CN101441222A - 检测β伴大豆球蛋白的方法及其专用抗体与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测β伴大豆球蛋白的方法及其专用单克隆抗体与试剂盒。该检测β伴大豆球蛋白的试剂盒，包括β伴大豆球蛋白单克隆抗体或多克隆抗体；所述单克隆抗体或多克隆抗体是以β伴大豆球蛋白半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述β伴大豆球蛋白半抗原为β伴大豆球蛋白分子α’亚基上的抗原表位肽。实验证明，本发明制备的β伴大豆球蛋白单克隆抗体的效价高、亲和性高、反应特异性强、无交叉反应、能和β伴大豆球蛋白发生强烈的结合反应；用本发明的单抗进行检测，检测范围广(0.002μg/ml～1.000μg/ml)，灵敏度高(0.002μg/ml)，变异系数小。本发明的杂交瘤细胞能够稳定的产生单克隆抗体。所以本发明检测方法及专用抗体适合于含豆类食品、动物饲料等中的β伴大豆球蛋白的检测。

Description

检测β伴大豆球蛋白的方法及其专用抗体与试剂盒

技术领域

本发明涉及检测β伴大豆球蛋白的方法及其专用抗体与试剂盒。

背景技术

大豆作为人和动物优质的植物蛋白和油脂来源，具有极高的营养价值，被广泛应用。大豆中的蛋白质约占大豆籽粒的40％，但是，其中含有胰蛋白酶抑制因子、凝集素、异黄酮、抗原蛋白等多种抗营养因子。其中大豆抗原蛋白是大豆中能引起人和畜禽过敏反应的一类蛋白质，主要包括：大豆疏水蛋白(免疫学命名为Gly ml)、大豆壳蛋白(Gly m2)、大豆抑制蛋白(Gly m3)、大豆球蛋白(glycinin)、β伴大豆球蛋白(β-conglycinin)等。

目前研究证实，大豆球蛋白和β伴大豆球蛋白是含量最丰富、免疫原性较强的大豆抗原蛋白，两者共占大豆籽实总蛋白的65-80％。β伴大豆球蛋白是大豆中的一种主要贮藏蛋白，分子量为140-180kDa，占大豆籽实总蛋白的10.0-12.7％和总球蛋白的30.0％。β伴大豆球蛋白含有很多的糖基(3.8％甘露糖和1.2％氨基葡萄糖)，且通过N-乙酰葡萄糖胺形式结合在肽链的天冬氨酸残基上，因此β伴大豆球蛋白是一类糖基化蛋白质(张雪梅和郭顺堂，2003)。其二级结构中α-螺旋、β-折叠和不规则结构分别占5％、35％和60％。β伴大豆球蛋白由α、α’和β三种亚基组成，三种亚基的分子量分别为58-77、58-83和42-53kDa；三个亚基都富含天冬氨酸/天门冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺、亮氨酸和精氨酸，热稳定性顺序为：β>α’>α，而抗原活性顺序为α’>α>β。β伴大豆球蛋白作为含量丰富、热稳定性强、具有较强免疫原性的大豆抗原蛋白，经常引起过敏反应，能引起婴幼儿、5-6％的儿童和2-4％的成年人腹泻，严重的伴有颤抖、咽喉水肿和急性哮喘等症状；在畜牧行业，大豆抗原蛋白可导致断乳仔猪和妊娠母猪、犊牛、大鼠等幼龄动物的过敏反应，常表现为腹泻、生长性能下降直至死亡。

目前已经开发了多种加工工艺来处理大豆、豆粕及豆制品，如多项研究证实豆粕、膨化大豆、发酵豆粕、大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白等大豆制品的抗原活性弱于生大豆。然而β伴大豆球蛋白是热稳定性的抗原蛋白，直接加热并不能彻底破坏其抗原活性。例如，经过加热处理的大豆制品中具有抗原活性的球蛋白残留量仍高达18％，这个量足以引起婴儿的过敏反应。所以，对不同加工工艺处理前后大豆、豆制品、豆粕饲料中β伴大豆球蛋白含量的检测具有重要的理论意义应用价值。

在以前的报道中，有使用SDS-PAGE方法检测β伴大豆球蛋白含量，该方法只能定性分析，结果不易重复；目前不少实验室使用多抗血清的间接ELISA方法分析大豆β伴大豆球蛋白的含量(Murphy和Resurreccion，1984)，该方法有不可避免的缺点：多抗血清需要重复制备、不同实验室之间不能参比、灵敏度和准确性低；而使用反相高效液相法(RP-HPLC)测得的大豆7S组分(主要是β伴大豆球蛋白)含量(Mujoo等，2003)，虽然灵敏度和准确性高，但是成本高昂。

大豆及豆制品大量应用于食品行业，玉米-豆粕型日粮作为主要的动物饲料广泛应用于畜禽生产。但是

多项研究证实现有的加工工艺不能完全去除大豆抗原蛋白的活性，目前没有一种简便快捷、灵敏特异、高效的β伴大豆球蛋白检测方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测β伴大豆球蛋白的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测β伴大豆球蛋白的酶联免疫试剂盒，包括β伴大豆球蛋白单克隆抗体或β伴大豆球蛋白多克隆抗体；所述单克隆抗体或多克隆抗体是以β伴大豆球蛋白半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述半抗原为β伴大豆球蛋白分子α’亚基上的抗原表位肽。

所述抗原表位肽的氨基酸序列具体可为PRPQHPERE。

所述β伴大豆球蛋白单克隆抗体具体可为由保藏号为CGMCC No.2792的抗β伴大豆球蛋白单克隆抗体细胞株3A9分泌产生的单克隆抗体。

所述试剂盒还可包括β伴大豆球蛋白半抗原。

由保藏号为CGMCC No.2792的抗β伴大豆球蛋白单克隆抗体细胞株3A9分泌产生的β伴大豆球蛋白单克隆抗体、及保藏号为CGMCC No.2792的抗β伴大豆球蛋白单克隆抗体细胞株3A9也均属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种检测β伴大豆球蛋白的方法。

本发明所提供的检测β伴大豆球蛋白的方法，包括用上述任一所述酶联免疫试剂盒对待检测样品进行检测的步骤。其中，所述方法还可包括对所述待检测样品进行如下前处理的步骤：将所述待检测样品溶于Tris-HCl中，搅拌，再以11000-13000g的速度离心，取上清用于检测；所述离心的速度优选为12000g。

将由保藏号为CGMCC No.2792的抗β伴大豆球蛋白单克隆抗体细胞株3A9分泌产生的β伴大豆球蛋白单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂、或以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱、或含有所述免疫亲和吸附剂、所述免疫亲和色谱柱的试剂盒也均属于本发明的保护范围。

上述免疫亲和吸附剂、免疫亲和色谱柱、试剂盒在分离纯化β伴大豆球蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供一种β伴大豆球蛋白的拮抗剂。

该β伴大豆球蛋白的拮抗剂，它的活性成分是由保藏号为CGMCC No.2792的抗β伴大豆球蛋白单克隆抗体细胞株3A9分泌产生的β伴大豆球蛋白单克隆抗体。

实验证明，本发明制备的β伴大豆球蛋白单克隆抗体的效价高、亲和性高、反应特异性强、无交叉反应、能和β伴大豆球蛋白发生强烈的结合反应；用本发明的单抗进行检测，检测范围广(0.002μg/ml～1.000μg/ml)，灵敏度高(0.002μg/ml)，变异系数小。本发明的杂交瘤细胞能够稳定的产生单克隆抗体。本发明以β伴大豆球蛋白单克隆抗体为基础，建立的双抗夹心法ELISA方法，测得的大豆β伴大豆球蛋白含量接近于RP-HPLC法测得的结果(1％误差范围内)，灵敏度和准确性显著高于抗血清法，本发明方法还具有成本很低、操作简便的有点。所以本发明检测方法及专用抗体适合于含豆类食品、动物饲料等中的β伴大豆球蛋白的检测。

附图说明

图1为SDS-PAGE分析纯化的β伴大豆球蛋白样品。

图2为单克隆抗体的效价曲线。

图3为单克隆抗体与大豆及其制品的免疫印迹分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从生物公司购买。

免疫纯单抗分型试剂盒I购自Pierce，产品目录号为Prod#37501；不完全培养液购自HyClone，产品目录号为SH30022.01B；HAT培养液购自Gibco，产品目录号为Cat.No.21060-017；HT培养液购自Gibco，产品目录号为Cat.No.11067-30。胰蛋白酶抑制因子购自sigma、产品目录号为232-906-9，凝集素购自Medicago、产品目录号为05-0117；大豆球蛋白按照专利(申请号200410029589.4)中所述方法制备。

实施例1、β伴大豆球蛋白单克隆抗体的制备及检测

一、β伴大豆球蛋白单克隆抗体的制备

(一)免疫原的制备

1、β伴大豆球蛋白的提取和纯化

采用分级盐析与凝胶过滤相结合的方法制备。具体流程如下：

大豆脱皮后磨浆，过滤后乙醚萃取脱脂，经旋转蒸发除去残留乙醚，制得脱脂大豆粉；在室温条件下，向脱脂大豆粉中加入0.03M的Tris-HCl(pH8.0，10mM2-ME)缓冲液(脱脂大豆粉与Tris-HCl的比例为1g脱脂大豆粉：20ml Tris-HCl)，溶解，10,000rpm/min离心30min，收集上清液；HCl调节pH至6.4，10,000rpm/min(4℃)离心30min，收集上清液；HCl调节pH至4.8，15,000rpm/min(4℃)离心30min后收集沉淀；0.03M的Tris-HCl(pH8.0，10mM2-ME)溶解沉淀，调节pH至6.2，15,000rpm/min(4℃)离心30min，取上清，上清即为β伴大豆球蛋白粗提液；调节pH至7.6，，加入固体(NH₄)₂SO₄，使(NH₄)₂SO₄饱和度达51％，4℃静置过夜，15,000rpm/min(4℃)离心30min后收集沉淀；溶解于pH7.6的磷酸盐缓冲液，加入固体(NH₄)₂SO₄，使(NH₄)₂SO₄饱和度达90％，4℃静置过夜，15,000rpm/min(4℃)离心30min，收集沉淀；将沉淀溶于pH7.6的磷酸盐缓冲液中。

琼脂糖凝胶Sepharose 6B经真空脱气后装柱(100cm×2.6cm)，充分平衡后上样进行凝胶过滤，用pH7.6的磷酸盐缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪280nm检测，分别收集洗脱液组分。将收集到的含有蛋白的洗脱液再经过DEAE-52层析柱(30cm×3.3cm)，收集蛋白洗脱液。将洗脱液于4℃对蒸馏水透析除盐，冷冻干燥。蛋白纯度鉴定和分子量测定采用SDS-PAGE电泳方法进行，添加SDS的分离凝胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。以低分子量标准蛋白为标准进行电泳，电泳条件为恒压100V。电泳结束后用考马斯亮兰染色液染色6h以上，脱色观察，结果如图1所示(条带1：提取的β伴大豆球蛋白粗样品，条带2：纯化的β伴大豆球蛋白样品)。利用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白的浓度，测定步骤按操作说明进行。

2、人工免疫原的制备

(1)半抗原的设计合成

选取β伴大豆球蛋白分子α’亚基上抗原活性最强的一段抗原表位肽(PRPQHPERE，77-85α’)用作半抗原。该九肽“PRPQHPERE”由北京奥科生物技术有限公司合成并鉴定。

(2)人工免疫原的制备

用于小鼠免疫生产抗体的人工免疫原由半抗原和载体蛋白偶联而成。偶联方法采用Burgeon等(1991)描述的两步戊二醛法。偶联步骤如下：

准确称取3.0mg OVA并溶于1mL0.1mol/L碳酸盐缓冲液(含0.9％(质量百分含量)NaCl、0.1％(质量百分含量)SDS，pH9.0)中。加20μL 25％戊二醛水溶液，于黑暗中室温孵育1h。将上述混合物经事先平衡好的Sephadex G25层析柱过滤以除去未结合的戊二醛。收集OVA峰，加入1.5mg半抗原(合成肽)，于黑暗中室温孵育16h。最后加甘氨酸(终浓度为1mol/L)，放置6h以终止反应。然后将上述溶液置于0.01mol/L PBS(pH7.4)中充分透析。偶联物浓度用BCATM蛋白检测试剂盒定量检测。每个标准品及样品的浓度均设三个重复，每个孔200μL，于37℃反应30min，在562nm波长下检测吸光值。根据标准品浓度与吸光值的关系绘制标准曲线，然后计算出样品浓度。偶联后的Peptide-OVA偶联物用作小鼠的免疫原。

3、包被抗原的制备

以BSA作为载体蛋白，应用EDC法(Burgeon等，1991)完成。偶联步骤如下：

准确称取5.0mg BSA，将其溶于1mL 0.01mol/L硼酸盐缓冲液(pH7.6)中。加10mg EDC。在室温下用0.1mol/L HCl调节pH值至4.5。10min后，加入1.5mg半抗原(合成肽)。将上述混合物置于4℃冷柜中，在磁力搅拌器轻缓搅拌下反应16h。反应结束后，将上述混合物置于0.01mol/L PBS(pH7.4)中充分透析以除去未偶联的合成肽。偶联物peptide-BSA浓度的测定步骤同peptide-OVA。制备的peptide-BSA偶联产物用作ELISA分析过程中的包被抗原。

(二)杂交瘤细胞系的建立

1、动物免疫

将免疫原peptide-OVA溶于0.5mL生理盐水中，加入等体积的完全佐剂后制成免疫原乳化剂，免疫6周龄雌性Balb/c小鼠。4周后行第二次免疫，再两周后行第三次免疫，均使用加入等体积的不完全佐剂后制成免疫原乳化剂。在第三次免疫后第10天间接ELISA测定小鼠血清中抗原表位肽“PRPQHPERE”抗体效价，效价高者进行下一步细胞融合。

2、细胞融合

无菌取材免疫过pept ide-OVA的Balb/c小鼠脾脏，制成脾细胞悬浮液。分别吸取含1×10⁸个脾细胞和2×10⁷个骨髓瘤细胞的悬浮液，移至50mL离心管中。加不完全培养液，使细胞液总体积为30mL。充分混匀后，于1000×g离心7min，将上清弃尽。轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散成均匀糊状。将离心管底部浸入37℃温水中，一只手均匀转动离心管，另一只手用1mL移液管将1mL 50％PEG溶液沿离心管壁移入转动的离心管。从移入到移完的时间控制在60s左右，然后立即将细胞悬浮液全部吸入吸管(时间控制在30s左右)，静置30s后，再将其吹入离心管内(时间也控制在30s左右)。在5min内加入25mL不完全培养液以稀释PEG，使PEG失去促融作用。于800g离心7min，弃去上清。加入10mL HAT培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀。将细胞悬浮液加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，每个孔0.1mL。然后将培养板置于37℃和5％ CO₂的培养箱内培养。

将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中，置于37℃和5％ CO₂的培养箱内培养。根据情况每2~3天更换培养液一次，换液时吸去1/2~2/3培养液，再加入等量新鲜培养液。所用的培养液应按培养的时间不同而有所不同：在融合后7天内用HAT培养液；第7~14天改用HT培养液；第14天以后则用普通的完全培养液。

3、间接免疫酶联吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞

在细胞融合后第7天，每次换液收集杂交瘤细胞培养液，然后采用间接ELISA方法对每个细胞培养孔的培养液进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。具体操作如下：

(1)包被：用包被缓冲液将包被抗原peptide-BSA稀释至最佳工作浓度(2.5μg/mL)，用移液枪准确移至酶标板，每个孔100μL，置湿盒中于37℃温育1h。

(2)封闭：弃去酶标板孔内的液体。每个孔加入封闭液150μL，置湿盒中于37℃温育1h后，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次90s(简称洗涤，下同)，然后拍干。

(3)加待测培养细胞上清样品：用抗体稀释液将培养细胞上清样品以适当起始浓度倍比稀释后加入酶标板，每个孔100μL，每个浓度梯度设3个重复。37℃温育1h后，洗涤，拍干。

(4)加酶标二抗：用抗体稀释液将酶标二抗(羊抗鼠IgG/HRP)稀释到工作浓度(1:5000)，加入酶标板，每个孔100μL，置于37℃温育1h后，洗涤，拍干。

(5)加底物溶液：向各酶标孔加新鲜配制的OPD底物使用液100μL，37℃温育15~30min。

(6)终止反应：每个孔加终止液50μL，终止底物显色反应。

(7)判定结果：用酶标仪于492nm波长下测定各个孔内溶液的吸光值(OD₄₉₂)，若待测孔OD₄₉₂大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即认为是阳性值，从而得出血清的效价。

其中，包被缓冲液的组成为：0.85mol/L、pH9.6的碳酸缓冲液；封闭液的组成为：用包被缓冲液配制成1％(质量百分含量)的明胶；洗涤缓冲液的组成为：含0.05％(质量百分含量)Tween-20的0.01mol/L PBS(pH 7.4)；抗体稀释液的组成为：含0.01％(质量百分含量)Tween-20、0.1％(质量百分含量)明胶的0.01mol/L PBS(pH 7.4)；0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)：pH 7.4，配方为8.00g NaCl，0.20g KCl，0.20g KH₂PO₄，1.15g Na₂HPO₄·12H₂O；加蒸馏水至1000mL。

结果，筛选得到分泌β伴大豆球蛋白单克隆抗体的阳性细胞株。

4、阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选的阳性细胞株进行克隆，具体步骤如下：于克隆前一天制备饲养细胞。将待克隆的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，转至24孔细胞培养板中，并进行细胞计数。根据计数结果，对细胞悬浮液做适当稀释。取250个活细胞悬浮于4.6mL(终体积)培养液中(此时平均每0.1mL溶液中含5个细胞)，接种96孔培养板，每个孔0.1mL，共36个孔。将4mL培养液加入到余下的1.0mL细胞溶液中(此时平均每0.1mL溶液中含1个细胞)，将此细胞液接种至其次的36孔，每个孔0.1mL。向剩余的1.4mL细胞悬浮液中补加培养液1.4mL(此时平均每0.1mL溶液中含0.5个细胞)。混匀后，将其接种于剩余的24孔，每个孔0.1mL。将培养板置于37℃和5％ CO₂孵箱中培养。

适时进行换液和检测。有多孔阳性时，应尽可能取单克隆孔进行再次克隆，直至所有细胞孔的培养液均为阳性。

最后获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株3A9，其分类命名为抗β伴大豆球蛋白单克隆抗体细胞株，该细胞株已于2008年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2792。

(三)体外培养法制备单抗

将已经建立的杂交瘤细胞CGMCC No.2792置于细胞培养基中，置于37℃和5％ CO₂孵箱中培养，每隔2天换一次细胞培养液，待细胞浓度大于10⁵mg/ml时停止换液，持续培养到细胞全部死亡。收集培养上清，1500rpm，离心10分钟，上清含有高水平的单克隆抗体，-20℃保存备用。

所述细胞培养基为向DMEM培养基中添加胎牛血清，使胎牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(体积百分含量)，所述细胞培养基的pH为7.4。

(四)体内诱生腹水法制备单抗

抗体的大量制备采用体内诱生法。将液体石蜡(0.5mL/只)注入健康的Balb/c雌性小鼠腹腔内，1~2周后备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹落，于1000×g离心5min后收集细胞，弃上清。用不完全培养液将细胞悬浮，混匀，将细胞浓度调整至10⁶个/mL。向已进行石蜡处理的小鼠腹腔内注射1mL/只的上述杂交瘤细胞。7~9天后收集腹水，于3000×g离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，置于-70℃冻存。

(五)单抗的纯化

步骤1：腹水的预处理(二氧化硅吸附法)

取小鼠腹水，用等体积的巴比妥缓冲液稀释。加二氧化硅粉末，室温下不时摇动30min。于2000×g离心20min，即得澄清的腹水。

步骤2：辛酸-硫酸铵沉淀法纯化IgG

向一份预处理过的腹水中加入2倍腹水体积的0.06mol/L乙酸缓冲液(pH5.0)。用0.1mol/L HCl调pH值至4.8。于室温下搅拌，并在30min内逐滴加入辛酸(每1mL稀释前的腹水加33μL辛酸)。在4℃静置2h后，于15000×g离心30min。弃沉淀，上清液经砂芯漏斗过滤。向溶液中加入1/10腹水体积的0.1mol/L PBS，用1mol/L NaOH调pH值至7.4。将腹水置于4℃冰浴中，在30min内加入0.277g/mL的(NH₄)₂SO₄，使其饱和度达45％。静置1h以上后，于10000×g离心30min。弃上清，将沉淀溶于适量的PBS(含137mmol/L NaCl、2.6mmol/LKCl和0.2mmol/L EDTA，pH 7.4)中。在4℃于PBS中透析过夜。于10000×g离心30min后，除去不溶性沉渣，澄清液即为初级纯的抗体。

步骤3：亲和层析纯化IgG

抗体的进一步纯化采用HiTrap Protein G HP亲和层析柱进行。具体操作如下：用10倍柱体积(约10mL)的结合缓冲液(20mmol/L磷酸盐，pH7.0)平衡层析柱。用直径为0.45μm的过滤器过滤样品以除去不溶物，然后与结合缓冲液按1:1(V/V)混合。然后用注射器进样，再用10倍柱体积(约10mL)的结合缓冲液冲洗，以除去未结合杂蛋白。之后用2~5倍柱体积的洗脱缓冲液(0.1mol/L甘氨酸-盐酸，pH2.7)洗脱样品。收集洗脱液(收集试管事先加有1mol/L pH 9.0的Tris-HCl中和液，其用量为100μL/mL收集液)。于5mmol/L PBS中充分透析，然后浓缩备用。

体外培养法制备的单抗不做纯化，直接做如下鉴定实验。

二、β伴大豆球蛋白单克隆抗体的鉴定

(一)单抗的特性鉴定

步骤1：抗体的类型及亚型

取阳性杂交瘤细胞CGMCC No.2792的培养液，于2000×g离心8min，以去除细胞及其碎片。用免疫纯单抗分型试剂盒I(ImmunoPure Monoclonal AntibodyIsotyping Kit I)测定抗体的类型、亚型和轻链的亚型。根据分型试剂盒分析，杂交瘤细胞系3A9产生的单抗属于含k轻链的IgG_2a。

步骤2：抗体的含量

收集阳性单克隆细胞的培养液，然后采用夹心ELISA法测定培养液中的抗体浓度(纯化兔抗鼠IgG包被酶标板，洗涤后加入兔抗鼠IgG-HRP)。以小鼠IgG的不同浓度为横坐标，以对应的OD₄₉₂值为纵坐标，绘制标准曲线。根据检测杂交瘤细胞培养液的OD₄₉₂值，计算出抗体的准确浓度。

步骤3：抗体的效价

用包被抗原包被酶标板，包被抗原(peptide-BSA)的浓度为5.0μg/mL；单抗的起始浓度为1.0mg/mL，将腹水进行倍比稀释后，用间接ELISA方法测定抗体的效价，以SP2/0诱生的小鼠腹水为阴性对照。图2是抗体的效价曲线图(图中每一个点代表在ELISA分析中8个重复测定的平均值)，与OD₄₉₂值为1.0相对应的抗体效价为1.18×10⁵。

步骤4：单抗稳定性的检测

复苏杂交瘤细胞，进行传代培养，收集不同传代次数的细胞上清，并用间接ELISA方法检测其效价。结果表明该单抗细胞株能够稳定的产生单克隆抗体。

步骤5：抗体亲和力的测定(非竞争性ELISA)

抗体的亲和常数采用非竞争性ELISA法，操作程序除了加入系列稀释的已知浓度的待测杂交瘤细胞培养液外，其它同间接免疫酶联吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞的实验步骤。

以待测样品的不同浓度为横坐标，以其相应的OD₄₉₂值为纵坐标，绘制三条测定曲线。以各曲线上部趋于平坦的OD₄₉₂值为100％，计算OD₄₉₂值为50％时抗体的浓度[Ab]t，这样每份待测样品可得[Ab]t、[Ab]′t、[Ab]″t三个值，然后根据文献(徐志凯主编.1991.实用单克隆抗体技术.西安：陕西科学技术出版社.pp7-145)中描述的方法计算，单抗3A9的亲和常数(K_a)为3.2×10¹⁰L/mol。

步骤6：单抗的反应特异性

(1)抗体与类似物交叉反应

用竞争性ELISA测定β伴大豆球蛋白与其结构或功能类似物之间的交叉反应。将Mabs进行浓度稀释后，以等体积分别与系列倍比稀释的类似物混匀后，室温反应15min。然后加至已包被处理的酶标板中。用于ELISA分析的包被抗原浓度为50.0μg/mL，抗体浓度为25ng/mL。其余步骤同间接免疫酶联吸附实验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞的实验步骤。根据OD₄₉₂值绘制标准曲线，计算各类似物的抑制率，结果见表1。

表1、抗体与β伴大豆球蛋白及其结构类似物或相关物质的交叉反应

 

竞争物	IC50，平均值±标准差，ng/mL(交叉反应，％)
		β伴大豆球蛋白	3.1±0.4(100.0)
大豆球蛋白	<0.01
		胰蛋白酶抑制因子	<0.01
凝集素	<0.01

(2)用Western Blot免疫印迹实验检测单抗与β伴大豆球蛋白结合反应

将大豆粗提蛋白和纯化的β伴大豆球蛋白进行10％SDS-PAGE电泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉在4℃封闭过夜，加入制备的单抗。室温反应1h，洗涤三次。随后加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，室温反应1h，洗涤三次。最后加入NBT/BCIP底物显色。洗涤均用TBST，每次10min。结果如图3所示，本发明单抗与β伴大豆球蛋白中抗原性最强的α’亚基有很强的特异性反应。(图3中，第一泳道为标准蛋白分子marker；第二泳道为大豆裂解液；第三泳道为β伴大豆球蛋白。)

ELISA和Western Blot的结果都证明：3A9单抗细胞株产生的单抗能和β伴大豆球蛋白发生强烈的结合反应，因此可以应用于的免疫学检测和蛋白定量，以及其他的相关应用研究。

实施例2、β伴大豆球蛋白多克隆抗体的制备及检测

步骤1：多抗的制备

取实施例1制备的抗原蛋白用生理盐水配成5mg/mL，与等量弗氏佐剂混合，利用旋涡混合器使其乳化完全。选取健康雌性新西兰大白兔，首次免疫为足内侧上皮，注射完全佐剂乳化抗原，选两个位点，每点0.5mL；首免后14d加强免疫，背部随机选取4点，消毒后皮下注射不完全佐剂乳化抗原，0.5mL/点；以后每隔10d加强免疫一次，连续三次加强免疫。最后一次加强免疫后10d，在耳上选择清晰的静脉血管，注射肾上腺素0.1mL/只，过0.5h后，再往静脉直接注射提纯的抗原。待效价达到要求后，对兔子进行前腔静脉采血，分离血清，-20℃保存备用。

步骤2：多抗的纯化

同实施例1中一(五)中步骤1。

步骤3：多抗的鉴定

多抗的效价用间接ELISA检测，多抗的反应特异性用竞争性ELISA和WesternBlot免疫印迹实验鉴定，方法同实施例1所述一致。

实施例3、用β伴大豆球蛋白单克隆抗体检测样品中β伴大豆球蛋白

本发明的单克隆抗体可用来检测大豆、大豆蛋白提取物、豆制品、豆奶粉、豆粕饲料中的β伴大豆球蛋白。

基于以上制备纯化的β伴大豆球蛋白样品、单抗、多抗，建立β伴大豆球蛋白双抗夹心ELISA的定量检测方法。以实施例2中制备纯化的β伴大豆球蛋白多抗包被ELISA酶标板，顺序加入待检样品，实施例1制备纯化的单抗，羊抗鼠IgG/HRP酶标二抗，OPD底物液，终止液，然后用酶标仪检测各个孔内溶液的吸光值(OD492)。以实施例1制备纯化的β伴大豆球蛋白为标准品，倍比稀释加样，根据吸光值读数建立标准曲线。样品孔吸光值比对标准曲线得出精确β伴大豆球蛋白含量。具体操作如下：

(1)大豆样品的处理：将大豆样品溶于0.03mol/L Tris-HCl(含0.01mol/L的β-巯基乙醇，pH8.0)中，并磁力搅拌2h，用超速离心机在4℃于12000g离心30min，取上清用于检测；此步骤的目的是使大豆蛋白以游离的形式释放出来，以便于用免疫学方法定量检测其中β伴大豆球蛋白的实际含量。

(2)包被多抗：纯化后的多抗用0.05mol/LNaHCO₃pH9.6配成2μg/ml，包被于96孔酶标板中，4℃过夜(200μL/孔)包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体。

(3)封闭：弃去酶标板孔内的液体。洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用1％牛血清白蛋白封闭，每个孔加入封闭液150μL。置湿盒中于37℃温育1h后，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次90s(简称洗涤，下同)，然后拍干。

(4)加待测样品：用包被缓冲液将标准品稀释成0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0μg/mL八个工作浓度。按酶标板纵顺序将每一种浓度的标准品加入到酶标板孔中，然后加入每个待测样品(每个样品设10个浓度梯度，每个浓度设3个重复)。每个孔100μL，每个浓度梯度或者样品至少设3个重复，同时设空白对照。置湿盒中于37℃烘箱孵育1h后，弃去孔内的液体，洗涤，拍干。

(5)加一抗(单抗)：用抗体稀释液将单抗稀释至最佳工作浓度(2.5μg/mL)，用移液枪准确移至酶标板，每个孔100μL，置湿盒中于37℃温育1h。弃去孔内的液体，洗涤，拍干。

(6)加酶标二抗：用抗体稀释液将酶标二抗(羊抗鼠IgG/HRP)稀释到工作浓度(1:5000)，加入酶标板，每个孔100μL，置于37℃温育1h后，弃去孔内的液体，洗涤，拍干。

(7)加底物溶液：向各酶标孔加新鲜配制OPD底物使用液100μL，37℃温育15~30min。

(8)终止反应：每个孔加终止液50μL，终止底物显色反应。

(9)判定结果：用酶标仪于492nm波长下测定孔内溶液的吸光值(OD₄₉₂)，以标准品不同稀释度所对应的吸光值(OD₄₉₂)做图，得出拟合曲线方程。然后把待测样品孔的吸光值(OD₄₉₂)带入方程，可准确得出β伴大豆球蛋白的浓度。

经检测，本研究开发出的β伴大豆球蛋白的双抗夹心ELISA检测方法，其检测范围广(0.002μg/ml～1.000μg/ml)，灵敏度高(0.002μg/ml)，变异系数小(板内变异系数为1.1％，板间变异系数为2.5％，批内变异系数为3.1％，批间变异系数为4.8％)，检测样品不同梯度的线性评估结果良好(R²＝0.991)。

实施例4、样品添加回收率

实验方法：

以大豆、浸提豆粕、膨化豆粕、发酵豆粕、大豆浓缩蛋白为实验对象。

分析前，将大豆、浸提豆粕、膨化豆粕以及发酵豆粕用样品粉碎机(1093型美国)进行粉碎，粒度为60目。用正己烷分别对粉碎后的物质进行脱脂，然后干燥。

在添加前，用实施例3中所述方法分别检测粉碎后的大豆、浸提豆粕、膨化豆粕以及发酵豆粕中的β伴大豆球蛋白含量。

将纯化的β伴大豆球蛋白以80、120和160μg/g添加到大豆粉中，以10、20和40μg/g添加到浸提豆粕中，以10、20和40μg/g添加到膨化豆粕中，以5、10和20μg/g添加到发酵豆粕中，以1、5和10μg/g添加到大豆浓缩蛋白中。然后用0.03mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，含0.01mol/Lβ-巯基乙醇)对上述大豆及其制品粉末(100g/L缓冲液)进行蛋白提取1h。提取物用超速离心机在4℃于12000×g离心30min，取上清液，上清液通过0.45μm Millex GP针式过滤器(Millipore，Cork，爱尔兰)过滤，滤液作为检测阳平用于检测或于-20℃保存备用检测。

β伴大豆球蛋白含量的测定：测定前，将每个检测样品溶液稀释，用2mol/LHCl调pH值至7.4。然后用实施例3中所述方法测定样品中β伴大豆球蛋白的含量。根据添加前后样品中β伴大豆球蛋白的含量结果，计算回收率和相对标准差。

以回收率试验检验双抗夹心ELISA的精确性和准确性，数据见表2。结果表明，β伴大豆球蛋白添加到上述样品中的回收率在95.8~102.5％，相对标准偏差(RSD)在5％范围内。这一结果表明，用β伴大豆球蛋白的双抗夹心ELISA检测方法检测大豆及其制品中的β伴大豆球蛋白能够获得良好的精确度和可重复性。

表2.β伴大豆球蛋白添加到大豆及大豆制品中的回收率测定

Claims (10)

1、一种检测β伴大豆球蛋白的酶联免疫试剂盒，包括β伴大豆球蛋白单克隆抗体或β伴大豆球蛋白多克隆抗体；所述单克隆抗体或多克隆抗体是以β伴大豆球蛋白半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述半抗原为β伴大豆球蛋白分子α’亚基上的抗原表位肽。

2、根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述抗原表位肽的氨基酸序列为PRPQHPERE。

3、根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述β伴大豆球蛋白单克隆抗体为由保藏号为CGMCC No.2792的抗β伴大豆球蛋白单克隆抗体细胞株3A9分泌产生的单克隆抗体。

4、由保藏号为CGMCC No.2792的抗β伴大豆球蛋白单克隆抗体细胞株3A9分泌产生的β伴大豆球蛋白单克隆抗体。

5、保藏号为CGMCC No.2792的抗β伴大豆球蛋白单克隆抗体细胞株3A9。

6、一种检测β伴大豆球蛋白的方法，包括用权利要求1-3中任一所述酶联免疫试剂盒对待检测样品进行检测的步骤。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法包括对所述待检测样品进行如下前处理的步骤：将所述待检测样品溶于Tris-HCl中，搅拌，再以11000-13000g的速度离心，取上清用于检测；所述离心的速度优选为12000g。

8、将权利要求4所述的β伴大豆球蛋白单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂或以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱或含有所述免疫亲和吸附剂、所述免疫亲和色谱柱的试剂盒。

9、权利要求8所述的免疫亲和吸附剂、所述免疫亲和色谱柱、所述试剂盒在分离纯化β伴大豆球蛋白中的应用。

10、β伴大豆球蛋白的拮抗剂，它的活性成分是权利要求4所述的β伴大豆球蛋白单克隆抗体。

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