CN105203760A - Psmd4蛋白的elisa检测试剂盒及其检测方法与应用 - Google Patents

Psmd4蛋白的elisa检测试剂盒及其检测方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫学和生物技术领域，具体涉及一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒及其检测方法与在肝癌血清学诊断中的应用。本发明人经过广泛而深入的研究，采用酶联免疫吸附法检测PSMD4蛋白在肝癌病人血清中的表达水平，并首次证实在肝癌病人的血清中存在PSMD4蛋白。本发明的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，包括：包被有PSMD4抗体的ELISA酶标板、检测PSMD4抗原的抗体、酶标二抗、标准蛋白等。本发明还提供了上述ELISA试剂盒的检测方法和应用。本发明操作简单方便，可准确、高灵敏度地检测到肝癌病人血清中的PSMD4蛋白的含量，为临床检验和基础研究提供了一种新的手段和方法。

Description

PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒及其检测方法与应用
技术领域
本发明属于免疫学和生物技术领域，具体涉及一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒及其检测方法与在肝癌血清学诊断中的应用。
背景技术
原发性肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一，每年新发病例约占全球50％。由于肝癌出现症状时多属中晚期，切除后复发、转移率高。因此，肝癌的早期诊断对延长患者的生存时间和降低肝癌死亡率具有重要意义。
目前肝癌的诊断主要依靠实验室检查、影像学检查以及肝穿刺组织学检查。影像学诊断在肝癌诊断中起重要作用，但在诊断小于2公分的小肝癌及区分良恶性结节方面具有一定的局限性。有创的组织病理学检查是诊断肝癌的金标准，但细针穿刺因取材有限而有较高的假阴性率，并且有使肿瘤扩散和针道种植的风险。临床上，血清甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是目前唯一广泛应用的HCC标志物。但是近年研究报道，以AFP诊断HCC的阳性率仅为60％-70％，在小肝癌中敏感性更低，容易造成漏诊；其次在一些良性肝病、生殖性畸胎瘤等患者中也可有升高，容易造成误诊。因此，临床仍需要高度敏感的血清肝癌特异标志物来鉴别肝脏良恶性病变，或在高危人群进行随访提高肝癌的早期诊断率。
HCC血清标志物的研究一直是科学家们研究的重点，但大多数研究成果难以满足实际应用的需要。探索高敏感性及特异性的血清学指标尤为重要。
本发明中的研究对象—PSMD4蛋白，是一个蛋白酶体26S非ATP酶亚基4(GeneID:5710)。该分子含有两段15个氨基酸的泛素相互作用模序(ubiquitininteractingmotif,UIM)，能够选择性结合泛素化蛋白，介导蛋白质降解。已有研究报道，PSMD4异常表达与炎症性肠病、溃疡性结肠炎等疾病相关，PSMD4在肝癌中的表达及生物学功能尚不十分清楚。有研究显示，PSMD4可能与细胞分化和机体发育有关(参见文献：Smalle,J,etal.Thepleiotropicroleofthe26SproteasomesubunitRPN10inArabidopsisgrowthanddevelopmentsupportsasubstrate-specificfunctioninabscisicacidsignaling.PlantCell,2003.15(4):p.965-80.；Szlanka,T,etal.DeletionofproteasomalsubunitS5a/Rpn10/p54causeslethality,multiplemitoticdefectsandoverexpressionofproteasomalgenesinDrosophilamelanogaster.JCellSci,2003.116(Pt6):p.1023-33.；Hamazaki,J.,etal.,Rpn10-mediateddegradationofubiquitinatedproteinsisessentialformousedevelopment.MolCellBiol,2007.27(19):p.6629-38)。我们发现PSMD4是一个重要的肝癌癌蛋白，并且可以释放入血。本申请人已就PSMD4作为肝癌预后诊断标志物的新用途申请了中国专利CN201310005491.4，发明名称为“PSMD4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用”，公开号为CN103091493A。
目前尚无文献报道在肝癌血清样品中准确检测到PSMD4蛋白；也尚无针对肝癌血清样品中的PSMD4蛋白含量提供一种准确、简便、灵敏度高的检测手段；也尚无文献报道PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒以及该类试剂盒在肝癌血清学诊断中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒；本发明的另一目的是提供利用上述试剂盒的检测方法；本发明的第三目的是提供上述试剂盒在肝癌血清学诊断中的应用。
本发明旨在为临床和实验室肝癌血清样品中PSMD4蛋白含量提供准确、简便、灵敏度高、并可被广泛使用的检测手段。
本发明人经过广泛而深入的研究，采用酶联免疫吸附法检测PSMD4蛋白在肝癌病人血清中的表达水平，并首次证实在肝癌病人的血清中存在PSMD4蛋白。
本发明第一方面，提供了一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，所述的ELISA检测试剂盒包括：
(1)包被有PSMD4抗体的ELISA酶标板，所述的包被抗体为兔抗人PSMD4的多克隆抗体；较优的，兔抗人PSMD4的多克隆抗体购自PTG公司；最优的，抗体工作浓度为2μg/ml。
(2)检测PSMD4抗原的抗体，为小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体；较优的，小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体购自PTG公司；最优的，检测抗体的工作浓度为0.5μg/ml。
(3)酶标二抗，HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗小鼠IgG；较优的，HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自PTG公司；最佳的，稀释浓度为1:5000。
(4)标准蛋白，为重组人PSMD4融合蛋白；较优的，重组人PSMD4融合蛋白购自PTG公司。
(5)所述的试剂盒，还包括有：常规的样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液；
所述的试剂盒，ELISA酶标板为市售的ELISA酶标板，优选德国greiner公司的ELISA酶标板(96孔单条可拆酶标板#650180)；
包被缓冲液，选用1×PBS，pH:7.4；
封闭液，选用含3％牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液；
ELISA酶标板洗涤液，较优的为含0.05％Tween-20的1×PBS溶液；
样品稀释液：样品为血清时，较优的为1×PBS，pH:7.4；
抗体稀释液，选用1×PBS；
显色液，选用sigam公司的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)；
终止液，较优的为2mol/L的硫酸溶液。
本发明所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，所用的试剂、条件进一步优化：
(1)包被抗体的优化：本发明的试剂盒，分别选用不同的抗体包被：兔抗人PSMD4的多克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-1)、兔抗人PSMD4的多克隆抗体(PTG公司，#14899-1-AP)，鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2)、鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(PTG公司，#66179-1-Ig)，检测浓度选用7.5μg/ml，5μg/ml，2.0μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml。结果发现选用兔抗人PSMD4的多克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-1)、鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)作为包被抗体均存在明显的非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性；但是使用兔抗人PSMD4的多克隆抗体(PTG公司，#14899-1-AP)则没有明显的非特异性反应，标准品的浓度和吸光度具有较好的相关性。经过反复优化，抗体工作浓度2μg/ml为最佳，标准品的浓度和吸光度数值的相关性最好。
(2)检测抗体的优化：本发明的试剂盒，分别选用不同的抗体作为检测抗体：当包被抗体为兔抗人PSMD4的两种多克隆抗体(Abnova公司；#H00005710-AP11-1；PTG公司，#14899-1-AP)时选用鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)分别作为检测抗体；当包被抗体为鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)时选用兔抗人PSMD4的两种多克隆抗体(Abnova；#H00005710-AP11-1；PTG公司，#14899-1-AP)。检测浓度选用2.0μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.1μg/ml。结果发现包被抗体兔抗人PSMD4的多克隆抗体(Abnova公司；#H00005710-AP11-1)与鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)配伍时呈现明显的非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性；兔抗人PSMD4的多克隆抗体(PTG公司，#14899-1-AP)与鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2)配伍时同样存在明显非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性；分别将两种包被抗体鼠抗人PSMD4的单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)与兔抗人PSMD4的两种多克隆抗体(Abnova；#H00005710-AP11-1；PTG公司，#14899-1-AP)配伍，结果也存在明显非特异反应，标准品的浓度和吸光度数值没有相关性。通过多次排列组合验证发现，仅在选用兔抗人PSMD4的多克隆抗体(PTG公司，#14899-1-AP)与小鼠抗人PSMD4单抗(PTG公司，#66179-1-Ig)配伍时，标准品的浓度和吸光度具有较好的相关性。后续经过反复优化，当检测抗体的工作浓度为0.5μg/ml时，标准品的浓度和吸光度数值的相关性最好。
(3)封闭液的优化：分别选用不同的封闭液，含1％牛血清白蛋白+PBS溶液，含2％牛血清白蛋白+PBS溶液，含3％牛血清白蛋白+PBS溶液，含4％牛血清白蛋白+PBS溶液，含5％牛血清白蛋白+PBS溶液，封闭时间选择室温1小时，室温2小时，4℃过夜。结果发现最佳封闭液和封闭时间为含3％牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液和室温封闭2小时为最佳组合。
(4)酶标二抗的优化：根据检测抗体的不同选用不同种属的酶标二抗，检测抗体为小鼠抗人PSMD4单抗(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)时选用山羊抗小鼠HRP标记的IgG抗体(Jackson公司#715-005-150)和山羊抗小鼠HRP标记的IgG抗体(PTG公司#SA00001-1)；检测抗体为兔抗人PSMD4多抗(Abnova；#H00005710-AP11-1；PTG公司，#14899-1-AP)时选用山羊抗兔HRP标记的IgG抗体(PTG公司#SA00001-15)。抗体稀释倍数选择1:1000，1:2000，1:3000，1:5000，1:10000。在组合验证中山羊抗小鼠HRP标记的IgG抗体(Jackson公司#715-005-150)和山羊抗兔HRP标记的IgG抗体(PTG公司#SA00001-15)的两组结果均未显示较好的相关性，存在非特异反应。在所以验证组合中小鼠抗人PSMD4单抗(PTG公司，#66179-1-Ig)作为检测抗体与酶标二抗为山羊抗小鼠HRP标记的IgG抗体配伍的结果显示较好的相关性(PTG公司#SA00001-1)，1:5000的稀释浓度为最佳。
(5)样品稀释液的优化：分别选用不同的样品稀释液，血清样本检测时样品稀释液选用1×PBS(pH:7.4)或含0.1％BSA，0.5％Tween-20的1×PBS溶液。结果发现最佳血清样本稀释液为1×PBS(pH:7.4)优于含0.1％BSA，0.5％Tween-20的1×TBS溶液。
本发明第二方面，提供了利用上述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒的检测方法。
所述的检测方法包括以下步骤：
制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将兔抗人PSMD4的多克隆抗体稀释成2.0ug/ml；
样本用样品稀释液以1:1稀释，加样至ELISA酶标板孔中，室温孵育1--2小时；
重组人PSMD4融合蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，加样至ELISA酶标板孔中，室温孵育1--2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次，甩干；
将检测PSMD4抗原的抗体稀释成0.5μg/ml，加至ELISA酶标板孔中，室温孵育1--2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次，甩干；
加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1--2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤6-8次，甩干；
加入显色液，室温避光孵育10-20分钟，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm测定OD值。
在本发明的一个优选实施例中，所述的检测方法具体为：
检测前，首先制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将抗体(兔抗人PSMD4的多克隆抗体)稀释成2.0ug/ml，在ELISA酶标板的每孔中加入100μl，封板后置于4℃孵育过夜，备用。
本发明的检测方法包括以下步骤：血清样本用样品稀释液以1:1稀释，以100μl/孔的体积加样，室温孵育2小时；PSMD4重组蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，以100μl/孔的体积加样，室温孵育2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤3-5次，甩干；将PSMD4检测抗体稀释成0.5μg/ml，每孔100μl，室温孵育1小时30分钟；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤3-5次，甩干；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔100μl，室温孵育1小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤6-8次，甩干；加入TMB，每孔100μl，室温避光孵育10-20分钟，加入2mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μl；在酶标仪上(450nm)测定OD值。
PSMD4重组蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，可以根据检测需要自行设定浓度梯度，在本发明的一个优选实施例中，浓度梯度为：10ng/ml，3ng/ml，1ng/ml，0.3ng/ml，0.1ng/ml，0.03ng/ml，0.01ng/ml。
本发明第三方面，提供了上述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在肝癌血清学诊断中的应用，所述的应用具体是指用于制备肝癌血清学诊断试剂盒。
所述的肝癌，包括诊断肝细胞癌；诊断甲胎蛋白阴性肝癌；鉴别区分肝癌和甲胎蛋白阳性的慢性肝病；诊断早期肝癌或小肝癌等。
所述的甲胎蛋白阴性的肝癌为甲胎蛋白含量小于20ng/ml的肝癌；
所述的慢性肝病主要指肝硬化等；
所述的小肝细胞癌是肿瘤直径小于2cm的肝细胞癌；
所述的早期肝细胞癌是BCLC0+A级的肝细胞癌。
本发明的有益效果：
1)准确：目前市场上无商业化的人源性PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，经文献检索没有定量检测人源性PSMD4蛋白含量的方法，前期工作发现PSMD4为肝癌癌蛋白，但目前无法对肝癌病人血清中的PSMD4进行测定。此ELISA试剂盒可准确检测肝癌病人血清中的PSMD4蛋白的含量，结果由酶标仪定量分析，排除了免疫组化、免疫荧光等半定量方法的主观性。
2)灵敏度高：用该方法检测到的PSMD4蛋白最低可至10pg/ml，敏感性明显高于普通的Westernblot和免疫组化等半定量方法。
3)简单方便：本方法中所用试剂和实验耗材均为市售商业化产品，容易获得；检测中仅需移液器和酶标仪进行加样和读数，普通的实验室和医院均可开展此项检测。
本发明提供的ELISA试剂盒操作简单方便，可准确、高灵敏度地检测到肝癌病人血清中的PSMD4蛋白的含量；特别是还能鉴别区分肝癌和甲胎蛋白阳性的慢性肝病；为临床检验和基础研究提供了一种新的手段和方法。
本发明的试剂盒主要用于肝癌病人的血清样品中PSMD4蛋白的定量检测，基础研究中可运用于各种生物学样品(如细胞培养上清液、细胞裂解液)中的PSMD4蛋白的检测。
本发明检测时不需要复杂仪器，易于在科研院校和医疗机构中推广应用，可大规模检测临床标本，快速获得人PSMD4蛋白相关的海量数据和信息，为肝癌患者的诊断提供重要的临床参考价值，具有广阔的市场前景、较大的经济和社会效益。
附图说明
图1是双抗体夹心ELISA方法检测PSMD4融合蛋白的结果，其中A图为柱状图，B图为散点图(呈线性相关)。
图2是双抗体夹心ELISA方法检测不同人群血清中PSMD4蛋白的结果，其中HC＝healthycontrol(健康对照)；LC＝livercirrhosis(肝硬化)；HCC＝hepatocellularcarcinoma(肝癌)；AFP＝α-fetoprotein(甲胎蛋白)。
图3是肝癌组对肝硬化患者和正常人群血清PSMD4和AFP的ROC曲线。
图4是肝癌组对肝硬化患者和正常人群血清PSMD4、AFP以及两者联合的ROC曲线。
图5是AFP-的肝癌患者对肝硬化患者和正常人群血清PSMD4的ROC曲线。
图6是肝癌组中不同肿瘤大小人群中血清ST-PSMD的表达水平。
图7是小肝癌患者对肝硬化患者和正常人群血清PSMD4和AFP的ROC曲线。
图8是早期肝癌患者对肝硬化患者和正常人群血清PSMD4、AFP以及两者联合的ROC曲线。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
兔抗人PSMD4的多克隆抗体，Abnova公司；H00005710-AP11-1
小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体，Abnova公司；H00005710-AP11-2
兔抗人PSMD4的多克隆抗体，PTG公司；14899-1-AP
小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体，PTG公司；66179-1-Ig
HRP标记的山羊抗小鼠IgG，PTG公司；SA00001-1
HRP标记的山羊抗兔IgG，PTG公司；SA00001-15
HRP标记的山羊抗小鼠IgG，Jackson公司；715-005-150
重组人PSMD4融合蛋白，PTG公司；ag6691
显色液选用sigam公司的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)。
实施例1：
检测ELISA酶标板的制备：包被缓冲液1×PBS，pH:7.4将抗体(兔抗人PSMD4的多克隆抗体)稀释成2.0ug/ml，在ELISA酶标板的每孔中加入100μl，含3％牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液封板后置于4℃孵育过夜，备用。
血清样本和重组蛋白的检测：血清样本用样品稀释液1×PBS(pH:7.4)以1:1稀释，以100μl/孔的体积加样，室温孵育2小时；PSMD4重组蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，以100μl/孔的体积加样，室温孵育2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液(含0.05％Tween-20的1×PBS溶液)，每孔300μl，洗涤3-5次，甩干；将PSMD4检测抗体稀释成0.5μg/ml，每孔100μl，室温孵育1小时30分钟；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤3-5次，甩干；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔100μl，室温孵育1小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤6-8次，甩干；加入TMB，每孔100μl，室温避光孵育10-20分钟，加入2mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μl；在酶标仪上(450nm)测定OD值。
实施例2：优化
1、包被抗体浓度的优化：
分别选用不同的包被抗体兔抗人PSMD4多克隆抗体(PTG公司和Abnova公司)，选择不同浓度(7.5μg/ml，5μg/ml，2.0μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml)包被ELISA酶标板，按照实施例1中的操作步骤进行检测，加入已知的不同浓度PSMD4蛋白标准品。根据获得的OD值，选择空白组OD值最小，且OD值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳抗体(PTG公司)包被抗体浓度为2.0μg/ml。
2、封闭液的优化：
分别选用不同的封闭液，含1％牛血清白蛋白+PBS溶液，含2％牛血清白蛋白+PBS溶液，含3％牛血清白蛋白+PBS溶液，含4％牛血清白蛋白+PBS溶液，含5％牛血清白蛋白+PBS溶液，封闭时间选择室温1小时，室温2小时，4℃过夜。按照实施例1中的操作步骤进行检测，加入已知的不同浓度PSMD4蛋白标准品，选择空白组OD值最小，且OD值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳封闭液和封闭时间。含3％牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液和室温封闭2小时为最佳组合。
3、检测抗体的优化：
检测抗体选用鼠抗人PSMD4的两种单克隆抗体(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)检测浓度选用(2.0μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.1μg/ml)。按照实施例1中的操作步骤进行检测，加入已知的不同浓度PSMD4蛋白标准品，选择空白组OD值最小，且OD值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳检测抗体和工作浓度。PSMD4(PTG公司)的工作浓度0.5μg/ml为最佳配伍。
4、酶标二抗的优化：
检测抗体为小鼠抗人PSMD4单抗(Abnova公司，#H00005710-AP11-2；PTG公司，#66179-1-Ig)时选取酶标二抗为山羊抗小鼠HRP标记的IgG(Jackson公司#715-005-150；PTG公司#SA00001-1)；抗体稀释倍数选择1:1000，1:2000，1:3000，1:5000，1:10000。按照实施例1中的操作步骤进行检测，加入已知的不同浓度PSMD4蛋白标准品，选择空白组OD值最小，且OD值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳酶标二抗和稀释浓度。山羊抗小鼠HRP标记的IgG抗体配伍为最佳(PTG公司#SA00001-1)，稀释浓度为1:5000稀释为最佳。
5、样品稀释液的优化：
病人血清样本检测时样品稀释液选用1×PBS(pH:7.4)或含0.1％BSA，0.5％Tween-20的1×TBS溶液，按照实施例1中的操作步骤进行检测，加入已知的不同浓度PSMD4蛋白标准品，选择OD值和标准蛋白浓度之间的线性关系最为密切的作为最佳血清样本稀释液。最佳血清样本稀释液为1×PBS(pH:7.4)溶液。
实施例3：PSMD4蛋白的ELISA试剂盒的特异性和敏感性评价
1、特异性试验
用实施例1建立的ELISA方法检测100例肝癌病人、50例正常人群以及20例肝硬化病人血清样本(健康人群选自本院员工体检样本；肝癌样本来源于上海东方肝胆外科医院样本库，经病理诊断为原发性肝癌；肝硬化样本来源于长海医院传染科，临床诊断为肝硬化)，将PSMD4重组蛋白作为阳性对照，根据所得标准品OD值与所对应浓度绘制标准曲线，计算各人群中PSMD4蛋白的血清学水平。
结果如图2所示，肝癌组人群PSMD4蛋白的血清学水平(Median388.2pg/mL,IQR348.3pg/ml)明显高于肝硬化组(Median87.2pg/mL,IQR145.5pg/ml)和正常人群(Median105.4pg/mL,IQR242pg/ml)，差异有统计学意义(p<0.001)。而在正常人群与肝硬化患者之间，结果提示差异无统计学意义(p＝0.675)。提示PSMD4在肝癌的血清学诊断中有一定的特异性。(Median-中位数；IQR-四分位间距)
2、敏感性试验
将PSMD4重组蛋白(1ug/ul)用1×PBS作连续倍比稀释，设置2个复孔，得出标准蛋白各个稀释点的平均OD值与空白组OD值有统计学差异的最高稀释倍数。
PSMD4融合蛋白稀释108倍后的OD值与空白组OD值仍有统计学差异，表明可检测的PSMD4蛋白最低浓度为10pg/ml。
实施例4：ELISA试剂盒检测PSMD4融合蛋白
将PSMD4重组蛋白(PTG#ag6691)倍比稀释，从10ng/ml开始稀释，连续稀释7个浓度，10ng/ml，3ng/ml，1ng/ml，0.3ng/ml，0.1ng/ml，0.03ng/ml，0.01ng/ml每个样品设置2个复孔，100μl/孔，按照实施例1的步骤重复检测5次，结果相似，如图1所示，PSMD4重组蛋白与抗体的反应具有良好的浓度依赖关系，且成明显的线性关系。
实施例5：PSMD4与AFP在肝癌诊断中的敏感性和特异性
以肝癌患者为病人组，以正常人群和肝硬化患者为对照组，根据实施例3、以及东方肝胆外科医院检验科检测的血清AFP(甲胎蛋白)的数据，采用IBM公司的SPSS(统计产品与服务解决方案)软件绘制PSMD4和的ROC曲线，确定血清PSMD4诊断肝癌的cutoff值、敏感性(sensitivity)、特异性(specificity)和曲线下面积(aeraunderthecurve，AUC)。绘制方法可参考文献ShenQ,etal.SerumDKK1asaproteinbiomarkerforthediagnosisofhepatocellularcarcinoma:alarge-scale,multicentrestudy.LancetOncol.2012；13(8):817-26.
绘制结果如图3所示。PSMD4cutoff值为0.288ng/mL时，诊断肝癌的敏感度为71％，特异度为84.2％，AUC为0.884(95％Cl：0.83-0.937)。选择临床常用值20ng/ml作为AFP的cutoff值，AFP的AUC为0.848(95％Cl：0.787-0.908)；AFP诊断肝癌的临界值选用20ng/mL时，诊断肝癌的敏感性为60％和特异性为84.2％。
结果显示PSMD4对肝癌的诊断准确性高于AFP，比AFP更为敏感，可有效提高临床上对肝癌的漏诊率。
实施例6：PSMD4与AFP在肝癌患者中的联合诊断
通过SPSS软件建立PSMD4与AFP联合诊断的logistic回归模型[Log(p/(1-p))＝7.495×PSMD4+0.004×AFP-2.128]，根据实施例3和东方肝胆外科医院检验科检测的血清AFP(甲胎蛋白)的数据，绘制联合使用PSMD4与AFP的ROC曲线，绘制方法同上。
绘制结果如图4所示，联合PSMD4与AFP的肝癌血清学诊断中，AUC为0.906(95％Cl：0.862-0.951)，联合诊断肝癌的敏感性为80％和特异性为84.2％。
结果显示与单独检测PSMD4蛋白或AFP相比，联合检测可显著提高诊断肝癌的敏感性。
实施例7：PSMD4在AFP阴性的肝癌患者中的诊断意义
临床上大约30％的肝癌患者血清AFP呈阴性，这部分患者常处于肝癌早期，如果AFP阴性的肝癌患者能较早的诊断并治疗，将显著提高肝癌患者的预后和5年生存期。将AFP阴性的肝癌病人血清中的ST-PSMD水平与肝硬化病人组和正常人群做比较分析，根据实施例3和东方肝胆外科医院检验科检测的血清AFP(甲胎蛋白)的数据，通过SPSS软件绘制ROC曲线，绘制方法同上。
绘制结果如图5所示，AFP阴性的肝癌病人中，PSMD4的AUC为0.866(95％CI0.801‐0.932)，敏感性为60％，特异性为84.3％。
结果显示PSMD4可以提高AFP-的肝癌患者的诊断率，很大程度上改善AFP对肝癌诊断的漏诊率，提高肝癌诊断的准确性。
实施例8：肿瘤大小与PSMD4表达情况的相关性分析
临床上肿瘤直径小于2cm的肝癌诊断较为困难，肿瘤的大小被认为与患者的预后和复发相关，因此如何提高小肝癌病人的诊断成功率显得尤为重要。本发明分析比较肝癌组中不同肿瘤大小病人血清中的PSMD4表达水平，探究肿瘤大小与血清学PSMD4的表达水平的相关性。
根据肿瘤直径的大小将肝癌组分为四组(小于2cm；2-5cm；5-10cm；大于10cm)，比较各组之间肿瘤大小与血清PSMD4表达的关系。
结果显示各组之间肿瘤大小与血清PSMD4的表达水平并无直接关系(p>0.05)，如图7所示；将肿瘤直径小于5cm和大于5cm两组之间血清PSMD4表达做比较，发现差异有统计学意义(p＝0.031)，如图6所示。
将肝癌组中肿瘤直径小于2cm的肝癌患者血清中PSMD4和AFP的水平与肝硬化病人组和正常人群做比较分析，绘制成ROC，见图7，PSMD4的AUC为0.88(95％CI0.804-0.956)敏感性88.9％，特异性82.9％；AFP的AUC为0.813(95％CI0.668-0.958)敏感性55.6％，特异性84.3％。
结果显示PSMD4在小肝癌的诊断敏感性上优于AFP，而AFP的特异性要略高于PSMD4。由于建立PSMD4与AFP联合诊断的logistic回归模型时，AFP未被纳入模型，故未能成功建立PSMD4与AFP的联合诊断模型。
实施例9：PSMD4与AFP在早期肝癌诊断中的意义
本发明采用巴塞罗那(BCLC)分级标准中0+A级的定义为肝癌早期，研究对象肝癌组中68％的病人属于BCLCstage0+A。绘制早期肝癌与肝硬化患者和正常人群ROC，PSMD4的AUC为0.868(95％CI0.809-0.928)敏感性71％，特异性85.79％；AFP的AUC为0.829(95％CI0.759-0.899)敏感性60％，特异性84.2％，如图8所示。
通过建立PSMD4与AFP联合诊断的logistic回归模型分析[Log(p/(1-p))＝6.928×PSMD4+0.004×AFP-2.245]，绘制联合使用PSMD4与AFP的ROC，见图8，联合PSMD4与AFP的早期肝癌的血清学诊断中，AUC为0.895(95％Cl：0.843-0.947)，联合诊断早期肝癌的敏感度为76％和特异度为87.1％。结果显示与单独检测PSMD4蛋白或AFP相比，联合检测可提高早期肝癌的敏感性和特异性。
实施例10：血清PSMD4与肝癌患者临床指标的关系
利用SPSS软件进行卡方分析明确PSMD4与肝癌患者临床指标的关系，实验结果如表1、2所示。
表1肝癌组患者的基本情况
缩写：HCC：hepatocellularcarcinoma，肝细胞癌；AFP：alpha-fetoprotein，甲胎蛋白；HbsAg：hepatitisBsurfaceantigen，乙肝病毒表面抗原；；BCLC：BarcelonaClinicLiverCancer，巴塞罗那临床肝癌标准
表2肝硬化组患者的基本情况
缩写：HBV-DNA(IU/ml)：乙型肝炎病毒DNA
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (9)

1.一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒包括：
(A)包被有PSMD4抗体的ELISA酶标板，所述的包被抗体为兔抗人PSMD4的多克隆抗体；
(B)检测PSMD4抗原的抗体，为小鼠抗人PSMD4的单克隆抗体；
(C)酶标二抗，为HRP标记的山羊抗小鼠IgG；
(D)标准蛋白，为重组人PSMD4融合蛋白；
(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。
2.根据权利要求1所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒中，ELISA酶标板为96孔的ELISA酶标板。
3.根据权利要求1所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒中，
包被缓冲液，为1×PBS，pH:7.4；
封闭液，为含3％牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液；
ELISA酶标板洗涤液，为含0.05％Tween-20的1×PBS溶液；
抗体稀释液，为1×PBS；
显色液，为3,3′,5,5′-四甲基联苯胺；
终止液，为2mol/L的硫酸溶液。
4.根据权利要求1所述的一种PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒中，当样品为血清时，样品稀释液为1×PBS，pH:7.4。
5.一种利用如权利要求1所述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：
制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将兔抗人PSMD4的多克隆抗体稀释成2.0ug/ml；
样本用样品稀释液以1:1稀释，加样至ELISA酶标板孔中，室温孵育1--2小时；
重组人PSMD4融合蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，加样至ELISA酶标板孔中，室温孵育1--2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次，甩干；
将检测PSMD4抗原的抗体稀释成0.5μg/ml，加至ELISA酶标板孔中，室温孵育1--2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤3-5次，甩干；
加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1--2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤6-8次，甩干；
加入显色液，室温避光孵育10-20分钟，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm测定OD值。
6.根据权利要求5所述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述的检测方法如下：
检测前，首先制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将兔抗人PSMD4的多克隆抗体稀释成2.0ug/ml，在ELISA酶标板的每孔中加入100μl，封板后置于4℃孵育过夜，备用；
血清样本用样品稀释液1×PBS，pH:7.4以1:1稀释，以100μl/孔的体积加样，室温孵育2小时；PSMD4重组蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，以100μl/孔的体积加样，室温孵育2小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤3-5次，甩干；将PSMD4检测抗体稀释成0.5μg/ml，每孔100μl，室温孵育1小时30分钟；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤3-5次，甩干；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔100μl，室温孵育1小时；甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，每孔300μl，洗涤6-8次，甩干；加入TMB，每孔100μl，室温避光孵育10-20分钟，加入2mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μl；在酶标仪上450nm测定OD值。
7.一种如权利要求1至4任一所述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备肝癌血清学诊断试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备肝癌血清学诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的肝癌，包括肝细胞癌、甲胎蛋白阴性肝癌、早期肝癌或小肝癌。
9.一种如权利要求1至4任一所述的PSMD4蛋白的ELISA检测试剂盒在制备鉴别甲胎蛋白阳性的慢性肝病的试剂盒中应用。
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