CN106084056A

CN106084056A - 一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN106084056A
Application number: CN201610401822.XA
Authority: CN
Inventors: 欧文军; 余厚美
Original assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Current assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Priority date: 2016-06-08
Filing date: 2016-06-08
Publication date: 2016-11-09

Abstract

本发明公开了一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)扩增淀粉磷酸化酶基因，并将其克隆到原核表达载体中，经E.coli表达纯化淀粉磷酸化酶；(2)用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，测定小鼠血清效价，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制备能产生淀粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)纯化淀粉磷酸化酶单克隆抗体并验证其特异性。通过本发明的方法制备的淀粉磷酸化酶单克隆抗体具有高效价、高稳定性和高特异性，可后期用于淀粉磷酸化酶的免疫学检测。

Description

一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

木薯是工业生产和动物饲料的重要原料，也是一种很有发展潜力的可再生资源作物。其块根淀粉含量及组成对加工利用意义重大。淀粉的合成与分解受一系列酶的催化调控，包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉去分支酶、淀粉磷酸化酶等。淀粉磷酸化酶在玉米胚乳的基质中发现是一种112Kd的蛋白质，可将直链淀粉或者支链淀粉非还原端α-1,4糖苷键磷酸化，产生葡萄糖-1磷酸，在变构酶的作用下生成葡萄糖-6磷酸进入糖酵解途径。根据近几年的研究显示，在淀粉合成的整个过程中都存在有淀粉的磷酸化，即有磷酸体以单酯化形式结合到淀粉上，而淀粉磷酸化酶在形成磷酸酯的过程中起着决定作用。在植物中，不同器官中的磷酸化程度不同。研究发现大多数磷酸体通过共价键结合在支链淀粉上而非直链淀粉上。目前有研究显示，在植物淀粉中磷酸化的淀粉链比未磷酸化的淀粉链要长。淀粉中磷酸酯含量的多少对淀粉理化品质具有较大的影响，比如磷酸化的淀粉能增加淀粉的水解，增强提高淀粉的糊化粘度，从而最终影响淀粉的工业或食品用途。如门福义等人研究的淀粉磷酸化酶在马铃薯淀粉合成运转中起重要的促进作用，其活性在淀粉形成的不同时期和不同温度下表现比较不同的调节作用。因此，需要研发出一种淀粉磷酸化酶抗体，用于淀粉磷酸化酶的免疫检测。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体的制备方法，解决了现有技术中还未有一种制备淀粉磷酸化酶单克隆抗体的方法。

本发明采用的技术手段如下：一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)扩增淀粉磷酸化酶基因，并将其克隆到原核表达载体中，经E.coli表达纯化淀粉磷酸化酶；(2)用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，测定小鼠血清效价，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制备能产生淀粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)获得纯化淀粉磷酸化酶单克隆抗体。

优选地，步骤(1)中，以5’－CGCGGATCCAAGTGCGTGTTGGATGAGACGA－3’和5’－CCGCTCGAGCTCCTCCCATTTAACATATTCA-3′为引物，引入酶切位点BamHI和XhoI，以木薯的cDNA基因片段为模板扩增出所需片段，连接到克隆载体。表达载体pET28a(+)用BamH I/Xho I双酶切后，与Pho目的基因的酶切产物于16℃连接12小时，将5μL连接产物转入感受态大肠杆菌中，接种于LB卡那霉素抗性固体培养基，在37℃的条件下培养过夜，挑取单克隆体至卡那霉素LB液体培养基中，37℃，200rpm/min的条件下培养过夜，获得pET28a(+)-SP基因重组质粒；将基因重组质粒pET28a(+)-淀粉磷酸化酶转化到大肠杆菌E.coli BL21中，经1.0mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导4-6h后，收集的菌在4℃用超声波破菌仪裂解菌体并高速离心收集上清和沉淀，后将细菌重悬于缓冲溶液中，超声波破碎细菌，离心洗涤，8mol/L尿素变性增溶，经Ni-NTA琼脂糖亲和柱分离制得纯化的淀粉磷酸化酶。优选地，缓冲溶液为0.5mol/L NaCl和20mmol/L Tris-HCl。

优选地，步骤(2)中，使用纯化后的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，在无菌条件下取出250μl小鼠快速免疫佐剂，与含抗原淀粉磷酸化酶蛋白250μg和250μl的生理盐水迅速混匀，通过小鼠后腿肌肉注射免疫小鼠，后断尾采血，全血4℃过夜，4℃10000r/min离心10min，收集血清并测定其效价，挑选效价为100000以上的小鼠按50ug/鼠的剂量腹腔加强免疫，72小时后取全血，在75％酒精中浸泡5min，分离脾细胞后和骨髓瘤细胞混合，在50％的PEG作用下离心融合，HAT筛选培养，有限稀释法克隆细胞直至出现阳性单克隆率为100％，获得杂交瘤细胞株。

优选地，步骤(3)中，将腹水滤掉沉淀和脂质，滤液用4倍体积的0.06MpH 4.0的醋酸缓冲液稀释，氢氧化钠调至pH为4.5，逐滴加入辛酸，室温搅拌30min后，以8000r/min离心30min，收集的上清液在冰浴条件下加入饱和硫酸铵，冰浴搅拌30min后，以6000r/min离心20min，沉淀用0.02M PBS透析72小时后获得纯化的抗淀粉磷酸化酶抗体。

另一方面，本发明还提供了一种抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体。

优选地，抗体效价为100000以上。

采用本发明所提供的一种抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体的制备方法，一方面，通过聚合酶链式反应扩增淀粉磷酸化酶基因，并将其克隆到原核表达载体(pET28a)中，经E.coli表达并纯化淀粉磷酸化酶；另一方面，用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，测定小鼠血清效价，取小鼠脾细胞与小鼠淀粉磷酸化酶2/0细胞融合，制备能产生抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株，后获得高纯度抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体。通过本发明的方法制备的抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体具有高效价、高稳定性和高特异性，为后期用于淀粉磷酸化酶的免疫检测奠定良好基础。

附图说明

图1为本发明的PCR扩增的Pho基因片段，1:PCR回收片段；2:Marker；

图2为本发明的pET28a(+)－淀粉磷酸化酶基因原核表达后菌液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1:上清；2:表达上清；3:包含体；4:Marker；

图3为本发明的重组pET28a(+)－淀粉磷酸化酶蛋白的Western blot图，1Marker；2:上清纯化产物。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例一：

一种抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1、聚合酶链式反应扩增淀粉磷酸化酶基因，并将其克隆到原核表达载体(pET28a)中，经E.coli表达纯化淀粉磷酸化酶(SP)，具体为：

pET28a(+)-淀粉磷酸化酶基因重组质粒的构建：设计淀粉磷酸化酶L序列引物为：5’-CGCGGATCCAAGTGCGTGTTGGATGAGACGA-3’和5’-CCGCTCGAGCTCCTCCCATTTAACATATTCA-3′，分别引入酶切位点BamHI和XhoI，以木薯的cDNA为模板扩增出所需片段，原核表达载体pET28a(+)分别用BamHI和XhoI双酶切将其线性化后，与淀粉磷酸化酶目的基因的酶切产物于16℃进行连接反应过夜。后将5μL连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，接种于LB卡那霉素抗性固体培养基，在37℃的条件下培养过夜，挑取单克隆至1.5mL卡那霉素LB液体培养基中，37℃，200rpm/min培养过夜，获得pET28a(+)-SPL基因重组质粒。构建的重组质粒pET28a(+)－淀粉磷酸化酶经BamHI/XhoI双酶切鉴定，得到342bp的目的条带，1％琼脂糖凝胶电泳结果如图1，(a：PCR回收片段；b：Marker)。

pET28a(+)－淀粉磷酸化酶基因原核表达：将构建好的基因重组质粒pET28a(+)-淀粉磷酸化酶转化到大肠杆菌E.coli BL21中，经1.0mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4-6h后，收集的细菌在4℃用超声波破菌仪裂解菌体并高速离心收集上清和沉淀并进行分析。加入等体积的十二烷基硫酸钠(SDS-PAGE)。在100℃下煮沸3min，冰浴4min，室温下离心1min(离心半径8cm,12000r/min)，取20μL离心液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，诱导后的菌液在相对分子质量约为61000处出现明显的目的条带，未经诱导的菌液无相应条带，结果如图2。

Western blot检测重组pET28a(+)－淀粉磷酸化酶蛋白，SDS-PAGE后转移硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶粉封闭；加抗His标签单克隆抗体(1:1000)作为第一抗体，室温轻摇作用2h；TBST(Tris-buffered saline with Tween-20)洗涤3次；加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1:2000)为第二抗体，室温反应2h，TBST(Tris-buffered saline with Tween-20)洗涤3次；增强化学发光法(enhanced chemiluminecence,ECL)显色，对表达产物-淀粉磷酸化酶蛋白进行Western blot分析，得到的特异性蛋白的相对分子质量约为61000，如图3。

淀粉磷酸化酶蛋白的纯化处理：重组质粒pET28a(+)－淀粉磷酸化酶阳性菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达，离心收集菌体，将细菌重悬于Buffer A(0.5mol/L NaCl,20mmol/LTris-HCl,pH8.0)中，4℃超声波破碎细菌，离心洗涤包涵体，8mol/L尿素变性增溶，经Ni-NTA琼脂糖亲和柱分离纯化目的蛋白。纯化蛋白经透析法复性，尿素浓度梯度依次为6.00、4.00、2.00、1.00、0.25、0.10及0.00mol/L，每个浓度透析时间为12h，表达的淀粉磷酸化酶作为制备抗体的免疫原，提高免疫原纯度，以获得特异性抗体。

2、用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，测定小鼠血清效价，取小鼠脾细胞与小鼠淀粉磷酸化酶2/0细胞融合，制备能产生淀粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株，具体为：

淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠：使用纯化后的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，按50ug/鼠的剂量免疫5只小鼠，在无菌条件下取出250μl小鼠快速免疫佐剂(QuickAntibody-mouse)与含抗原淀粉磷酸化酶蛋白250μg和250μl生理盐水迅速混匀，通过后腿小腿肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠注射100μl，第21天按同样方式加强免疫1针，第35天小鼠断尾采血，全血4℃过夜，在4℃、10000r/min离心10min，收集血清，通过间接ELISA法测血清效价，用采血前小鼠的血清作为阴性对照，得到5只小鼠血清效价，挑选效价为100000以上的小鼠取脾脏进行细胞融合，将5周小鼠快速免疫佐剂取代传统的弗氏佐剂，避免用弗氏佐剂乳化过程中对抗原结构的破坏。

杂交瘤细胞的制备：挑选效价为100000以上的小鼠按50ug/鼠的剂量腹腔加强免疫，72小时后摘眼球取全血，75％酒精中浸泡5min，无菌条件下取出小鼠脾脏，分离脾细胞后和骨髓瘤细胞混合，本制备方法采用2000r/min高速离心10min，离心后在50％PEG作用下融合，为保证高融合率得到特异性杂交瘤细胞的可能，融合过程用50％PEG，合理控制融合时间，并融合后采用轻柔一吸一打的方法，使融合的细胞较少可能形成2个以上的多个细胞核聚合体；HAT筛选培养，阳性细胞用有限稀释法克隆细胞直至出现阳性单克隆率为100％，由于细胞融合率较高，融合板检测时阳性率为100％，为防止检测到的抗体是未融合B细胞产生，采用将融合板细胞上清液全部吸走，换上新的培养液再检测的方法，以确定真实的阳性细胞并用有限稀释法进行克隆以得到阳性单克隆细胞。小鼠体内诱生腹水法制备抗体，将阳性杂交瘤细胞于液氮中长期保存。

3、纯化获得抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体

腹水的纯化：腹水用滤纸滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积的0.06MPH4.0的醋酸缓冲液稀释，氢氧化钠调PH至4.5，逐滴加入辛酸(终浓度为25μl/ml)，室温搅拌30min后，以8000r/min离心30min，收集的上清液在冰浴条件下等体积加入饱和硫酸铵，冰浴搅拌30min后，以6000r/min离心20min，沉淀用0.02M PBS透析72小时后分装获得淀粉磷酸化酶抗体。

对本实施例一获得的淀粉磷酸化酶抗体进行效价和亚型测定：

抗体检测效价的测定采用棋盘法，蛋白用0.05M PH 9.6的碳酸盐缓冲液梯度包被，100μl/孔包被，4℃过夜，封闭，加100μl/孔梯度稀释的抗体，37℃反应30min，洗涤液洗涤4-5次，加100μl/孔酶标羊抗鼠抗体，在37℃反应30min，洗涤液洗涤4-5次，TMB底物液37℃反应15min，0.5M H₂SO₄终止反应。选择阳性吸光度值大于阴性吸光度值的2.1倍时，抗原抗体的稀释倍数为抗原抗体的效价。抗体亚型用购买的分型试剂盒根据说明书进行检测。

融合后的细胞经过2-4次的克隆和间接ELISA方法筛选得到15株阳性单克隆细胞，15株阳性单克隆细胞分别体外诱导法制备腹水。纯化后15株抗体效价均达到10⁵及以上，纯化目的为减少腹水中杂质对检测过程中结果的干扰，浓缩抗体体积。抗体亚型鉴定结果显示其中2H5和2E9为IgM型，1C7和3D2为IgG2a型，1F9为IgG2b型，其余抗体均为IgG1型。

表1 纯化后抗体效价和亚型测定

抗体的特异性检测：

将淀粉磷酸化抗体分别加到事先包被好淀粉磷酸化酶、钙调蛋白、牛血清白蛋白的酶标孔中反应，显色结果表明淀粉磷酸化酶抗体只结合淀粉磷酸化酶抗原，不结合钙调蛋白、牛血清白蛋白，说明产生的抗体为淀粉磷酸化酶特异性抗体。

表2

抗体的稳定性测定：

将所有纯化后的IgG型的抗体置-20℃反复冻融5次、4℃保存30天，37℃作用7天，比较处理前后抗体效价的变化情况。

13株IgG型的抗体热稳定性效价检测结果见表2，大部分抗体在-20℃冻融5次和在4℃保存30天活性下降不明显，其中2A2和3D2活性下降相对较少，说明抗体活性稳定，优选作为生物检测试剂盒。

表2 抗体稳定性测定

对比例一:对比例一与实施例一的区别在于：采用弗氏佐剂、抗原淀粉磷酸化酶蛋白和生理盐水迅速混匀注射免疫小鼠，获得的小鼠血清效价低于10000。

对比例二:对比例二与实施例一的区别在于：采用1000r/min转速离心10min，离心后在100％PEG作用下融合，阳性单克隆杂交瘤量大大降低。

综上所述，采用本发明所提供的一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体的制备方法，一方面，通过聚合酶链式反应扩增淀粉磷酸化酶基因，并将其克隆到原核表达载体(pET28a)中，经E.coli表达纯化淀粉磷酸化酶；另一方面，用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，测定小鼠血清效价，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制备能产生淀粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株，后获得高纯淀粉磷酸化酶单克隆抗体。通过本发明的方法制备的淀粉磷酸化酶单克隆抗体具有高效价、稳定性和特异性，为后期用于淀粉磷酸化酶的免疫检测奠定良好基础。

进一步地，通过针对淀粉磷酸化酶抗原的纯化条件、细胞融合条件的优化、肝腹水抗体纯化参数的优化，有效提高了淀粉磷酸化酶单克隆抗体的效价、稳定性和特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims

1.一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)扩增淀粉磷酸化酶基因，并将其克隆到原核表达载体中，经E.coli表达纯化淀粉磷酸化酶；(2)用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，测定小鼠血清效价，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制备能产生抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)获得纯化淀粉磷酸化酶单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，以5’－CGCGGATCCAAGTGCGTGTTGGATGAGACGA－3’和5’－CCGCTCGAGCTCCTCCCATTTAACATATTCA-3′为引物，引入酶切位点BamHI和XhoI，以木薯的cDNA为模板扩增出所需片段，连接到克隆载体,表达载体pET28a(+)用BamH I/Xho I双酶切后，与淀粉磷酸化酶SP目的基因的酶切产物于16℃连接12小时，将5μL连接产物转入感受态大肠杆菌中，接种于LB卡那霉素抗性固体培养基，在37℃的条件下培养过夜，挑取单克隆体至卡那霉素LB液体培养基中，37℃，200rpm/min的条件下培养过夜，获得pET28a(+)-SP基因重组质粒；将基因重组质粒pET28a(+)-SP转化到大肠杆菌BL21中，经1.0mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导4-6h后，收集的菌在4℃用超声波破菌仪裂解菌体并高速离心收集上清和沉淀，后将细菌重悬于缓冲溶液中，超声波破碎细菌，离心洗涤，8mol/L尿素变性增溶，经Ni-NTA琼脂糖亲和柱分离制得纯化的淀粉磷酸化酶，缓冲溶液为0.5mol/L NaCl和20mmol/L Tris-HCl。

3.根据权利要求1所述的一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，使用纯化后的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，在无菌条件下取出250μl小鼠快速免疫佐剂，与含抗原淀粉磷酸化酶蛋白250μg的250μl的生理盐水迅速混匀，通过小鼠后腿肌肉注射免疫小鼠，后断尾采血，全血4℃过夜，4℃10000r/min离心10min，收集血清并测定其效价，挑选效价为100000以上的小鼠按50ug/鼠的剂量腹腔加强免疫，72小时后取全血，在75％酒精中浸泡5min，分离脾细胞后和骨髓瘤细胞混合，在50％的PEG作用下离心融合，HAT筛选培养，有限稀释法克隆细胞直至出现阳性单克隆率为100％，获得杂交瘤细胞株。

4.根据权利要求1所述的一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将腹水滤掉沉淀和脂质，滤液用4倍体积的0.06M pH 4.0的醋酸缓冲液稀释，氢氧化钠调至pH为4.5，逐滴加入辛酸，室温搅拌30min后，以8000r/min离心30min，收集的上清液在冰浴条件下加入饱和硫酸铵，冰浴搅拌30min后，以6000r/min离心20min，沉淀用0.02M PBS透析72小时后获得纯化的淀粉磷酸化酶单克隆抗体。

5.一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体，根据权利要求1-4任一项所述的方法制得。

6.根据权利要求5所述的一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体，其特征在于：所述抗体效价为100000以上。