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solarium integrifolium oder Solarium lycopersicum [Tomate]; Sterculiaceae, wie die Gattung Theobroma, z. B. die Spezies Theobroma cacao [Kakao]; Theaceae, wie die Gattung Camellia, z. B. die Spezies Camellia sinensis [Tee]).
  • Die Einbringung der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen, zum Beispiel Pflanzen, kann im Prinzip durch alle der dem Fachmann bekannten Verfahren geschehen. Die Einbringung der Nukleinsäuresequenzen führt zur Entstehung rekombinanter oder transgener Organismen.
  • Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird Transformation genannt. Hierbei werden die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren für eine transiente oder stabile Transformation benutzt. Geeignete Verfahren sind die Protoplasten-Transformation durch Poly(ethylenglycol)-induzierte DNA-Aufnahme, das ”Biolistik”-Verfahren mit Hilfe der Genkanone – bekannt als Teilchenbeschussverfahren – die Elektroporation, die Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in Jenes B. et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung S.D und Wu R., Academic Press (1993) 128–143, und in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205 (1991), beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche exprimiert werden soll(en), wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der für das Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12, 8711 (1984)). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in einer bekannten Weise für die Transformation von Pflanzen, insbesondere von Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, verwendet werden, beispielsweise durch Baden von geritzten Blättern oder Blattsegmenten bzw. zerhackten Blättern in einer agrobakteriellen Lösung und anschließendes Kultivieren derselbigen in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. 16, 9877 (1988) beschrieben oder ist unter anderem aus White F. F., Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung, S. D., und Wu, R., Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
  • Mit einem Expressionsvektor gemäß der Erfindung transformierte Agrobakterien können auch in einer bekannten Weise für die Transformation von Pflanzen, wie etwa Versuchspflanzen, wie Arabidopsis, oder Nutzpflanzen, wie Getreidearten, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprikaschoten, Ölsamenraps, Tapioca, Maniokstrauch, Pfeilwurz, Studentenblume, Alfalfa, Kopfsalat und die verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinstockarten, insbesondere von ölhaltigen Nutzpflanzen, wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Ölsamenraps, Kokusnuss, Ölpalme, Saflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohnen, oder speziell Mais, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle und Canola, verwendet werden, zum Beispiel indem geritzte Blätter oder zerhackte Blätter in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren kann man in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer finden.
  • Demgemäß betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung transgene Organismen, welche durch mindestens eine(n) Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor gemäß der Erfindung transformiert sind, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile – wie zum Beispiel Blätter, Wurzeln, etc. im Fall von pflanzlichen Organismen – oder reproduktives Material, das aus solchen Organismen abgeleitet ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden Wirtspflanzen für die Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor gemäß der Erfindung aus der Gruppe ausgewählt, welche Mais, Soja, Ölsamenraps (einschließlich Canola und Winter-Ölsamenraps), Baumwolle, Weizen und Reis, umfasst.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts, z. B. einer Expressionskassette, die eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, welche ein oder mehrere in Tabelle II gezeigte Polypeptide codieren, oder ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle umfasst, wie sie in Tabelle I aufgeführt sind, oder damit hybridisierende DNA-Sequenzen codiert, für die Transformation von Pflanzenzellen, Geweben oder Teilen von Pflanzen.
  • Hierbei können die in Tabelle I oder II gezeigten Nukleinsäuremoleküle oder Sequenzen, abhängig von der Wahl des Promoters, spezifisch in den Blättern, in den Samen, den Noduli bzw. Knötchen, in Wurzeln, im Stängel oder anderen Teilen der Pflanze exprimiert werden. Diejenigen transgenen Pflanzen, welche Sequenzen, z. B. wie in der Tabelle I aufgeführt, überproduzieren, das Fortpflanzungsmaterial derselben, zusammen mit den Pflanzenzellen, Geweben oder Teilen davon, sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
  • Die Expressionskassette oder die Nukleinsäuresequenzen oder das Konstrukt gemäß der Erfindung, welche Nukleinsäuremoleküle oder Sequenzen gemäß Tabelle I enthalten, können außerdem ebenfalls für die Transformation der Organismen, die oben als Beispiele angegeben sind, wie Bakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Pflanzen, verwendet werden.
  • Innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung bezieht sich ein erhöhter Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder ein(e) erhöhte(r) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischer Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel auf das künstlich erworbene Merkmal mit dem erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder ein(e) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder eine andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu den nicht genetisch modifizierten anfänglichen Pflanzen, z. B. auf die Eigenschaft, welche durch die genetische Modifikation des Zielorganismus, und auf Grund funktioneller Überexpression von einer oder mehreren Polypeptid(sequenzen) von Tabelle II, die z. B. von den entsprechenden Nukleinsäuremolekülen, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, aufgeführt, und/oder Homologen codiert sind, in den Organismen gemäß der Erfindung, vorteilhafterweise in der erfindungsgemäßen oder nach dem erfindungsgemäßen Verfahren produzierten transgenen Pflanze, wenigstens für die Dauer von mindestens einer Pflanzengeneration, erworben wird.
  • Eine konstitutive Expression der Polypeptidsequenzen von Tabelle II, die von dem entsprechenden Nukleinsäuremolekül, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, aufgeführt, und/oder Homologen codiert sind, ist darüber hinausgehend vorteilhaft. Andererseits kann jedoch eine induzierbare Expression ebenfalls wünschenswert scheinen. Die Expression der Polypeptidsequenzen der Erfindung kann entweder auf das Cytoplasma oder die Organellen, vorzugsweise die Plastiden der Wirtszellen, vorzugsweise der Pflanzenzellen, gerichtet sein.
  • Die Effizienz der Expression der Sequenzen der Tabelle II, die von dem entsprechenden Nukleinsäuremolekül, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, aufgeführt, und/oder Homologen codiert sind, kann zum Beispiel in vitro durch Sprossmeristem-Propagation bestimmt werden. Darüber hinaus kann eine Expression der Sequenzen von Tabelle II, die von dem entsprechenden Nukleinsäuremolekül, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, aufgeführt, und/oder Homologen codiert sind, welche hinsichtlich Natur und Pegel und ihren Effekt auf den Ertrag, z. B. auf eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, aber auch auf die Leistung von Stoffwechselwegen, modifiziert ist, anhand von Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
  • Ein zusätzlicher Gegenstand der Erfindung umfasst transgene Organismen, wie transgene Pflanzen, die durch eine Expressionskassette, welche Sequenzen, wie in Tabelle I, Spalte 5 oder 7, gemäß der Erfindung aufgeführt, oder damit hybridisierende DNA-Sequenzen enthält, transformiert sind, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Fortpflanzungsmaterial solcher Pflanzen. Besondere Bevorzugung erfahren in diesem Fall transgene Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Ölsamenraps und Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Distel, Kartoffel, Tabak, Tomate, Tapioca, Maniokstrauch, Pfeilwurz, Alfalfa, Kopfsalat und die verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinstockarten.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden transgene Pflanzen, die durch eine Expressionskassette, welche Nukleinsäuremoleküle oder Sequenzen gemäß der Erfindung, wie in der Tabelle I, Spalte 5 oder 7, aufgeführt, insbesondere von Tabelle IIB, oder damit hybridisierende DNA-Sequenzen enthält oder umfasst, transformiert sind, aus der Gruppe ausgewählt, welche Mais, Soja, Ölsamenraps (einschließlich Canola und Winter-Ölsamenraps), Baumwolle, Weizen und Reis, umfasst.
  • Für die Zwecke der Erfindung sind Pflanzen mono- und dikotyle Pflanzen, Moose oder Algen, speziell Pflanzen, zum Beispiel in einer Ausführungsform monokotyle Pflanzen, oder zum Beispiel in einer anderen Ausführungsform dikotyle Pflanzen. Eine weitere Verfeinerung gemäß der Erfindung sind transgene Pflanzen, wie oben stehend beschrieben, welche eine Nukleinsäuresequenz oder ein Konstrukt gemäß der Erfindung oder eine Expressionskassette gemäß der Erfindung enthalten.
  • Allerdings bedeutet transgen auch, dass die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an ihrer natürlichen Position im Genom eines Organismus lokalisiert sind, aber dass die Sequenz, z. B. die codierende Sequenz oder eine regulatorische Sequenz, zum Beispiel die Promotorsequenz, im Vergleich mit der natürlichen Sequenz modifiziert worden ist. Vorzugsweise versteht es sich, dass transgen/rekombinant bedeuten soll, dass die Transkription von einer oder mehreren Nukleinsäuren oder Molekülen der Erfindung, welche in Tabelle I gezeigt sind, an einer nicht-natürlichen Position im Genom stattfindet. In einer Ausführungsform ist die Expression der Nukleinsäuren oder Moleküle homolog. In einer anderen Ausführungsform ist die Expression der Nukleinsäuren oder Moleküle heterolog. Diese Expression kann transient oder von einer Sequenz aus, die stabil in das Genom integriert worden ist, erfolgen.
  • Vorteilhafte induzierbare Pflanzenpromotoren sind zum Beispiel der PRP1-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22361 (1993)), ein durch Benzensulfonamid induzierbarer Promotor ( EP 388 186 ), ein durch Tetracyclin induzierbarer Promotor (Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992)), ein durch Salicylsäure induzierbarer Promotor ( WO 95119443 ), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor ( EP 335 528 ) und ein durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor ( WO 93/21334 ). Andere Beispiele von pflanzlichen Promotoren, welche vorteilhafterweise verwendet werden können, sind der Promotor von cytoplasmatischer FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI-Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)), der Promotor von Phosphoribosyl-Pyrophosphat-Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank-Zugangsnummer U87999) oder ein Nodiene-spezifischer Promotor, wie in EP 249 676 beschrieben.
  • Besonders vorteilhaft sind diejenigen Promotoren, welche eine Expression beim Aufkommen von abiotischen Stressbedingungen gewährleisten. Besonders vorteilhaft sind diejenigen Promotoren, welche eine Expression nach Anbruch von Niedertemperatur-Bedingungen, z. B. beim Auftreten von abkühlenden und/oder gefrierenden Temperaturen, wie hierin oben definiert, z. B. für die Expression von Nukleinsäuremolekülen, wie in Tabelle VIIIb gezeigt, gewährleisten. Vorteilhaft sind diejenigen Promotoren, welche eine Expression bei Bedingungen mit limitierter Nährstoffverfügbarkeit gewährleisten, z. B. beim Aufkommen begrenzter Stickstoffresourcen in dem Fall, dass der Stickstoff des Erdbodens oder Nährmediums erschöpft ist, z. B. für die Expression der Nukleinsäuremoleküle oder ihrer Genprodukte, wie in Tabelle Villa gezeigt. Besonders vorteilhaft sind diejenigen Promotoren, welche eine Expression nach Anbruch von Wassermangel, wie hierin oben definiert, z. B. für die Expression der Nukleinsäuremoleküle oder ihrer Genprodukte, wie in der Tabelle VIIIc gezeigt, gewährleisten. Besonders vorteilhaft sind diejenigen Promotoren, welche eine Expression beim Aufkommen von Standard-Wachstumsbedingungen, z. B. unter einem Zustand ohne Stress und ohne mangelhafte Nährstoffversorgung, z. B. für die Expression der Nukleinsäuremoleküle oder ihrer Genprodukte, wie in Tabelle VIIId gezeigt, gewährleisten.
  • Derartige Promotoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können aus Genen isoliert werden, welche unter den oben erwähnten Bedingungen induziert werden. In einer Ausführungsform können samenspezifische Promotoren für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden.
  • Im Prinzip können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulations-Sequenzen verwendet werden, wie diejenigen, die oben für die Expressionskassette gemäß der Erfindung und das Verfahren gemäß der Erfindung genannt wurden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren in vorteilhafter Weise zur Anwendung kommen. Bei der Herstellung einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotidsequenz zu erhalten, die in brauchbarer Weise in der korrekten Richtung ablesbar ist und mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Um die DNA-Fragmente (= Nukleinsäuren gemäß der Erfindung) miteinander zu verbinden, können Adaptoren oder Linker an die Fragmente angefügt werden. Die Promotor- und die Terminatorregionen können in nützlicher Weise in der Transkriptionsrichtung vorgesehen werden, wobei ein Linker oder Polylinker einen oder mehrere Restriktionspunkte für die Insertion dieser Sequenz enthält. Im Allgemeinen weist der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionspunkte auf. Im Allgemeinen ist die Größe des Linkers innerhalb der regulatorischen Region geringer als 100 bp, häufig geringer als 60 bp, aber beträgt mindestens 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ oder homolog als auch fremd oder heterolog bezüglich des Wirtsorganismus, zum Beispiel der Wirtspflanze, sein. In der 5'-3'-Transkriptionsrichtung enthält die Expressionskassette den Promotor, eine DNA-Sequenz, die in Tabelle I gezeigt ist, und eine Region für die Transkriptionstermination. Verschiedene Terminationsregionen können in beliebiger gewünschter Weise gegeneinander ausgetauscht werden.
  • Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, z. B. ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid, welches erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz und/oder gesteigerte Toleranz gegen periodische Dürre in Pflanzen vermittelt, kann unter Anwendung standardmäßger molekularbiologischer Techniken und der hierin bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Zum Beispiel kann eine A. thaliana-Polypeptid codierende cDNA aus einer A. thaliana-cDNA-Bibliothek isoliert werden, oder eine Synechocystis sp.-, Brassica napus-, Glycine max-, Zea mays- oder Oryza sativa-Polypeptid codierende cDNA kann jeweils aus einer Synechocystis sp.-, Brassica napus-, Glycine max-, Zea mays- oder Oryza sativa-cDNA-Bibliothek isoliert werden, wobei die Gesamtheit oder ein Abschnitt von einer der in Tabelle I gezeigten Sequenzen verwendet wird. Darüber hinaus kann ein Nukleinsäuremolekül, das die Gesamtheit oder einen Abschnitt von einer der Sequenzen von Tabelle I umfasst, durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, welche auf der Basis dieser Sequenz entworfen sind. Beispielsweise kann mRNA aus Pflanzenzellen isoliert werden (z. B. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)), und cDNA kann mittels Reverser Transkriptase (zum Beispiel Moloney MLV Reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV Reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) erzeugt werden. Synthetische Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation mittels Polyermase-Kettenreaktion können auf der Basis von einer der in Tabelle I gezeigten Nukleotidsequenzen entworfen werden. Ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA oder, alternativ dazu, genomischer DNA als einer Matrize und geeigneten Oligonukleotid-Primern gemäß standardmäßigen Techniken zur PCR-Amplifikation amplifiziert werden. Das so amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen passenden Vektor einkloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Ferner können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Gene durch standardmäßige Synthesetechniken, z. B. unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen automatisierten DNA-Synthesizers, hergestellt werden.
  • In einer Ausführungsform umfasst ein Isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine(s) der Nukleotidsequenzen oder -moleküle, wie in Tabelle I gezeigt. Außerdem kann das Nukleinsäuremolekül der Erfindung nur einen Abschnitt der codierenden Region von einer der Sequenzen oder einem der Moleküle von einer Nukleinsäure von Tabelle I umfassen, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, das einen biologisch aktiven Abschnitt eines erfindungsgemäßen Polypeptids codiert.
  • Abschnitte von Proteinen, die von dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder von ein Polypeptid codierenden Nukleinsäuremolekülen der Erfindung codiert werden, sind vorzugsweise die hierin beschriebenen biologisch aktiven Abschnitte. Wie hierin verwendet, soll der Begriff ”biologisch aktiver Abschnitt von” einem Polypeptid einen Abschnitt, z. B. eine Domäne/Motiv, von einem mit erhöhtem Ertrag, z. B. einer erhöhten oder gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. erhöhter Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz, zusammenhängenden Protein einschließen, das bei einer gesteigerten Nährstoffverwertungseffizienz, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz, und/oder erhöhtem intrinsischen Ertrag in einer Pflanze beteiligt ist. Um zu bestimmen, ob ein Polypeptid gemaß der Erfindung, oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon, zu einem erhöhten Ertrag führt, z. B. eine ertragsbezogene Eigenschaft erhöhte oder steigerte, z. B. das mit Niedertemperatur
  • Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängende Protein erhöhte, das bei einer gesteigerten Nährstoffverwertungseffizienz, z. B. Stickstoffverwertungseffizienz und/oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag in einer Pflanze beteiligt ist, kann eine Analyse einer Pflanze, die das Polypeptid umfasst, vorgenommen werden. Solche Analysemethoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt, wie es in den Beispielen ausführlich geschildert wird. Genauer gesagt, können Nukleinsäurefragmente, die biologisch aktive Abschnitte eines Polypeptids codieren, durch Isolieren eines Abschnitts von einer der Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle, die in Tabelle I aufgelistet sind, Exprimieren des codierten Abschnitts des Polypeptids oder Peptids davon (z. B. durch rekombinante Expression in vitro) und Prüfen der Aktivität des codierten Abschnitts hergestellt werden.
  • Biologisch aktive Abschnitte des erfindungsgemäßen Polypeptids werden von der vorliegenden Erfindung abgedeckt und schließen Peptide, welche aus der Aminosäuresequenz des Polypeptid-codierenden Gens oder der Aminosäuresequenz eines zu dem erfindungsgemäßen Polypeptid homologen Proteins abgeleitete Aminosäuresequenzen umfassen, ein, die weniger Aminosäuren als ein erfindungsgemäßes Volllängen-Polypeptid oder das Volllängenprotein, das zu dem erfindungsgemäßen Polypeptid homolog ist, einschließen und zumindest eine bestimmte enzymatische oder biologische Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids aufzeigen. In der Regel umfassen biologisch aktive Abschnitte (z. B. Peptide, welche zum Beispiel, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren Länge aufweisen) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids. Darüber hinaus können andere biologisch aktive Abschnitte, in denen andere Regionen des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt und hinsichtlich einer oder mehrerer der hierin beschriebenen Aktivitäten ausgewertet werden. Vorzugsweise schließen die biologisch aktiven Abschnitte des Polypeptids gemäß der Erfindung eine oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Abschnitte davon, welche biologische Aktivität aufweisen, ein.
  • Der Begriff ”biologisch aktiver Abschnitt” oder ”biologische Aktivität” bedeutet ein Polypeptid, wie in Tabelle II, Spalte 3, aufgeführt, oder einen Abschnitt des Polypeptids, der noch mindestens 10% oder 20%, vorzugsweise 30%, 40%, 50% oder 60%, besonders bevorzugt 70%, 75%, 80%, 90% oder 95% der enzymatischen oder biologischen Aktivität des natürlichen oder Ausgangs-Enzyms oder Proteins aufweist.
  • Im Verfahren gemäß der Erfindung können Nukleinsäuresequenzen oder -moleküle verwendet werden, welche, falls zutreffend, synthetische, nicht-natürliche oder modifizierte Nukleotidbasen enthalten, welche in DNA oder RNA eingebunden werden können. Die synthetischen, nicht-natürlichen oder modifizierten Basen können zum Beispiel die Stabilität des Nukleinsäuremoleküls außerhalb oder innerhalb einer Zelle erhöhen. Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können die gleichen Modifikationen enthalten, wie vorangehend erwähnt.
  • Wie im vorliegenden Kontext verwendet, kann der Begriff ”Nukleinsäuremolekül” ebenfalls die/das untranslatierte Sequenz oder Molekül beinhalten, welche(s) am 3'- und am 5'-Ende der codierenden Genregion liegt, zum Beispiel mindestens 500, vorzugsweise 200, besonders bevorzugt 100, Nukleotide der Sequenz stromaufwärts vom 5'-Ende der codierenden Region und mindestens 100, vorzugsweise 50, besonders bevorzugt 20, Nukleotide der Sequenz stromabwärts vom 3'-Ende der codierenden Genregion. Es ist oft vorteilhaft, zu Klonierungs- und Expressionszwecken nur die codierende Region zu wählen.
  • Vorzugsweise ist das im Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül. In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül der Erfindung das Nukleinsäuremolekül, das im Verfahren der Erfindung verwendet wird.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann des im Verfahren gemäß der Erfindung verwendete, isolierte Nukleinsäuremolekül zum Beispiel weniger als ungefähr 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen umfassen, welche von Natur aus das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der das Nukleinsäuremolekül stammt, flankieren.
  • Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle, zum Beispiel das Polynukleotid der Erfindung oder ein Teil davon, können unter Anwendung von molekularbiologischen Standardtechniken und der hierin bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Außerdem können beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzregionen auf DNA- oder Aminosäure-Ebene mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen identifiziert werden. Erstere kann/können als Hybridisierungssonden unter standardmäßigen Hybridisierungstechniken (zum Beispiel denjenigen, beschrieben in Sambrook et al., siehe oben) zum Isolieren weiterer Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, welche in diesem Verfahren brauchbar sind.
  • Ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle, zum Beispiel des Polynukleotids der Erfindung, oder einen Teil davon, kann außerdem durch Polymerase-Kettenreaktion isoliert werden, wobei auf dieser Sequenz oder auf Teilen davon basierende Oligonukleotid-Primer verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständige Sequenz oder einen Teil davon, durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern isoliert werden, welche auf der Grundlage eben dieser Sequenz hergestellt wurden. Beispielsweise kann mRNA aus Zellen isoliert werden (zum Beispiel durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)), und cDNA kann mittels Reverser Transkriptase erzeugt werden (zum Beispiel Moloney MLV Reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV Reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL).
  • Synthetische Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation mittels Polyermase-Kettenreaktion können auf der Basis einer hierin gezeigten Sequenz unter Anwendung bekannter Verfahren hergestellt werden.
  • Ferner ist es möglich, ein konserviertes Protein zu identifizieren durch Ausführen von Proteinsequenz-Alignments mit dem Polypeptid, codiert von den Nukleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung, insbesondere mit den, von dem in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigten Nukleinsäuremolekül codierten, Sequenzen, aus denen konservierte Regionen und, im Gegenzug, degenerierte Primer abgeleitet werden können. Konservierte Regionen sind diejenigen, welche eine sehr geringe Variation an der Aminosäure in einer jeweiligen Position von mehreren Homologen unterschiedlicher Herkunft aufzeigen. Die Consensussequenz und Polypeptidmotive, die in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt sind, werden aus den Alignments hergeleitet. Darüber hinaus ist es möglich, konservierte Regionen aus verschiedenen Organismen durch Ausführen von Proteinsequenz-Alignments mit dem Polypeptid, codiert von der Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung, insbesondere mit den Sequenzen, codiert von dem in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigten Polypeptidmolekül, zu identifizieren, aus denen konservierte Regionen und, im Gegenzug, degenerierte Primer hergeleitet werden können.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform wird im Verfahren der vorliegenden Erfindung die Aktivität eines Polypeptids erhöht, welches eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, die/das in Tabelle IV, Spalte 7, gezeigt ist, umfasst oder daraus besteht, und in einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, umfassend oder bestehend aus einer Consensussequenz oder einem Polypeptidmotiv, die/das in Tabelle IV, Spalte 7, gezeigt ist, wobei weniger als 20, vorzugsweise weniger als 15 oder 10, bevorzugt weniger als 9, 8, 7, oder 6, weiter bevorzugt weniger als 5 oder 4, noch weiter bevorzugt weniger als 3, noch stärker bevorzugt weniger als 2, noch weiter bevorzugt 0, der angegebenen Aminosäurepositionen durch eine beliebige Aminosäure ersetzt sein können. In einer Ausführungsform sind/ist nicht mehr als 15%, vorzugsweise 10%, noch stärker bevorzugt 5%, 4%, 3% oder 2%, am meisten bevorzugt 1% oder 0% der Aminosäureposition, angegeben durch einen Buchstaben, mit einer anderen Aminosäure ersetzt. In einer Ausführungsform sind weniger als 20, vorzugsweise weniger als 15 oder 10, vorzugsweise weniger als 9, 8, 7 oder 6, weiter bevorzugt weniger als 5 oder 4, noch weiter bevorzugt weniger als 3, noch weiter bevorzugt weniger als 2, noch stärker bevorzugt 0 Aminosäuren in eine Consensussequenz oder ein Proteinmotiv eingefügt.
  • Die Consensussequenz wurde aus einem Mehrfach-Alignment der Sequenzen, wie sie in Tabelle II aufgelistet sind, abgeleitet. Die Buchstaben repräsentieren den Ein-Buchstabe-Aminosäure-Code und zeigen, dass die Aminosäuren in mindestens 80% der alignierten bzw. parallel übereinandergestellten Proteine konserviert sind, wohingegen der Buchstabe X für Aminosäuren steht, welche nicht in mindestens 80% der alignierten Sequenzen konserviert sind. Die Consensussequenz beginnt mit der ersten konservierten Aminosäure im Alignment und endet mit der letzten konservierten Aminosäure im Alignment der betrachteten Sequenzen. Die Anzahl von angezeigten X gibt die Distanzen zwischen konservierten Aminosäureresten an, wobei Y-x(21,23)-F beispielsweise bedeutet, dass konservierte Tyrosin- und Phenylalaninreste in dem Alignment durch minimal 21 und maximal 23 Aminosäurereste in dem Alignment aller betrachteten Sequenzen voneinander getrennt sind.
  • Konservierte Domänen wurden aus allen Sequenzen identifiziert und sind unter Anwendung einer Untergruppe der standardmäßigen Prosite-Notation beschrieben, wobei z. B. das Muster Y-x(21,23)-[FW] bedeutet, dass ein konserviertes Tyrosin durch minimal 21 und maximal 23 Aminosäurereste von entweder einem Phenylalanin oder Tryptophan getrennt ist. Muster mussten bei mindestens 80% der betrachteten Proteine übereinstimmen. Konservierte Muster wurden mit dem Software-Tool MEME, Version 3.5.1, oder manuell identifiziert. MEME wird bei Timothy L. Bailey und Charles Elkan (Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, S. 28–36, AAAI Press, Menlo Park, Kalifornien 1994) beschrieben. Der Quellcode für das Standalone-Programm ist vom San Diego Supercomputer Center öffentlich verfügbar. Zum Identifizieren von gemeinsamen Motiven in allen Sequenzen mit dem Software-Tool MEME wurden die folgenden Einstellungen verwendet: -maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0.001, -maxw 60, -distance 1e-3, -minsites, Anzahl der für die Analyse verwendeten Sequenzen. Die Eingabesequenzen für MEME waren nicht-alignierte Sequenzen im Fasta-Format. Andere Parameter wurden bei den Standardeinstellungen in dieser Softwareversion verwendet. Prosite-Muster für konservierte Domänen wurden mit dem Software-Werkzeug Pratt, Version 2.1, oder manuell erstellt. Pratt wurde von Inge Jonassen, Dept. of Informatics, Universität Bergen, Norwegen, entwickelt und ist beschrieben bei Jonassen et al. (I. Jonassen, J. F. Collins und D. G. Higgins, Protein Science 4 (1995), S. 1587–1595; I. Jonassen, Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph, eingereicht bei CABIOS, Febr. 1997]. Der Quellcode (ANSI C) für das Standalone-Programm ist öffentlich verfügbar, z. B. bei etablierten Bioinformatik-Zentren, wie dem FBI (Europäisches Bioinformatik-Institut). Zum Erstellen von Muster mit dem Software-Tool Pratt wurden die folgenden Einstellungen verwendet: PL (max. Muster-Länge): 100, PN (max. Anz. an Muster-Symbolen): 100, PX (max. Anz. aufeinanderfolgender x's): 30, FN (max. Anz. flexibler Spacer): 5, FL (max. Flexibilität): 30, FP (max. Flex. Produkt): 10, ON (max. Anzahl an Mustern): 50. Die Eingabesequenzen für Pratt waren einzelne Regionen der Proteinsequenzen, welche eine hohe Ähnlichkeit aufwiesen, wie es mit dem Software-Werkzeug MEME identifiziert wurde. Die Minimumzahl an Sequenzen, welche mit den erzeugten Mustern übereinstimmen müssen (CM, min. Anz. von Seq., die Übereinstimmung zeigen müssen) wurde auf mindestens 80% der eingegebenen Sequenzen eingestellt. Die hier nicht erwähnten Parameter wurden in ihren Standardeinstellungen verwendet. Die Prosite-Muster der konservierten Domänen können verwendet werden, um nach Proteinsequenzen zu suchen, welche diesem Muster entsprechen. Verschiedene etablierte Bioinformatik-Zentren liefern öffentliche Internetportale zur Verwendung dieser Muster bei Datenbank-Suchen (z. B. PIR (Protein Information Resource, bereitgehalten am Georgetown University Medical Center) oder ExPASy (Experten-Protein-Analyse-System)). Alternativ dazu ist Standalone-Software verfügbar, wie etwa das Programm Fuzzpro, welches ein Teil des EMBOSS Software-Pakets ist. Beispielsweise gestattet das Programm Fuzzpro nicht nur die Suche nach einer exakten Muster-Protein-Übereinstimmung, sondern ermöglicht es auch, verschiedene Mehrdeutigkeiten bei der durchgeführten Suche vorzugeben bzw. einzustellen.
  • Das Alignment wurde durchgeführt mit der Software ClustalW (Version 1.83) und ist beschrieben von Thompson et al. (Nucleic Acids Research 22, 4673 (1994)). Der Quellcode für das Standalone-Programm ist vom European Molecular Biology Laboratory; Heidelberg, Deutschland, öffentlich verfügbar. Die Analyse wurde unter Verwendung der Standardparameter von ClustalW v1.83 durchgeführt (Lücken-Öffnungs-Strafwert: 10,0; Lücken-Erweiterungs-Strafwert: 0,2; Proteinmatrix: Gonnet; Protein/DNA-Lückenende: –1; Protein/DNA-Lückendistanz: 4).
  • Degenerierte Primer können dann mit Hilfe von PCR zur Amplifizierung von Fragmenten neuer Proteine mit der oben erwähnten Aktivität, bei der z. B. ein erhöhter Ertrag, z. B. die erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, insbesondere die gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. Niedertemperaturtoleranz, Toleranz gegenüber periodischer Düne, Wassernutzungseffizienz, Nährstoff(z. B. Stickstoff)-Verwertungseffizienz und/oder ein erhöhter intrinsischer Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon nach der Erhöhung der Expression oder Aktivität herbeigeführt wird, oder mit der Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigt, oder weiterer funktioneller Homologe des Polypeptids der Erfindung aus anderen Organismen, verwendet werden.
  • Diese Fragmente können dann als Hybridisierungssonde zum Isolieren der vollständigen Gensequenz verwendet werden. Als Alternative können die fehlenden 5'- und 3'-Sequenzen mit Hilfe von RACE-PCR isoliert werden. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA oder, als Alternative, genomischer DNA als Matrize und von geeigneten Oligonukleotid-Primern unter Befolgung von standardmäßigen PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Das derartig amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, welche einem der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle entsprechen, können durch standardmäßige Syntheseverfahren, zum Beispiel unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers, erzeugt werden.
  • Nukleinsäuremoleküle, welche für das Verfahren gemäß der Erfindung vorteilhaft sind, können basierend auf ihrer Homologie zu den hierin offenbarten Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon als, oder für die Erzeugung von, eine(r) Hybridisierungssonde und gemäß Standardhybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. In diesem Zusammenhang ist es möglich, zum Beispiel ein oder mehrere isolierte Nukleinsäuremoleküle von mindestens 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 oder mehr Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 15, 20 oder 25 Nukleotiden Länge zu verwenden, welche unter stringenten Bedingungen mit den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, insbesondere mit denjenigen, welche eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls, das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird oder ein in der Erfindung verwendetes Protein codiert, oder des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung umfassen. Nukleinsäuremoleküle mit 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden können ebenfalls verwendet werden.
  • Mit ”Hybridisieren” ist gemeint, dass derartige Nukleinsäuremoleküle unter herkömmlichen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, hybridisieren, wie z. B. bei Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6, beschrieben.
  • Gemäß der Erfindung können sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle der Nukleinsäure der Erfindung als Sonden verwendet werden. Ferner können, als Matrize zur Identifizierung von funktionellen Homologen, sowohl Northern-Blot-Assays als auch Southern-Blot-Assays durchgeführt werden. Der Northern-Blot-Assay liefert in vorteilhafter Weise weitere Informationen über das exprimierte Genprodukt: z. B. Expressionsmuster, Auftreten von Prozessierungsschritten, wie Spleißen und Capping, etc. Der Southern-Blot-Assay liefert zusätzliche Information über die chromosomale Lokalisierung und die Organisation des Gens, welches das Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert.
  • Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C, beispielsweise bei 50°C, 55°C oder 60°C. Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen als Funktion des Typs der Nukleinsäure und, zum Beispiel, wenn organische Lösungsmittel vorhanden sind, bezüglich Temperatur und Pufferkonzentration abwelchen. Die Temperatur unter ”Standardhybridisierungsbedingungen” differiert beispielsweise als eine Funktion des Typs der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 50°C in einem wässerigen Puffer mit einer Konzentration von 0,1 ×, 0,5 ×, 1 ×, 2 ×, 3 ×, 4 × oder 5 × SSC (pH 7,2). Wenn organische(s) Lösungsmittel, beispielsweise 50% Formamid, im oben erwähnten Puffer vorhanden ist/sind, beläuft sich die Temperatur unter Standardbedingungen auf ungefähr 40°C, 42°C oder 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride betragen zum Beispiel vorzugsweise 0,1 × SSC und 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C oder 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride sind beispielsweise bevorzugt 0,1 × SSC und 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C oder 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben erwähnten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure mit ungefähr 100 bp (= Basenpaare) Länge und mit einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid ermittelt. Der Fachmann weiß, wie man die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen mit der Hilfe von Lehrbüchern, zum Beispiel denjenigen, welche oben erwähnt wurden, oder aus den folgenden Lehrbüchern ermittelt: Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames und Higgins (Hrsg.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press bei Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press bei Oxford University Press, Oxford.
  • Ein weiteres Beispiel einer derartigen stringenten Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung bei 4 × SSC bei 65°C, gefolgt von Waschen in 0,1 × SSC bei 65°C während einer Stunde. Alternativ dazu erfolgt eine beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingung in 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C. Ferner können die Bedingungen während des Waschschrittes aus dem Bereich von Bedingungen ausgewählt werden, der von Niederstringenzbedingungen (ungefähr 2 × SSC bei 50°C) und Hochstringenzbedingungen (ungefähr 0,2 × SSC bei 50°C, vorzugsweise bei 65°C) begrenzt wird (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Außerdem kann die Temperatur während des Waschschrittes von Niederstringenzbedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, auf Höherstringenzbedingungen mit ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration sowie Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, oder ansonsten kann einer der zwei Parameter konstant gehalten werden, während nur der andere variiert wird. Denaturierungsmittel, zum Beispiel Formamid oder SDS, können ebenfalls während der Hybridisierung verwendet werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung vorzugsweise bei 42°C ausgeführt. Relevante Faktoren, wie 1) Länge der Behandlung, 2) Salzbedingungen, 3) Detergenzbedingungen, 4) Kompetitor-DNAs, 5) Temperatur und 6) Sondenauswahl, können je nach Fall so kombiniert werden, dass hier nicht alle Möglichkeiten erwähnt werden können.
  • So werden, in einer bevorzugten Ausführungsform, Northern-Blots mit Rothi-Hybri-Quick-Puffer (Roth, Karlsruhe) bei 68°C während 2 Stunden vorhybridisiert. Die Hybridisierung mit radioaktiv markierter Sonde erfolgt über Nacht bei 68°C. Nachfolgende Waschschritte werden bei 68°C mit 1 × SSC durchgeführt. Für Southern-Blot-Assays wird die Membran mit Rothi-Hybri-Quick-Puffer (Roth, Karlsruhe) bei 68°C während 2 Stunden vorhybridisiert. Die Hybridisierung mit radioaktiv markierter Sonde wird über Nacht bei 68°C durchgeführt. Anschließend wird der Hybridisierungspuffer verworfen, und der Filter kurz unter Verwendung von 2 × SSC; 0,1% SDS gewaschen. Nach Verwerfen des Waschpuffers werden erneut 2 × SSC; 0,1% SDS-Puffer zugesetzt und bei 68°C 15 Minuten lang inkubiert. Dieser Waschschritt wird zweimal durchgeführt, wonach ein zusätzlicher Waschschritt mit 1 × SSC; 0,1% SDS bei 68°C während 10 Minuten folgt.
  • Einige Beispiele von Bedingungen für die DNA-Hybridisierung (Southern-Blot-Assays) und den Waschschritt sind hierin nachstehend gezeigt:
    • (1) Hybridisierungsbedingungen können zum Beispiel aus den folgenden Bedingungen ausgewählt werden: (a) 4 × SSC bei 65°C, (b) 6 × SSC bei 45°C, (c) 6 × SSC, 100 mg/ml denaturierte fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C, (d) 6 × SSC, 0,5% SSC, 100 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA bei 68°C, (e) 6 × SSC, 0,5% SSC, 100 mg/ml denaturierte fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C, (f) 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C, (g) 50% (v/v) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphat-Puffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, (h) 2 × oder 4 × SSC bei 50°C (Niederstringenzbedingung), oder (i) 30 bis 40% Formamid, 2 × oder 4 × SSC bei 42°C (Niederstringenzbedingung).
    • (2) Waschschritte können zum Beispiel aus den folgenden Bedingungen gewählt sein: (a) 0,015 M NaCl/1,0015 M Natriumcitrat/0,1% SSC bei 50°C. (b) 0,1 × SSC bei 65°C. (c) 0,1 × SSC, 0,5% SSC bei 68°C. (d) 0,1 × SSC, 0,5% SSC, 50% Formamid bei 42°C. (e) 0,2 × SSC, 0,1% SSC bei 42°C. (f) 2 × SSC bei 65°C (Niederstringenzbedingung).
  • Polypeptide mit der oben erwähnten Aktivität, d. h. vermittelnd einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, wie hierin erwähnt, z. B. erhöhte abiotische Stresstoleranz, z. B. Niedertemperaturtoleranz, z. B. mit erhöhter Nährstoffverwertungseffizienz und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon, die aus anderen Organismen abgeleitet werden, können von anderen DNA-Sequenzen codiert sein, welche an die in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen unter gelockerten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und welche bei Expression Peptide codieren, die den erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, wie hierin erwähnt, z. B. erhöhte abiotische Stresstoleranz, z. B. Niedertemperaturtoleranz oder gesteigerte Kälte-Toleranz, z. B. mit erhöhter Nährstoffverwertungseffizienz und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon vermitteln.
  • Ferner müssen manche Anwendungen bei Niederstringenz-Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden, und zwar ohne irgendwelche Folgen für die Spezifität der Hybridisierung. Zum Beispiel könnte eine Southern-Blot-Analyse von Gesamt-DNA mit einem Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung sondiert und bei niedriger Stringenz (55°C in 2 × SSPE, 0,1% SDS) gewaschen werden. Die Hybridisierungsanalyse könnte ein einfaches Muster von lediglich solchen Genen, welche Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, z. B. mit der hierin erwähnten Aktivität zur Steigerung des erhöhten Ertrags, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, wie hierin erwähnt, z. B. erhöhte abiotische Stresstoleranz, z. B. erhöhte Niedertemperaturtoleranz oder gesteigerte Kälte-Toleranz, z. B. mit erhöhter Nährstoffverwertungseffizienz und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhtem intrinsischen Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon, enthüllen. Ein weiteres Beispiel solcher niederstringenten Hybridisierungsbedingungen ist 4 × SSC bei 50°C oder eine Hybridisierung mit 30 bis 40% Formamid bei 42°C. Derartige Moleküle umfassen diejenigen, welche Fragmente, Analoge oder Derivate des erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptids sind, und unterscheiden sich beispielsweise hinsichtlich Aminosäure- und/oder Nukleotiddeletion(en), -insertion(en), -substitution(en), -addition(en) und/oder -rekombination(en) oder jedweder sonstigen Modifikation(en), welche im Fachgebiet bekannt sind, entweder allein oder in Kombination, von den oben beschriebenen Aminosäuresequenzen oder ihren zugrunde liegenden Nukleotidsequenz(en). Allerdings ist es bevorzugt, Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen anzuwenden.
  • Die Hybridisierung sollte in vorteilhafter Weise mit Fragmenten von mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 oder 40 bp, vorteilhafterweise mindestens 50, 60, 70 oder 80 bp, vorzugsweise mindestens 90, 100 oder 110 bp durchgeführt werden. Am meisten bevorzugt sind Fragmente mit wenigstens 15, 20, 25 oder 30 bp. Bevorzugt sind auch Hybridisierungen mit mindestens 100 bp oder 200, insbesondere bevorzugt mindestens 400 bp Länge. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sollte die Hybridisierung mit der gesamten Nukleinsäuresequenz bei den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt werden.
  • Die Begriffe ”Fragment”, ”Fragment einer Sequenz” oder ”Teil einer Sequenz” bedeuten eine trunkierte bzw. verkürzte Sequenz der betreffenden Originalsequenz. Die trunkierte Sequenz (Nukleinsäure- oder Proteinsequenz) kann hinsichtlich der Länge in großem Maß variieren; wobei die Minimumgröße eine Sequenz von ausreichender Größe ist, um eine Sequenz, die wenigstens eine vergleichbare Funktion und/oder Aktivität der Originalsequenz oder des betreffenden Moleküls aufweist oder mit dem erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremolekül unter stringenten Bedingungen hybridisiert, vorzusehen, während die Maximalgröße nicht kritisch ist. In manchen Anwendungen ist die Maximumgröße üblicherweise nicht wesentlich größer als diejenige, welche erforderlich ist, um die gewünschte Aktivität und/oder Funktion(en) der Originalsequenz bereitzustellen.
  • Typischerweise wird die/das trunkierte Aminosäuresequenz oder -molekül im Bereich von etwa 5 bis etwa 310 Aminosäuren Länge liegen. Noch typischer wird die Sequenz jedoch maximal etwa 250 Aminosäuren Länge, vorzugsweise maximal etwa 200 oder 100 Aminosäuren, aufweisen. Es ist üblicherweise erwünscht, Sequenzen mit mindestens etwa 10, 12 oder 15 Aminosäuren, bis zu einem Maximum von etwa 20 oder 25 Aminosäuren, zu wählen.
  • Der Begriff ”Epitop” bezieht sich auf spezifische immunreaktive Stellen innerhalb eines Antigens, welche ebenfalls als antigene Determinanten bekannt sind. Diese Epitope können eine lineare Anordnung von Monomeren in einer polymeren Zusammensetzung – wie etwa Aminosäuren in einem Protein – sein oder aus einer komplexeren Sekundär- oder Tertiärstruktur bestehen, oder diese umfassen. Der Fachmann wird erkennen, dass Immunogene (d. h. Substanzen, die zum Hervorrufen einer Immunantwort befähigt sind) Antigene sind; allerdings sind manche Antigene, wie etwa Haptene, keine Immunogene, sondern können durch Kopplung an ein Trägermolekül immunogen gemacht werden. Der Begriff ”Antigen” beinhaltet Bezugnahmen auf eine Substanz, gegen die ein Antikörper erzeugt werden kann und/oder gegen die der Antikörper spezifisch immunreaktiv ist.
  • In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Epitop des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder des Polypeptids, das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird und einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft wie hierin erwähnt, z. B. erhöhte abiotische Stresstoleranz, z. B. Niedertemperaturtoleranz oder gesteigerte Kälte-Toleranz, z. B. mit erhöhter Nah rstoffverwertungseffizienz, und/oder Wassernutzungseffizienz und/oder erhöhten intrinsischen Ertrag etc., im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon vermittelt.
  • Der Begriff ”eine oder mehrere Aminosäure(n)” bezieht sich auf mindestens eine Aminosäure aber nicht mehr als diejenige Anzahl von Aminosäuren, welche zu einer Homologie von unter 50% Identität führen wird. Vorzugsweise ist die Identität mehr als 70% oder 80%, weiter bevorzugt sind 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% oder 95%, noch weiter bevorzugt sind 96%, 97%, 98% oder 99% Identität.
  • Ferner umfasst das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das ein Komplement von einer der Nukleotidsequenzen der oben erwähnten Nukleinsäuremoleküle oder eines Abschnittes davon ist. Ein Nukleinsäuremolekül oder seine Sequenz, welche(s) zu einer/einem der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidmoleküle- oder sequenzen komplementär ist, ist ein solches, welches zu einer/einem der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidmoleküle- oder sequenzen ausreichend komplementär ist, damit es an eine der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidsequenzen hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex gebildet wird. Vorzugsweise wird die Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt. Allerdings ist ein Komplement von einer der hierin offenbarten Sequenzen vorzugsweise ein Sequenzkomplement dazu, in Übereinstimmung mit der dem Fachmann allgemein bekannten Basenpaarung von Nukleinsäuremolekülen. Beispielsweise gehen die Basen A und G jeweils eine Basenpaarung mit den [Basen T bzw. U oder C ein, und umgekehrt. Modifikationen der Basen können den Basenpaarungs-Partner beeinflussen.
  • Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu mindestens etwa 30%, 35%, 40% oder 45%, vorzugsweise mindestens etwa 50%, 55%, 60% oder 65%, weiter bevorzugt mindestens etwa 70%, 80%, oder 90%, und noch weiter bevorzugt mindestens etwa 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu einer in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidsequenz oder einem Abschnitt davon homolog ist und vorzugsweise die oben erwähnte Aktivität aufweist, insbesondere eine Ertrags-erhöhende Aktivität, z. B. Erhöhen einer ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel Steigern der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Erhöhen von Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhen der Nährstoffverwertungseffizienz, des erhöhten intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft nach Erhöhung der Aktivität, oder eine Aktivität eines Gens, wie in Tabelle I gezeigt, oder eines Genprodukts, z. B. wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigt, zum Beispiel durch Expression entweder im Cytosol oder Cytoplasma oder in einer Organelle, wie einer Plastide oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, aufweist.
  • In einer Ausführungsform werden die Nukleinsäuremoleküle, die in Tabelle I, Spalte 6, mit ”plastidisch” gekennzeichnet sind, oder von den Nukleinsäuremolekülen codierte Genprodukte, in Kombination mit einem Targeting-Signal, wie hierin beschrieben, exprimiert.
  • Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst ein(e) Nukleotidsequenz oder -molekül, welche(s) an eine der Nukleotidsequenzen oder ein Molekül, welche(s) in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigt ist, oder einen Abschnitt davon hybridisiert, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie hierin definiert, hybridisiert, und ein Protein codiert, das die oben erwähnte Aktivität, welche z. B. einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder eine andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon beispielsweise durch Expression entweder im Cytosol oder in einer Organelle, wie einer Plastide oder Mitochondrien oder beides, vorzugsweise in Plastiden, vermittelt, aufweist und gegebenenfalls die Aktivität aufweist, welche aus der Gruppe gewählt ist, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohllenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendes Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht.
  • Außerdem kann das Nukleinsäuremolekül der Erfindung lediglich einen Abschnitt der codierenden Region von einer der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen, zum Beispiel ein Fragment, welches als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment umfasse, codierend einen biologisch aktiven Abschnitt des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder eines im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptids, d. h. welcher die oben erwähnte Aktivität aufweist, die z. B. einen erhöhten Ertrag, z. B. mit einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, einen erhöhten intrinsischen Ertrag und/oder eine andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon vermittelt, wenn seine Aktivität beispielsweise durch Expression entweder im Cytosol oder in einer Organelle, wie einer Plastide oder Mitochondrien oder beides, vorzugsweise in Plastiden, erhöht wird. Die Nukleotidsequenzen, ermittelt aus der Klonierung des Gens, codierend das erfindungsgemäß betroffene Protein, gestatten die Erzeugung von Sonden und Primern, die für die Verwendung bei der Identifizierung und/oder Klonierung seiner Homologe in anderen Zelltypen und Organismen entworfen werden. Die Sonde/der Primer umfasst typischerweise im wesentlichen gereinigtes Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst typischerweise eine Nukleotidsequenz-Region, welche unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, 15, vorzugsweise etwa 20 oder 25, weiter bevorzugt etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide von einem Sense-Strang von einer der z. B. in Tabelle I, Spalten 5 und 7, dargestellten Sequenzen, von einer Antisense-Sequenz von einer der z. B. in Tabelle I, Spalten 5 und 7, dargestellten Sequenzen, oder von natürlich vorkommenden Mutanten davon, hybridisiert. Auf einem Nukleotid der Erfindung basierende Primer können in PCR-Reaktionen verwendet werden, um Homologe des Polypeptids der Erfindung oder des im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptids zu klonieren, z. B. wie die Primer, die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, z. B. wie in den Beispielen gezeigt. Eine PCR mit den in Tabelle III, Spalte 7, gezeigten Primern wird zu einem Fragment des Genprodukts führen, wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigt.
  • Primersätze sind austauschbar. Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, wie man die Primer kombiniert, damit sie zu dem gewünschten Produkt, z. B. zu einem Volllängenklon oder einer partiellen Sequenz, führen. Auf den Sequenzen des erfindungsgemäßen oder im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls basierende Sonden können verwendet werden, um Transkripte oder genomische Sequenzen, welche die gleichen oder homologe Proteine codieren, nachzuweisen. Die Sonde kann ferner eine daran gebundene Markierungsgruppe umfassen, wobei die Markierungsgruppe z. B. ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Cofaktor sein kann. Derartige Sonden können als ein Teil eines genomischen Marker-Testkits zum Identifizieren von Zellen eingesetzt werden, welche ein erfindungsgemäßes oder im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendetes Polypeptid exprimieren, wie etwa durch Messen eines Spiegels eines codierenden Nukleinsäuremoleküls in einer Probe von Zellen, wobei z. B. mRNA-Spiegel erfasst werden oder bestimmt wird, ob ein genomisches Gen, umfassend die Sequenz des erfindungsgemäßen oder in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Polynukleotids, mutiert oder deletiert worden ist.
  • Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert ein Polypeptid oder einen Abschnitt davon, welcher eine Aminosäuresequenz einschließt, die zu der in den Spalten 5 und 7 von Tabelle II gezeigten Aminosäuresequenz ausreichend homolog ist, damit das Protein oder der Abschnitt davon die Fähigkeit beibehält, an der Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon, teilzunehmen, wobei insbesondere die Erhöhung der Aktivität, wie oben erwähnt oder wie in den Beispielen beschrieben, in Pflanzen eingeschlossen ist.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”ausreichend homolog” auf Proteine oder Abschnitte davon, welche Aminosäuresequenzen aufweisen, die eine minimale Anzahl an identischen oder äquivalenten Aminosäureresten (z. B. einen Aminosäurerest, der eine ähnliche Seitenkette wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung enthält) zu einer in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Aminosäuresequenz einschließen, so dass das Protein oder der Abschnitt davon zu einer Beteiligung an der Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon, in der Lage ist. Zum Beispiel weist es die Aktivität eines Proteins, wie in Tabelle II, Spalte 3, gezeigt und wie hierin beschrieben, auf.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure, welche einen Abschnitt des Proteins der vorliegenden Erfindung codiert. Das Protein ist mindestens etwa 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, bevorzugt mindestens etwa 55%, 60%, 65% oder 70%, und weiter bevorzugt mindestens etwa 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% oder 94% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95%, 97%, 98%, 99% oder mehr, homolog zu einer vollständigen Aminosäuresequenz von Tabelle II, Spalten 5 und 7, und weist die oben erwähnte Aktivität auf, die z. B. einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon, beispielsweise durch Expression entweder im Cytosol oder in einer Organelle, wie einer Plastide oder Mitochondrien oder beides, vorzugsweise in Plastiden, herbeiführt.
  • Abschnitte von Proteinen, die von dem Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktiv, wobei sie vorzugsweise die oben erwähnte zugeschriebene Aktivität, die z. B. einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon nach Erhöhen der Aktivität herbeiführt, aufweisen.
  • Wie hierin erwähnt, ist mit dem Begriff ”biologisch aktiver Abschnitt” beabsichtigt, einen Abschnitt, z. B. eine Domäne/ein Motiv, einzuschließen, welcher einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon vermittelt oder eine immunologische Aktivität aufweist, so dass er an einen Antikörper bindet, der spezifisch an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Polypeptid bindet, das in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung des Ertrags, z. B. zur Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel zur Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel zur Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder zur Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, zur Erhöhung des intrinsischen Ertrag und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon, verwendet wird.
  • Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuremoleküle, welche als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes von einer der in Tabelle IA, Spalten 5 und 7, gezeigten Nukleotidsequenzen (und Abschnitten davon) abweichen und dementsprechend ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, im Besonderen ein Polypeptid, das die oben erwähnte Aktivität aufweist, z. B. wie jene Polypeptide, die durch die in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigte Sequenz aufgeführt sind, oder die funktionellen Homologe, codieren. In vorteilhafter Weise umfasst, oder, in einer anderen Ausführungsform, besitzt, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Nukleotidsequenz, die ein Protein, das eine in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigte Aminosäuresequenz umfasst oder, in einer anderen Ausführungsform, aufweist, oder die funktionellen Homologe codiert. In noch einer weiteren Ausführungsform codiert das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Volllängenprotein, das zu einer in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Aminosäuresequenz oder den funktionellen Homologen im Wesentlichen homolog ist. Allerdings besteht das Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, in einer Ausführungsform, nicht aus der in Tabelle I, vorzugsweise Tabelle IA, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz.
  • Darüber hinaus wird es der Fachmann auf dem Gebiet richtig verstehen, dass DNA-Sequenzpolymorphismen, welche zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen führen, innerhalb einer Population vorkommen können. Ein derartiger genetischer Polymorphismus in dem Gen, welches z. B. das Polypeptid der Erfindung codiert oder das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst, kann aufgrund natürlicher Variation unter Individuen innerhalb einer Population existieren.
  • Nukleinsäuremoleküle, welche natürlichen Varianten-Homologen eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung entsprechen, bei denen es sich auch um eine cDNA handeln kann, können basierend auf ihrer Homologie zu den hierin offenbarten Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, oder eines Abschnitts davon, als Hybridisierungssonde gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden.
  • Folglich ist ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung, in einer anderen Ausführungsform, mindestens 15, 20, 25 oder 30 Nukleotide lang. Vorzugsweise hybridisiert es unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung oder des im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls, z. B. umfassend die in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigte Sequenz. Das Nukleinsäuremolekül ist vorzugsweise mindestens 20, 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide lang.
  • Der Begriff ”hybridisiert unter stringenten Bedingungen” ist oben stehend definiert. In einer Ausführungsform beschreibt der Ausdruck ”hybridisiert unter stringenten Bedingungen” beabsichtigtermaßen Bedingungen für die Hybridisierung und das Waschen, unter denen Nukleotidsequenzen, welche wenigstens zu 30%, 40%, 50% oder 65% identisch zueinander sind, in der Regel aneinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen derartig, dass Sequenzen mit wenigstens etwa 70%, weiter bevorzugt wenigstens etwa 75% oder 80%, und noch weiter bevorzugt wenigstens etwa 85%, 90% oder 95% oder mehr Identität zueinander in der Regel aneinander hybridisiert bleiben.
  • Vorzugsweise entspricht ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung, das unter stringenten Bedingungen an eine in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigte Sequenz hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül der Erfindung. Wie hierin verwendet, bezieht sich ein ”natürlich vorkommendes” Nukleinsäuremolekül auf ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, welche in der Natur vorkommt (wobei es z. B. ein natürliches Protein codiert). Vorzugsweise codiert das Nukleinsäuremolekül ein natürliches Protein, welches eine oben erwähnte Aktivität, die z. B. eine Erhöhung des Ertrags, z. B. Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel eine Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft nach Erhöhen der Expression oder Aktivität davon vermittelt, oder die Aktivität eines erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteins zum Beispiel durch Expression der Nukleinsäuresequenz des Genprodukts im Cytosol und/oder in einer Organelle, wie einer Plastide oder Mitochondrien, vorzugsweise in Plastiden, aufweist.
  • Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der Sequenzen des Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls der Erfindung sowie des im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptids oder Nukleinsäuremoleküls, welche in der Population existieren können, wird der Fachmann ferner davon ausgehen, dass Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls, welches das erfindungsgemäße oder im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid codiert, eingebracht werden können, was zu Änderungen in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids ohne Änderung des Funktionsvermögens des Polypeptids führt, wobei vorzugsweise die Aktivität nicht verringert wird.
  • Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, welche zu Aminosäuresubstitutionen an ”nicht-essentiellen” Aminosäureresten führen, in einer Sequenz des erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküls, die z. B. in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigt ist, vorgenommen werden.
  • Ein ”nicht-essentieller” Aminosäurerest ist ein Rest, der von der Wildtypsequenz ohne Ändern der Aktivität des Polypeptids abgewandelt werden kann, wohingegen ein ”essentieller” Aminosäurerest für eine Aktivität, wie oben erwähnt, erforderlich ist, die z. B. eine Erhöhung des Ertrags, z. B. die Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel eine Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon in einem Organismus nach einer Erhöhung der Aktivität des Polypeptids herbeiführt. Andere Aminosäurereste (z. B. diejenigen, welche in der Domäne mit der Aktivität nicht konserviert oder lediglich halbkonserviert sind) müssen jedoch nicht essentiell für die Aktivität sein und vermögen daher wahrscheinlich einer Änderung unterzogen zu werden, ohne die Aktivität zu verändern.
  • Ferner weiß der Fachmann auf dem Gebiet, dass sich die Codon-Verwendung zwischen Organismen unterscheiden kann. Deshalb kann er die Codon-Verwendung im Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung an die Verwendung des Organismus oder des Zellkompartiments, zum Beispiel der Plastide oder Mitochondrien, in denen das Polynukleotid oder Polypeptid exprimiert wird, anpassen.
  • Demzufolge betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, codierend ein Polypeptid mit einer oben-erwähnten Aktivität, in einem Organismen oder Teilen davon zum Beispiel bei Expression entweder im Cytosol oder in einer Organelle, wie einer Plastide oder Mitochondrien oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, welche Änderungen in Aminosäureresten enthalten, die für die Aktivität nicht essentiell sind. Derartige Polypeptide unterscheiden sich hinsichtlich der Aminosäuresequenz von einer Sequenz, enthalten in den in der Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen, aber behalten dennoch die hierin beschriebene Aktivität bei. Das Nukleinsäuremolekül kann eine Nukleotidsequenz umfassen, codierend ein Polypeptid, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu etwa 50% identisch zu einer in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Aminosäuresequenz ist und zur Teilnahme an der Erhöhung des Ertrags, z. B. der Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel der Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel der Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder der Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrag und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon nach Erhöhen seiner Aktivität, z. B. seiner Expression zum Beispiel durch Expression entweder im Cytosol oder in einer Organelle wie einer Plastide oder Mitochondrien, oder beiden, vorzugsweise in Plastiden, in der Lage ist. Vorzugsweise ist das von dem Nukleinsäuremolekül codierte Protein zu mindestens etwa 60% identisch zu der in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz, weiter bevorzugt mindestens etwa 70% identisch zu einer der in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen, noch weiter bevorzugt mindestens etwa 80%, 90%, 95% homolog zu der in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz, und am meisten bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98% oder 99% identisch zu der in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz.
  • Um die prozentuale Homologie (= Identität, hierin austauschbar verwendet) von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuremolekülen zu ermitteln, werden die Sequenzen für einen optimalen Vergleich untereinander aufgeschrieben (zum Beispiel können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingefügt werden, um eine optimale Ausrichtung bzw. Alignierung mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure zu schaffen).
  • Die Aminosäurereste oder Nukleinsäuremoleküle an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz von demselben Aminosäurerest oder demselben Nukleinsäuremolekül wie die entsprechende Position in der anderen Sequenz besetzt ist, sind die Moleküle an dieser Position homolog (d. h. Aminosäure- oder Nukleinsäure-”Homologie”, wie im vorliegenden Kontext verwendet, entspricht Aminosäure- oder Nukleinsäure-”Identität”). Die prozentuale Homologie zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen, welche die Sequenzen gemeinsam haben (d. h. % Homologie = Anzahl identischer Positionen/Gesamtanzahl an Positionen × 100). Die Begriffe ”Homologie” und ”Identität” sind daher als Synonyme zu betrachten.
  • Für die Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität) von zwei oder mehr Aminosäure- oder zwei oder mehr Nukleotid-Sequenzen sind mehrere Computer-Softwareprogramme entwickelt worden. Die Homologie von zwei oder mehreren Sequenzen kann beispielsweise mit der Software Fasta berechnet werden, welche gegenwärtig in der Version Fasta 3 angewandt worden ist (W. R. Pearson und D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988); W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 63 (1990); W. R. Pearson und D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988); W. R. Pearson, Enzymology 183, 63 (1990)). Ein anderes nützliches Programm für die Berechnung von Homologien verschiedener Sequenzen ist das standardmäßige Blast-Programm, welches in der Biomax-Pedant-Software (Biomax, München, Bundesrepublik Deutschland) enthalten ist. Dieses führt unglücklicherweise manchmal zu suboptimalen Ergebnissen, da Blast nicht immer vollständige Sequenzen der Datenbanksequenz (Subject) und der Suchsequenz (Query) beinhaltet. Da dieses Programm nichtsdestoweniger sehr effizient ist, kann es für den Vergleich einer gewaltigen Anzahl von Sequenzen verwendet werden. Die folgenden Einstellungen werden typischerweise für einen derartigen Vergleich von Sequenzen verwendet: -p Programmname [String]; -d Datenbank [String]; Vorgabe = nr; -i Query-Datei [File In]; Vorgabe stdin; -e Erwartungswert (E) [Real]; Vorgabe = 10.0; -m Alignment-Anzeigeoptionen: 0 = paarweise; 1 = Query-verankert, Identitäten-Anzeige; 2 = Query-verankert, ohne Identitäten; 3 = flach Query-verankert, Identitäten-Anzeige; 4 = flach Query-verankert, ohne Identitäten; 5 = Query-verankert, ohne Identitäten und glatte Enden; 6 = flach Query-verankert, ohne Identitäten und glatte Enden; 7 = XML-Blast-Ausgabe; 8 = tabellenförmig; 9 tabellenförmig mit Kommentarzeilen [Integer]; Vorgabe = 0; -o BLAST Report-Ausgabedatei [File Out] Optional; Vorgabe = stdout; -F Filter Query-Sequenz (DUST bei blastn, SEG bei anderen) [String]; Vorgabe = T; -G Lückenöffnungs-Aufwand (null bedingt Standardverhalten) [Integer]; Vorgabe = 0; -E Lückenerweiterungs-Aufwand (null bedingt Standardverhalten) [Integer]; Vorgabe = 0; -X X Abschaltwert für lückenhaltiges Alignment (in bits) (null bedingt Standardverhalten); blastn 30, megablast 20, tblastx 0, alle anderen 15 [Integer]; Vorgabe = 0; -I Gl's in Def.-Zeilen zeigen [T/F]; Vorgabe = F; -q Strafwert für eine Nukleotid-Fehlpaarung (nur blastn) [Integer]; Vorgabe = -3; -r Belohnungswert für eine Nukleotid-Übereinstimmung (nur blastn) [Integer]; Vorgabe = 1; -v Zahl an Datenbanksequenzen, für die einzeilige Beschreibungen gezeigt werden sollen (V) [Integer]; Vorgabe = 500; -b Zahl an Datenbanksequenzen, für die Alignments für (B) gezeigt werden sollen [Integer]; Vorgabe = 250; -f Schwelle für Treffererweiterung, Vorgabe sofern null; blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, megablast 0 [Integer]; Vorgabe = 0; -g Durchführen von lückenhaltigem Alignment (nicht verfügbar bei tblastx) [T/F]; Vorgabe = T; -Q Zu verwendender Query-Genetischer-Code [Integer]; Vorgabe = 1; -D DB Genetischer Code (nur für tblast[nx]) [Integer]; Vorgabe = 1; -a Zahl zu nutzender Prozessoren [Integer]; Vorgabe = 1; -O SeqAlign-Datei [File Out] Optional; -J Query-Def.-Zeile vertrauen [T/F]; Vorgabe = F; -M Matrix [String]; Vorgabe = BLOSUM62; -W Wortgröße, Vorgabe falls null (blastn 11, megablast 28, alle anderen 3) [Integer]; Vorgabe = 0; -z Effektive Länge der Datenbank (verwende null für die reale Größe) [Real]; Vorgabe = 0; -K Zahl an beizubehaltenden besten Treffern aus einer Region (standardmäßig ausgeschaltet, sofern verwendet, wird ein Wert von 100 empfohlen) [Integer]; Vorgabe = 0; -P 0 für Mehrfach-Treffer, 1 für Einzel-Treffer [Integer]; Vorgabe = 0; -Y Effektive Länge des Abfrageraums (benutze Null für die reale Große) [Real]; Vorgabe = 0; -S Query-Stränge, die gegen die Datenbank abzufragen sind (für blast[nx], und tblastx); 3 für beide, 1 für oberen, 2 für unteren [Integer]; Vorgabe = 3; -T HTML-Ausgabe erstellen [T/F]; Vorgabe = F; -I Datenbanksuche auf Liste von Gl's begrenzen [String] Optional; -U Verwende Kleinbuchstaben-Filterung von FASTA-Sequenz [T/F] Optional; Vorgabe = F; -y X Abschaltwert für lückenfreie Erweiterungen in bits (0.0 bedingt Standardverhalten); blastn 20, megablast 10, alle anderen 7 [Real]; Vorgabe = 0.0; -Z X Abschaltwert für letztliches lückenhaltiges Alignment in bits (0.0 bedingt Standardverhalten); blastn/megablast 50, tblastx 0, alle anderen 25 [Integer]; Vorgabe = 0; -R PSI-TBLASTN-Checkpoint-Datei [File In] Optional; -n MegaBlast-Suche [T/F]; Vorgabe = F; -L Lage auf Query-Sequenz [String] Optional; -A Mehrfach-Treffer Fenstergröße, Vorgabe falls null (blastn/megablast 0, alle anderen 40 [Integer]; Vorgabe = 0; -w Rasterschub-Strafwert (OOF Algorithmus für blastx) [Integer]; Vorgabe = 0; -t Länge des größten Introns, zugelassen in tblastn zum Verknüpfen von HSPs (0 schaltet das Verknüpfen aus) [Integer]; Vorgabe = 0.
  • Ergebnisse von hoher Qualität werden durch Anwenden des Algorithmus von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman erreicht. Deshalb werden Programme, die auf den genannten Algorithmen basieren, bevorzugt. Vorteilhafterweise können die Vergleiche von Sequenzen mit dem Programm PileUp (J. Mal. Evolution., 25, 351 (1987), Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989)) oder vorzugsweise mit den Programmen ”Gap” und ”Needle”, welche beide auf den Algorithmen von Needleman und Wunsch basieren (J. Mol. Biol. 48; 443 (1970)), sowie ”Best-Fit”, welches auf dem Algorithmus von Smith und Waterman basiert (Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981)), durchgeführt werden. ”Gap” und ”BestFit” sind Teil des GCG-Software-Pakets (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)), ”Needle” ist ein Teil der ”The European Molecular Biology Open Software Suite” (EMBOSS) (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)). Deshalb werden die Berechnungen zur Bestimmung der Prozentsätze der Sequenzhomologie vorzugsweise mit den Programmen ”Gap” oder ”Needle” über die gesamte Spannweite der Sequenzen hinweg durchgeführt. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen wurden für ”Needle” verwendet: Matrix: EDNAFULL, Lücken-Strafwert: 10,0, Erweiterungs-Strafwert: 0,5. Die folgenden Standardeinstellungen für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen wurden für ”Gap” verwendet: Lücken-Gewichtung: 50, Längen-Gewichtung: 3, durchschnittliche Übereinstimmung: 10,000, durchschnittliche Fehlpaarung: 0,000.
  • Es versteht sich, dass beispielsweise eine Sequenz, welche eine 80%ige Homologie zur Sequenz SEQ ID NR: 22 auf dem Nukleinsäureniveau aufweist, eine Sequenz bezeichnet, welche beim Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NR: 22 durch das oben genannte Programm ”Needle” mit dem oben genannten Parameter-Satz eine Homologie von 80% aufweist.
  • Es versteht sich, dass Homologie zwischen zwei Polypeptiden die Identität der Aminosäuresequenz über, in jedem Fall, die gesamte Sequenzlänge bedeutet, welche durch einen Vergleich mit Hilfe des oben genannten Programms ”Needle” unter Verwendung der Matrix: EBLOSUM62, Lücken-Strafwert: 8,0, Erweiterungs-Strafwert: 2,0 berechnet wird.
  • Zum Beispiel versteht es sich, dass eine Sequenz, welche eine 80%ige Homologie mit der Sequenz SEQ ID NR: 23 auf dem Proteinniveau aufweist, eine Sequenz bedeutet, welche bei einem Vergleich zur Sequenz SEQ ID NR: 23 durch das oben genannte Programm ”Needle” mit dem oben aufgeführten Parameter-Satz eine 80%ige Homologie aufweist.
  • Funktionelle Äquivalente, die aus der Nukleinsäuresequenz, wie in Tabelle I, Spalten 5 und 7 gezeigt, gemäß der Erfindung durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitet werden, weisen mindestens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 85% oder 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, 97%, 98% oder 99% Homologie mit einem der Polypeptide, wie in Tabelle II, Spalten 5 und 7 gezeigt, gemäß der Erfindung, auf und codieren Polypeptide, die im wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie das Polypeptid, wie in Tabelle II, Spalten 5 und 7 gezeigt, aufweisen. Funktionelle Äquivalente, die aus einem der Polypeptide, wie in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigt, gemäß der Erfindung durch Substitution, Insertion oder Deletion abgeleitet werden, weisen mindestens 30%, 35%, 40%, 45% oder 50%, bevorzugt mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 85% oder 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, 97%, 98% oder 99% Homologie mit einem der Polypeptide, wie in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigt, gemäß der Erfindung auf und zeichnen sich durch im wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie das Polypeptid, wie in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigt, aus.
  • ”Im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften” eines funktionellen Äquivalentes versteht sich vor allem in der Bedeutung, dass das funktionelle Äquivalent die oben erwähnte Aktivität aufweist, beispielsweise bei Expression entweder im Cytosol oder in einer Organelle, wie einer Plastide oder Mitochondrien oder beidem, vorzugsweise in Plastiden, während die Proteinmenge, die Aktivität oder die Funktion des funktionellen Äquivalentes in einem Organismus, z. B. einem Mikroorganismus, einer Pflanze oder in einem Pflanzengewebe oder Tiergewebe, Pflanzen- oder Tierzellen oder einem Teil derselben erhöht wird.
  • Ein Nukleinsäuremolekül, das ein Homolog zu einer Proteinsequenz von Tabelle II, Spalten 5 und 7, codiert, kann durch Einbringen von einer oder mehreren Nukleotid-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen in eine Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung, insbesondere von Tabelle I, Spalten 5 und 7, so erzeugt werden, dass eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen in das codierte Protein eingeführt werden. Mutationen können in die codierenden Sequenzen von Tabelle I, Spalten 5 und 7, durch Standardtechniken, wie ortsgerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingeführt werden.
  • Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren vorausgesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten vorgenommen. Eine ”konservative Aminosäuresubstitution” ist eine solche, bei welcher der Aminosäurerest mit einem Aminosäurerest ersetzt wird, der eine ähnliche Seitenkette aufweist. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind im Fachgebiet definiert worden. Diese Familien beinhalten Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht-polaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, [soleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin).
  • Somit wird ein vorhergesagter nichtessentieller Aminosäurerest in einem Polypeptid der Erfindung oder einem im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptid vorzugsweise mit einem anderen Aminosäurerest aus der gleichen Familie ersetzt. Alternativ können, in einer anderen Ausführungsform, Mutationen entlang der Gesamtheit oder eines Teils einer codierenden Sequenz eines erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküls statistisch eingeführt werden, wie etwa durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können hinsichtlich der hierin beschriebenen Aktivität durchrastert bzw. gescreent werden, um Mutanten zu identifizieren, welche die oben erwähnte Aktivität beibehalten oder sogar im erhöhten Maße aufweisen, die z. B. einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon, vermittelt.
  • Im Anschluss an die Mutagenese von einer der Sequenzen, wie hierin gezeigt, kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann zum Beispiel unter Anwendung der hierin beschriebenen Assays ermittelt werden (siehe Beispiele).
  • Die höchste Homologie des im Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls wurde für die folgenden Datenbank-Eingaben mittels Gap-Suche gefunden.
  • Homologe der verwendeten Nukleinsäuresequenzen mit der in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenz umfassen auch allelische Varianten mit mindestens ungefähr 30%, 35%, 40% oder 45% Homologie, vorzugsweise mindestens ungefähr 50%, 60% oder 70%, weiter bevorzugt mindestens ungefähr 90%, 91%, 92%, 93%, 94% oder 95% und noch weiter bevorzugt mindestens ungefähr 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Homologie zu einer der gezeigten Nukleotidsequenzen oder den oben erwähnten abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen oder ihren Homologen, Derivaten oder Analogen oder Teilen derselben. Allelische Varianten beinhalten insbesondere funktionelle Varianten, welche durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus den gezeigten Sequenzen, vorzugsweise aus Tabelle I, Spalten 5 und 7, oder aus den abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen erhalten werden können, wobei die Absicht jedoch darin besteht, dass die Enzymaktivität oder die biologsche Aktivität der resultierenden synthetisierten Proteine in vorteilhafter Weise beibehalten bleibt oder erhöht wird.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das erfindungsgemäße oder im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül die Sequenzen, die in einer beliebigen der Spalten 5 und 7 von Tabelle I gezeigt sind. Es wird bevorzugt, dass das Nukleinsäuremolekül so wenig andere Nukleotide wie möglich, welche in einer beliebigen der Spalten 5 und 7 von Tabelle I nicht gezeigt sind, umfasst. In einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50 oder 40 weitere Nukleotide. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 30, 20 oder 10 weitere Nukleotide. In einer Ausführungsform ist das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül identisch zu den Sequenzen, die in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigt sind.
  • Auch wird es bevorzugt, dass das im Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid codiert, das die in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigte Sequenz umfasst. In einer Ausführungsform codiert das Nukleinsäuremolekül weniger als 150, 130, 100, 80, 60, 50, 40 oder 30 weitere Aminosäuren. In einer weiteren Ausführungsform, umfasst das codierte Polypeptid weniger als 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 oder 5 weitere Aminosäuren. In eher im erfindungsgemäßen Verfahren angewandten Ausführungsform ist das codierte Polypeptid identisch zu den in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen.
  • In einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße oder im Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid, welches die in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigte Sequenz umfasst, und beinhaltet weniger als 100 weitere Nukleotide. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül weniger als 30 weitere Nukleotide. In einer Ausführungsform ist das im Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül identisch zu einer codierenden Sequenz von den in Tabelle I, Spalten 5 und 7, gezeigten Sequenzen.
  • Polypeptide (= Proteine), welche noch die essentielle biologische oder enzymatische Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung aufweisen, die einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanze oder einem Teil davon vermittelt, d. h. deren Aktivität nicht im Wesentlichen reduziert ist, sind Polypeptide mit mindestens 10% oder 20%, bevorzugt 30% oder 40%, besonders bevorzugt 50% oder 60%, ganz besonders bevorzugt 80% oder 90 oder mehr der biologischen Wildtypaktivität oder Enzymaktivität, wobei die Aktivität im Vergleich zu der Aktivität eines in Tabelle II, Spalten 5 und 7, gezeigten Polypeptids, das unter identischen Bedingungen exprimiert wird, vorteilhafterweise im Wesentlichen nicht verringert ist.
  • Homologe von Tabelle I, Spalten 5 und 7, oder der abgeleiteten Sequenzen von Tabelle II, Spalten 5 und 7, bedeuten ebenfalls verkürzte Sequenzen, cDNA, einzelsträngige DNA oder RNA der codierenden und nicht codierenden DNA-Sequenz. Es versteht sich auch, dass Homologe der Sequenzen Derivate bedeuten, welche nichtcodierende Regionen, wie zum Beispiel, UTRs, Terminatoren, Enhancer oder Promotorvarianten umfassen. Die Promotoren stromaufwärts der angegebenen Nukleotidsequenzen können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert sein, ohne jedoch die Funktionalität oder Aktivität entweder der Promotoren, des offenen Leserahmens (= ORF), oder die 3'-regulatorische Region, wie Terminatoren oder andere 3'-regulatorische Regionen, welche weit entfernt von dem ORF liegen, zu beeinträchtigen. Es ist außderdem möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifizieren ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind hierin nachstehend erwähnt.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen, welche das Polypeptid gemäß der Erfindung codieren, betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung negative Regulatoren der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls, gewählt aus der Gruppe gemäß Tabelle I, Spalte 5 und/oder 7, vorzugsweise Spalte 7. Man nimmt an, dass Antisense-Polynukleotide gegen selbige die herunterregulierende Aktivität dieser negativen Regulatoren durch spezifisches Binden des Zielpolynukleotids und Stören der Transkription, des Spleißens, des Transports, der Translation, und/oder der Stabilität des Zielpolynukleotids inhibieren. Im Stand der Technik werden Verfahren für das Targeting des Antisense-Polynukleotids zur chromosomalen DNA, zu einem primären RNA-Transkript, oder zu einer prozessierten mRNA beschrieben. Vorzugsweise schließen die Zielregionen Spleißstellen, Translationsinitiations-Codons, Translationsterminations-Codons und andere Sequenzen innerhalb des offenen Leserahmens ein.
  • Der Begriff ”Antisense” bezieht sich, für die Zwecke der Erfindung, auf eine Nukleinsäure, umfassend ein Polynukleotid, das ausreichend komplementär zur Gesamtheit oder einem Abschnitt eines Gens, Primärtranskripts oder prozessierter mRNA ist, so dass es die Expression des endogenen Gens stört. ”Komplementäre” Polynukleotide sind diejenige, welche zur Basenpaarung gemäß den standardmäßigen Watson-Crick-Komplementaritäts-Regeln in der Lage sind. Im Genaueren werden Purine mit Pyrimidinen basenpaaren, wobei eine Kombination von Guanin, gepaart mit Cytosin (G:C), und Adenin, entweder gepaart mit Thymin (A:T) im Fall von DNA oder Adenin, das mit Uracil gepaart ist (A:U), im Fall von RNA, gebildet wird. Es versteht sich auch, dass zwei Polynukleotide miteinander hybridisieren können, selbst wenn sie nicht vollständig komplementär zueinander sind, vorausgesetzt, dass jedes mindestens eine Region aufweist, welche im Wesentlichen komplementär zum anderen ist. Der Begriff ”Antisense-Nukleinsäure” beinhaltet einzelsträngige RNA sowie doppelsträngige DNA-Expressionskassetten, welche transkribiert werden können, um eine Antisense-RNA herzustellen. ”Aktive” Antisense-Nukleinsäuren sind Antisense-RNA-Moleküle, welche zum selektiven Hybridisieren mit einem negativen Regulator der Aktivität eines Nukleinsäuremoleküls fähig sind, das ein Polypeptid codiert, aufweisend mindestens 80% Sequenzidentität zu dem Polypeptid, gewählt aus der Gruppe gemäß Tabelle II, Spalte 5 und/oder 7, vorzugsweise Spalte 7.
  • Die Antisense-Nukleinsäure kann zu einem gesamten Negativregulator-Strang oder lediglich zu einem Abschnitt davon komplementär sein. In einer Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül der Antisense zu einer ”nicht-codierenden Region” des codierenden Strangs einer das Polypeptid gemäß der Erfindung codierenden Nukleotidsequenz. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sieh auf die codierende Region flankierende 5'- und 3'-Sequenzen, welche nicht zu Aminosäuren translatiert werden (d. h., die ebenfalls als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet werden). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu nur einem Abschnitt der nicht-codierenden Region einer mRNA sein. Zum Beispiel kann das Antisense-Oligonukleotid komplementär zu der Region sein, welche die Translations-Startstelle der mRNA umgibt. Ein Antisense-Oligonukleotid kann zum Beispiel etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. In der Regel umfassen die Antisense-Moleküle der vorliegenden Erfindung eine RNA mit 60–100% Sequenzidentität zu mindestens 14 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer nicht-codierenden Region von einer der Nukleinsäuren von Tabelle I. Vorzugsweise wird die Sequenzidentität mindestens 70%, weiter bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% und am meisten bevorzugt 99% betragen.
  • Eine Antisense-Nukleinsäure der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Prozeduren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschieden modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen um die biologische Stabilität der Moleküle zu erhöhen oder die physikalische Stabilität des Duplex zu erhöhen, der zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuren gebildet wird, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Zu Beispielen für modifizierte Nukleotide, welche zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, zählen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)-uracil, acp3 und 2,6-Diaminopurin. Alternativ kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in den eine Nukleinsäure in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., RNA, die von der inserierten Nukleinsäure aus transkribiert wird, wird eine Antisense-Orientierung zu einer Ziel-Nukleinsäure von Interesse aufweisen, was im folgenden Unterabschnitt weiter beschrieben wird).
  • In noch einer anderen Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander laufen (Gaultier et al., Nucleic Acids. Res. 15, 6625 (1987)). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15, 6131 (1987)) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al., FEBS Lett. 215, 327 (1987)) umfassen.
  • Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung werden typischerweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie an zelluläre mRNA und/oder genomische DNA hybridisieren oder daran binden. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex, oder, zum Beispiel, im Fall von einem Antisense-Nukleinsäuremolekül, das an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix erfolgen. Das Antisense-Molekül kann modifiziert sein, so dass es spezifisch an einen Rezeptor oder ein Antigen, der/das auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert wird, bindet, z. B. durch Verknüpfen des Antisense-Nukleinsäuremoleküls an ein Peptid oder einen Antikörper, das an ein(en) Zelloberflächenrezeptor oder -antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen zugeführt werden. Um eine ausreichende intrazelluläre Konzentrationen der Antisense-Moleküle zu erreichen, werden Vektorkonstrukte bevorzugt, in denen das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter die Kontrolle eines starken prokaryotischen, viralen, oder eukaryotischen (einschließlich pflanzlichen) Promotor gestellt ist.
  • Als eine Alternative zu Antisense-Polynukleotiden können Ribozyme, Sense-Polynukleotide oder doppelsträngige RNA (dsRNA) verwendet werden, um die Expression des Polypeptids gemäß der Erfindung-Polypeptids zu reduzieren. Mit ”Ribozym” wird ein katalytisches RNA-basiertes Enzym mit Ribonuklease-Aktivitöt gemeint, welches zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäure, wie einer mRNA, fähig ist, zu der es eine komplementäre Region aufweist. Ribozyme (z. B., "Hammerkopf"-Ribozyme, beschrieben in Haselhoff und Gerlach, Nature 334, 585 (1988)) können verwendet werden, um die mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, um dadurch die Translation der mRNA zu inhibieren. Ein Ribozym mit Spezifität für die erfindungsgemäßes Polypeptid codierende Nukleinsäure kann entworfen werden basierend auf der Nukleotidsequenz der Erfindungsgemäßes-Polypeptid-cDNA, wie hierin offenbart, oder auf der Basis einer heterologen Sequenz, die gemäß den in dieser Erfindung gelehrten Verfahren isoliert werden soll. Zum Beispiel kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS-RNA konstruiert werden, in welchem die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in der erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden mRNA gespalten werden soll. Siehe z. B. U.S. Patent Nrn: 4 987 071 und 5 116 742 von Cech et al. Alterriativ kann die mRNA verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren. Siehe z. B. Bartel D., und Szostak J. W., Science 261, 1411 (1993). In bevorzugten Ausführungsformen wird das Ribozym einen Abschnitt mit mindestens 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 Nukleotiden, und weiter bevorzugt 7 oder 8 Nukleotiden enthalten, welcher 100% Komplementarität zu einem Abschnitt der Ziel-RNA aufweist. Verfahren zur Herstellung von Ribozymen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Siehe, z. B. U.S.-Patent Nrn. 6 025 167 , 5 773 260 und 5 496 698 .
  • Der Begriff ”dsRNA,” wie hierin verwendet, bezieht sich auf RNA-Hybride, die zwei Stränge von RNA umfassen. Die dsRNAs können eine lineare oder zirkulare Struktur aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dsRNA spezifisch für ein Polynukleotid, codierend entweder das Polypeptid gemäß Tabelle II oder ein Polypeptid mit mindestens 70% Sequenzidentität mit einem Polypeptid gemäß Tabelle II. Die hybridisierenden RNAs können im Wesentlichen oder vollständig komplementär sein. Mit ”im Wesentlichen komplementär” ist gemeint, dass wenn die zwei hybridisierenden RNAs mit Hilfe des BLAST-Programms, wie oben stehend beschrieben, optimal aligniert sind, die hybridisierenden Abschnitte zu mindestens 95% komplementär sind. Vorzugsweise ist die dsRNA mindestens 100 Basenpaare lang. In der Regel werden die hybridisierenden RNAs bei identischer Länge ohne überhängende 5'- oder 3'-Enden und ohne Lücken vorliegen. Allerdings können dsRNAs mit 5'- oder 3'-Überhängen von bis zu 100 Nukleotiden in den Verfahren der Erfindung verwendet werden.
  • Die dsRNA kann Ribonukleotide oder Ribonukleotidanaloge, wie 2'-O-Methylribosyl-Reste, oder Kombinationen davon, umfassen. Siehe z. B. U.S.-Patent Nm. 4 130 641 und 4 024 222 . Eine dsRNA-Polyriboinosin-Säure:Polyribocytidyl-Säure ist im U.S.-Patent 4 283 393 beschrieben. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von dsRNA sind im Fachgebiet bekannt. Ein Verfahren umfasst die gleichzeitige Transkription von zwei komplementären DNA-Strängen, entweder in vivo, oder in einer einzelnen In-vitro-Reaktionsmischung. Siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5 795 715 . In einer Ausführungsform kann dsRNA in eine Pflanze oder Pflanzenzelle direkt durch standardmäßige Transformationsprozeduren eingebracht werden. Alternativ kann dsRNA in einer Pflanzenzelle durch Transkribieren von zwei komplementären RNAs exprimiert werden.
  • Andere Verfahren zur Inhibition der endogenen Genexpression, wie etwa Tripelhelix-Bildung (Moser et al., Science 238, 645 (1987), und Cooney et al., Science 241, 456 (1988)) und Cosuppression (Napoli et al., The Plant Cell 2, 279, 1990) sind im Fachgebiet bekannt. Partielle und Volllänge-cDNAs sind für die Cosuppression von endogenen Pflanzengenen verwendet worden. Siehe z. B. U.S.-Patent Nrn. 4 801 340 , 5 034 323 , 5 231 020 und 5 283 184 ; Van der Kroll et al., The Plant Cell 2, 291, (1990); Smith et al., Mol. Gen. Genetics 224, 477 (1990), und Napoli et al., The Plant Cell 2, 279 (1990).
  • Bei der Sense-Suppression nimmt man an, dass die Einbringung eines Sense-Polynukleotids die Transkription des entsprechenden Zielgens blockiert. Das Sense-Polynukleotid besitzt mindestens 65% Sequenzidentität mit dem/der Ziel-Pflanzengen oder -RNA. Vorzugsweise beträgt die prozentuale Identität mindestens 80%, 90%, 95% oder mehr. Das eingeführte Sense-Polynukleotid muss nicht Volllänge relativ zum Zielgen oder -transkript aufweisen. Vorzugsweise weist das Sense-Polynukleotid mindestens 65% Sequenzidentität mit mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von einer der Nukleinsäuren, wie in Tabelle I angeführt, auf. Die Regionen mit Identität können Introns und/oder Exons und untranslatierte Regionen umfassen. Das eingeführte Sense-Polynukleotid kann in der Pflanzenzelle vorübergehend vorhanden sein, oder kann stabil in ein Pflanzenchromosom oder extrachromosomales Replikon integriert sein.
  • Ferner handelt es sich bei einer Ausführungsform der Erfindung um einen Expressionsvektor oder eine Expressionskassette, umfassend ein hierin beschriebenes Nukleinsäuremolekül, z. B. das erfindungsgemäße oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül, z. B. umfassend
    • (a) ein Nukleinsäuremolekül, welches das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigte Polypeptid codiert;
    • (b) ein Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigt ist;
    • (c) ein Nukleinsäuremolekül, das als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes aus einer in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II aufgeführten Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann und einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (d) ein Nukleinsäuremolekül, das mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% Identität zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigte Nukleinsäuremolekül, aufweist und einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (e) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% Identität zu der Aminosäuresequenz des von dem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c) oder (d) codierten Polypeptids codiert und die Aktivität, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt, aufweist und erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (f) Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a), (b), (c), (d) oder (e) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (g) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt wurden, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) codiert wird, und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt;
    • (h) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Consensussequenz oder ein oder mehr Polypeptidmotive, wie in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt;
    • (i) ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt, und erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp-Pflanzenzelle, einer Pflanze oder einem Teil davon vermittelt;
    • (j) Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, welches durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erhalten wird und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt; und
    • (k) ein Nukleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek, speziell einer cDNA-Bibliothek und/oder einer genomischen Bibliothek, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, aufweisend mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 750 nt oder 1000 nt von einem Nukleinsäuremolekül, komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein repräsentiert wird, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt.
  • Die Erfindung stellt ferner eine(n) isolierte(n) rekombinante(n) Expressionsvektor oder Expressionskassette bereit, umfassend das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, wobei die jeweilige Expression des Vektors oder des Nukleinsäuremoleküls in einer Wirtszelle zu einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer(m) erhöhten Nah rstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, im Vergleich zu dem entsprechenden, z. B. nicht-transformierten, Wildtyp der Wirtszelle führt.
  • Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise regulatorische Sequenzen, welche zur Steuerung der Genexpression in Pflanzenzellen in der Lage sind und welche funktionsfähig so verknüpft sind, dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, zum Beispiel die Termination der Transkription durch Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, welche aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen, wie etwa dem als Octopin-Synthase bekannten Gen 3 des Ti-Plasmides pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835 (1984)), oder funktionelle Äquivalente davon, wobei aber alle anderen Terminatoren, welche in Pflanzen funktionsmäßig aktiv sind, geeignet sind. Da die Pflanzen-Genexpression sehr oft nicht auf transkriptionellen Ebenen limitiert wird, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere operativ verknüpfte Sequenzen, wie etwa Translationsenhancer, wie die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz von Tabakmosaikvirus enthält, die das Protein-pro-RNA-Verhältnis steigert (Gallie et al., Nucl. Acids Research 15, 8693 (1987)).
  • Die Pflanzengenexpression muss funktionsmäßig mit einem geeigneten Promotor gekoppelt sein, der eine Genexpression am richtigen Zeitpunkt und in einer zell- oder gewebespezifischen Weise herbeiführt. Es werden Promotoren bevorzugt, welche die konstitutive Expression antreiben (Benfey et al., EMBO J. 8, 2195 (1989)), wie etwa diejenigen, welche aus Pflanzenviren, wie 35S CaMV (Franck et al., Cell 21, 285 (1980)), 19S CaMV (siehe auch U.S.-Patent Nr. 5 352 605 und PCT-Anmeldung Nr. WO 84102913 ), stammen, oder Pflanzen-Promotoren, wie diejenigen von der kleinen Rubisco-Untereinheit, beschrieben in U.S.-Patent Nr. 4 962 028 . Andere Promotoren, z. B. Super-Promotor (Ni et al., Plant Journal 7, 661 (1995)), Ubiquitin-Promotor (Callis et al., J. Biol. Chem., 265, 12486 (1990); US 5 510 474 ; US 6 020 190 ; Kawalleck et al., Plant. Molecular Biology, 21, 673 (1993)) oder 34S-Promotor (GenBank Zugangsnummern M59930 und X16673) wären gleichfalls für die vorliegende Erfindung nützlich und sind einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Gemäß der Entwicklungsstufe bevorzugte Promotoren werden präferenziell bei bestimmten Stadien der Entwicklung exprimiert. Die hinsichtlich eines Gewebes und Organs bevorzugten Promotoren schließen diejenigen ein, welche präferenziell in bestimmten Geweben oder Organen, wie Blättern, Wurzeln, Samen, oder Xylem, exprimiert werden. Beispiele von Gewebe-bevorzugten und Organ-bevorzugten Promotoren schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Frucht-bevorzugte, Samenanlage-bevorzugte, für männliches Gewebe bevorzugte, Samen-bevorzugte, Integument-bevorzugte, Knollen-bevorzugte, Halm-bevorzugte, Pericarp-bevorzugte und Blatt-bevorzugte, Stigma-bevorzugte, Pollen-bevorzugte, Anther-bevorzugte, Petalen-bevorzugte, Sepalen-bevorzugte, Blütenstiel-bevorzugte, Schoten-bevorzugte, Stängel-bevorzugte, Wurzel-bevorzugte Promotoren und dergleichen, ein. Samen-bevorzugte Promotoren werden präferenziell während der Samenentwicklung und/oder Keimung exprimiert. Zum Beispiel können für Samen bevorzugte Promotoren Embryo-bevorzugt, Endosperm-bevorzugt und Samenhüllen-bevorzugt sein; siehe Thompson et al., BioEssays 10, 108 (1989). Beispiele von für Samen bevorzugten Promotoren schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Cellulosesynthase (celA), Cim1, gamma-Zein, Globulin-1, Mais-19 kD-Zein (cZ19B1) und dergleichen ein.
  • Andere in den Expressionskassetten der Erfindung nützliche Promotoren schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den ”Major-Chlorophyll a/b-Eindungs-Protein”-Promotor, Histon-Promotoren, den Ap3-Promotor, den β-Conglycin-Promotor, den Napin-Promotor, den Lectin-Promotor aus Sojabohne, den Mais-15kD-Zein-Promotor, den 22kD-Zein-Promotor, den 27kD-Zein-Promotor, den g-Zein-Promotor, die ”waxy”-, ”shrunken 1”-, ”shrunken 2”- und ”bronze”-Promotoren, den Zm13-Promotor ( U.S.-Patent Nr. 5 086 169 ), die Mais-Polygalacturonase-Promotoren (PG) ( U.S.-Patent Nm. 5 412 085 und 5 545 546) und den SGB6-Promotor ( U.S.-Patent Nr. 5 470 359 ), sowie synthetische oder andere natürliche Promotoren ein.
  • Zusätzliche vorteilhafte regulatorische Sequenzen sind zum Beispiel in den Pflanzenpromotoren, wie CaMV/35S (Franck et al., Cell 21 285 (1980)), PRP1 (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361 (1993)), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos, Ubiquitin-, Napin- oder Phaseolin-Promotor, eingeschlossen. Ebenso vorteilhaft in diesem Zusammenhang sind induzierbare Promotoren, wie die Promotoren, beschrieben in EP 388 186 (Benzylsulfonamid-induzierbar), Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992) (Tetracyclin-induzierbar), EP-A-0 335 528 (Abscisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenolinduzierbar). Weitere nützliche pflanzliche Promotoren sind der cytoplasmatische FBPase-Promotor oder der ST-LSI Promotor von Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 2445 (1989)), der Phosphoribosylpyrophoshat-Amido-Transferase-Promotor von Glycine max (Genbank-Zugangs-Nr. U87999) oder der Nodien-spezifische Promotor, der in EP-A-0 249 676 beschrieben wird. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, welche für Monokotyle oder Dikotyle verwendet werden können und in US 5 608 152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Phaseolin-Promotor aus Arabidopsis), US 5 504 200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica) und Baeumlein et al., Plant J., 2 (2), 233 (1992) (LEB4-Promotor aus Leguminosa) beschrieben sind. Die Promotoren sind in Dikotylen nützlich. Die folgenden Promotoren sind zum Beispiel in Monokotylen nützlich: Ipt-2- oder Ipt-1-Promotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder Hordein-Promotor aus Gerste. Andere nützliche Promotoren sind in WO 99/16890 beschrieben. Im Prinzip ist es möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren regulatorischen Sequenzen, wie jene, die oben stehend erwähnt sind, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist weiterhin ebenfalls möglich und vorteilhaft, synthetische Promotoren zu verwenden.
  • Das Genkonstrukt kann auch weitere Gene umfassen, welche in die Organismen eingebracht werden sollen und welche zum Beispiel an Stresstoleranz und Ertragserhöhung beteiligt sind. Es ist möglich und vorteilhaft, regulatorische Gene, wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre enzymatische Aktivität in die Regulation eingreifen, oder ein oder mehre oder alle Gene eines biosynthetischen Weges, in Wirtsorganismen einzubringen und zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Die inserierten Gene können ihren eigenen Promotor besitzen oder ansonsten unter der Steuerung des gleichen Promotors wie die Sequenzen der Nukleinsäure von Tabelle I oder ihre Homologe stehen.
  • Das Genkonstrukt umfasst vorteilhafterweise, für die Expression der anderen vorhandenen Gene, zusätzlich 3'- und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen, um die Expression zu steigern, welche für eine optimale Expression abhängig von dem gewählten Wirtsorganismus und dem Gen oder den Genen ausgewählt werden.
  • Mit diesen regulatorischen Sequenzen wird beabsichtigt, dass sie eine spezifische Expression der Gene und Proteinexpression möglich machen, wie oben erwähnt. Dies kann, abhängig vom Wirtsorganismus, zum Beispiel bedeuten, dass das Gen nur nach einer Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
  • Die regulatorischen Sequenzen oder Faktoren können außerdem vorzugsweise einen nützlichen Effekt auf die Expression der eingebrachten Gene haben und sie dementsprechend erhöhen. Auf diese Weise ist es für die regulatorischen Elemente möglich, in vorteilhafter Weise auf der Ebene der Transkription durch Verwenden starker Transkriptionssignale, wie Promotoren und/oder Enhancern, verstärkt zu werden. Allerdings ist es zusätzlich ebenfalls möglich, die Translation, zum Beispiel durch Verbessern der Stabilität der mRNA, zu steigern.
  • Andere bevorzugte Sequenzen zur Verwendung in Pflanzen-Genexpressionskassetten sind Targeting-Sequenzen, die für das Lenken des Genprodukts in sein passendes Zellkompartiment (für eine Übersicht, siehe Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15 (4), 285 (1996) und darin zitierte Referenzen), wie die Vakuole, den Zellkern, alle Typen von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen, notwendig sind.
  • Die Expression von Pflanzengenen kann auch mittels eines induzierbaren Promotors erleichtert werden (für eine Übersicht, siehe Gatz, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89 (1997)). Chemisch induzierbare Promotoren sind besonders geeignet, wenn gewünscht wird, dass eine Genexpression in einer zeitlich spezifischen Weise stattfindet.
  • Die Tabelle VI listet einige Beispiele von Promotoren auf, welche verwendet werden können, um die Transkription der codierenden Nukleinsäure-Sequenzen der vorliegenden Erfindung zu regulieren. Tab. VI: Beispiele von gewebespezifischen und induzierbaren Promotoren in Pflanzen
    Expression Referenz
    Cor78-induzierbar durch Kälte, Dürre, Salz, ABA, Verletzung Ishitani, et al., Plant Cell 9, 1935 (1997), Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki, Plant Cell 6, 251 (1994)
    Rci2A-induzierbar durch Kälte, Wasserentzug Capel et al., Plant Physiol 115, 569 (1997)
    Rd22-Dürre, Salz Yamaguchi-Shinozaki und Shinozaki, Mol. Gen. Genet. 238, 17 (1993)
    Cor15A-Kälte, Wasserentzug, ABA Baker et al., Plant Mal. Biol. 24, 701 (1994)
    GH3- Auxin-induzierbar Liu et al., Plant Cell 6, 645 (1994)
    ARSK1-Wurzel, salzinduzierbar Hwang und Goodman, Plant J. 8, 37 (1995)
    PtxA-Wurzel, salzinduzierbar GenBank-Eintrag X67427
    SbHRGP3-Wurzelspezifisch Ahn et al., Plant Cell 8, 1477 (1998).
    KST1-Schließzell-spezifrsch Plesch et al., Plant Journal. 28 (4), 455–(2001)
    KAT1-Schließzell-spezifisch Plesch et al., Gene 249, 83 (2000), Nakamura et al., Plant Physiol. 109, 371 (1995)
    Salicylsäure-induzierbar PCT-Anmeldung Nr. WO 95/19443
    Tetracyclin-induzierbar Gatz et al., Plant J. 2, 397 (1992)
    Ethanol-induzierbar PCT-Anmeldung Nr. WO 93/21334
    Pathogen-induzierbar PRP1 Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22, 361–(1993)
    Hitze-induzierbar hsp80 U.S.-Patent Nr. 5,187,267
    Kälte-induzierbar alpha-Amylase PCT-Anmeldung Nr. WO 96/12814
    Verletzungs-induzierbar pinII Europäisches Patent Nr. 375 091
    RD29A-salzinduzierbar Yamaguchi-Shinozalei et al. Mol. Gen. Genet. 236, 331 (1993)
    Plastiden-spezifische virale RNA-Polymerase PCT-Anmeldung Nr. WO 95/16783 , PCT-Anmeldung WO 97/06250
  • Zusätzliche Flexibilität bei der Steuerung der Expression heterologer Gene in Pflanzen kann man durch Verwenden von DNA-Bindungsdomänen und Antwortelementen aus heterologen Quellen (d. h. DNA-Bindungsdomänen aus nicht-pflanzlichen Quellen) erhalten. Ein Beispiel einer solchen heterologen DNA-Bindungsdomäne ist die LexA-DNA-Bindungsdomäne (Brent und Ptashne, Cell 43, 729 (1985)).
  • In einer Ausführungsform schließt der Ausdruck ”im Wesentlichen frei von zellularem Material” Präparationen eines Proteins ein, die weniger als etwa 30% (bezogen auf das Trockengewicht) an kontaminierendem Material (hierin ebenfalls bezeichnet als ”kontaminierendes Polypeptid”), weiter bevorzugt weniger als etwa 20% kontaminierendes Material, noch weiter bevorzugt weniger als etwa 10% kontaminierendes Material, und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% kontaminierendes Material aufweisen.
  • Die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Polypeptide, Polypeptidhomologe, Fusionspolypeptide, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einem oder mehreren der folgenden Verfahren verwendet werden: Identifizierung von S. cerevisiae, E. coli oder Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa und verwandten Organismen; Kartierung von Genomen von Organismen, die mit S. cerevisiae, E. coli verwandt sind; Identifizierung und Lokalisierung von interessierenden Sequenzen von S. cerevisiae, E. coli oder Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa; evolutionäre Untersuchungen; Bestimmen von für eine Funktion erforderlichen Polypeptid-Regionen; Modulieren einer Polypeptid-Aktivität; Modulieren des Metabolismus von einer oder mehreren Zellfunktionen; Modulieren des Transmembrantransports von einer oder mehreren Verbindungen; Modulieren des Ertrags, z. B. einer ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, z. B. der Niedertemperaturtoleranz, der Dürretoleranz, der Wassernutzungseffizienz, der Nährstoffverwertungseffizienz und/oder des intrinsischen Ertrags; und Modulieren der Expression von Polypeptid-Nukleinsäuren.
  • Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung sind auch nützlich für evolutionäre und strukturelle Untersuchungen an Polypeptiden. Die Stoffwechsel- und Transportprozesse, an denen die Moleküle der Erfindung beteiligt sind, werden von einer großen Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen genutzt; durch Vergleichen der Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung mit jenen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann der evolutionäre Verwandschaftsgrad der Organismen eingeschätzt werden. In ähnlicher Weise erlaubt ein solcher Vergleich eine Einschätzung, welche Regionen der Sequenz konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestimmung derjenigen Regionen des Polypeptids helfen kann, die für das Funktionieren des Enzyms wesentlich sind. Dieser Typ von Bestimmung ist von Nutzen für Polypeptid-Engineering-Untersuchungen und kann einen Hinweis darauf geben, was das Polypeptid in Bezug auf Mutagenese tolerieren kann, ohne an Funktion zu verlieren.
  • Es gibt eine Anzahl von Mechanismen, durch welche die Abänderung des Polypeptids der Erfindung direkt den Ertrag, z. B. eine ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz, und/oder Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder eine andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, beeinflußen kann.
  • Der Effekt der genetischen Modifikation in Pflanzen in Bezug auf den Ertrag, z. B. einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz, und/oder Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder eine andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, kann durch das Kultivieren der modifizierten Pflanze unter schlechteren als den geeigneten Bedingungen und dann das Analysieren der Wachstumscharakteristika und/oder des Metabolisms der Pflanze überprüft werden. Derartige Analysetechniken sind dem Fachmann allgemein bekannt und schließen Trockengewicht, Frischgewicht, Polypeptidsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirations-Raten, allgemeinen Pflanzen- und/oder Nutzpflanzenertrag, Aufblühen, Reproduktion, Samenerzeugung, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten, etc., ein ("Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim; Belter P. A. et al., 1988, Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy J. F., und Cabral, J. M. S., 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A., und Henry, J. D., 1988, Biochemical separations, in: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3, Kapitel 11, Seite 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow F. J., 1989, Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
  • Zum Beispiel können Hefe-Expressionsvektoren, umfassend die hierin offenbarten Nukleinsäuren, oder Fragmente davon, konstruiert und unter Anwendung von Standardprotokollen in S. cerevisiae transformiert werden. Die resultierenden transgenen Zellen können dann hinsichtlich der Erzeugung oder Veränderung ihres Ertrags, z. B. ihrer ertragsbezogenen Eigenschaften, zum Beispiel der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz, und/oder der Nährstoffverwertungseffizienz, des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, getestet werden. In ähnlicher Weise können Pflanzen-Expressionsvektoren, welche die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, konstruiert und in eine geeignete Pflanzenzelle, wie Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Baumwolle, Reis, Weizen, Medicago truncatula, etc., mittels Standardprotokollen transformiert werden. Die resultierenden transgenen Zellen und/oder davon abgeleitete Pflanzen können dann hinsichtlich der Erzeugung oder Veränderung ihres Ertrags, z. B. ihrer ertragsbezogenen Eigenschaften, zum Beispiel Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz, und/oder Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischem Ertrag und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, getestet werden.
  • Das gentechnische Manipulieren von einem oder mehren Genen gemäß Tabelle I, welche für die Polypeptide von Tabelle II der Erfindung codieren, kann auch zu veränderten Aktivitäten führen, die indirekt und/oder direkt die Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress von Algen, Pflanzen, Ciliaten, Pilzen oder anderen Mikroorganismen, wie C. glutamicum, beeinflußen.
  • Insbesondere sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer Nukleinsäure vor, wobei die Expression der Nukleinsäure(n) in der Pflanze zu einer Erhöhung des Ertrags, z. B. der Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, im Vergleich zu einer Wildtyp-Pflanze führt, das folgendes umfasst: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine in Tabelle I dargestellte Nukleinsäure umfasst, und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze, welche eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyp-Pflanze aufweist, aus der Pflanzenzelle.
  • Die vorliegende Erfindung sieht auch Antikörper vor, welche spezifisch an das Polypeptid gemäß der Erfindung oder einen Abschnitt davon, wie von einer hierin beschriebenen Nukleinsäure codiert, binden. Antikörper können durch viele allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden (siehe z. B. Harlow und Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Kurz dargestellt, kann gereinigtes Antigen in ein Tier bei einer Menge und bei Intervallen injiziert werden, die ausreichen, um eine Immunantwort auszulösen. Antikörper können entweder direkt gereinigt werden, oder Milzzellen können aus dem Tier erhalten werden. Die Zellen können dann mit einer immortalen Zelllinie fusioniert und hinsichtlich der Antikörpersekretion gescreent werden. Die Antikörper können zum Screenen von Nukleinsäureklon-Bibliotheken hinsichtlich Zellen, welche das Antigen sezernieren, verwendet werden. Die positiven Klone können dann sequenziert werden. Siehe zum Beispiel Kelly et al., Bio/Technology 10, 163 (1992); Bebbington et al., Bio/Technology 10, 169 (1992).
  • Die Genexpression in Pflanzen wird durch die Wechselwirkung von Protein-transkriptionsfaktoren mit spezifischen Nukleotidsequenzen innerhalb der regulatorischen Region eines Gens reguliert. Ein Beispiel für Transkriptionsfaktoren sind Polypeptide, welche Zinkfinger(ZF)-Motive enthalten. Jedes ZF-Modul ist ungefähr 30 Aminosäuren lang und um ein Zinkion gefaltet. Die DNA-Erkennungsdomäne eines ZF-Proteins ist eine α-helikale Struktur, die in die große Furche der DNA-Doppelhelix eingreift. Das Modul enthält drei Aminosäuren, die an die DNA binden, wobei jede Aminosäure ein einzelnes Basenpaar in der Ziel-DNA-Sequenz kontaktiert. ZF-Motive sind in einer modular wiederkehrenden Weise angeordnet, so dass ein Satz von Fingern gebildet wird, welche eine zusammenhängende DNA-Sequenz erkennen. Zum Beispiel wird ein dreifingriges ZF-Motiv 9 bp DNA erkennen. Es wurde gezeigt, dass Hunderte von Proteinen ZF-Motive mit zwischen 2 und 37 ZF-Modulen in jedem Protein enthalten (Isalan, M., et al., Biochemistry 37 (35), 12026 (1998); Moore, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (4), 1432 (2001) und Moore, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (4), 1437 (2001); US-Patente US 6 007 988 und US 6013453 ).
  • Die regulatorische Region eines Pflanzengens enthält viele kurze DNA-Sequenzen (cis-wirkende Elemente), welche als Erkennungsdomänen für Transkriptionsfaktoren, einschließlich ZF-Proteinen, dienen. Ähnliche Erkennungsdomänen in verschiedenen Genen gestatten die koordinierte Expression von mehreren Genen, die Enzyme in einem Stoffwechselweg codieren, durch gemeinsame Transkriptionsfaktoren. Die Variation in den Erkennungsdomänen unter Mitgliedern einer Genfamilie erleichtert Unterschiede in der Genexpression innerhalb derselben Genfamilie, zum Beispiel, zwischen Geweben und Entwicklungsstufen und als Antwortreaktion auf Umweltbedingungen.
  • Typische ZF-Proteine enthalten nicht nur eine DNA-Erkennungsdomäne sondern auch eine funktionale Domäne, welche dem ZF-Protein gestattet, die Transkription eines spezifischen Gens zu aktivieren oder zu unterdrücken. Experimentell ist eine Aktivierungsdomäne verwendet worden, um die Transkription des Zielgens zu aktivieren ( US-Patent 5 789 538 und Patentanmeldung WO 95119431 ), aber es ist auch möglich, eine Transkriptionsrepressordomäne an den ZF zu verknüpfen und dadurch die Transkription zu inhibieren (Patentanmeldungen WO 00/47754 und WO 01/002019 ). Es ist berichtet worden, dass eine enzymatische Funktion, wie Nukleinsäurespaltung, an den ZF angekoppelt werden kann (Patentanmeldung WO 00/20622 ).
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das dem Fachmann auf dem Gebiet erlaubt, die regulatorische Region von einem oder mehreren, erfindungsgemäße Polypeptide codierenden Genen aus dem Genom einer Pflanzenzelle zu isolieren und Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren zu entwerfen, die mit einer funktionellen Domäne verknüpft sind, welche mit der regulatorischen Region des Gens interagieren wird. Die Wechselwirkung des Zinkfingerproteins mit dem Pflanzengen kann auf solche Weise entworfen sein, dass die Expression des Gens verändert wird und dadurch vorzugsweise die Erhöhung des Ertrags, z. B. die Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel die Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, eine Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, vermittelt wird.
  • Insbesondere sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer codierenden Nukleinsäure vor, wobei die Expression der Nukleinsäure(n) in der Pflanze zu einer Erhöhung des Ertrags, z. B. der Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, im Vergleich zu einer Wildtyp-Pflanze führt, das folgendes umfasst: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine codierende Nukleinsäure umfasst, und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze, welche eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyp-Pflanze aufweist, aus der Pflanzenzelle. Für eine solche Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR, verwendet werden (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66, 221 (1990)). Darüber hinaus sind geeignete binäre Vektoren zum Beispiel pBIN19, pBI101, pGPTV oder pPZP (Hajukiewicz P. et al., Plant Mol. Biol., 25, 989 (1994)).
  • Alternative Verfahren zur Transfektion schließen den direkten Transfer von DNA in sich entwickelnde Blüten durch Elektroporation oder Agrobacterium-vermittelten Gentransfer ein. Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens-Stamms GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell, Mol. Gen. Genet. 204, 383 (1986)) oder LBA4404 (Ooms et al., Plasmid, 7, 15 (1982); Hoekema et al., Nature, 303, 179 (1983)) durchgeführt werden. Eine Transformation kann durch standardmäßige Transformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al., Nuci. Acids. Res. 13, 4777 (1994); Gelvin und Schilperoort, Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl. – Dordrecht:Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick B. R. und Thompson J. E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton:CRC Press, 1993. – 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Zum Beispiel kann Raps mittels Kotyledon- oder Hypokotyl-Transformation transformiert werden (Moloney et al., Plant Cell Reports 8, 238 (1989); De Block et al., Plant Physiol. 91, 694 (1989)). Die Verwendung von Antibiotika für Agrobakterium- und Pflanzenselektion hängt ab von dem binären Vektor und dem für die Transformation verwendeten Agrobacterium-Stamm. Raps-Selektion wird normalerweise unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzen-Marker durchgeführt. Agrobacterium-vermittelter Gentransfer zu Flachs kann, zum Beispiel, mit Hilfe einer bei Mlynarova et al., Plant Cell Report 13, 282 (1994) beschriebenen Technik durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Transformation von Sojabohne zum Beispiel mit Hilfe einer im Europäischen Patent Nr. 424 047 , U.S.-Patent Nr. 5 322 783 , Europäischen Patent Nr. 397 687 , U.S.-Patent Nr. 5 376 543 oder U.S.-Patent Nr. 5 169 770 beschriebenen Technik durchgeführt werden. Die Transformation von Mais kann durch Partikelbeschuss, Polyethylenglycol-vermittelte DNA-Aufnahme oder mittels der Siliziumcarbidfasertechnik erreicht werden (siehe zum Beispiel, Freeling und Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezifisches Beispiel von Maistransformation findet man in U.S.-Patent Nr. 5 990 387 , und ein spezifisches Beispiel von Weizentransformation kann in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256 gefunden werden.
  • Das Wachsenlassen der modifizierten Pflanzen unter definierten N-Bedingungen, in einer besonderen Ausführungsform unter abiotischen Umweltstressbedingungen, und dann das Screening und Analysieren der Wachstumscharakteristika und/oder metabolischen Aktivität dienen zur Prüfung des Effekts der genetischen Modifikation in Pflanzen auf die Erhöhung des Ertrags, z. B. der Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel der Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Sie betreffen beim Screening (Römpp Lexikon Biotechnologie, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1992, "Screening" S. 701) Trockengewicht, Frischgewicht, Proteinsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirations-Raten, allgemeinen Pflanzenund/oder Nutzpflanzenertrag, Aufblühen, Reproduktion, Samenerzeugung, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten, etc. (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laborstory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy J. F. und Cabral J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz J. A. und Henry J. D., 1988 Biochemical separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3, Kapitel 11, Seite 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
  • In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Genprodukts, das eine Erhöhung des Ertrags, z. B. die Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel die Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel die Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder die Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, die Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, im Vergleich zu einer entsprechenden, z. B. nicht-transformierten Wildtypzelle herbeiführt, in einer Zelle eines Organismus, zum Beispiel einer Pflanze, welches die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Inkontaktbringen, z. B. Hybridisieren, einiger oder aller Nukleinsäuremoleküle einer Probe, z. B. Zellen, Gewebe, Pflanzen oder Mikroorganismen, oder einer Nukleinsäurebibliothek, welche ein Kandidatengen enthalten kann, codierend ein Genprodukt, das eine Erhöhung des Ertrags, z. B. die Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel die Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel die Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder die Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, die Erhöhung des i herbeiführt, mit einem Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B gezeigt, oder einem funktionellen Homolog davon;
    • (b) Identifizieren der Nukleinsäuremoleküle, welche unter gelockert-stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül, insbesondere an die Nukleinsäuremolekülsequenz, die in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigt ist, hybridisieren, und gegebenenfalls Isolieren des Volllängen-cDNA-Klons oder vollständigen genomischen Klons;
    • (c) Identifizieren der Kandidaten-Nukleinsäuremoleküle oder eines Fragmentes davon in Wirtszellen, vorzugsweise in einer Pflanzenzelle;
    • (d) Erhöhen des Exprimierens der identifizierten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen, für welche eine gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder ein erhöhter Ertrag gewünscht sind;
    • (e) Assay der Höhe der gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder des erhöhten Ertrags der Wirtszellen; und
    • (f) Identifizieren des Nukleinsäuremoleküls und seines Genprodukts, das eine Erhöhung des Ertrags, z. B. die Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel die Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel die Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder die Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, die Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, in der Wirtszelle im Vergleich zum Wildtyp herbeiführt.
  • Gelockerte Hybridisierungsbedingungen sind: Nach standardmäßigen Hybridisierungs-Prozeduren können Waschschritte bei niedrigen bis mittleren Stringenzbedingungen üblicherweise mit Waschbedingungen von 40°–55°C und Salzbedingungen zwischen 2 × SSC und 0,2 × SSC mit 0,1% SDS, im Vergleich zu stringenten Waschbedingungen wie z. B. 60° bis 68°C mit 0,1% SDS durchgeführt werden. Weitere Beispiele können in den oben aufgeführten Bezugsstellen für die stringenten Hybridisierungsbedingungen gefunden werden. Üblicherweise werden Waschschritte mit steigender Stringenz und Länge wiederholt, bis ein brauchbares Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis nachgewiesen wird, und hängen von vielen Faktoren, wie dem Ziel, z. B. dessen Reinheit, GC-Gehalt, Größe, etc., der Sonde, z. B. deren Länge, ob es sich um eine RNA- oder eine DNA-Sonde handelt, den Salzbedingungen, der Wasch- oder Hybridisierungstemperatur, der Wasch- oder Hybridisierungszeit, etc., ab.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Genprodukts, dessen Expression erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder eine(n) erhöhte(n) Nährstoffverwertungseffizienz, intrinsischen Ertrag und/oder andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft herbeiführt, in einer Zelle, das die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Identifizieren eines Nukleinsäuremoleküls in einem Organismus, welches mindestens 20%, vorzugsweise 25%, weiter bevorzugt 30%, noch weiter bevorzugt sind 35%, 40% oder 50%, noch weiter bevorzugt sind 60%, 70% oder 80%, am meisten bevorzugt sind 90% oder 95% oder mehr, homolog zu dem Nukleinsäuremolekül ist, codierend ein Protein, umfassend das Polypeptidmolekül, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigt, oder umfassend eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt, oder codiert von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigt, oder eines Homologs davon, wie hierin beschrieben, beispielsweise durch Homologiesuche in einer Datenbank;
    • (b) Steigern der Expression der identifizierten Nukleinsäuremoleküle in den Wirtszellen;
    • (c) Assay des Ausmaßes der Steigerung der Erhöhung des Ertrags, z. B. der Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel der Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel der Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder der Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, der Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, in den Wirtszellen; und
    • (d) Identifizieren der Wirtszelle, in der die gesteigerte Expression die Erhöhung des Ertrags, z. B. die Erhöhung einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel die Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel die Erhöhung der Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder die Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, die Erhöhung des intrinsischen Ertrag und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, in der Wirtszelle im Vergleich zu einem Wildtyp herbeiführt.
  • Ferner kann das hierin offenbarte Nukleinsäuremolekül, insbesondere das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B gezeigte Nukleinsäuremolekül, ausreichend homolog zu den Sequenzen aus verwandten Spezies sein, so dass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in dem verwandten Organismus oder zur Assoziationskartierung dienen können. Ferner kann die natürliche Variation in den genomischen Regionen, die den hierin offenbarten Nukleinsäuren, insbesondere dem in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B gezeigten Nukleinsäuremolekül, oder einem Homolog davon, entsprechen, zu einer Variation in der Aktivität der hierin offenbarten Proteine, insbesondere der Proteine, umfassend Polypeptide, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B gezeigt, oder umfassend die Consensussequenz oder das Polypeptidmotiv, wie in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt, und deren Homolog, und in der Konsequenz zu einer natürlichen Variation eines erhöhten Ertrags, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, führen.
  • Folglich existiert natürliche Variation schließlich auch in Form von aktiveren allelischen Varianten, die bereits zu einer relativen Erhöhung beim Ertrag, z. B. einer Erhöhung bei einer ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Nährstoffverwertungseffizienz und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, führen. Unterschiedliche Varianten des hierin offenbarten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere der Nukleinsäure, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B gezeigt, welche unterschiedlichen Spiegeln des erhöhten Ertrags, z. B. unterschiedlichen Spiegeln der erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer unterschiedlichen Steigerung der Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel erhöhter Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder Erhöhung der Nährstoffverwertungseffizienz, Erhöhung des intrinsischen Ertrags und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, entsprechen, können identifiziert und für eine markerunterstützte Züchtung hinsichtlich eines erhöhten Ertrags, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, verwendet werden.
  • Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Züchten von Pflanzen mit einem einen erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz und/oder einer anderen, umfassend
    • (a) Auswählen einer ersten Pflanzenvarietät mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz und/oder einer anderen, basierend auf einer erhöhten Expression einer Nukleinsäure der Erfindung, wie hierin offenbart, insbesondere eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA oder B gezeigt, oder eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA oder B gezeigt, oder umfassend eine Consensussequenz oder ein Polypeptidmotiv, wie in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt, oder ein Homolog davon, wie hierin beschrieben;
    • (b) Assoziieren des Spiegels an erhöhtem Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, mit dem Expressionsspiegel oder der Genomstruktur eines Gens, welches das Polypeptid oder das Nukleinsäuremolekül codiert;
    • (c) Kreuzen der ersten Pflanzenvarietät mit einer zweiten Pflanzenvarietät, welche sich hinsichtlich ihres Spiegels an erhöhtem Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, signifikant unterscheidet; und
    • (d) Feststellen, welche der Nachkommenvarietäten erhöhte Spiegel an einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer gesteigerten Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, erhalten hat.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, welches das Nukleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle, das Polypeptid, oder den Antisense, die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressionsmolekül oder Ribozymmolekül oder das virale Nukleinsäuremolekül, den Antikörper, die Pflanzenzelle, die Pflanze oder das Pflanzengewebe, den erntefähigen Teil, das Fortpflanzungsmaterial und/oder die Verbindung und/oder den gemäß des Verfahrens der Erfindung identifizierten Agonisten umfasst.
  • Die Verbindungen des Kits der vorliegenden Erfindung können in Behältern, wie Gefäßen, gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein. Geeignetenfalls könnten eine oder mehrere der Komponenten in ein und demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten an einem festen Träger, wie z. B. einem Nitrozellulosefilter, einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotitterplatte, adsorbiert sein. Das Kit kann für ein Beliebiges aus den hierin beschriebenen Verfahren und Ausführungsformen, z. B. für die Herstellung der Wirtszellen, transgenen Pflanzen, pharmazeutischen Zusammensetzungen, den Nachweis von homologen Sequenzen, die Identifizierung von Antagonisten oder Agonisten, als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Ergänzung davon, oder als Zusatz zum Behandeln von Pflanzen, etc., zur Anwendung kommen. Ferner kann das Kit Anweisungen für den Gebrauch des Kits für eine Beliebige der Ausführungsformen enthalten. In einer Ausführungsform umfasst das Kit ferner ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein oder mehrere von dem zuvor erwähnten Protein, und/oder einen Antikörper, einen Vektor, eine Wirtszelle, eine Antisense-Nukleinsäure, eine Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe oder eine Pflanze. in einer anderen Ausführungsform umfasst des Kit PCR-Primer zum Nachweisen und Unterscheiden des Nukleinsäuremoleküls, das im Verfahren der Erfindung reduziert werden soll, z. B. des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, bereitstellend des Nukleinsäuremolekül zur Verwendung gemäß des Verfahrens der Erfindung, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, den Vektor der Erfindung, den Antisense, die RNAi, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, das Cosuppressionsmolekül, Ribozym oder den Antikörper der Erfindung, das virale Nukleinsäuremolekül der Erfindung oder das Polypeptid der Erfindung, oder umfassend die Schritte des Verfahrens gemäß der Erfindung zum identifizieren der Verbindung oder des Agonisten; und zum Formulieren des Nukleinsäuremoleküls, des Vektors oder des Polypeptids der Erfindung oder des Agonisten, oder der Verbindung, identifiziert gemäß den Methoden oder Verfahren der vorliegenden Erfindung oder mit Hilfe der Gegenstandssubjekte der vorliegenden Erfindung, in einer Form, welche als Zusammensetzung für die Pflanzenlandwirtschaft anwendbar ist.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen der Pflanzenkulturzusammensetzung, welches die Schritte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst; sowie zum Formulieren der identifizierten Verbindung in einer als landwirtschaftliche Zusammensetzung annehmbaren Form.
  • Unter ”annehmbar als landwirtschaftliche Zusammensetzung” versteht es sich, dass eine derartige Zusammensetzung in Übereinstimmung mit den Gesetzen steht, welche den Gehalt an Fungiziden, Pflanzennährstoffen, Herbiziden, etc., regeln. Vorzugsweise ist eine derartige Zusammensetzung ohne jede Gefahr für geschützte Pflanzen sowie Tiere (einschließlich Menschen), welche diese aufnehmen. Das Polypeptid oder Nukleinsäuremolekül oder die genomische Struktur der Gene, codierend das Polypeptid oder Nukleinsäuremolekül der Erfindung.
  • Überall in dieser Patentanmeldung werden verschiedene Publikationen als Bezugsstellen angeführt. Die Offenbarungen von allen diesen Veröffentlichungen, und diejenigen Bezugsstellen, die innerhalb dieser Veröffentlichungen zitiert werden, sind in ihrer jeweiligen Gesamtheit hiermit durch den Bezug darauf in diese Patentanmeldung einbezogen, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, der von dieser Erfindung betroffen wird.
  • Es sollte sich ebenfalls verstehen, dass das oben Genannte auf bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zutrifft, und dass zahlreiche Änderungen und Variationen daran vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche in keiner Weise als einschränkend auszulegen sind. Andererseits ist es klar zu verstehen, dass verschiedene andere Ausführungsformen, Modifikationen und Äquivalente davon, sich dem Fachmann auf dem Gebiet, nach Lesen der hierin geschilderten Beschreibung, von selbst aus nahelegen, ohne vom Sinngehalt der vorliegenden Erfindung und/oder dem Umfang der Ansprüche abzuweichen.
  • In einer Ausführungsform führt der erhöhte Ertrag zu einer Erhöhung der Produktion eines spezifischen Bestandteils, einschließlich, ohne Einschränkung, einem/einer gesteigerten und/oder verbesserten Zuckergehalt oder Zuckerzusammensetzung, einem/einer gesteigerten und/oder verbesserten Stärkegehalt und/oder Stärkezusammensetzung, einem/einer gesteigerten und/oder verbesserten Ölgehalt und/oder Ölzusammensetzung (wie gesteigertem Samen-Ölgehalt), einem/einer gesteigerten und/oder verbesserten Proteingehalt und/oder Proteinzusammensetzung (wie gesteigertem Samen-Proteingehalt), einem/einer gesteigerten und/oder verbesserten Vitamingehalt und/oder Vitaminzusammensetzung, oder dergleichen.
  • Ferner umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung, in einer Ausführungsform, das Ernten der Pflanze oder eines Teils der Pflanze, welche(r) hergestellt oder angebaut wurde, und die Herstellung von Treibstoff mit oder aus der geernteten Pflanze oder dem geernteten Teil davon. Außerdem umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung, in einer Ausführungsform, das Ernten eines Pflanzenteils, der nützlich zur Stärkeisolierung ist, und das isolieren bzw. Gewinnen von Stärke aus diesem Pflanzenteil, wobei die Pflanze eine Pflanze ist, die zur Stärkeproduktion brauchbar ist, z. B. Kartoffel. Ferner umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung, in einer Ausführungsform, das Ernten eines Pflanzenteils, der nützlich zur Ölisolierung ist, und das Isolieren von Öl aus diesem Pflanzenteil, wobei die Pflanze eine Pflanze ist, die zur Ölproduktion brauchbar ist, z. B. Ölsamenraps oder Canola, Baumwolle, Soja oder Sonnenblume.
  • Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform der Ölgehalt im Maissamen erhöht. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ölgehalt pro ′Acre′ (erntefähiges Öl).
  • Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform der Ölgehalt im Sojasamen erhöht. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von Sojapflanzen mit erhöhtem Ölgehalt pro ′Acre′ (erntefähiges Öl).
  • Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform der Ölgehalt im OSR-Samen erhöht.
  • Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von OSR-Pflanzen mit erhöhtem Ölgehalt pro ′Acre′ (erntefähiges Öl).
  • Zum Beispiel betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von Baumwollpflanzen mit erhöhtem Ölgehalt pro ′′Acre′ (erntefähiges Öl).
  • Ferner sind zur Bezugnahme die folgenden Anmeldungen, von welchen die vorliegende Anmeldung die Priorität beansprucht, einbezogen: US-Patentanmeldungen US61/227839 und US61/261775 sowie EP-Patentanmeldungen EP09166280.9 und EP09176194.0 . Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche nicht als einschränkend beabsichtigt sind.
  • Beispiel 1a:
  • Gentechnische Herstellung von Arabidopsis-Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft durch Überexprimieren der Gene von Tabelle I, z. B. Exprimieren von Genen der vorliegenden Erfindung.
  • Klonierung der Sequenzen der vorliegenden Erfindung, wie in Tabelle I, Spalte 5 und 7, gezeigt, für die Expression in Pflanzen.
  • Außer es ist anderslautend angegeben, werden Standardverfahren, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laborstory Press, beschrieben, angewandt.
  • Die erfindungsgemäßen Sequenzen, wie in Tabelle I, Spalte 5, gezeigt, wurden durch PCR amplifiziert, wie es im Protokoll der Pfu Ultra-, Pfu Turbo- oder Herculase-DNA-Polymerase (Stratagene) beschrieben ist. Die Zusammensetzung für das Protokoll der Pfu Ultra-, Pfu Turbo- oder Herculase-DNA-Polymerase war wie folgt: 1 × PCR-Puffer (Stratagene), 0,2 mM von jedem dNTP, 100 ng genomische DNA von Saccharomyces cerevisiae (Stamm S288C; Research Genetics, Inc., heute: Invitrogen), Escherichia coli (Stamm MG1655; E. coli Genetic Stock Center), Synechocystis sp. (Stamm PCC6803), Azotobacter vinelandii (Stamm N. R. Smith, 16), Thermus thermophilus (HB8) oder 50 ng cDNA aus verschiedenen Geweben und Entwicklungsstadien von Arabidopsis thaliana (Ecotype Columbia), Physcomitrella patens, Glycine max (Varietät Resnick) oder Zea mays (Varietät B73, Mo17, A188), 50 pmol Vorwärtsprimer, 50 pmol Rückwärtsprimer, mit oder ohne 1 M Betain, 2,5 u Pfu Ultra-, Pfu Turbo- oder Herculase-DNA-Polymerase.
  • Die Amplifizierungszyklen waren wie folgt:
    1 Zyklus von 2–3 Minuten bei 94–95°C, dann 25–36 Zyklen mit 30–60 Sekunden bei 94–95°C, 30–45 Sekunden bei 50–60°C und 210–480 Sekunden bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 5–10 Minuten bei 72°C, dann 4–16°C – vorzugsweise für Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus.
  • Im Fall von Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens, Zea mays waren die Amplifizierungszyklen wie folgt:
    1 Zyklus mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 61°C, 15 Minuten bei 72°C,
    dann 2 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C, 15 Minuten bei 72°C,
    dann 3 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 59°C, 15 Minuten bei 72°C,
    dann 4 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 58°C, 15 Minuten bei 72°C,
    dann 25 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 57°C, 15 Minuten bei 72°C,
    dann 1 Zyklus mit 10 Minuten bei 72°C,
    dann zuletzt 4–16°C.
  • RNA wurde mit dem RNeasy Plant Kit gemäß des Standardprotokolls (Qiagen) erzeugt, und Superscript II-Reverse-Transkriptase wurde verwendet, um doppelsträngige cDNA gemäß des Standardprotokolls (Invitrogen) herzustellen.
  • ORF-spezifische Primerpaare für die zu exprimierenden Gene sind in der Tabelle III, Spalte 7, gezeigt. Die folgenden Adaptorsequenzen wurden an Saccharomyces cerevisiae-ORF-spezifische Primer (siehe Tabelle III) für Klonierungszwecke angefügt:
    Figure 01330001
  • Diese Adaptorsequenzen erlauben die Klonierung des ORF in die verschiedenen Vektoren, welche die Resgen-Adaptoren enthalten, siehe Tabelle Spalte E von Tabelle VII.
  • Die folgenden Adaptorsequenzen wurden für Klonierungszwecke an Saccharomyces cerevisiae-, Escherichia coli-, Synechocystis sp.-, Azotobacter vinelandii-, Thermus thermophilus-, Arabidopsis thaliana-, Brassica napus-, Glycine max-, Oryza sativa-, Physcomitrella patens- oder Zea mays-ORF-spezifische Primer angefügt:
    Figure 01330002
  • Die Adaptorsequenzen erlauben die Klonierung des ORF in die verschiedenen Vektoren, welche die Colic-Adaptoren enthalten, siehe Tabelle Spalte E von Tabelle VII.
  • Deshalb verwendete man für die Amplifizierung und Klonierung von Saccharomyces cerevisiae SEQ ID NR: 3153 einen Primer, der aus der Adaptorsequenz i) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 3155 bestand, sowie einen zweiten Primer, der aus der Adaptorsequenz ii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 3156 bestand.
  • Für die Amplifizierung und Klonierung von Escherichia coli SEQ ID NR: 1783 verwendete man einen Primer, der aus der Adaptorsequenz iii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1951 bestand, und einen zweiten Primer, der aus der Adaptorsequenz iiii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1952 bestand.
  • Für die Amplifizierung und Klonierung von Azotobacter vinelandii SEQ ID NR: 1030 verwendete man einen Primer, der aus der Adaptorsequenz iii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1778 bestand, und einen zweiten Primer, der aus der Adaptorsequenz iiii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1779 bestand.
  • Für die Amplifizierung und Klonierung von Arabidopsis thaliana SEQ ID NR: 22 verwendete man einen Primer, der aus der Adaptorsequenz iii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1022 bestand, und einen zweiten Primer, der aus der Adaptorsequenz iiii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 1023 bestand.
  • Für die Amplifizierung und Klonierung von Glycine max SEQ ID NR: 5241 verwendete man einen Primer, der aus der Adaptorsequenz iii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 5269 bestand, und einen zweiten Primer, der aus der Adaptorsequenz iiii) und der ORF-spezifischen Sequenz SEQ ID NR: 5270 bestand.
  • Unter Befolgung dieser Beispiele kann jede in Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, offenbarte Sequenz kloniert werden, indem man die Adaptorsequenzen an die jeweiligen spezifischen Primersequenzen fusioniert, wie sie in Tabelle III, Spalte 7 offenbart sind, wobei die in Tabelle VII gezeigten jeweiligen Vektoren verwendet werden.
  • Tabelle VII. Übersicht der verschiedenen Vektoren, die zur Klonierung der ORFs verwendet werden, wobei deren SEQ-IDs (Spalte A), deren Vektornamen (Spalte B), die Promotoren, die sie für die Expression der ORFs enthalten (Spalte C), die zusätzliche künstliche Targetingsequenz (Spalte D), die Adaptorsequenz (Spalte E), der vom in Spalte B erwähnten Promotor herbeigeführte Expressionstyp (Spalte F) und die Figurennummer (Spalte G) gezeigt sind.
    A B C D E F G
    SeqID Vektorname Promotorname Targetsequenz Adaptorsequenz Expressionstyp Figur
    9 pMTXO270 p Super Colic nicht-zielgelenkte konstitutive Expression präferenziell in grünen Geweben 6
    12 pMTX155 Big35S Resgen nicht-zielgelenkte konstitutive Expression präferenziell in grünen Geweben 7
    13 VC-MME354-1QCZ Super FNR Resgen plastidisch-zielgelenkte konstitutive Expression präferenziell in grünen Geweben 3
    15 VC-MME220-1qcz Super Colic nicht-zielgelenkte konstitutive Expression präferenziell in grünen Geweben 1
    16 VC-MME432-1qcz Super FNR Colic plastidisch-zielgelenkte konstitutive Expression präferenziell in grünen Geweben 4
    18 VC-MME221-1qcz PcUbi Colic nicht-zielgelenkte konstitutive Expression präferenziell in grünen Geweben 2
    19 pMTX447k orr PcUbi FNR Colic plastidisch-zielgelenkte konstitutive Expression präferenziell in grünen Geweben 8
    21 VC-MME489-1QCZ Super Resgen nicht-zielgelenkte konstitutive Expression präferenziell in grünen Geweben 5
    6207 VC-MME301-1QCZ USP Resgen nicht-zielgelenkte Expression präferenziell in Samen 9
    6208 VC-MME289-1qcz USP Colic nicht-zielgelenkte Expression präferenziell in Samen 10
  • Beispiel 1b)
  • Konstruktion von binären Vektoren für die nicht-zielgelenkte Expression von Proteinen.
  • ”Nicht-zielgelenkte” Expression bedeutet in diesem Zusammenhang, dass keine zusätzliche Targetingsequenz(en) an den zu exprimierenden ORF angefügt waren.
  • Für die nicht-zielgelenkte Expression waren die binären Vektoren, die zur Klonierung verwendet wurden, VC-MME220-1qcz SEQ ID NR: 15 (1), VC-MME221-1qcz SEQ ID NR: 18 (2), VC-MME489-1QCZ SEQ ID NR: 21 (5), VC-MME301-1QCZ SEQ ID NR: 6207 (9) bzw. VC-MME289-1qcz SEQ ID NR: 6208 (10). Die binären Vektoren, die zur Klonierung der Targetingsequenz verwendet wurden, waren VC-MME489-1QCZ SEQ ID NR: 21 (5) bzw. pMTX0270p SEQ ID NR: 9 (6). Andere nützliche binäre Vektoren sind dem Fachmann bekannt; ein Überblick über binäre Vektoren und ihre Anwendung kann in Hellens, R., Mullineaux, P., und Klee, H., (Trends in Plant Science, 5 (10), 446 (2000)) gefunden werden. Solche Vektoren müssen gleichermaßen mit passenden Promotoren und Targeting-Sequenzen ausgestattet sein.
  • Beispiel 1c):
  • Amplifikation der Plastiden-Targetingsequenz des Gens FNR aus Spinacia oleracea und Vektor-Konstruktion für Plastiden-zielgelenkte Expression präferenziell in grünen Geweben oder präferenziell in Samen.
  • Um die Targeting-Sequenz des FNR-Gens aus S. oleracea zu amplifizieren, wurde genomische DNA aus Blättern von 4 Wochen alten S. oleracea Pflanzen extrahiert (DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, Hilden). Die gDNA wurde als die Matrize für eine PCR verwendet.
  • Um die Klonierung der Transit-Sequenz in den Vektor VC-MME489-1QCZ zu ermöglichen, wurde eine EcoRI-Restriktionsenzym-Erkennungssequenz an sowohl die Vorwärts- als auch Rückwärtsprimer angefügt, wohingegen für die Klonierung in den Vektoren pMTX0270p, VC-MME220-1qcz und VC-MME221-1qcz eine PmeI-Restriktionsenzym-Erkennungssequenz an den Vorwärtsprimer und eine NcoI-Stelle an den Rückwärtsprimer angefügt wurde.
  • Figure 01360001
  • Die resultierende Sequenz SEQ ID NR: 10, die aus genomischer Spinat-DNA amplifiziert wurde, umfasste eine 5'UTR (bp 1–165) und die codierende Region (bp 166–273 und 351–419). Die codierende Sequenz ist durch eine intronische Sequenz von bp 274 bis bp 350 unterbrochen:
    Figure 01360002
  • Das mit den Primern FNR5EcoResgen und FNR3EcoResgen hergeleitete PCR-Fragment wurde mit EcoRI verdaut und in den Vektor VC-MME489-1QCZ ligiert, welcher ebenfalls mit EcoRI verdaut worden war. Die korrekte Orientierung der FNR-Targeting-Sequenz wurde durch Sequenzieren geprüft. Bei dem in diesem Ligationsschritt erzeugten Vektor handelte es sich um VC-MME354-1QCZ.
  • Das mit den Primern FNR5PmeColic und FNR3NcoColic hergeleitete PCR-Fragment wurde mit PmeI und NcoI verdaut und in die Vektoren VC-MME220-1qcz und VC-MME221-1qcz ligiert, welche mit SmaI und NcoI verdaut worden waren. Bei den in diesem Ligationsschritt erzeugten Vektoren handelte es sich um VC-MME432-1qcz bzw. pMTX447korr.
  • Für plastidisch-zielgelenkte konstitutive Expression präferenziell in grünen Geweben wurde ein künstlicher Promotor A(ocs)3AmasPmas-Promotor (Super-Promotor) (Ni et al., Plant Journal 7, 661 (1995), WO 95/14098 ) im Kontext des Vektors VC-MME354-1QCZ für ORFs aus Saccharomyces cerevisiae und im Kontext des Vektors VC-MME432-1qcz für ORFs aus Escherichia coli verwendet, was in jedem Fall zu einer ”im-Leseraster”-Fusion der FNR-Targeting-Sequenz mit den ORFs führte.
  • Für eine plastidisch-zielgelenkte konstitutive Expression in präferenziell grünen Geweben und in Samen wurde der PcUbi-Promotor im Kontext des Vektors pMTX447korr für ORFs aus Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens oder Zea mays verwendet, was in jedem Fall zu einer im-Leseraster”-Fusion der FNR-Targeting-Sequenz mit den ORFs führte.
  • Beispiel 1d)
  • Klonierung von Sequenzen der Erfindung, wie in Tabelle I, Spalte 5 gezeigt, in den verschiedenen Expressionsvektoren.
  • Für die Klonierung der ORFs von SEQ ID NR: 3153, aus S. cerevisiae, in Vektoren, welche die Resgen-Adaptorsequenz enthielten, wurde die jeweilige Vektor-DNA mit dem Restriktionsenzym NcoI behandelt. Für die Klonierung von ORFs aus Saccharomyces cerevisiae in Vektoren, welche die Colic-Adaptorsequenz enthielten, wurde die jeweilige Vektor-DNA mit den Restriktionsenzymen PacI und NcoI unter Befolgung des Standardprotokolls (MBI Fermentas) behandelt. Für die Klonierung von ORFs aus Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens oder Zea mays wurde die Vektor-DNA mit den Restriktionsenzymen PacI und NcoI unter Befolgung des Standardprotokolls (MBI Fermentas) behandelt. In allen Fällen wurde die Reaktion durch Inaktivierung bei 70°C während 20 Minuten gestoppt und über QIAquick- oder NucleoSpin Extract II-Säulen unter Befolgung des Standardprotokolls gereinigt (Qiagen oder Macherey-Nagel).
  • Dann wurden das PCR-Produkt, welches den amplifizierten ORF mit den jeweiligen Adaptorsequenzen repräsentierte, und die Vektor-DNA mit T4-DNA-Polymerase gemäß des Standardprotokolls (MBI Fermentas) behandelt, um einzelsträngige Überhänge zu erzeugen, und zwar bei den Parametern 1 Unit T4-DNA-Polymerase bei 37°C während 2–10 Minuten für den Vektor, und 1–2 u T4-DNA-Polymerase bei 15–17°C während 10–60 Minuten für das PCR-Produkt, das SEQ ID NR: 3153 repräsentiert.
  • Die Reaktion wurde durch Zusetzen von Hochsalzpuffer gestoppt und über QIAquick- oder NucleoSpin Extract II-Säulen unter Befolgung des Standardprotokolls (Qiagen oder Macherey-Nagel) gereinigt.
  • In Übereinstimmung mit diesem Beispiel ist der Fachmann in der Lage, alle Sequenzen, die in Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, offenbart sind, zu klonieren.
  • Ungefähr 30–60 ng vorbereiteter Vektor und eine definierte Menge an hergestelltem Amplifikat wurden gemischt und bei 65°C für 15 Minuten hybridisiert, gefolgt von 37°C bei 0,1°C/1 Sekunde, gefolgt von 37°C während 10 Minuten, gefolgt von 0,1°C/1 Sekunde, danach 4–10°C.
  • Die ligierten Konstrukte wurden im selben Reaktionsgefäß durch Zusetzen von kompetenten E. coli-Zellen (Stamm DH5alpha) und Inkubation während 20 Minuten bei 1°C, gefolgt von einem Hitzeschock während 90 Sekunden bei 42°C und Abkühlen auf 1–4°C, transformiert. Dann wurde Vollmedium (SOC) zugegeben, und die Mischung wurde während 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Die gesamte Mischung wurde anschließend auf einer Agarplatte mit 0,05 mg/ml Kanamycin ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • Das Ergebnis des Klonierungsschritts wurde durch Amplifikation mit Hilfe von Primern bestätigt, welche stromaufwärts und stromabwärts der Integrationsstelle binden, wodurch die Amplifikation der Insertion gestattet wird. Die Amplifikationen wurden wie im Protokoll von Taq-DNA-Polymerase (Gibco-BRL) beschrieben, durchgeführt. Die Amplifikationszyklen waren wie folgend:
    1 Zyklus von 1–5 Minuten bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen von in jedem Fall 15–60 Sekunden bei 94°C, 15–60 Sekunden bei 50–66°C und 5–15 Minuten bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 10 Minuten bei 72°C, dann 4–16°C.
  • Es wurden mehrere Kolonien überprüft, aber man verwendete nur eine Kolonie, für welche ein PCR-Produkt der erwarteten Größe nachgewiesen wurde, in den folgenden Schritten.
  • Eine Portion dieser positiven Kolonie wurde in ein Reaktionsgefäß, das mit einem, mit Kanamycin ergänzten Vollmedium (LB) gefüllt war, überführt und über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • Die Plasmidpräparation wurde durchgeführt, wie im Qiaprep- oder NucleoSpin Multi-96 Plus-Standardprotokoll angegeben (Qiagen oder Macherey-Nagel).
  • Erzeugung von transgenen Pflanzen, welche SEQ ID NR: 3153 oder eine andere beliebige in Tabelle I, vorzugsweise Spalte 5, offenbarte Sequenz exprimieren
  • 1–5 ng der isolierten Plasmid-DNA wurde durch Elektroporation oder Transformation in kompetente Zellen von Agrobacterium tumefaciens des Stamms GV 3101 pMP90 (Koncz und Schell, Mol. Gen. Gent. 204, 383 (1986)) transformiert. Danach wurde Vollmedium (YEP) zugegeben, und die Mischung wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt, und zwar für 3 Stunden bei 28°C. Danach wurde die gesamte Reaktionsmischung auf YEP-Agarplatten ausplattiert, die mit den jeweiligen Antibiotika, z. B. Rifampicin (0,1 mg/ml), Gentamycin (0,025 mg/ml) und Kanamycin (0,05 mg/ml) ergänzt waren, und 48 Stunden lang bei 28°C inkubiert.
  • Die Agrobakterien, welche das Plasmidkonstrukt enthalten, wurden dann für die Transformation von Pflanzen verwendet.
  • Eine Kolonie wurde von der Agarplatte mit Hilfe einer Pipettenspitze aufgepickt und in 3 ml flüssigem TB-Medium aufgenommen, welches auch geeignete Antibiotika, wie oben beschrieben, enthielt. Die Vorkultur wurde 48 Stunden lang bei 28°C und 120 U/min wachsen gelassen.
  • 400 ml LB-Medium, enthaltend dieselben Antibiotika, wie oben, wurden für die Hauptkultur verwendet. Die Vorkultur wurde in die Hauptkultur übertragen. Sie wurde 18 Stunden lang bei 28°C und 120 U/min wachsen gelassen. Nach Zentrifugation bei 4000 U/min wurde das Pellet in Infiltrationsmedium (MS-Medium, 10% Saccharose) resuspendiert.
  • Um die Pflanzen für die Transformation zu kultivieren, wurden Schalen (Piki Saat 80, grün, ausgestattet mit einem Maschenboden, 30 × 20 × 4,5 cm, von Wiesauplast, Kunststofftechnik, Deutschland) zur Hälfte mit einem GS 90-Substrat (Standard-Erdboden, Werkverband E. V., Deutschland) gefüllt. Die Schalen wurden über Nacht mit 0,05% Proplant-Lösung (Chimac-Apriphar, Belgien) bewässert. A. thaliana C24-Samen (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, Großbritannien; NASC Stock N906) wurden über der Schale ausgestreut, und zwar ungefähr 1000 Samen pro Schale. Die Schalen wurden mit einer Haube abgedeckt und in die Stratifikations-Anlage gebracht (8 h, 110 μmol/m2s1, 22°C; 16 h, Dunkelheit, 6°C). Nach 5 Tagen wurden die Schalen in die mit kontrollierter Umgebung betriebene Kurztag-Kammer (8 h, 130 μmol/m2s1, 22°C; 16 h, Dunkelheit, 20°C) eingebracht, wo sie ungefähr 10 Tage lang blieben, bis sich die ersten echten Blätter gebildet hatten.
  • Die Sämlinge wurden in Blumentöpfe überführt, welche das gleiche Substrat enthielten (Teku-Blumentöpfe, 7 cm, LC-Serie, hergestellt von Pöppelmann GmbH & Co, Deutschland). Fünf Pflanzen wurden in jeden Topf eingepflanzt. Die Blumentöpfe wurden dann in die Kurz-Tag-Kammer mit kontrollierter Umgebung zurückgebracht, damit die Pflanze das Wachstum fortsetzt.
  • Nach 10 Tagen wurden die Pflanzen in das Gewächshausabteil (ergänzende Beleuchtung, 16 h, 340 μE/m2s, 22°C; 8 h, Dunkelheit, 20°C) überführt, wo sie weitere 17 Tage lang wachsen gelassen wurden.
  • Für die Transformation wurden 6 Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen, welche eben die Blüte begonnen hatten, 10 Sekunden lang in die oben beschriebene agrobakterielle Suspension eingetaucht, welche zuvor mit 10 μl Silwett L77 (Crompton S. A., Osi Specialties, Schweiz) behandelt worden war. Das betreffende Verfahren ist von Clough J. C. und Bent A. F. (Plant J. 16, 735 (1998)) beschrieben worden.
  • Die Pflanzen wurden anschließend 18 Stunden lang in eine feuchte Kammer eingebracht. Danach wurden die Töpfe zurück in das Gewächshaus gebracht, damit die Pflanzen das Wachstum fortsetzen. Die Pflanzen blieben weitere 10 Wochen lang im Gewächshaus, bis die Samen bereit für das Ernten waren.
  • Abhängig von dem für die Selektion der transformierten Pflanzen verwendeten Toleranzmarker wurden die geernteten Samen im Gewächshaus eingepflanzt und einer Sprühselektion unterworfen oder aber zuerst sterilisiert und dann auf Agarplatten wachsen gelassen, die mit dem jeweiligen Selektionsmittel versetzt waren. Da der Vektor das bar-Gen als den Toleranzmarker enthielt, wurden die Pflänzchen viermal bei einem Intervall von 2 bis 3 Tagen mit 0,02% BASTA® besprüht, und es wurde zugelassen, dass transformierte Pflanzen Samen entwickeln.
  • Die Samen der transgenen A. thaliana-Pflanzen wurden im Gefrierschrank (bei –20°C) aufbewahrt.
  • Beispiel 1e:
  • Screening von Pflanzen (Arabidopsis) hinsichtlich Wachstum bei beschränkter Stickstoffversorgung
  • Arabidopsis thaliana-Samen wurden in Blumentöpfen ausgesät, die eine Mischung von 1:1 (v:v) von nährstoffabgereichertem Erdboden (”Einheitserde Typ 0”, 30% Ton, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand enthielten. Die Keimung wurde durch eine viertägige Periode bei 4°C, im Dunklen, induziert. Anschließend wurden die Pflanzen unter Standard-Wachstumsbedingungen (Photoperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, und eine Photonenflussdichte von 200 μE) wachsen gelassen. Die Pflanzen wurden wachsen gelassen und kultiviert, wobei sie unter anderem jeden zweiten Tag mit einer N-abgereicherten Nährstofflösung bewässert wurden. Die N-abgereicherte Nährstofflösung enthielt z. B. neben Wasser
    mineralischer Nährstoff Endkonzentration
    KCl 3,00 mM
    MgSO4 × 7 H2O 0,5 mM
    CaCl2 × 6 H2O 1,5 mM
    K2SO4 1,5 mM
    NaH2PO4 1,5 mM
    Fe-EDTA 40 μM
    H3BO3 25 μM
    MnSO4 × H2O 1 μM
    ZnSO4 × 7H2O 0,5 μM
    Cu2SO4 × 5 H2O 0,3 μM
    Na2MoO4 × 2 O20 0,05 μM
  • Nach 9 bis 10 Tagen wurden die Pflanzen vereinzelt. Nach einer Gesamtzeit von 29 bis 31 Tagen wurden die Pflanzen geerntet und gemäß dem Frischgewicht der oberirdischen Teile der Pflanzen bewertet. Pro transgenem Konstrukt wurden 4 unabhängige transgene Linien (= Ereignisse) getestet (28 Pflanzen pro Konstrukt). Die Ergebnisse hiervon sind in der Tabelle VIII-A zusammengefasst.
  • Tabelle VIII-A: Biomasseproduktion von transgenen Arabidopsis thaliana, die unter begrenzter Stickstoffzufuhr wachsen gelassen wurden (erhöhte NUE). Die Biomasseerhöhung wurde als Verhältnis des Mittelwerts der Gewichte für transgene Pflanzen im Vergleich zum Mittelwerts der Gewichte von Wildtyp-Kontrollpflanzen aus dem gleichen Experiment berechnet, welche in derselben Kulturanlage wie die transformierten Pflanzen wachsen gelassen und am selben Tag geerntet wurden. Transgene Pflanzen, welche die angegebenen SeqIDs enthielten, zeigten eine Biomasseerhöhung von 10% oder mehr im Vergleich zu Kontrollpflanzen bei einem p-Wert eines zweiseitigen T-Tests unter 0,1.
    SeqID Target bzw. Ziel Lokus Biomasse-Erhöhung
    1958 cytoplasmatisch B1430 1,338
  • Beispiel 1f:
  • Screening von Pflanzen hinsichtlich Wachstum unter Niedertemperatur-Bedingungen In einem Standardexperiment wurde Erdboden als Mischung von 3,5:1 (v/v) aus nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Sand hergestellt.
  • Blumentöpfe wurden mit Erdbodenmischung gefüllt und in Schalen eingebracht. Wasser wurde in die Schalen zugegeben, damit zugelassen wird, dass die Erdbodenmischung die passende Menge an Wasser für die Aussaatprozedur aufnimmt. Die Samen für transgene A. thaliana-Pflanzen wurden in Blumentöpfe (6 cm Durchmesser) ausgesät. Die Stratifikation wurde für eine Periode von 3 Tagen im Dunklen bei 4°C–5°C eingerichtet. Die Keimung von Samen und das Wachstum wurde bei einer Wachstumsbedingung von 20°C, ungefähr 60% relative Feuchtigkeit, 16 h Lichtperiode und Bestrahlung mit Fluoreszenzlicht bei 150–200 μmol/m2s initiiert. Eine BASTA-Selektion wurde am Tag 9 nach dem Säen durch Besprühen der Töpfe mit den Pflänzchen von oben her vorgenommen. Hierfür wurde eine 0,07%ige (v/v) Lösung von BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser versprüht. Die Wildtyp-Kontrollpflanzen wurden lediglich mit Leitungswasser besprüht (anstelle Besprühens mit in Leitungswasser gelöstem BASTA), aber wurden ansonsten identisch behandelt. Das Bewässern wurde alle zwei Tage durchgeführt, nachdem die Hauben von den Schalen entfernt worden waren. Die Pflanzen wurden 12–13 Tage nach der Aussaat durch Entfernen des Überschusses an Sämlingen vereinzelt, wobei nur ein Sämling in einem Blumentopf übrig gelassen wurde. Kälte (Abkühlen auf 11°C–12°C) wurde 14–16 Tage nach dem Säen bis zum Ende des Experiments angewandt. Für das Messen der Biomasseleistung wurde das Pflanzen-Frischgewicht beim Erntezeitpunkt (35–37 Tage nach dem Säen) durch Abschneiden der Sprosse und Wiegen derselben bestimmt. Die Pflanzen befanden sich im Stadium vor dem Aufblühen und vor dem Wachstum der Infloreszenz, als sie geerntet wurden. Transgene Pflanzen wurden mit am selben Tag geernteten nicht-transgenen Wildtyp-Kontrollpflanzen verglichen. Die Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasseveränderungen wurden durch Anwenden des ′Student'schen′ t-Tests berechnet (Parameter: zweiseitig, ungleiche Varianz).
  • Pro transgenem Konstrukt wurden bis zu fünf Linien in 2 bis 3 sukzessiven experimentellen Stufen getestet. Nur Konstrukte, welche eine positive Leistung zeigten, wurden der nächsten experimentellen Stufe unterzogen. In der letzten experimentellen Stufe wurden 20–58 Pflanzen getestet. Die Biomasse-Leistung wurde wie oben beschrieben ausgewertet. Daten sind für Konstrukte gezeigt, welche erhöhte Biomasse-Leistung in mindestens zwei sukzessiven experimentellen Stufen aufzeigten.
  • Tabelle VIII-B: Biomasseproduktion von transgenen A. thaliana nach Ausüben von Abkühlungsstress.
  • Die Biomasseproduktion wurde durch Wiegen von Pflanzenrosetten gemessen. Die Biomasseerhöhung wurde als Verhältnis des durchschnittlichen Gewichts von transgenen Pflanzen im Vergleich zum durchschnittlichen Gewicht von Wildtyp-Kontrollpflanzen aus dem gleichen Experiment berechnet. Die mittlere Biomasseerhöhung von transgenen Konstrukten ist angegeben. Transgene Pflanzen, welche die angegebenen SeqIDs enthielten, zeigten eine Biomasseerhöhung von 10% oder mehr im Vergleich zu Kontrollpflanzen bei einem p-Wert eines zweiseitigen T-Tests unter 0,1.
    SeqID Target Lokus Biomasse-Erhöhung
    1958 cytoplasmatisch B1430 1,610
    3882 cytoplasmatisch YDR046C 1,206
    6079 cytoplasmatisch YDR046C_2 1,206
  • Beispiel 1g:
  • Screening von Pflanzen hinsichtlich Wachstum unter Bedingungen periodischer Dürre
  • Im Test hinsichtlich periodischer Dürre wird ein repetitiver Stress auf Pflanzen ausgeübt, ohne zu einer Austrocknung zu führen. In einem Standardexperiment wird Erdboden als Mischung von 1:1 (v/v) von nährstoffreicher Erde (GS90, Tantau, Wansdorf, Deutschland) und Quarzsand hergestellt. Blumentöpfe (6 cm Durchmesser) werden mit dieser Mischung gefüllt und in Schalen eingebracht. Wasser wird in die Schalen zugesetzt, damit zugelassen wird, dass die Erdbodenmischung die passende Menge an Wasser für die Aussaatprozedur aufnimmt (Tag 1), und anschließend werden Samen von transgenen A. thaliana-Pflanzen und ihren Wildtypkontrollen in Blumentöpfe ausgesät. Dann wird die gefüllte Schale mit einer transparenten Haube abgedeckt und in eine vorgekühlte (4°C–5°C) und abgedunkelte Wachstumskammer überführt. Die Stratifikation wurde für eine Periode von 3 Tagen im Dunklen bei 4°C–5°C oder, alternativ, für 4 Tage im Dunklen bei 4°C eingerichtet. Die Keimung von Samen und das Wachstum werden bei einer Wachstumsbedingung von 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, 16 h Lichtperiode und Bestrahlung mit Fluoreszenzlicht bei ungefähr 200 μmol/m2s initiiert. Die Hauben werden 7–8 Tage nach dem Säen entfernt. Eine BASTA-Selektion wird am Tag 10 oder Tag 11 (9 oder 10 Tage nach dem Säen) durch Besprühen der Töpfe mit den Pflänzchen von oben her vorgenommen. In dem Standardexperiment konnte eine 0,07%ige (v/v) Lösung von BASTA-Konzentrat (183 g/l Glufosinat-Ammonium) in Leitungswasser einmal versprüht werden, oder alternativ dazu konnte eine 0,02%ige (v/v) Lösung von BASTA dreimal versprüht werden. Die Wildtyp-Kontrollpflanzen werden lediglich mit Leitungswasser besprüht (anstelle Besprühens mit in Leitungswasser gelostem BASTA), aber werden ansonsten identisch behandelt. Die Pflanzen werden 13–14 Tage nach dem Säen vereinzelt, indem der Überschuss an Sämlingen entfernt und nur ein Sämling im Erdboden übrig gelassen wird.
  • Transgene Ereignisse und Wildtyp-Kontrollpflanzen werden gleichmäßig über die Kammer verteilt.
  • Die Wasserversorgung im gesamten Experiment ist limitiert, und die Pflanzen werden Zyklen von Dürre und erneutem Bewässern unterzogen. Die Bewässerung wird am Tag 1 (vor dem Säen), Tag 14 oder Tag 15, Tag 21 oder Tag 22, und, schließlich, Tag 27 oder Tag 28 durchgeführt. Für das Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung (Tag 28 oder Tag 29) durch Abschneiden der Sprosse und Wiegen derselben bestimmt. Neben dem Wiegen kann phänotypische Information im Fall von Pflanzen hinzugefügt werden, welche sich von der Wildtypkontrolle unterscheiden. Die Pflanzen sind im Stadium vor dem Aufblühen und vor dem Wachstum der Infloreszenz, wenn sie geerntet werden. Die Signifikanzwerte für die statistische Signifikanz der Biomasseveränderungen werden durch Anwenden des ′Student'schen′ t-Tests berechnet (Parameter: zweiseitig, ungleiche Varianz).
  • Bis zu vier Linien (Ereignisse) pro transgenem Konstrukt wurden in aufeinanderfolgenden experimentellen Stufen (bis zu 3) getestet. Transgene Linien, welche eine erhöhte Biomasseproduktion im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen aufzeigen, wurden der nächsten experimentellen Stufe unterzogen. Üblicherweise wurden in der ersten Stufe fünf Pflanzen pro Konstrukt getestet, und in den nachfolgenden Stufen wurden 14–40 Pflanzen getestet. Die Biomasseleistung wurde wie oben beschrieben ausgewertet. Daten aus Stufe 3 sind in der Tabelle VIII-C gezeigt.
  • Tabelle VIII-C: Biomasseproduktion von transgenen, unter periodischer Dürre entwickelten A. thaliana
  • Die Biomasseproduktion wurde durch Wiegen von Pflanzenrosetten gemessen. Die Biomasseerhöhung wurde als Verhältnis des durchschnittlichen Gewichts für transgene Pflanzen im Vergleich zum durchschnittlichen Gewicht von Wildtyp-Kontrollpflanzen aus dem gleichen Experiment berechnet. Die mittlere Biomasseerhöhung von transgenen Pflanzen ist angegeben (Signifikanzwert < 0,05).
    SeqID Target Lokus Biomasse-Erhöhung
    3882 plastidisch YDR046C 1,351
    6079 plastidisch YDR046C_2 1,351
  • Beispiel 2:
  • Gentechnische Herstellung von Arabidopsis-Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, durch Überexprimieren der ertragserhöhenden, z. B. das erfindungsgemäße Polypeptid, z. B. ein mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängendes Protein, codierenden Gene aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli unter Verwendung gewebespezifischer und/oder stressinduzierbarer Promotoren.
  • Transgene Arabidopsis-Pflanzen können wie in Beispiel 1 hergestellt werden, damit sie die, erfindungsgemäßes Polypeptid, z. B. ertragserhöhendes, z. B. mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängendes Protein codierenden Transgene unter der Steuerung eines gewebespezifischen und/oder stressinduzierbaren Promotors exprimieren.
  • Pflanzen der T2-Generation werden hergestellt und werden unter Stressbedingungen, vorzugsweise Bedingungen mit niedriger Temperatur, wachsen gelassen. Die Biomasseproduktion wird nach einer Gesamtzeit von 29 bis 30 Tagen, beginnend mit dem Säen, bestimmt. Die transgene Arabidopsis-Pflanze produziert mehr Biomasse als nicht-transgene Kontrollpflanzen.
  • Beispiel 3:
  • Überexpression der ertragserhöhenden, z. B. mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid, z. B. mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängenden Protein, z. B. mit Stress zusammenhängenden Gene aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli gewährt eine Toleranz bei mehreren abiotischen Stressformen
  • Pflanzen, welche Toleranz gegen einen abiotischen Stress zeigen, weisen oft Toleranz gegenüber einem weiteren Umweltstress auf. Dieses Phänomen der Kreuz-Toleranz ist auf einer mechanistischen Ebene nicht verstanden (McKersie und Leshem, 1994). Nichtsdestoweniger ist es vernünftig, zu erwarten, dass Pflanzen, die eine gesteigerte Toleranz gegenüber Niedertemperatur, z. B. Abkühlungstemperaturen und/oder Frosttemperaturen, wegen der Expression eines Transgens zeigen, auch Toleranz gegenüber Dürre und/oder Salz und/oder anderen abiotischen Stressformen aufzeigen könnten. Als Untermauerung dieser Hypothese, wird die Expression einiger Gene durch mehrere abiotische Stressfaktoren hoch- oder herunterreguliert, wobei niedrige Temperatur, Dürre, Satz, osmotischer Zustand, ABA, etc. eingeschlossen sind (z. B. Hong et al., Plant Mol. Biol. 18, 663 (1992); Jagendorf und Takabe, Plant Physiol. 127, 1827 (2001)); Mizoguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 765 (1996); Zhu, Curr. Opin. Plant Biol. 4, 401 (2001)).
  • Zur Bestimmung der Salztoleranz können Samen von A. thaliana sterilisiert werden (100% Bleichmittel, 0,1% TritonX, zweimal während fünf Minuten, und fünfmal gespült mit ddH2O). Samen wurden auf Nicht-Selektions-Medien ausplattiert (1/2 MS, 0,6% Phytagar, 0,5 g/l MES, 1% Saccharose, 2 μg/ml Benamyl). Die Samen werden ungefähr zehn Tage lang auskeimen gelassen. Beim 4-5-Blatt-Stadium wurden transgene Pflanzen in Töpfe von 5,5 cm Durchmesser eingepflanzt und ungefähr sieben Tage lang, mit Bewässern nach Bedarf, wachsen gelassen (22°C, kontinuierliches Licht). Um den Assay zu beginnen, werden zwei Liter 100 mM NaCl und 1/8 MS in die Schale unter den Blumentöpfen hinzugegeben. In die Schale, welche die Kontrollpflanzen enthielt, werden drei Liter 1/8 MS gegeben. Die Konzentrationen des NaCl-Zusatzes werden schrittweise alle 4 Tage um 50 mM bis zu 200 mM erhöht. Nach der Salz-Behandlung mit 200 mM, werden Frische und Überleben und die Biomasseproduktion der Pflanzen bestimmt.
  • Um die Dürretoleranz zu bestimmen, können Samen der transgenen und Niedertemperatur-Linien ausgekeimt und ungefähr 10 Tage lang bis zum 4-5-Blattstadium, wie oben, wachsen gelassen werden. Die Pflanzen werden dann zu Dürre-Bedingungen überführt, und können über die Blüte- und Samenentstehungs-Entwicklungsstadien hindurch wachsen gelassen werden. Die Photosynthese kann unter Verwendung der Chlorophyll-Fluoreszenz als Indikator der photosynthetischen Fitness und Integrität der Photosysteme gemessen werden. Das Überleben und die pflanzliche Biomasseproduktion als Indikatoren für den Samenertrag werden bestimmt.
  • Pflanzen, welche Toleranz gegenüber Salzgehalt oder Niedertemperatur aufweisen, weisen höhere Überlebensraten und Biomasseproduktion, einschließlich Samenertrag und Trockenmasseproduktion, als anfällige Pflanzen auf.
  • Beispiel 4:
  • Gentechnische Herstellung von Alfalfa-Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz und/oder anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von ertragserhöhenden, z. B. das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden, z. B. mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli oder Azotobacter vinelandii.
  • Ein regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) kann unter Anwendung von Verfahren des Stands der Technik (z. B. McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999)) transformiert werden. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotyp-abhängig, und deswegen wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät, wie beschrieben von Brown D. C. W. und Atanassov A. (Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 111 (1985)) ausgewählt werden. Alternativ dazu wird die Varietät RA3 (University of Wisconsin) zur Verwendung in Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., Am. J. Bet. 65, 654 (1978)).
  • Petiolen-Explante werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999)) oder LBA4404, enthaltend einen binären Vektor, cokultiviert. Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols, Methods in Molecular Biology, Band 44, S. 47–62, Gartland, K. M. A., und Davey, M. R., Hrsg., Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem Vektor pBIN19, beschrieben von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)), der eine Pflanzen-Genexpressionskassette enthält, die von den linken und rechten Border-Sequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens flankiert wird. Eine Pflanzen-Genexprossionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem pflanzlichen Promoter, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des merkmalstragenden Gens reguliert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis-Gens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patente 5 7673 666 und 6 225 105 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren des merkmalstragenden Gens verwendet werden, was eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulierung der Gentranskription bereitstellt, in diesem Beispiel wird der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet, um die konstitutive Expression des merkmalstragenden Gens vorzusehen.
  • Die Explantate werden während 3 Tagen im Dunklen auf SH-Induktionsmedium, enthaltend 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon, cokultiviert. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) von halber Stärke gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und geeignetem Antibiotikum zum Inhibieren des Wachstums von Agrobacterium, ausplattiert. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryos zu BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika, und 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryos werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Sämlinge werden in Blumentöpfe überführt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Pflanzen der T1- oder T2-Generation werden hergestellt und Niedertemperaturexperimenten, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen. Für die Bewertung der Ertragserhöhung, wird z. B. die Toleranz gegenüber Niedertemperatur, die Biomasseproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockenmasseproduktion und/oder der Samenertrag mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen, verglichen.
  • Beispiel 5:
  • Gentechnische Herstellung von Raygras-Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. gesteigerter Stress-Toleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von ertragserhöhenden, z. B. das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden, z. B. mit Toleranz gegenüber niedriger Temperatur zusammenhängenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli oder Azotobacter vinelandii.
  • Samen von einigen verschiedenen Raygras-Varietäten können als Explantatquellen zur Transformation verwendet werden, einschließlich der handelsüblichen Varietät Gunne, die von Svalöf Weibull Seed Company erhältlich ist, oder der Varietät Affinity. Die Samen werden der Reihe nach mit 1% Tween-20 während 1 Minute, 100% Bleichmittel während 60 Minuten, 3 Spülungen von je 5 Minuten mit entionisiertem und destilliertem H2O, oberflächensterilisiert und dann während 3–4 Tagen auf feuchtem, sterilem Filterpapier im Dunklen auskeimen gelassen. Die Sämlinge werden ferner 1 Minute lang mit 1% Tween-20, 5 Minuten mit 75% Bleichmittel, sterilisiert und dreimal mit ddH2O jeweils 5 Minuten lang gespült.
  • Oberflächensterilisierte Samen werden auf das Kallusinduktionsmedium gebracht, das basale Salze and Vitamine nach Murashige und Skoog, 20 g/l Saccharose, 150 mg/l Asparagin, 500 mg/l Caseinhydrolysat, 3 g/l Phytagel, 10 mg/l BAP und 5 mg/l Dicamba enthält. Die Platten werden 4 Wochen lang im Dunklen bei 25°C für die Samenkeimung und zur Induktion von embryogenem Callus inkubiert.
  • Nach 4 Wochen auf dem Kallusinduktionsmedium werden die Sprosse und Wurzeln der Sämlinge weggeschnitten, der Callus wird in frisches Medium überführt, weitere 4 Wochen lang in Kultur gehalten und wird dann bei Licht während 2 Wochen zu MSO-Medium überführt. Mehrere Stücke von Callus (11–17 Wochen alt) werden entweder durch ein 10-mesh-Sieb passiert und auf Kallusinduktionsmedium gebracht, oder werden in 100 ml flüssigem Raygras-Kallusinduktionsmedium (gleiches Medium wie für Kallusinduktion mit Agar) in einem 250-ml-Kolben kultiviert. Der Kolben wird in Folie eingewickelt und im Dunklen bei 23°C eine Woche lang bei 175 U/min geschüttelt. Durch Absieben der Flüssigkultur mit einem 40-mesh-Sieb werden die Zellen abgesammelt. Die auf dem Sieb gesammelte Fraktion wird ausplattiert und auf festem Raygras-Kallusinduktionsmedium 1 Woche lang im Dunklen bei 25°C kultiviert. Der Callus wird dann auf MS-Medium, das 1% Saccharose enthält, überführt und 2 Wochen lang darauf kultiviert.
  • Die Transformation kann entweder mit Agrobacterium- oder mit Teilchenbeschuss-Verfahren erreicht werden. Ein Expressionsvektor wird erzeugt, der einen konstitutiven Pflanzenpromotor und die cDNA des Gens in einem pUC-Vektor enthält. Die Plasmid-DNA wird aus E. coli-Zellen mit Hilfe des Qiagen-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert. Ungefähr 2 g embryogener Callus werden in der Mitte eines sterilen Filterpapiers in einer Petri-Schale verteilt. Ein Aliquot von flüssigem MSO mit 10 g/l Saccharose wird dem Filterpapier zugesetzt. Goldteilchen (1,0 μm Größe) werden mit Plasmid-DNA gemäß dem Verfahren von Sanford et al., 1993, beschichtet und werden dem embryogenen Callus unter den folgenden Parametern zugeführt: 500 μg Teilchen und 2 μg DNA je Schuß, 1300 psi und eine Zieldistanz von 8,5 cm von der Stoppingplatte bis zur Callus-Platte, sowie 1 Schuß je Callus-Platte.
  • Nach dem Beschuß werden die Calli zurück zu frischem Callus-Entwicklungsmedium überführt und während eines Zeitraums von 1 Woche im Dunklen bei Raumtempratur gehalten. Der Callus wird dann zu Wachstumsbedingungen in Licht bei 25°C zum Initiieren der Embryodifferenzierung, mit dem passenden Selektionsmittel, z. B. 250 nM Arsenal, 5 mg/l PPT oder 50 mg/l Kanamycin, überführt. Schösslinge, die gegen das Selektionsmittel resistent sind, erscheinen und werden, nach der Wurzelbildung, in Erdboden überführt.
  • Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet, um eine Digoxigeninmarkierte Sonde durch PCR herzustellen, wobei es gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wird.
  • Transgene T0-Raygraspflanzen können durch Exzision von Wurzelsprossen vegetativ vermehrt werden. Die transplantierten Wurzelsprosse werden 2 Monate lang im Gewächshaus gehalten, bis sie sich gut entwickelt haben. Die Schösslinge werden entlaubt und 2 Wochen lang wachsen gelassen.
  • Pflanzen der T1- oder T2-Generation werden hergestellt und Niedertemperaturexperimenten, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen. Für die Bewertung der Ertragserhöhung werden z. B. die Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, die Biomasseproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockenmasseproduktion und/oder der Samenertrag mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen, verglichen.
  • Beispiel 6:
  • Gentechnische Herstellung von Sojapflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhtem Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. gesteigerter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von ertragserhöhenden, z. B. das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden, z. B. mit Toleranz gegenüber Niedertemperatur zusammenhängenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli oder Azotobacter vinelandii.
  • Soja kann gemäß der folgenden Modifikation des Verfahrens, beschrieben im Texas A&M-Patent US 5 164 310 , transformiert werden. Mehrere kommerzielle Sojabohnen-Varietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zuführbar. Das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Die Samen werden durch Eintauchen in 70% (v/v) Ethanol während 6 Minuten und in 25% kommerziellem Bleichmittel (NaOCl), ergänzt mit 0,1% (v/v) Tween, während 20 Minuten sterilisiert, gefolgt von viermaligem Spülen mit sterilem doppeltdestilliertem Wasser. Durch Entfernen der Keimwurzel, des Hypokotyls und eines Kotyledons aus jedem Sämling werden Sieben-Tages-Sämlinge vermehrt. Dann wird das Epikotyl mit einem Kotyledon auf frisches Keimungsmedium in Petrischalen überführt und bei 25°C bei einer 16-h-Lichtperiode (ungefähr 100 μmol/m2s) drei Wochen lang inkubiert. Axilläre Nodi bzw. Blattansätze (ungefähr 4 mm Länge) werden von 3 bis 4 Wochen alten Pflanzen abgeschnitten. Die axillären Nodi werden herausgeschnitten und in Agrobacterium LBA4404-Kultur inkubiert.
  • Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An, G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology, Bd. 44, S. 47–62, Hrsg.: Gartland K. M. A. und Davey, M. R., Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem Vektor pBIN19, beschrieben von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)), der eine Pflanzen-Genexpressionskassette enthält, flankiert von den linken und rechten Border-Sequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens. Eine Pflanzen-Genexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem pflanzlichen Promotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des merkmalstragenden Gens reguliert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis-Gens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patente 5 7673 666 und 6 225 105 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren des merkmalstragenden Gens verwendet werden, um eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulierung der Gentranskription vorzusehen. In diesem Beispiel kann der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet werden, um eine konstitutive Expression des merkmalstragenden Gens vorzusehen.
  • Nach der Cokultivierungs-Behandlung werden die Explantate gewaschen und zu Selektionsmedien überführt, die mit 500 mg/l Timentin supplementiert sind. Schösslinge werden herausgeschnitten und auf ein Schössling-Elongationsmedium gebracht. Schösslinge, die länger als 1 cm sind, werden zwei bis vier Wochen lang auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bevor sie in Erde umgepflanzt werden.
  • Die primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einer 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet, um eine Digoxigenin-markierte Sonde durch PCR herzustellen, wobei es gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wird.
  • Pflanzen der T1- oder T2-Generation werden hergestellt und Niedertemperaturexperimenten, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen. Für die Bewertung der Ertragserhöhung werden z. B. die Toleranz gegenüber Niedertemperatur, die Biomasseproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockenmasseproduktion und/oder der Samenertrag mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen, verglichen.
  • Beispiel 7:
  • Gentechnische Herstellung von Raps/Canola-Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. gesteigerter Stress-Toleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von ertragserhöhenden, z. B. das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden, z. B. mit Toleranz gegenüber Niedertemperatur zusammenhängenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli oder Azotobacter vinelandii.
  • Kotyledonäre Petiolen und Hypokotyle von 5–6 Tage alten Jung-Sämlingen können als Explantate für Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (Plant Cell Rep 17, 183 (1998)) transformiert werden. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die Standardvarietät, die für die Transformation herangezogen wird, aber es können andere Varietäten verwendet werden.
  • Agrobacterium tumefaciens LBA4404, enthaltend einen binären Vektor, kann für die Transformation von Canola eingesetzt werden. Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Bd. 44, S. 47–62, Hrsg.: Gartland, K. M. A., und Davey, M. R., Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzen-Genexpressionskassette enthält, flankiert von den linken und rechten Border-Sequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens. Eine Pflanzen-Genexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem pflanzlichen Promotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des merkmalstragenden Gens reguliert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis-Gens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patente 5 7673 666 und 6 225 105 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren des merkmalstragenden Gens verwendet werden, wodurch eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulierung der Gentranskription vorgesehen wird. In diesem Beispiel kann der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet werden, um eine konstitutive Expression des merkmalstragenden Gens vorzusehen.
  • Canola-Samen werden in 70% Ethanol während 2 Minuten, und dann in 30% Clorox mit einem Tropfen Tween-20 während 10 Minuten oberflächensterilisiert, woran sich drei Spülungen mit sterilisiertem destilliertem Wasser anschließen. Die Samen werden dann in vitro 5 Tage lang auf MS-Medium von halber Stärke ohne Hormone, 1% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 h Licht, keimen gelassen. Die Kotyledon-Petiolen-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen herausgeschnitten und werden mit Agrobacterium durch Eintauchen des geschnittenen Endes des Petiolen-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 h Licht kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium, werden die Petiolen-Explantate zu MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l), während 7 Tagen transferiert und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Schösslingsregeneration kultiviert. Wenn die Schösslinge eine Länge von 5 bis 10 mm haben, werden sie geschnitten und in/auf Schösslings-Elongationsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Schösslinge mit einer Länge von etwa 2 cm werden auf das Bewurzelungsmedium (MSO) zur Wurzelinduktion überführt.
  • Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet, um eine Digoxigeninmarkierte Sonde durch PCR herzustellen, wobei es gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wird.
  • Pflanzen der T1- oder T2-Generation werden hergestellt und Niedertemperaturexperimenten, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen. Für die Bewertung der Ertragserhöhung werden z. B. die Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, die Biomasseproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockenmasseproduktion und/oder der Samenertrag mit Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen, verglichen.
  • Beispiel 8:
  • Gentechnische Herstellung von Mais-Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. gesteigerter Stress-Toleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von ertragserhöhenden, z. B. das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden, z. B. mit Resistenz und/oder Toleranz gegenüber niedriger Temperatur zusammenhängenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli oder Azotobacter vinelandii.
  • Die Transformation von Mais (Zea Mays L.) kann mit einer Modifikation des von Ishida et al. (Nature Biotech 14745 (1996)) beschriebenen Verfahrens ausgeführt werden. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezielle Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzuchtlinie A188 (Universität von Minnesota) oder Hybride mit A188 als Stammform sind gute Quellen für Spendermaterial für eine Transformation (Fromm et al. Biotech 8, 833 (1990)), aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) von Maispflanzen geerntet, wenn die Länge von unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche ”superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO 94/00977 und WO 95/06722 beschrieben. Vektoren wurden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patent 6 025 541 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren des merkmalstragenden Gens verwendet werden, wodurch eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulierung der Gentranskription bereitgestellt wird. In diesem Beispiel wurde der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet, um eine konstitutive Expression des merkmalstragenden Gens vorzusehen.
  • Herausgeschnittene Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann Maisregenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, wachsen gelassen. Die Petri-Schalen werden im Licht bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, oder bis sich Schösslinge entwickeln, inkubiert. Die grünen Schösslinge werden von jedem Embryo in Mais-Bewurzelungsmedium überführt und 2 bis 3 Wochen lang bei 25°C inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Schösslinge werden in Erde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber den Imidazolinon-Herbiziden aufzeigen und welche PCR-positiv hinsichtlich der Transgene sind.
  • Die transgenen T1-Pflanzen werden dann hinsichtlich ihrer gesteigerten Stresstoleranz, wie Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder erhöhter Biomasseproduktion gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ausgewertet. Die T1-Generation von Einzelgenort-Insertionen der T-DNA wird bezüglich des Transgens in einem Verhältnis von 3:1 segregieren. Diejenigen Nachkommen, die ein oder zwei Kopien des Transgens enthalten, sind tolerant gegenüber dem Herbizid Imidazolinon und zeigen einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel eine Steigerung der Stresstoleranz, wie der Toleranz gegenüber Niedertemperatur, und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion, gegenüber denjenigen Nachkommen, denen die Transgene fehlen.
  • Pflanzen der T1- oder T2-Generation werden hergestellt und Niedertemperaturexperimenten, z. B. wie oben in Beispiel 2 beschrieben, unterzogen. Für die Bewertung der Ertragserhöhung werden z. B. die Toleranz gegenüber Niedertemperatur, die Biomasseproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockenmasseproduktion und/oder der Samenertrag mit z. B. entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen, verglichen.
  • Homozygote T2-Pflanzen zeigten ähnliche Phänotypen. Hybridpflanzen (F1-Nachkommen) von homozygoten transgenen Pflanzen und nicht-transgenen Pflanzen zeigten ebenfalls einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerte Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel eine erhöhte Dürretoleranz und/oder eine erhöhte Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder eine andere erwähnte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. gesteigerte Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, auf.
  • Beispiel 9:
  • Gentechnische Herstellung von Weizenpflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel gesteigerter Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, zum Beispiel einer erhöhten Dürretoleranz und/oder Niedertemperaturtoleranz und/oder einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz, und/oder einer anderen erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. gesteigerter Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von ertragserhöhenden, z. B. das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden, z. B. mit Resistenz und/oder Toleranz gegenüber Niedertemperatur zusammenhängenden Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder Synechocystis oder E. coli oder Azotobacter vinelandii.
  • Die Transformation von Weizen kann mit Hilfe des Verfahrens durchgeführt werden, das von Ishida et al. (Nature Biotech. 14745 (1996)) beschrieben wurde. In der Transformation wird gewöhnlich das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CYMMIT, Mexiko) verwendet. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche ”superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO94/00977 und WO95/06722 beschrieben. Vektoren wurden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patent 6 025 541 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren des merkmalstragenden Gens verwendet werden, wodurch eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulierung der Gentranskription vorgesehen wird. In diesem Beispiel wurde der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet, um eine konstitutive Expression des merkmalstragenden Gens vorzusehen.
  • Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen auf Kallusinduktionsmedium, dann Regenerationsmedium, das Imidazolinon als ein Selektionsmittel enthält, wachsen gelassen. Die Petri-Schalen werden bei Licht während 2 bis 3 Wochen, oder bis sich Schösslinge entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die grünen Schösslinge werden von jedem Embryo zu einem Bewurzelungsmedium überführt und 2 bis 3 Wochen lang bei 25°C inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Schösslinge werden in Erde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufzeigen und welche PCR-positiv hinsichtlich der Transgene sind.
  • Die transgenen T1-Pflanzen werden dann hinsichtlich ihrer gesteigerten Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder erhöhter Biomasseproduktion gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren ausgewertet. Die T1-Generation von Einzel-Lokus-Insertionen der T-DNA wird bezüglich des Transgens in einem Verhältnis von 3:1 segregieren. Diejenigen Nachkommen, die ein oder zwei Kopien des Transgens enthalten, sind tolerant gegenüber dem Herbizid Imidazolinon und zeigen einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, zum Beispiel eine gesteigerte Toleranz gegenüber Niedertemperatur, und/oder erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu den Nachkommen, denen die Transgene fehlen. Homozygote T2-Pflanzen zeigen ähnliche Phänotypen.
  • Für die Einschätzung der Ertragserhöhung können z. B. die Toleranz gegenüber Niedertemperatur, die Biomasseproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trocken masseproduktion und/oder der Samenertrag mit z. B. entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen verglichen werden. Zum Beispiel können Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. höherer Toleranz gegenüber Stress, z. B. mit einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, eine(n) erhöhte(n) Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag unter niedriger Temperatur im Vergleich zu Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen, zeigen.
  • Beispiel 10:
  • Identifizierung von identischen und heterologen Genen
  • Gensequenzen können zum Identifizieren identischer oder heterologer Gene aus cDNA- oder genomischen Bibliotheken verwendet werden. Identische Gene (z. B. Volllängen-cDNA-Klone) können durch Nukleinsäurehybridisierung zum Beispiel unter Verwendung von cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Abhängig von der Häufigkeit des Gens von Interesse werden 100000 bis 1000000 rekombinante Bakteriophagen ausplattiert und auf Nylonmembranen überführt. Nach Denaturierung mit Alkali wird DNA auf der Membran z. B. durch UV-Vernetzung immobilisiert. Die Hybridisierung wird bei Hochstringenzbedingungen durchgeführt. In wässriger Lösung wird das Hybridisieren und Waschen bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C durchgeführt. Hybridisierungssonden werden z. B. durch radioaktive (32P) Nick-Transkriptions-Markierung (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland) erzeugt. Signale werden durch Autoradiographie nachgewiesen.
  • Partiell identische oder heterologe Gene, welche verwandt aber nicht identisch sind, können in einer analogen Weise zur oben beschrieben Prozedur mit Hilfe von Niederstringenz-Hybridisierung und -Waschbedingungen identifiziert werden. Für eine wässrige Hybridisierung wird die Ionenstärke normalerweise bei 1 M NaCl gehalten, während die Temperatur progressiv von 68 auf 42°C gesenkt wird.
  • Die Isolierung von Gensequenzen mit Homologie (oder Sequenzidentität/ähnlichkeit) nur in einer bestimmten Domäne (von zum Beispiel 10–20 Aminosäuren) kann mit Hilfe synthetischer radioaktiv-markierter Oligonukleotidsonden durchgeführt werden. Radiomarkierte Oligonukleotide werden durch Phosphorylierung des 5'-Endes von zwei komplementären Oligonukleotiden mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werden annealt und ligiert, um Konkatemere zu bilden. Die doppelsträngigen Konkatemere werden dann zum Beispiel mittels Nick-Transkription radioaktiv markiert. Die Hybridisierung wird normalerweise bei Niederstringenz-Bedingungen unter Verwendung hoher Oligonukleotidkonzentrationen durchgeführt.
  • Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:
    • 6 × SSC
    • 0,01 M Natriumphosphat
    • 1 mM EDTA (pH 8)
    • 0,5% SDS
    • 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA
    • 0,1% fettfreie Trockenmilch
  • Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5–10°C unter der geschätzten Oligonukleotid-Tm oder bis hinab zu Raumtemperatur gesenkt, woran sich Waschschritte und die Autoradiographie anschließen. Das Waschen wird mit geringer Stringenz, wie etwa mit 3 Waschschritten unter Verwendung von 4 × SSC, durchgeführt. Weitere Details sind von Sambrook J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder Ausubel, F. M., et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, beschrieben.
  • Beispiel 11:
  • Identifizierung von identischen Genen durch Screening von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
  • c-DNA-Klone können verwendet werden, um rekombinantes Polypeptid zum Beispiel in E. coli herzustellen (z. B. Qiagen QIAexpress pQE-System). Rekombinante Polypeptide werden dann in normaler Weise durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitätsgereinigt. Rekombinante Polypeptide werden dann verwendet, um spezifische Antikörper, zum Beispiel mit Hilfe von Standardtechniken zur Kaninchenimmunisierung, herzustellen. Die Antikörper werden unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule, gesättigt mit dem rekombinanten Antigen, wie bei Gu et al., Bio Techniques 17, 257 (1994) beschrieben, affinitätsgereinigt. Der Antikörper kann dann zum Screenen von Expressions-cDNA-Bibliotheken verwendet werden, um identische oder heterologe Gene mittels eines immunologischen Screenings zu identifizieren (Sambrook, J., et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder Ausubel, F. M., et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
  • Beispiel 12:
  • In-vivo-Mutagenese
  • Eine In-vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann durch Passage von Plasmid-(oder sonstiger Vektor-)DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen, wie S. cerevisiae) ausgeführt werden, welche hinsichtlich ihrer Fähigkeiten beeinträchtigt sind, die Integrität ihrer genetischen Information aufrecht zu halten. Typische Mutator-Stämme besitzen Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem (z. B. mutHLS, mutD, mutT, etc.; zur Referenz, siehe Rupp W. D., DNA repair mechanisms, in: E. coli and Salmonella, S. 2277–2294, ASM, 1996, Washington.) Derartige Stämme sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Die Verwendung solcher Stämme ist zum Beispiel in Greener, A., und Callahan, M., Strategies 7, 32 (1994), veranschaulicht. Die Übertragung von mutierten DNA-Molekülen in Pflanzen wird vorzugsweise nach Selektion und Testen in Mikroorganismen durchgeführt. Transgene Pflanzen werden gemäß verschiedenen Beispielen Innerhalb der exemplifizierenden Schilderung dieses Dokuments erzeugt.
  • Beispiel 13:
  • Gentechnische Herstellung von Arabidopsis-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden Genen zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa unter Verwendung gewebespezifischer oder stressinduzierbarer Promotoren.
  • Transgene Arabidopsis-Pflanzen, die das erfindungsgemäße Polypeptid codierende Gene, z. B. ein mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängendes Protein codierende Gene, zum Beispiel aus Brassica napus, Glycine max, Zea mays and Oryza sativa überexprimieren, können wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt werden, so dass sie die erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden Transgene unter der Steuerung eines gewebespezifischen oder stress-induzierbaren Promotors exprimieren. Pflanzen der T2-Generation werden hergestellt und unter Stress- oder Nicht-Stressbedingungen, z. B. Niedertemperatur-Bedingungen, wachsen gelassen. Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. höherer Toleranz gegen Stress, z. B. niedrige Temperatur, oder mit einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, zeigen eine(n) erhöhte(n) Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag unter Niedertemperatur-Bedingungen im Vergleich zu Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen.
  • Beispiel 14:
  • Gentechnische Herstellung von Alfalfa-Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedrigier Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden Genen, z. B. mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängenden Genen beispielsweise aus zum Beispiel A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
  • Ein regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) kann unter Anwendung des Verfahrens von McKersie et al. (Plant Physiol 119, 839 (1999)) transformiert werden. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotyp-abhängig, und deswegen wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät, wie von Brown und Atanassov (Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 111 (1985)) beschrieben, gewählt werden. Alternativ, ist die Varietät RA3 (University of Wisconsin) zur Verwendung in Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., Am. J. Bot. 65, 54 (1978)).
  • Petiolen-Explante werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., Plant Physiol 119, 839 (1999)) oder LBA4404, enthaltend einen binären Vektor, cokultiviert. Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols, Methods in Molecular Biology, Band 44, S. 47–62, Gartland, K. M. A., und Davey, M. R., Hrsg., Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem Vektor pBIN19, beschrieben von Bevan (Nucleic Acid Research 12, 8711 (1984)), der eine Pflanzen-Genexpressionskassette enthält, flankiert von den linken und rechten Border-Sequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens. Eine Pflanzen-Genexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem pflanzlichen Promotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des merkmalstragenden Gens reguliert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis-Gens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patente 5 7673 666 und 6225105 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren des merkmalstragenden Gens verwendet werden, was eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulierung der Gentranskription bereitstellt. In diesem Beispiel wurde der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet, um die konstitutive Expression des merkmalstragenden Gens vorzusehen.
  • Die Explantate werden während 3 Tagen im Dunklen auf SH-Induktionsmedium, enthaltend 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon, cokultiviert. Die Explantate wurden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) von halber Stärke gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und geeignetem Antibiotikum zum Inhibieren des Wachstums von Agrobacterium, ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryos in/auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika, und 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryos werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Sämlinge werden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Die transgenen T0-Pflanzen werden durch Nodien-Schnitte vermehrt und in Turface-Wachstumsmedium bewurzelt. Pflanzen der T1- oder T2-Generation werden hergestellt und Experimenten, die Stress- oder Nicht-Stressbedingungen, z. B. Niedertemperaturbedingungen beinhalten, wie in vorangehenden Beispielen beschrieben, unterzogen.
  • Für die Einschätzung der Ertragserhöhung wird z. B. die Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, die Biomasseproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockenmasseproduktion und/oder der Samenertrag z. B. mit entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen verglichen.
  • Zum Beispiel können Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. höherer Toleranz gegenüber Stress, z. B. mit einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, eine(n) erhöhte(n) Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag unter niedriger Temperatur im Vergleich zu Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen, zeigen.
  • Beispiel 15:
  • Gentechnische Herstellung von Raygraspflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber Niedertemperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden Genen, z. B. mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängenden Genen, zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
  • Samen von einigen verschiedenen Raygras-Varietäten können als Explantatquellen zur Transformation verwendet werden, einschließlich der handelsüblichen Varietät Gunne, erhältlich von Svalöf Weibull Seed Company, oder der Varietät Affinity. Die Samen werden der Reihe nach mit 1% Tween-20 während 1 Minute, 100% Bleichmittel während 60 Minuten, 3 Spülungen von je 5 Minuten mit entionisiertem und destilliertem H2O, oberflächensterilisiert und dann während 3–4 Tagen auf feuchtem, sterilem Filterpapier im Dunklen auskeimen gelassen. Die Sämlinge werden ferner 1 Minute lang mit 1% Tween-20, 5 Minuten mit 75% Bleichmittel, sterilisiert und dreimal mit doppelt-destilliertem H2O jeweils 5 Minuten lang gespült.
  • Oberflächensterilisierte Samen werden auf das Kallusinduktionsmedium gebracht, das basale Salze and Vitamine nach Murashige und Skoog, 20 g/l Saccharose, 150 mg/l Asparagin, 500 mg/l Caseinhydrolysat, 3 g/l Phytagel, 10 mg/l BAP und 5 mg/l Dicamba enthält. Die Platten werden 4 Wochen lang im Dunklen bei 25°C für die Samenkeimung und zur Induktion von embryogenem Callus inkubiert.
  • Nach 4 Wochen auf dem Kallusinduktionsmedium werden die Sprosse und Wurzeln der Sämlinge weggeschnitten, der Callus wird in frisches Medium überführt, weitere 4 Wochen lang in Kultur gehalten und wird dann bei Licht während 2 Wochen zu MSO-Medium überführt. Mehrere Stücke von Callus (11–17 Wochen alt) werden entweder durch ein 10-mesh-Sieb passiert und auf Kallusinduktionsmedium gebracht, oder werden in 100 ml flüssigem Raygras-Kallusinduktionsmedium (gleiches Medium wie für Kallusinduktion mit Agar) in einem 250-ml-Kolben kultiviert. Der Kolben wird in Folie eingewickelt und im Dunklen bei 23°C eine Woche lang bei 175 U/min geschüttelt. Durch Absieben der Flüssigkultur mit einem 40-mesh-Sieb werden die Zellen abgesammelt. Die auf dem Sieb gesammelte Fraktion wird ausplattiert und wird auf festem Raygras-Kallusinduktionsmedium 1 Woche lang im Dunklen bei 25°C kultiviert. Der Callus wird dann auf MS-Medium, enthaltend 1% Saccharose, überführt und 2 Wochen lang darauf kultiviert.
  • Die Transformation kann entweder mit Agrobacterium- oder mit Teilchenbeschuss-Verfahren erreicht werden. Ein Expressionsvektor wird erzeugt, der einen konstitutive Pflanzenpromotor und die cDNA des Gens in einem pUC-Vektor enthält. Die Plasmid-DNA wird aus E. coli-Zellen mit Hilfe des Qiagen-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert. Ungefähr 2 g embryogener Callus werden in der Mitte eines sterilen Filterpapiers in einer Petri-Schale verteilt. Ein Aliquot von flüssigem MSO mit 10 g/l Saccharose wird dem Filterpapier zugesetzt. Goldteilchen (1,0 μm Größe) werden mit Plasmid-DNA gemäß dem Verfahren von Sanford et al., 1993, beschichtet und werden dem embryogenen Callus unter den folgenden Parametern zugeführt: 500 μg Teilchen und 2 μg DNA je Schuß, 1300 psi und eine Zieldistanz von 8,5 cm von der Stoppingplatte bis zur Callus-Platte, sowie 1 Schuß je Callus-Platte.
  • Nach dem Beschuß werden die Calli zurück zu frischem Callus-Entwicklungsmedium überführt und während eines Zeitraums von 1 Woche im Dunklen bei Raumtempratur gehalten. Der Callus wird dann zu Wachstumsbedingungen in Licht bei 25°C zum Initiieren der Embryodifferenzierung, mit dem passenden Selektionsmittel, z. B. 250 nM Arsenal, 5 mg/l PPT oder 50 mg/l Kanamycin, überführt. Schösslinge, die gegen das Selektionsmittel resistent sind, erscheinen und werden, nach der Wurzelbildung, in Erdboden überführt.
  • Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet, um eine Digoxigeninmarkierte Sonde durch PCR herzustellen, wobei es gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wird.
  • Transgene T0-Raygraspflanzen werden durch Exzision von Wurzelsprossen bzw. Trieben vegetativ vermehrt. Die transplantierten Wurzelsprosse werden 2 Monate lang im Gewächshaus gehalten, bis sie sich gut entwickelt haben. Pflanzen der T1- oder T2-Generation werden hergestellt und Stress oder Nicht-Stressbedingungen, z. B. Niedertemperaturexperimeten, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen.
  • Für die Einschätzung der Ertragserhöhung wird z. B. die Toleranz gegenüber Niedertemperatur, die Biomasseproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockenmasseproduktion und/oder der Samenertrag mit z. B. entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen verglichen. Zum Beispiel können Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. höherer Toleranz gegenüber Stress, z. B. mit einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, eine(n) erhöhte(n) Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag unter niedriger Temperatur im Vergleich zu Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen, zeigen.
  • Beispiel 16:
  • Gentechnische Herstellung von Sojapflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer gesteigerten Stress-Toleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden Genen, z. B. mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängenden Genen, zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
  • Sojabohne kann gemäß der folgenden Modifikation des Verfahrens, beschrieben im Texas A&M-Patent US 5 164 310 , transformiert werden. Mehrere kommerzielle Sojabohnen-Varietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zuführbar. Das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Die Samen werden durch Eintauchen in 70% (v/v) Ethanol während 6 Minuten und in 25% kommerziellem Bleichmittel (NaOCl), ergänzt mit 0,1% (v/v) Tween, während 20 Minuten sterilisiert, gefolgt von viermaligem Spülen mit sterilem doppeltdestilliertem Wasser. Durch Entfernen der Keimwurzel, des Hypokotyls und eines Kotyledons aus jedem Sämling werden Sieben-Tages-Sämlinge vermehrt. Dann wird das Epikotyl mit einem Kotyledon auf frisches Keimungsmedium in Petrischalen überführt und bei 25°C bei einer 16-h-Lichtperiode (ungefähr 100 μmol/ms) drei Wochen lang inkubiert. Axilläre Nodi bzw. Blattansätze (ungefähr 4 mm Länge) werden von 3 bis 4 Wochen alten Pflanzen abgeschnitten. Die axillären Nodi werden herausgeschnitten und in Agrobacterium LBA4404-Kultur inkubiert.
  • Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An, G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology, Bd. 44, S. 47–62, Hrsg.: Gartland K. M. A. und Davey, M. R., Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschriebenen Vektor pB1N19, der eine Pflanzen-Genexpressionskassette enthält, die von den linken und rechten Border-Sequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens flankiert ist. Eine Pflanzen-Genexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem pflanzlichen Promotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des merkmalstragenden Gens reguliert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis-Gens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patente 5 7673 666 und 6 225 105 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren des merkmalstragenden Gens verwendet werden, um eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulierung der Gentranskription vorzusehen. In diesem Beispiel wird der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet, um eine konstitutive Expression des merkmalstragenden Gens vorzusehen.
  • Nach der Cokultivierungs-Behandlung werden die Explantate gewaschen und zu Selektionsmedien überführt, die mit 500 mg/l Timentin supplementiert sind. Schösslinge werden herausgeschnitten und auf ein Schössling-Elongationsmedium gebracht. Schösslinge, die länger als 1 cm sind, werden zwei bis vier Wochen lang auf Bewurzelungsmedium gesetzt, bevor sie in Erde umgepflanzt werden.
  • Die primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet, um eine Digoxigenin-markierte Sonde durch PCR herzustellen, wobei es gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt wird.
  • Sojabohnenpflanzen, welche das erfindungsgemäße Polypeptid codierende Gene, z. B. mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängende Gene, aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa überexprimieren, zeigen einen erhöhten Ertrag, wobei sie zum Beispiel höhere Samenerträge aufweisen.
  • Pflanzen der T1- oder T2-Generation werden hergestellt und Stress- sowie Nicht-Stressbedingungen, z. B. Niedertemperaturexperimenten, z. B. wie oben in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen.
  • Für die Einschätzung der Ertragserhöhung wird z. B. die Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, die Biomasseproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockenmasseproduktion und/oder der Samenertrag mit z. B. entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen verglichen. Zum Beispiel können Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. höherer Toleranz gegenüber Stress, z. B. mit einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, eine(n) erhöhte(n) Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag unter niedriger Temperatur im Vergleich zu Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen, zeigen.
  • Beispiel 17:
  • Gentechnische Herstellung von Raps/Canola-Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer gesteigerten Stress-Toleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden Genen, z. B. von mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängenden Genen, zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
  • Kotyledonäre Petiolen und Hypokotyle von 5–6 Tage alten Jung-Sämlingen können als Explantate für Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (Plant Cell Rep 17, 183 (1998)) transformiert werden. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die Standardvarietät, die für die Transformation herangezogen wird, aber es können andere Varietäten verwendet werden.
  • Agrobacterium tumefaciens LBA4404, enthaltend einen binären Vektor, kann für die Transformation von Canola eingesetzt werden. Für die Transformation von Pflanzen sind viele unterschiedliche binäre Vektorsysteme beschrieben worden (z. B. An G., in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology Bd. 44, S. 47–62, Hrsg.: Gartland, K. M. A., und Davey, M. R., Humana Press, Totowa, New Jersey). Viele basieren auf dem von Bevan (Nucleic Acid Research. 12, 8711 (1984)) beschriebenen Vektor pBIN19, der eine Pflanzen-Genexpressionskassette enthält, flankiert von den linken und rechten Border-Sequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens. Eine Pflanzen-Genexpressionskassette besteht aus mindestens zwei Genen – einem Selektionsmarkergen und einem pflanzlichen Promotor, der die Transkription der cDNA oder genomischen DNA des merkmalstragenden Gens reguliert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Arabidopsis-Gens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patente 5 7673 666 und 6 225 105 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren des merkmalstragenden Gens verwendet werden, wodurch eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulierung der Gentranskription vorgesehen wird. In diesem Beispiel wird der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet, um eine konstitutive Expression des merkmalstragenden Gens vorzusehen.
  • Canola-Samen werden in 70% Ethanol während 2 Minuten, und dann in 30% Clorox mit einem Tropfen Tween-20 während 10 Minuten oberflächensterilisiert, woran sich drei Spülungen mit sterilisiertem destilliertem Wasser anschließen. Die Samen werden dann in vitro 5 Tage auf MS-Medium von halber Stärke ohne Hormone, 1% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 h Licht, auskeimen gelassen. Die Kotyledon-Petiolen-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden aus den In-vitro-Sämlingen herausgeschnitten und werden mit Agrobacterium durch Eintauchen des geschnittenen Endes des Petiolen-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 h Licht kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium, werden die Petiolen-Explantate zu MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l), während 7 Tagen transferiert und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin, oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Schösslingsregeneration kultiviert. Wenn die Schösslinge eine Länge von 5 bis 10 mm aufweisen, werden sie geschnitten und in/auf Schösslings-Elongationsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Schösslinge mit einer Länge von etwa 2 cm werden auf das Bewurzelungsmedium (MSO) zur Wurzelinduktion überführt.
  • Proben der primärer transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um die Gegenwart von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, in welcher DNA einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) überführt wird, bestätigt. Das PCR DIG Probe Synthesis-Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet, um eine Digoxigeninmarkierte Sonde durch PCR herzustellen, und wird gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewandt.
  • Die transgenen Pflanzen können dann bezüglich ihres erhöhten Ertrags, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. höherer Toleranz gegenüber Stress, z. B. gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder erhöhter Biomasseproduktion gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren ausgewertet werden. Es wird festgestellt, dass transgene Raps/Canola, welche das erfindungsgemäße Polypeptid codierende Gene, z. B. mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängende Gene, aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa überexprimieren, erhöhten Ertrag zeigen, zum Beispiel einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. höhere Toleranz gegenüber Stress, z. B. mit gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder erhöhter Biomasseproduktion im Vergleich zu Pflanzen ohne das Transgen, z. B. entsprechenden nicht-transgenen Kontrollpflanzen, zeigen.
  • Beispiel 18:
  • Gentechnische Herstellung von Maispflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer gesteigerten Stress-Toleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder erhöhter Biomasseproduktion durch Überexprimieren von das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden Genen, z. B. mit Toleranz gegenüber niedriger Temperatur zusammenhängenden Genen, zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
  • Die Transformation von Mais (Zea Mays L.) kann mit einer Modifikation des von Ishida et al. (Nature Biotech 14745 (1996)) beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezielle Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzuchtlinie A188 (Universität von Minnesota) oder Hybride mit A188 als Stammform sind gute Quellen für Spendermaterial für eine Transformation (Fromm et al. Biotech 8, 833 (1990)), aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) von Maispflanzen geerntet, wenn die Länge von unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryos können mit Agrobacterium tumefaciens, welche ”superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert werden, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO 94/00977 und WO 95/06722 beschrieben. Vektoren werden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patent 6 025 541 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren des merkmalstragenden Gens verwendet werden, wodurch eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulierung der Gentranskription vorgesehen wird. In diesem Beispiel wird der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet, um eine konstitutive Expression des merkmalstragenden Gens vorzusehen.
  • Herausgeschnittene Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann Maisregenerationsmedium, das Imidazolinon als Selektionsmittel enthält, wachsen gelassen. Die Petri-Schalen werden im Licht bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, oder bis sich Schösslinge entwickeln, inkubiert. Die grünen Schösslinge von jedem Embryo werden in Mais-Bewurzelungsmedium überführt und 2 bis 3 Wochen lang bei 25°C inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Schösslinge werden in Erde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber den Imidazolinon-Herbiziden aufzeigen und PCR-positiv hinsichtlich der Transgene sind.
  • Die transgenen T1-Pflanzen können dann hinsichtlich eines erhöhten Ertrags, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. höherer Toleranz gegenüber Stress, z. B. bei gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder erhöhter Biomasseproduktion gemäß den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren ausgewertet werden. Die T1-Generation von Einzelgenort-Insertionen der T-DNA wird bezüglich des Transgens in einem Verhältnis von 1:2:1 segregieren. Diejenigen Nachkommen, die ein oder zwei Kopien des Transgens enthalten (3/4 der Nachkommen), sind tolerant gegenüber dem Herbizid Imidazolinon und zeigen einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. höhere Toleranz gegenüber Stress, z. B. bei gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu jenen Nachkommen, denen die Transgene fehlen. Tolerante Pflanzen weisen höhere Samenerträge auf. Homozygote T2-Pflanzen zeigten ähnliche Phänotypen. Hybridpflanzen (F1-Nachkommen) von homozygoten transgenen Pflanzen und nicht-transgenen Pflanzen zeigten ebenfalls einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. höhere Toleranz gegenüber Stress, z. B. bei gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion.
  • Beispiel 19:
  • Gentechnische Herstellung von Weizenpflanzen mit erhöhtem Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, zum Beispiel einer gesteigerten Stresstoleranz, vorzugsweise Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, und/oder einer erhöhten Biomasseproduktion durch Überexprimieren von, das erfindungsgemäße Polypeptid codierenden Genen, z. B. von mit Niedertemperatur-Resistenz und/oder -Toleranz zusammenhängenden Genen, zum Beispiel aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
  • Die Transformation von Weizen kann mit Hilfe des Verfahrens durchgeführt werden, das von Ishida et al. (Nature Biotech. 14745 (1996)) beschrieben wurde. In der Transformation wird gewöhnlich das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CYMMIT, Mexiko) verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche ”superbinäre” Vektoren tragen, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Das superbinäre Vektorsystem von Japan Tobacco ist in den WO-Patenten WO 94/00977 und WO 95/06722 beschrieben. Vektoren werden wie beschrieben konstruiert. Verschiedene Selektionsmarkergene können verwendet werden, einschließlich des Maisgens, das ein mutiertes Acetohydroxysäure-Synthase-Enzym (AHAS) codiert ( US-Patent 6 025 541 ). In ähnlicher Weise können verschiedene Promotoren zum Regulieren des merkmalstragenden Gens verwendet werden, wodurch eine konstitutive, entwicklungs-, gewebe- oder umweltbedingte Regulierung der Gentranskription vorgesehen wird. In diesem Beispiel wird der 34S-Promotor (GenBank-Zugangsnummern M59930 und X16673) verwendet, um eine konstitutive Expression des merkmalstragenden Gens vorzusehen.
  • Nach Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen auf Kallusinduktionsmedium, dann Regenerationsmedium mit Imidazolinon als einem Selektionsmittel, wachsen gelassen. Die Petri-Schalen werden bei Licht während 2 bis 3 Wochen, oder bis sich Schösslinge entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die grünen Schösslinge werden von jedem Embryo zu einem Bewurzelungsmedium überführt und 2 bis 3 Wochen lang bei 25°C inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Schösslinge werden in Erde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegen die Imidazolinon-Herbizide aufzeigen und welche PCR-positiv hinsichtlich der Transgene sind.
  • Die transgenen T1-Pflanzen können dann hinsichtlich ihres erhöhten Ertrags, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. höherer Toleranz gegenüber Stress, z. B. bei gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder erhöhter Biomasseproduktion gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren ausgewertet werden. Die T1-Generation von Einzel-Lokus-Insertionen der T-DNA wird bezüglich des Transgens in einem Verhältnis von 1:2:1 segregieren. Diejenigen Nachkommen, die ein oder zwei Kopien des Transgens enthalten (3/4 der Nachkommen), sind tolerant hinsichtlich des Herbizids Imidazolinon und zeigen einen erhöhten Ertrag, z. B. eine erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft, z. B. höhere Toleranz gegenüber Stress, z. B. bei gesteigerter Toleranz gegenüber niedriger Temperatur und/oder eine erhöhte Biomasseproduktion, im Vergleich zu jenen Nachkommen, denen die Transgene fehlen.
  • Für die Einschätzung der Ertragserhöhung können z. B. die Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, die Biomasseproduktion, der intrinsische Ertrag und/oder die Trockenmasseproduktion und/oder der Samenertrag mit z. B. entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen verglichen werden. Zum Beispiel können Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, z. B. einer erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft, z. B. höherer Toleranz gegenüber Stress, z. B. mit einer erhöhten Nährstoffverwertungseffizienz oder einem erhöhten intrinsischen Ertrag, und z. B. mit höherer Toleranz gegenüber niedriger Temperatur, eine(n) erhöhte(n) Biomasseproduktion und/oder Trockenmasseproduktion und/oder Samenertrag unter niedriger Temperatur im Vergleich zu Pflanzen, denen das Transgen fehlt, z. B. zu entsprechenden nicht-transgenen Wildtyp-Pflanzen, aufzeigen.
  • Beispiel 20:
  • Gentechnische Herstellung von Reispflanzen mit erhöhtem Ertrag unter Bedingungen von vorübergehendem und repetitivem abiotischen Stress durch Überexprimieren von stressbezogenen Genen aus Saccharomyces cerevisiae oder E. coli oder Synechocystis Transformation von Reis
  • Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor der Erfindung enthält, kann zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet werden. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare werden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wird durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl2, gefolgt von sechsmaligem, 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen werden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthält (Callus-Induktions-Medium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen werden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen werden die Calli durch Subkultivieren während weiterer 2 Wochen auf dem gleichen Medium vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke werden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
  • Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor der Erfindung enthält, kann für die Co-Kultivierung verwendet werden. Agrobacterium wird auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien werden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD600) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wird dann in eine Petrischale überführt, und die Calli werden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe werden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli werden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wird das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse werden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem Auxin-enthaltenden Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt werden. Ausgehärtete Sprosse werden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten werden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten werden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts werden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen werden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
  • Für den Assay bezüglich periodischer Dürre wird ein repetitiver Stress auf Pflanzen ausgeübt, ohne dass dies zu einer Austrockung führt. Die Wasserversorgung im gesamten Experiment ist begrenzt, und Pflanzen werden Zyklen von Dürre und erneuter Bewässerung unterzogen. Für das Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Schösslinge und Wiegen derselben bestimmt.
  • Beispiel 21:
  • Gentechnische Herstellung von Reispflanzen mit erhöhtem Ertrag unter Bedingungen von vorübergehendem und repetitivem abiotischen Stress durch Überexprimieren von zum Beispiel ertrags- und stressbezogenen Genen beispielsweise aus A. thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays oder Oryza sativa
  • Transformation von Reis:
  • Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor der Erfindung enthält, kann zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet werden. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare werden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wird durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl2, gefolgt von sechsmaligem, 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen werden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthält (Callus-Induktions-Medium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen werden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen werden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke werden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
  • Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor der Erfindung enthält, kann für die Co-Kultivierung verwendet werden. Agrobacterium wird auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien werden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD600) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wird dann in eine Petrischale überführt, und die Calli werden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe werden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli werden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wird das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse werden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem Auxin-enthaltenden Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt werden. Gehärtete Sprosse werden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten werden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten werden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts werden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen werden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
  • Für den Assay hinsichtlich periodischer Dürre wird ein repetitiver Stress auf Pflanzen ausgeübt, ohne dass dies zu Austrockung führt. Die Wasserversorgung im gesamten Experiment ist begrenzt, und Pflanzen werden Zyklen von Dürre und erneuter Bewässerung unterzogen. Für das Messen der Biomasseproduktion wird das Pflanzenfrischgewicht einen Tag nach der letzten Bewässerung durch Abschneiden der Schösslinge und Wiegen derselben bestimmt. Bei einem äquivalenten Grad an Dürrestress sind tolerante Pflanzen zur Wiederaufnahme eines normalen Wachstums in der Lage, wohingegen anfällige Pflanzen starben oder bedeutende Schäden erleiden, welche zu kürzeren Blättern und weniger Trockenmasse führen.
  • Figuren:
  • 1. Vektor VC-MME220-1qcz (SEQ ID NR: 15), verwendet zur Klonierung des Gens von Interesse für eine nicht-zielgelenkte Expression.
  • 2. Vektor VC-MME221-1qcz (SEQ ID NR: 18), verwendet zur Klonierung des Gens von Interesse für eine nicht-zielgelenkte Expression.
  • 3. Vektor VC-MME354-1QCZ (SEQ ID NR: 13), verwendet zur Klonierung des Gens von Interesse für eine plastidisch-zielgelenkte Expression.
  • 4. Vektor VC-MME432-1qcz (SEQ ID NR: 16), verwendet zur Klonierung des Gens von Interesse für eine plastidisch-zielgelenkte Expression.
  • 5. Vektor VC-MME489-1QCZ (SEQ ID NR: 21), verwendet zur Klonierung des Gens von Interesse für eine nicht-zielgelenkte Expression und zur Klonierung einer Targeting-Sequenz.
  • 6. Vektor pMTX0270p (SEQ ID NR: 9), verwendet zur Klonierung einer Targeting-Sequenz.
  • 7. Vektor pMTX155 (SEQ ID NR: 12), verwendet zur Klonierung des Gens von Interesse für eine nicht-zielgelenkte Expression.
  • 8: Vektor pMTX447korr (SEQ ID NR: 19), verwendet für plastidisch-zielgelenkte Expression.
  • 9. Vektor VC-MME301-1QCZ (SEQ ID NR: 6207), verwendet für eine nicht-zielgelenkte Expression präferenziell in Samen.
  • 10. Vektor VC-MME289-1qcz (SEQ ID NR: 6208), verwendet für eine nicht-zielgelenkte Expression präferenziell in Samen.
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  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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    • Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994 [0621]

Claims (38)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyp-Pflanze, wobei das Verfahren mindestens den folgenden Schritt umfasst: Erhöhen oder Herbeiführen in einer Pflanze oder einem Teil derselben von einer oder mehreren Aktivitäten eines Polypeptids, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht.
  2. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyp-Pflanze, wobei das Verfahren mindestens einen der Schritte umfasst, gewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Polypeptids, umfassend ein Polypeptid, eine Consensussequenz oder mindestens ein Polypeptidmotiv, wie jeweils in Spalte 5 oder 7 der Tabelle II bzw. der Tabelle IV angegeben; (ii) Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines Expressionsprodukts, codiert von einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, wie in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I angegeben, und (iii) Erhöhen oder Herbeiführen der Aktivität eines funktionellen Äquivalents von (i) oder (ii).
  3. Verfahren von Anspruch 1 oder 2, umfassend (i) Erhöhen oder Herbeiführen der Expression von mindestens einem Nukleinsäuremolekül; und/oder (ii) Erhöhen oder Herbeiführen der Expression eines Expressionsprodukts, das von mindestens einem Nukleinsäuremolekül codiert wird; und/oder (iii) Erhöhen oder Herbeiführen einer oder mehrerer Äktivitäten eines Expressionsprodukts, das von mindestens einem Nukleinsäuremolekül codiert wird; wobei das mindestens eine Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül umfasst, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, welches das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigte Polypeptid codiert; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigt ist; (c) einem Nukleinsäuremolekül, das, als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II aufgeführten Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (d) einem Nukleinsäuremolekül, das ungefähr 80% oder mehr Identität zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigte Nukleinsäuremolekül, aufweist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit ungefähr 80% oder mehr Identität zu der Aminosäuresequenz des von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codierten Polypeptids codiert und die Aktivität, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt, aufweist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (f) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt wurden, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) codiert wird, und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Consensussequenz oder ein oder mehr Polypeptidmotive, wie in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (j) Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, welches durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erhalten wird und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt; und k) einem Nukleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, aufweisend ungefähr 50 nt oder mehr von einem Nukleinsäuremolekül, komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein repräsentiert wird, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt.
  4. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzenzellkerns oder eines Pflanzengewebes mit einem Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, welches das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II gezeigte Polypeptid codiert; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigt ist; (c) einem Nukleinsäuremolekül, das, als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II aufgeführten Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (d) einem Nukleinsäuremolekül, das mindestens ungefähr 95% Identität zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigte Nukleinsäuremolekül, aufweist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit mindestens ungefähr 95% Identität zu der Aminosäuresequenz des von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codierten Polypeptids codiert und die Aktivität, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt, aufweist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (f) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt wurden, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) codiert wird, und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Consensussequenz oder ein oder mehr Polypeptidmotive, wie in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (j) Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, welches durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erhalten wird und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt; und k) einem Nukleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, aufweisend mindestens ungefähr 400 nt von einem Nukleinsäuremolekül, komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein repräsentiert wird, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt, und das Regenerieren einer transgenen Pflanze aus diesem transformierten Pflanzenzellkern, dieser transformierten Pflanzenzelle oder diesem transformierten Pflanzengewebe mit erhöhtem Ertrag.
  5. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 4, wobei die eine oder die mehreren erhöhten oder herbeigeführten Aktivität(en) von einem Polypeptid aufgewiesen wird, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht.
  6. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, das zu erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden Wildtyp-Pflanze unter standardmäßigen Wachstumbedingungen, niedriger Temperatur, Dürre oder abiotischen Stressbedingungen führt.
  7. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, welches das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIB gezeigte Polypeptid codiert; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IB gezeigt ist; (c) einem Nukleinsäuremolekül, das, als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer in Spalte 5 oder 7 von Tabelle II aufgeführten Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (d) einem Nukleinsäuremolekül, das mindestens etwa 95% Identität zu der Nukleinsäuremolekülsequenz eines Polynukleotids, umfassend das in Spalte 5 oder 7 von Tabelle I gezeigte Nukleinsäuremolekül, aufweist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit mindestens etwa 95% Identität zu der Aminosäuresequenz des von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) codierten Polypeptids codiert und die Aktivität, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt, aufweist und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (f) Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (g) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches mit Hilfe von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern isoliert werden kann, die gegen ein Polypeptid erzeugt wurden, das von einem der Nukleinsäuremoleküle von (a) bis (e) codiert wird, und die Aktivität aufweist, repräsentiert durch das Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle I aufgeführt; (h) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Consensussequenz oder ein oder mehr Polypeptidmotive, wie in Spalte 7 von Tabelle IV gezeigt, und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt; (i) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Protein, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt, und einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt; (j) Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid umfasst, welches durch Amplifizieren einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek unter Verwendung der Primer in Spalte 7 von Tabelle III erhalten wird und vorzugsweise die Aktivität aufweist, repräsentiert durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid, wie in Spalte 5 von Tabelle II oder IV aufgeführt; und (k) einem Nukleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Screenen einer geeigneten Nukleinsäure-Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde, umfassend eine komplementäre Sequenz von einem Nukleinsäuremolekül von (a) oder (b), oder mit einem Fragment davon, aufweisend mindestens 400 nt von einem Nukleinsäuremolekül, komplementär zu einer in (a) bis (e) charakterisierten Nukleinsäuremolekülsequenz, und ein Polypeptid codiert, das die Aktivität aufweist, die durch ein Protein repräsentiert wird, umfassend ein Polypeptid, wie in Spalte 5 von Tabelle II aufgeführt.
  8. Nukleinsäuremolekül von Anspruch 7, wobei das Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (k) mindestens in einem oder mehreren Nukleotiden unterschiedlich zu der in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IA aufgeführten Sequenz ist und vorzugsweise ein Protein codiert, das sich mindestens in einer oder mehreren Aminosäuren von den in Spalte 5 oder 7 von Tabelle IIA aufgeführten Proteinsequenzen unterscheidet.
  9. Nukleinsäurekonstrukt, das die Expression des Nukleinsäuremoleküls von Anspruch 7 oder 8 vermittelt, welches ein oder mehrere regulatorische Elemente umfasst.
  10. Vektor, der das Nukleinsäuremolekül, wie in Anspruch 7 oder 8 beansprucht, oder das Nukleinsäurekonstrukt von Anspruch 9 umfasst.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei das Polypeptid im Wirtszellkern oder in der Wirtszelle exprimiert wird, wie in Anspruch 11 beansprucht.
  12. Polypeptid, hergestellt durch das Verfahren, wie in Anspruch 12 beansprucht, oder codiert durch das Nukleinsäuremolekül, wie in Anspruch 7 oder 8 beansprucht, oder wie in Tabelle IIB aufgeführt, wobei das Polypeptid sich gegenüber der Sequenz, wie in Tabelle IIA gezeigt, um eine oder mehrere Aminosäuren unterscheidet.
  13. Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid, wie in Anspruch 13 beansprucht, bindet.
  14. Pflanzenzellkern, Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Pollen, Nachkommen, geerntetes Material oder eine Pflanze, umfassend das Nukleinsäuremolekül, wie in Anspruch 7 oder 8 beansprucht, oder den Wirtszellkern oder die Wirtszelle, wie in Anspruch 11 beansprucht.
  15. Ein Pflanzenzellkern, eine Pflanzenzelle, ein Pflanzengewebe, Vermehrungsmaterial, Samen, Pollen, Nachkommen oder ein Pflanzenteil, der nach der Regeneration zu einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag führt; oder eine Pflanze mit erhöhtem Ertrag; oder ein Teil derselben; wobei der Ertrag erhöht ist im Vergleich zu einem entsprechenden Wildtyp, hergestellt durch ein Verfahren gemäß beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 oder transformiert mit dem Nukleinsäuremolekül, wie in Anspruch 7 oder 8 beansprucht, oder dem Nukleinsäurekonstrukt von Anspruch 9.
  16. Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil derselben von Anspruch 15, welche aus einer monokotylen Pflanze abgeleitet sind.
  17. Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil derselben von Anspruch 15, welche aus einer dikotylen Pflanze abgeleitet sind.
  18. Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil derselben von Anspruch 15, wobei die entsprechende Pflanze aus der Gruppe gewählt ist, die aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Ölsamenraps, einschließlich Canola und Winterölsamenraps, Maniok, Pfeffer/Paprika, Sonnenblume, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Flachs, Borretsch, Saflor, Leinsamen, Primel, Rübsamen, Rübsen, Tagetes, Nachtschattengewächsen, einschließlich Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate; Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, Ölpalme, Kokosnuss, perennierendem Gras, Futterpflanzen und Arabidopsis thaliana besteht.
  19. Transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, transgene Pflanze oder Teil derselben von Anspruch 15, wobei die Pflanze aus der Gruppe gewählt ist, die aus Mais, Soja, Olsamenraps (einschließlich Canola und Winterölsamenraps), Baumwolle, Weizen und Reis besteht.
  20. Transgene Pflanze, die eines oder mehrere von Pflanzenzellkernen oder Pflanzenzellen, Nachkommen, Samen oder Pollen umfasst oder von einer transgenen Pflanze nach beliebigen der Ansprüche 14 bis 19 hergestellt wird.
  21. Transgene Pflanze, transgener Pflanzenzellkern, transgene Pflanzenzelle, Pflanze, umfassend eines oder mehrere von derartigen transgenen Pflanzenzellkernen oder Pflanzenzellen, Nachkommen, Samen oder Pollen, abgeleitet aus oder hergestellt von einer transgenen Pflanze von beliebigen der Ansprüche 6 bis 9, wobei die transgene Pflanze, der transgene Pflanzenzellkern, die transgene Pflanzenzelle, die Pflanze, umfassend eines oder mehrere von derartigen transgenen Pflanzenzellkernen oder Pflanzenzellen, Nachkommen, Samen oder Pollen, genetisch homozygot bezüglich eines Transgens ist, das einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt.
  22. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon in einer Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon vermittelt, einer transgenen Pflanze oder einem Teil davon, das folgende Schritte umfasst: (a) Kultivieren einer Pflanzenzelle; einer transgenen Pflanze oder eines Teils davon, welche(r) das Polypeptid von Anspruch 12 sowie ein Ablesungssystem exprimiert, das zur Wechselwirkung mit dem Polypeptid unter geeigneten Bedingungen fähig ist, welche die Interaktion des Polypeptids mit diesem Ablesungssystem in Gegenwart einer Verbindung oder einer Probe, welche eine Vielzahl an Verbindungen enthält, gestatten, und das zur Abgabe eines nachweisbaren Signals als Reaktion auf die Bindung einer Verbindung an das Polypeptid unter Bedingungen fähig ist, welche die Expression des Ablesungssystems und des von dem Nukleinsäuremolekül von Anspruch 12 codierten Polypeptides erlauben; (b) Feststellen, ob die Verbindung ein effektiver Agonist ist, durch Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit oder Erhöhung eines von dem Ablesungssystem erzeugten Signals.
  23. Verfahren zur Herstellung einer landwirtschaftlichen Zusammensetzung, umfassend die Schritte des Verfahrens von Anspruch 22 und das Formulieren der in Anspruch 22 identifizierten Verbindung in einer Form, die für eine Verwendung in der Landwirtschaft annehmbar ist.
  24. Zusammensetzung, die das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 7 oder 8, das Nukleinsäurekonstrukt von Anspruch 9, den Vektor von Anspruch 10, das Polypeptid von Anspruch 12, die Verbindung von Anspruch 22 und/oder den Antikörper von Anspruch 13 und gegebenenfalls einen landwirtschaftlich annehmbaren Träger umfasst.
  25. Polypeptid von Anspruch 12 oder das Nukleinsäuremolekül, welches aus Hefe oder E. coli gewählt wird.
  26. Verwendung der Nukleinsäuren von Anspruch 7 oder 8 zur Herstellung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze.
  27. Verwendung der Nukleinsäuren gemäß Anspruch 7 oder 8 als Marker zur Identifizierung oder Selektion einer Pflanze mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanze.
  28. Verwendung der Nukleinsäuren gemäß Anspruch 17 oder Teilen derselben als Marker zum Nachweis von Ertragserhöhung in Pflanzen oder Pflanzenzellen.
  29. Verfahren zur Identifizierung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, welches das Screenen einer Population von einem/einer oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon hinsichtlich einer Aktivität eines Polypeptids, gewählt aus der Gruppe, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht, das Vergleichen der Höhe der Aktivität mit dem Aktivitätspegel in einer Referenz; das Identifizieren von einem/einer oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon mit der im Vergleich zur Referenz erhöhten Aktivität, wahlweise das Herstellen einer Pflanze aus den identifizierten Pflanzenzellkernen, der Zelle oder dem Gewebe, umfasst.
  30. Verfahren zur Identifizierung einer Pflanze mit einem erhöhten Ertrag, welches das Screenen einer Population von einem/einer oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon hinsichtlich des Expressionsspiegels einer Nukleinsäure, codierend für ein Polypeptid, das eine Aktivität von einem Polypeptid vermittelt, gewählt aus der Gruppe, die aus 26S-Proteasom-Untereinheit, 50S-Ribosomenprotein L36, autophagiebezogenem Protein, B0050-Protein, Verzweigtkettige-Aminosäure-Permease, Calmodulin, Kohlenstoffspeicherungsregulator, FK506-bindendem Protein, gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyrat-Hydrolase, GM02LC38418-Protein, Hitzestress-Transkriptionsfaktor, Mannan-Polymerase II-Komplex-Untereinheit, mitochondrialem Präkursor von Lon-Protease-Homolog, MutS-Protein-Homolog, Phosphat-Transporter-Untereinheit, Protein EFR3, Pyruvatkinase, Tellurit-Resistenz-Protein, Xanthin-Permease und YAR047C-Protein besteht, das Vergleichen des Spiegels der Expression mit einer Referenz; das Identifizieren von einem/einer oder mehreren Pflanzenzellkernen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen oder Teilen davon mit dem im Vergleich zur Referenz erhöhten Expressionsspiegel, wahlweise das Herstellen einer Pflanze aus den identifizierten Pflanzenzellkernen, der Zelle oder dem Gewebe, umfasst.
  31. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 oder die Pflanze gemäß einem beliebigen der Ansprüche 14 bis 20, wobei die Pflanze eine verbesserte ertragsbezogene Eigenschaft zeigt.
  32. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 oder die Pflanze gemäß einem beliebigen der Ansprüche 14 oder 15, wobei die Pflanze eine verbesserte Nährstoffverwertungseffizienz und/oder abiotische Stresstoleranz zeigt.
  33. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 oder die Pflanze gemäß einem beliebigen der Ansprüche 14 bis 20, wobei die Pflanze eine verbesserte erhöhte Niedertemperatur-Toleranz zeigt.
  34. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 oder die Pflanze gemäß einem beliebigen der Ansprüche 14 bis 20, wobei die Pflanze eine Erhöhung des erntefähigen Ertrags zeigt.
  35. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 oder die Pflanze gemäß einem beliebigen der Ansprüche 14 bis 20, wobei die Pflanze einen verbesserten zeigt, wobei die Ertragserhöhung auf einer Basis pro Pflanze oder in Bezug auf eine spezifische Ackerlandfläche berechnet wird.
  36. Verfahren zur Erhöhung des Ertrags einer Population von Pflanzen, umfassend das Überprüfen der Wachstumstemperatur(en) in der Fläche für den Anbau, das Vergleichen der Temperaturen mit der optimalen Wachstumstemperatur einer für den Anbau in Erwägung gezogenen Pflanzenspezies oder -varietät, das Anbauen und das Wachsenlassen der Pflanze von einem beliebigen der Ansprüche 14 bis 20 oder 31 bis 35, wenn die Wachstumstemperatur nicht optimal für das Anbauen und Wachsenlassen der für den Anbau in Erwägung gezogenen Pflanzenspezies oder -varietät ist.
  37. Verfahren der vorangehenden Ansprüche, umfassend das Ernten der Pflanze oder eines Teils der Pflanze, welche hergestellt oder angebaut wurde, und das Erzeugen von Treibstoff mit oder aus der geernteten Pflanze oder einem Teil derselben.
  38. Verfahren der vorangehenden Ansprüche, wobei die Pflanze eine zur Stärkeproduktion brauchbare Pflanze ist, umfassend das Ernten des zur Stärkeisolierung brauchbaren Pflanzenteils und das Isolieren von Stärke aus diesem Pflanzenteil.
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