CN106749654B - 制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体，所述方法包括以下步骤：用纯化的融合蛋白ACP‑CaM与佐剂免疫小鼠；用生理盐水稀释的融合蛋白ACP‑CaM腹腔冲击小鼠；取所述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；融合后采用HAT培养液培养和间接ELISA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞；用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％；排除抗体与标签蛋白ACP有交叉反应的阳性杂交瘤细胞；采用小鼠体内诱生腹水法制备钙调蛋白单克隆抗体；纯化所述钙调蛋白单克隆抗体。通过本发明方法制备的钙调蛋白单克隆抗体具有高效价、高稳定性和高特异性。

Description

制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体。

背景技术

木薯(Manihot esculanta Crantz)中NADH-氧化酶表达上调产生大量ROS，诱导钙调蛋白(Calmodulin,CaM)上调，从而启动一系列的生物防御反应，提高抗逆蛋白质的表达从而延长块根贮藏时间，推测CaM在木薯块根采后腐烂中起重要的调节作用(简纯平.采后木薯块根贮存能力及蛋白质组学分析[D].海口:海南大学,2013；张振文.木薯块根采后生理的蛋白质调控机理研究[D].海口:海南大学,2012)。研究表明，不同生物或非生物的刺激，如病虫害(朱友林,吴健胜,王金生.水稻对白叶枯病菌抗性相关蛋白的双向电泳分析[J].中国农业科学,2000,33(4):91-93；陈荣智,翁清妹,黄臻,等.水稻对褐飞虱抗性相关蛋白的双向电泳分析(英文)[J].植物学报(英文版),2002,44(4):427-432；ALI G S,REDDYV S,LINDGREN P B,et al.Differential expression of genes encoding calmodulin-binding proteins in response to bacterial pathogens and inducers of defenseresponses[J].Plant Molecular Biology,2003,51(6):803-815)、缺氧(SHI J X,Chen S,NATAN G,et al.Effects of anaerobic stress on the proteome of citrus fruit[J].Plant Science,2008,175(4):478-486)、高盐(蔡伦,张富春,曾幼玲,等.新疆盐生植物的钙调蛋白基因克隆与序列分析[J].植物生理学通讯,2005,41(02):163-167.；CHEN S,GOLLOP N,HEUER B.Proteomic analysis of salt-stressed tomato(Solanumlycopersicum)seedlings:effect of genotype and exogenous application ofglycinebetaine[J].Journal of Experimental Botany,2009,60(7):2005-2019)、重金属(孙鹂.铅对细胞内钙离子及钙调蛋白影响的研究进展[J].国外医学卫生学分册,2002,29(6):328-330)和温度(MAJOUL T,BANCEL E,TRIBOI E,et al.Proteomic analysis of theeffect of heat stress on hexaploid wheat grain:Characterization of heat-responsive proteins from non-prolamins fraction[J].Proteomics,2004,3(2):175-183)胁迫等，可以改变植物CaM基因的表达分布，只是在不同组织和器官中的含量和分布不同(刘维.番茄钙调蛋白和类钙调蛋白的抗病调控功能分析[D].杭州:浙江大学,2015)。作为抗逆信号转导中重要的蛋白，研究CaM含量在不同木薯品种、不同器官和不同时期含量变化非常必要。

目前CaM的测定方法主要有免疫学方法、凝胶电泳法和酶法(梁婧,张晓蓉,许艳华.钙调蛋白的研究进展[J].临床口腔医学杂志,2010,26(08):500-501)。凝胶电泳法因为检测不准确，所以用的比较少；酶法能检测有活性的CaM，但是测定过程中容易受到干扰而导致测定值偏低；免疫学方法主要有放射免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)，这两种方法检测都是以抗原抗体特异性结合为基础，两者都需要制备CaM抗体(梁婧,张晓蓉,许艳华.钙调蛋白的研究进展[J].临床口腔医学杂志,2010,26(08):500-501)。免疫学检测方法特异性强，受待测样本中非CaM成分干扰相对小，能检测CaM总量，但是不能确定CaM活性含量(王娟,李晓军,潘继文,等.钙调素ELISA定量检测方法的建立与实验条件优化[J].医学研究生学报,2003,16(6):401-403)。

随着木薯全基因组测序工作的完成及基因数据库的构建(WANG W,FENG B,XIAOJ,et al.Cassava genome from a wild ancestor to cultivated varieties[J].NatureCommunications,2013,10(5):5110)，免疫学技术结合蛋白质组学的研究在木薯高效、高产、特用育种和关键蛋白表达调控机制研究通路中的应用将会变得越来越重要(陈松笔,安飞飞,朱文丽,等.蛋白质组学在木薯育种中的应用[J].生物技术通报,2015,31(11):18-26)。CaM在真核细胞的进化过程中高度保守，甚至在脊椎动物中具有完全一样的一级结构；在植物中，钙调蛋白的一级结构相似程度也在90％以上(ZHAO S,CHEN D,GENG Q,etal.The highly conserved LAMMER/CLK2protein kinases prevent germ celloverproliferation in drosophila[J].Developmental Biology,2013,376(2):163-70)，在更低级的生物中序列差异越来越大(刘维.番茄钙调蛋白和类钙调蛋白的抗病调控功能分析[D].杭州:浙江大学,2015)。CaM是由148个氨基酸残基组成的小分子蛋白，由于其一级结构在进化上高度保守，抗原表位较少，用常规方法极难制备出特异性强的优质抗体(王娟,李晓军,潘继文,等.钙调素ELISA定量检测方法的建立与实验条件优化[J].医学研究生学报,2003,16(6):401-403)。

因此，本领域需要有效的木薯钙调蛋白单克隆抗体制备方法及其制备的抗体，用于快速检测CaM在木薯不同品种(系)、不同器官和不同时期的分布和含量变化。

发明内容

本发明人首次从木薯中克隆钙调蛋白基因，体外表达CaM蛋白，免疫小鼠制备其单克隆抗体，为快速检测CaM在木薯不同品种(系)、不同器官和不同时期的分布和含量变化提供优良抗体，也可为木薯采后生理腐烂调控机理的研究提供材料。因此，本发明提出一种钙调蛋白单克隆抗体的制备方法，获得的钙调蛋白单克隆抗体具有高效价和高稳定性。

因此，在第一方面，本发明提供了一种木薯钙调蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)用融合蛋白ACP-CaM与佐剂一起免疫小鼠；

2)用含融合蛋白ACP-CaM的溶液腹腔冲击所述小鼠；

3)取所述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；

4)筛选获得阳性杂交瘤细胞；

5)对所述阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％；

6)在所述阳性单克隆率为100％的阳性杂交瘤细胞中，排除其抗体与标签蛋白ACP有交叉反应的阳性杂交瘤细胞；

7)将步骤6)中获得的阳性杂交瘤细胞获得并纯化所述钙调蛋白单克隆抗体。

在一个实施方案中，步骤1)中的融合蛋白ACP-CaM的制备步骤包括：

a)将载体pET-16b的EcoR I酶切位点后插入SEQ ID NO.5，得到表达载体KJ-2；

b)用上游引物ACP-CaM-F(SEQ ID NO.1)：CTGggatccATGGCGGATCAGCTTACTGA；和下游引物ACP-CaM-R(SEQ ID NO.2)：CCGctcgagTCACTTCGCCATCATCACCT，以木薯块根cDNA为模板，采用PCR扩增目的片段；

c)将所述扩增的片段回收后与表达载体KJ-2分别用BamH I/Xho I双酶切、回收、连接，宿主细胞中扩增，取质粒进行测序鉴定，鉴定正确的质粒命名为KJ-2-CaM；

d)将所述质粒KJ-2-CaM转化到宿主菌中，用IPTG诱导表达，分离纯化蛋白；

e)用抗ACP标签单克隆抗体确认所述纯化蛋白的反应原性。

在一个实施方案中，所述融合蛋白ACP-CaM的编码序列是(SEQ ID NO.3)：

atggcgactcaattcagcgcttctgtctcattgcaaacttcttgtctggcaacaacaaggattagtttccaaaagccagctttgatttccaaccatggaaagactaatctatccttcaacctccgccgttcaatcccatctcgccgcctctctgtttcttgcgcggcaaaacaagagacgatagagaaagtgtctgctatagttaagaagcaactatcacttacaccggataaaaaagtcgttgcagaaaccaaatttgctgaccttggagcagattctctcgacacggttgagatagtaatgggtttagaggaagagtttaacatccaaatggccgaagagaaagcacagaagattgccacagttgagcaagctgctgaactcattgaagagctcatcaacgagaagaagagatctgggatccATGGCGGATCAGCTTACTGATGAC CAGATCTCCGAGTTCAAGGAAGCCTTCAGCTTGTTCGACAAAGATGGAGACGGTTGCATTACCACAAAGGAGCTTG GAACTGTGATGAGATCACTGGGACAGAACCCCACCGAGGCAGAGCTCCAGGACATGATTAATGAAGTTGATGCAGA TGGAAATGGAACTATTGACTTCCCTGAGTTTCTGAATCTTATGGCTAGGAAGATGAAAGACACTGACTCTGAGGAG GAGCTGAAAGAAGCCTTCAGAGTTTTTGACAAGGATCAGAATGGTTTTATTTCTGCTGCTGAATTGCGCCATGTGA TGACAAACCTTGGTGAGAAGCTTACTGATGAAGAAGTTGATGAAATGATAAGGGAGGCAGATGTAGATGGTGATGG CCAGATAAATTATGAGGAATTTGTGAAGGTGATGATGGCGAAGTGA(其中下划线的大写字母是CaM基因序列)。

在一个实施方案中，所述融合蛋白ACP-CaM的序列是(SEQ ID NO.4)：

MATQFSASVSLQTSCLATTRISFQKPALISNHGKTNLSFNLRRSIPSRRLSVSCAAKQETIEKVSAIVKKQLSLTPDKKVVAETKFADLGADSLDTVEIVMGLEEEFNIQMAEEKAQKIATVEQAAELIEELINEKKRSGIMAD QLTDDQISEFKEAFSLFDKDGDGCITTKELGTVMRSLGQNPTEAELQDMINEVDADGNGTIDFPEFLNLMARKMKD TDSEEELKEAFRVFDKDQNGFISAAELRHVMTNLGEKLTDEEVDEMIREADVDGDGQINYEEFVKVMMAK(其中下划线字母是CaM蛋白序列)。

在一个实施方案中，步骤1)中所述佐剂是QuickAntibody-mouse 5w。

在一个实施方案中，步骤1)中免疫小鼠的方式是：后腿肌肉注射免疫小鼠，第21天按同样方式再免疫1次。

在一个实施方案中，步骤1)中免疫多只小鼠，步骤2)中使用ELISA间接法检测血清效价，腹腔冲击免疫抗体效价高的小鼠。

在一个实施方案中，步骤3)中在生理盐水稀释的融合蛋白ACP-CaM腹腔冲击小鼠后72小时取所述小鼠的脾细胞。

在一个实施方案中，步骤3)中脾细胞与骨髓瘤细胞在PEG作用下融合。

在一个实施方案中，步骤4)中HAT筛选培养7-10d后用上述间接ELISA检测细胞上清。

在第二方面，本发明还提供了一种利用本发明第一方面的制备方法制备的单克隆抗体。

在第三方面，本发明还提供了融合蛋白ACP-CaM用于制备钙调蛋白单克隆抗体的用途。

在一个实施方案中，所述融合蛋白ACP-CaM的制备方法见本发明第一方面的优选实施方案中融合蛋白ACP-CaM的制备方法。

在一个实施方案中，所述融合蛋白ACP-CaM的编码序列是(SEQ ID NO.3)：

AtggcgactcaattcagcgcttctgtctcattgcaaacttcttgtctggcaacaacaaggattagtttccaaaagccagctttgatttccaaccatggaaagactaatctatccttcaacctccgccgttcaatcccatctcgccgcctctctgtttcttgcgcggcaaaacaagagacgatagagaaagtgtctgctatagttaagaagcaactatcacttacaccggataaaaaagtcgttgcagaaaccaaatttgctgaccttggagcagattctctcgacacggttgagatagtaatgggtttagaggaagagtttaacatccaaatggccgaagagaaagcacagaagattgccacagttgagcaagctgctgaactcattgaagagctcatcaacgagaagaagagatctgggatccATGGCGGATCAGCTTACTGATGAC CAGATCTCCGAGTTCAAGGAAGCCTTCAGCTTGTTCGACAAAGATGGAGACGGTTGCATTACCACAAAGGAGCTTG GAACTGTGATGAGATCACTGGGACAGAACCCCACCGAGGCAGAGCTCCAGGACATGATTAATGAAGTTGATGCAGA TGGAAATGGAACTATTGACTTCCCTGAGTTTCTGAATCTTATGGCTAGGAAGATGAAAGACACTGACTCTGAGGAG GAGCTGAAAGAAGCCTTCAGAGTTTTTGACAAGGATCAGAATGGTTTTATTTCTGCTGCTGAATTGCGCCATGTGA TGACAAACCTTGGTGAGAAGCTTACTGATGAAGAAGTTGATGAAATGATAAGGGAGGCAGATGTAGATGGTGATGG CCAGATAAATTATGAGGAATTTGTGAAGGTGATGATGGCGAAGTGA(其中下划线的大写字母是CaM基因序列)。

在一个实施方案中，所述融合蛋白ACP-CaM的序列是(SEQ ID NO.4)：MATQFSASVSLQTSCLATTRISFQKPALISNHGKTNLSFNLRRSIPSRRLSVSCAAKQETIEKVSAIVKKQLSLTPDKKVVAETKFADLGADSLDTVEIVMGLEEEFNIQMAEEKAQKIATVEQAAELIEELINEKKRSGIMADQLTDDQISEFKEAFSLFD KDGDGCITTKELGTVMRSLGQNPTEAELQDMINEVDADGNGTIDFPEFLNLMARKMKDTDSEEELKEAFRVFDKDQ NGFISAAELRHVMTNLGEKLTDEEVDEMIREADVDGDGQINYEEFVKVMMAK(其中下划线字母是CaM蛋白序列)。

本发明的有益效果是：

本发明方法用融合蛋白ACP-CaM免疫小鼠，取免疫小鼠脾脏和SP2/0细胞融合，经间接ELISA发检测和有限稀释法进行克隆，得到抗钙调蛋白抗体阳性细胞株，经体内诱生腹水法得到抗体，纯化获得高纯度的钙调蛋白单克隆抗体。本发明所提供的一种钙调蛋白单克隆抗体的制备方法，获得了高纯钙调蛋白单克隆抗体。通过本发明的方法制备的钙调蛋白单克隆抗体具有高效价、高稳定性和高特异性，为后期用于钙调蛋白的免疫检测奠定良好基础。

附图说明

通过以下附图对本发明进行说明。

图1.PCR扩增的CaM基因片段，图中第1列为PCR回收片段。

图2.SDS-PAGE检测CaM表达情况，图中第1列为上清液；第2列为表达上清液；第3列为包涵体。

图3.Western blot检测CaM表达情况，图中第1列为表达上清纯化产物；第2列为上清液。

图4.小鼠血清效价检测。

图5.Western Blot检测木薯块根中CaM的表达，图中第1-3列为木薯块根蛋白质；第4列为BSA。

具体实施方式

不希望拘囿于任何理论，本发明人认为，本发明的融合蛋白ACP-CaM改变了CaM的抗原性，使得融合蛋白中CaM更容易具有免疫原性，从而使得不容易产生抗体的CaM获得了容易产生抗体的性质。

实施例中使用的主要原料与试剂：限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA连接酶、Marker等均购自北京索莱宝公司；质粒、E-coli来自国家菌种保藏中心；PEG融合剂、小鼠抗体亚型鉴定试剂盒、酰基载体蛋白质(Acyl Carrier Protein,ACP)、淀粉磷酸化酶(Starchphosphorylase,SP)、组氨酸(Histidine,His)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)为Sigma公司产品；QuickAntibody-mouse 5w佐剂、clone easy培养基购自北京博奥龙免疫技术有限公司；HRP-羊抗鼠、DMEM不完全培养基、L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、胎牛血清、小牛血清、HAT、HT、DMSO购自GIBCO公司；Tween-20、TritonX-100、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氯化钾、甘油、丙酮、无水乙醇等化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司；ACP单克隆抗体为北京义翘神州生物技术有限公司产品；Babl/C小鼠购自汕头大学医学中心；SP2/0保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室；“华南5号”木薯保存于农业部国家木薯种质资源圃；淀粉磷酸化酶为本发明人原核表达；KJ-2为发明人在pET-16b(Nav-agene公司)的EcoR I酶切位点后插入ACP标签(SEQ ID NO.5：atggcgactcaattcagcgcttctgtctcattgcaaacttcttgtctggcaacaacaaggattagtttccaaaagccagctttgatttccaaccatggaaagactaatctatccttcaacctccgccgttcaatcccatctcgccgcctctctgtttcttgcgcggcaaaacaagagacgatagagaaagtgtctgctatagttaagaagcaactatcacttacaccggataaaaaagtcgttgcagaaaccaaatttgctgaccttggagcagattctctcgacacggttgagatagtaatgggtttagaggaagagtttaacatccaaatggccgaagagaaagcacagaagattgccacagttgagcaagctgctgaactcattgaagagctcatcaacgagaagaag)后改造得来。

1KJ-2-CaM重组质粒的构建

根据phytozome database

(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Mesculenta)cassava4.1_018409m数据库找到基因序列，设计扩增CaM序列的引物，预期扩增产物450bp；

上游引物ACP-CaM-F(SEQ ID NO.1)：

CTGggatccATGGCGGATCAGCTTACTGA；

下游引物ACP-CaM-R(SEQ ID NO.2)：

CCGctcgagTCACTTCGCCATCATCACCT，在上下游引物中分别引入酶切位点BamH I/Xho I，以“华南5号”木薯块根cDNA为模板，采用PCR扩增目的片段回收后与表达载体KJ-2分别用BamH I/Xho I双酶切、回收、连接，取少量连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，接种LB卡那霉素抗性固体培养基中并37℃培养过夜，挑取单克隆至卡那霉素LB液体培养基中37℃200r/min培养过夜，取质粒进行测序鉴定，鉴定正确的质粒命名为KJ-2-CaM。

PCR法从木薯块根基因中获得CaM基因片段，经10g/L琼脂糖凝胶电泳后450bp的目的条带清晰可见，结果如图1所示，大小与预期大小相同，提取的阳性克隆质粒测序鉴定结果也验证序列的准确性。

2融合蛋白原核表达、鉴定与纯化

将测序正确的质粒KJ-2-CaM转化到宿主菌E.coli BL21中，用1.0mmol/L IPTG诱导表达，收集菌体用超声波破菌仪裂解，离心分别收集上清和沉淀并进行分析。沉淀用8mol/L尿素变性增溶，Ni-NTA亲和柱分离纯化目的蛋白。纯化蛋白依次在浓度为6、4、2、1、0.25、0.1、0mol/L的尿素溶液中透析复性，每个浓度尿素溶液中透析12h，复性蛋白分装后-20℃冻存，备用。取50μL纯化蛋白加入等体积2×SDS凝胶上样缓冲液，100℃煮沸和冰浴分别处理各4min，室温10000r/min离心5min，取20μL进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色检测纯化效果。采用Western blot以1∶1000稀释的抗ACP标签单克隆抗体检测重组蛋白的反应原性。

Western blot分析

将KJ-2-CaM质粒转化至E.coli BL21感受态细胞内。1.0mmol/L IPTG诱导5h，表达蛋白经12％分离胶SDS-PAGE，如图2所示在诱导后的菌液样品在相对分子质量约为21ku处出现明显目的条带，未经诱导的菌液上清样品则无相应条带。说明目的蛋白在E.coli BL21中获得表达，目的蛋白以包涵体表达，主要存在于沉淀中。表达产物的Western blot结果如图3所示，印迹条带在约为21ku处，说明蛋白表达成功。

3CaM单克隆抗体的制备

将纯化后的融合蛋白ACP-CaM按每鼠50μg的剂量与QuickAntibody-mouse 5w佐剂等剂量混匀，后腿肌肉注射免疫5只小鼠，第21天按同样方式再免疫1次，第35天断尾采血，全血37℃放置2h后4℃放置12h，4℃10 000r/min离心15min，收集血清，以纯化后的融合蛋白ACP-CaM作为包被原，ELISA间接法检测血清效价。用免疫前的小鼠血清作为阴性对照，抗原包被2g/mL，5只小鼠血清分别梯度稀释，得到5只小鼠血清效价如图4所示，挑选效价高的2#小鼠进行细胞融合。取50μg纯化后的融合蛋白ACP-CaM用生理盐水定容到500μL，腹腔冲击免疫抗体效价高的小鼠，冲击免疫后72h左右摘眼球取全血分离血清保存，备用。将小鼠在酒精中浸泡10min，无菌条件下取出小鼠脾脏并分离脾细胞，与SP2/0细胞在PEG作用下融合，HAT筛选培养，培养7-10d用上述间接ELISA检测细胞上清，阳性细胞用有限稀释法克隆直至阳性单克隆率为100％，小鼠体内诱生腹水法制备抗体，将阳性杂交瘤细胞于液氮中长期保存。

4腹水纯化

将新采集的腹水4℃、10000r/min离心15min，去沉淀，用0.5mol/L、pH7.0的PBS 5倍稀释，在冰浴条件下等体积逐滴加入饱和硫酸铵溶液，冰浴搅拌30min后4℃静置12h，4℃、10000r/min离心15min，弃上清，沉淀用与腹水等体积的0.02mol/L pH7.2的PBS溶解，冰浴条件下再逐滴加入总PBS体积半量的饱和硫酸铵溶液使之达到33％饱和度，连续搅拌30min后4℃、10000r/min离心15min，弃上清，沉淀用0.02mol/L、pH7.2的PBS透析72h后分装，-20℃冻存。

5抗体鉴定

5.1抗体特异性检测：采用棋盘法测定抗体效价，即将纯化的融合蛋白ACP-CaM用pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释，按照250ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL的质量浓度梯度包被酶标板，每孔100μL，37℃包被2h，每孔120μL含小牛血清的PBST，37℃封闭1.5h，每孔加100μL梯度稀释的抗体，37℃反应30min，PBST洗涤4-5次，每孔加100μL酶标羊抗鼠二抗，37℃反应30min，PBST洗涤4-5次，TMB底物液37℃显色反应15min，0.5mol/LH₂SO₄终止反应后酶标仪检测每孔的吸光度(OD)值。选择阳性孔OD值大于阴性OD值的2.1倍的抗体最高稀释倍数为抗体的效价。然后分别在酶标板上包被1μg/mL ACP-CaM、ACP、SP、His、BSA，采用ELISA方法检测抗体的特异性。

5.2抗体亚型鉴定：用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒检测7株单抗的亚型。

5.3抗体纯化后效价、亚型测定和特异性测定

融合后的杂交瘤细胞经过2-4次的有限稀释克隆，得到7株阳性单克隆细胞(表1)，7株阳性单克隆细胞体外诱导法制备的腹水效价均达到10⁶及以上，抗体亚型均为IgG型。所有抗体均与SP、His、BSA无交叉反应，4D5株与载体ACP有交叉反应，说明4D5株细胞产生的抗体为标签蛋白特异性抗体，其余6株为CaM的特异性抗体。

表1 纯化后腹水效价和抗体亚型测定

6.单克隆抗体的应用：取“华南5号”鲜薯块根1g，液氮中研磨，用丙酮沉淀法提取块根蛋白，金属浴10min后13000r/min室温高速离心取上清，得木薯块根CaM蛋白初提液，CaM蛋白初提液SDS-PAGE后转移至NC膜，用5g/L脱脂奶粉的PBST室温封闭2h；加1∶2000稀释的抗CaM单克隆抗体室温轻摇作用1h；PBST洗涤3次；加入1∶3000稀释的AP标记羊抗鼠IgG室温反应1h，再PBST洗涤3次；BCIP/NBT底物显色。

丙酮沉淀法提取的“华南5号”鲜薯块根CaM蛋白，经Western Blot分析，结果如图5所示，木薯块根样本所在的1-3泳道在16.7ku处有明显印迹条带，而无关蛋白BSA泳道未出现明显条带，说明该抗体能和木薯中钙调蛋白特异性结合，具有良好的反应原性。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

<120> 制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体

<130> CP201604

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgggatcca tggcggatca gcttactga 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgctcgagt cacttcgcca tcatcacct 29

<210> 3

<211> 874

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcgactc aattcagcgc ttctgtctca ttgcaaactt cttgtctggc aacaacaagg 60

attagtttcc aaaagccagc tttgatttcc aaccatggaa agactaatct atccttcaac 120

ctccgccgtt caatcccatc tcgccgcctc tctgtttctt gcgcggcaaa acaagagacg 180

atagagaaag tgtctgctat agttaagaag caactatcac ttacaccgga taaaaaagtc 240

gttgcagaaa ccaaatttgc tgaccttgga gcagattctc tcgacacggt tgagatagta 300

atgggtttag aggaagagtt taacatccaa atggccgaag agaaagcaca gaagattgcc 360

acagttgagc aagctgctga actcattgaa gagctcatca acgagaagaa gagatctggg 420

atccatggcg gatcagctta ctgatgacca gatctccgag ttcaaggaag ccttcagctt 480

gttcgacaaa gatggagacg gttgcattac cacaaaggag cttggaactg tgatgagatc 540

actgggacag aaccccaccg aggcagagct ccaggacatg attaatgaag ttgatgcaga 600

tggaaatgga actattgact tccctgagtt tctgaatctt atggctagga agatgaaaga 660

cactgactct gaggaggagc tgaaagaagc cttcagagtt tttgacaagg atcagaatgg 720

ttttatttct gctgctgaat tgcgccatgt gatgacaaac cttggtgaga agcttactga 780

tgaagaagtt gatgaaatga taagggaggc agatgtagat ggtgatggcc agataaatta 840

tgaggaattt gtgaaggtga tgatggcgaa gtga 874

<210> 4

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ala Thr Gln Phe Ser Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Ser Cys Leu

1 5 10 15

Ala Thr Thr Arg Ile Ser Phe Gln Lys Pro Ala Leu Ile Ser Asn His

20 25 30

Gly Lys Thr Asn Leu Ser Phe Asn Leu Arg Arg Ser Ile Pro Ser Arg

35 40 45

Arg Leu Ser Val Ser Cys Ala Ala Lys Gln Glu Thr Ile Glu Lys Val

50 55 60

Ser Ala Ile Val Lys Lys Gln Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Lys Val

65 70 75 80

Val Ala Glu Thr Lys Phe Ala Asp Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr

85 90 95

Val Glu Ile Val Met Gly Leu Glu Glu Glu Phe Asn Ile Gln Met Ala

100 105 110

Glu Glu Lys Ala Gln Lys Ile Ala Thr Val Glu Gln Ala Ala Glu Leu

115 120 125

Ile Glu Glu Leu Ile Asn Glu Lys Lys Arg Ser Gly Ile Met Ala Asp

130 135 140

Gln Leu Thr Asp Asp Gln Ile Ser Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu

145 150 155 160

Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Cys Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr

165 170 175

Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp

180 185 190

Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile Asp Phe Pro

195 200 205

Glu Phe Leu Asn Leu Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu

210 215 220

Glu Glu Leu Lys Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gln Asn Gly

225 230 235 240

Phe Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu

245 250 255

Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Val

260 265 270

Asp Gly Asp Gly Gln Ile Asn Tyr Glu Glu Phe Val Lys Val Met Met

275 280 285

Ala Lys

290

<210> 5

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggcgactc aattcagcgc ttctgtctca ttgcaaactt cttgtctggc aacaacaagg 60

attagtttcc aaaagccagc tttgatttcc aaccatggaa agactaatct atccttcaac 120

ctccgccgtt caatcccatc tcgccgcctc tctgtttctt gcgcggcaaa acaagagacg 180

atagagaaag tgtctgctat agttaagaag caactatcac ttacaccgga taaaaaagtc 240

gttgcagaaa ccaaatttgc tgaccttgga gcagattctc tcgacacggt tgagatagta 300

atgggtttag aggaagagtt taacatccaa atggccgaag agaaagcaca gaagattgcc 360

acagttgagc aagctgctga actcattgaa gagctcatca acgagaagaa g 411

Claims (10)

1.一种制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)用融合蛋白ACP-CaM与佐剂一起免疫小鼠，所述融合蛋白ACP-CaM的序列是SEQ IDNO.4；

2)用含融合蛋白ACP-CaM的溶液腹腔冲击所述小鼠；

3)取所述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；

4)筛选获得阳性杂交瘤细胞；

5)对所述阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％；

6)在所述阳性单克隆率为100％的阳性杂交瘤细胞中，排除其抗体与标签蛋白ACP有交叉反应的阳性杂交瘤细胞；

7)将步骤6)中获得的阳性杂交瘤细胞获得并纯化所述钙调蛋白单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的所述融合蛋白ACP-CaM的制备方法包括：

a)将载体pET-16b的EcoR I酶切位点后插入SEQ ID NO.5，得到表达载体；

b)用上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2，以木薯块根cDNA为模板，采用PCR扩增目的片段；

c)将所述扩增的片段回收后与所述表达载体分别用BamH I/Xho I双酶切、回收、连接，宿主细胞中扩增，取质粒进行测序鉴定，鉴定质粒；

d)将所述质粒转化到宿主菌中，用IPTG诱导表达，分离纯化蛋白；

e)用抗ACP标签单克隆抗体确认所述纯化蛋白的反应原性。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤1)中所述佐剂是QuickAntibody-mouse 5w。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤1)中免疫小鼠的方式是：后腿肌肉注射免疫小鼠，第21天按同样方式再免疫1次。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)中免疫多只小鼠，步骤2)中使用ELISA间接法检测血清效价，腹腔冲击免疫抗体效价高的小鼠。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)中在生理盐水稀释的融合蛋白ACP-CaM腹腔冲击小鼠后72小时取所述小鼠的脾细胞。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)中脾细胞与骨髓瘤细胞在PEG作用下融合。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤4)中HAT筛选培养7-10d后用上述间接ELISA检测细胞上清。

9.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体利用权利要求1-8任一项的方法制备。

10.融合蛋白ACP-CaM用于制备钙调蛋白单克隆抗体的用途，所述融合蛋白ACP-CaM的序列是SEQ ID NO.4。