CN109781977A - IL15Rα以及相关膜蛋白检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人外周血浆中检测IL15Rα的试剂盒及其应用。本发明的发明人经过创造性劳动提供了一种高灵敏度的检测IL15Rα的方法，以及相关的检测试剂。

Description

IL15Rα以及相关膜蛋白检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及人外周血浆中检测IL15Rα以及相关膜蛋白检测试剂盒及其应用。

背景技术

免疫炎症因子参与到很多疾病的发生发展。如广泛被研究报道的HLA系统基因和白细胞介素家族基因等，在神经系统发育和精神疾病中关系密切。其很早就被认为是一种免疫性疾病，患者体循环中淋巴细胞在形态、数量及功能等方面均存在异常，血浆中炎症因子浓度升高，这包括IL-1、sIL-2α、IL-6、IL-8、TNF-α等。一些学者也在精神分裂症患者体内检出了多种自身抗体，如抗NMDAR抗体、抗D2R抗体、抗海马抗原的抗体等，流行病学调查结果显示自身免疫疾病是精神分裂症的高危因素之一，因此推测精神分裂症发病可能与自身免疫有关。也有研究表明，免疫系统可能直接影响神经系统发育。在围产期遭遇严重感染的患儿罹患精神分裂症的可能性显著高于正常人，尤其是在妊娠期前3月，而这个时间正是胎儿神经系统发育的关键期。最近还发现小胶质细胞能够识别并吞噬被补体、MHCI类分子标记的突触，参与了突触的修剪负向选择。最新的精神分裂症人群中的大样本基因测序以及尸检研究结果证实补体C4的活性与精神分裂症的风险紧密相关，C4是另外一种在突触上沉积的C3的上游激活物，而后者可以作为一种树突棘修剪的信号。

其中IL-15/IL-15RΑ系统参与到精神疾病中，发挥着介导免疫炎症信号通路的作用。IL-15是白介素家族之一，属4α超螺旋细胞因子超家族，其受体是由α、β和γ亚基构成的三聚体，α亚基可特异性的结合IL-15。IL-15/IL-15Rα广泛分布于各种组织细胞，除了能促进T细胞、NK细胞、树突状细胞等免疫细胞增殖分化以及功能成熟外，还可调节各种非免疫细胞功能，如促进纤维母细胞、上皮细胞、肌细胞、肝细胞、角化细胞、脂肪细胞等的增殖和分化，抑制凋亡。

IL15Rα在维持正常的神经系统功能方面有重要的作用。IL15Rα基因缺失小鼠中表现出一系列精神疾病样行为，包括自主活动亢进、社会交互障碍、学习记忆缺陷，抑郁性等行为。最新的研究发现，IL15Rα可能参与到精神疾病的发生，检测外周血中IL15Rα有利于对精神疾病进行早期诊断，然而IL15RRα在外周表达量较低，现有检测方法的检测灵敏度较低，容易被其他因素干扰，产生假阳性或假阴性的结果。因此，对于有效、灵敏地检测患者外周血中IL15Rα表达水平的试剂和方法存在客观需求。

现有的检测外周血中游离IL15Rα蛋白的方法主要是采用酶联免疫测定(ELISA)法，然而由于IL15Rα蛋白在血液中含量非常低，并且血液中存在大量诸如白蛋白、IgG等高丰度蛋白，对于痕量蛋白例如IL15Rα蛋白的检测灵敏度往往达不到要求。

此外，在临床上进行血样检测时，例如体检、筛查等，采集的血样往往不能立即进行检测，需要低温保存，有时需要冷冻保存一段时间之后再进行检测，临床上对于保存一段时间的样品尤其是冷冻后的样品再检测也经常出现检测灵敏度下降等问题。因此，因此迫切需要一种高灵敏度的检测IL15Rα蛋白的方法。

发明内容

本发明的发明人经过创造性劳动提供了一种高灵敏度的检测IL15Rα的方法。

在一方面，本发明提供了一种检测IL15Rα的试剂盒，所述试剂盒包括IL15Rα抗体、封闭缓冲液、样品处理液、IL15Rα标准品、洗涤缓冲液，其特征在于，所述样品处理液包含NP40、Triton X-100和SDS。

根据前述方面，所述IL15Rα抗体包括第一IL15Rα抗体和生物素化的第二IL15Rα抗体。

根据前述方面，所述封闭缓冲液为含有1％BSA的PBS。

根据前述方面，所述样品处理液为比例为含有NP40(0.01％-0.125％)、SDS(0.02％-0.25％)、Triton X-100(0.2％-2.5％)的缓冲液，优选为含有NP40(0.05％)、SDS(0.1％)、Triton X-100(1％)的缓冲液。

在一方面，本发明提供了一种检测IL15Rα的样品处理液，所述样品处理液为含有NP40(0.01％-0.125％)、SDS(0.02％-0.25％)、Triton X-100(0.2％-2.5％)的缓冲液，优选为含有NP40(0.05％)、SDS(0.1％)、Triton X-100(1％)的缓冲液。

在一方面，本发明提供了一种检测IL15Rα的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)用IL15Rα抗体包被平板；

(2)用含有1％BSA的PBS进行封闭处理；

(3)用样品处理液稀释样品；

(4)稀释后的样品加入包被有IL15Rα抗体的孔中；

(5)洗涤后加入生物素标记的IL15Rα抗体；

(6)孵育后加入HRP标记的亲和素孵育，经过彻底洗涤后用底物显色。

(7)用酶标仪在450nm波长下测定吸光度,570nm测吸光度作为参考波长，根据标准曲线计算样品浓度。

根据前述方面，所述样品处理液为比例为含有NP40(0.01％-0.125％)、SDS(0.02％-0.25％)、Triton X-100(0.2％-2.5％)的缓冲液，优选为含有NP40(0.05％)、SDS(0.1％)、Triton X-100(1％)的缓冲液。

根据前述方面，所述步骤(3)，样品处理液与样品的比例为0.1:1-1:10，优选为0.5:1-1:5，更优选为1:1-1:3，最优选为1:1或1:2。

根据前述方面，所述方法包括如下步骤：

(1)用IL15Rα抗体包被平板，孵育过夜；

(2)用含有1％BSA的PBS进行封闭处理处理0.5-5小时；

(3)用样品处理液按照0.1:1-1:10的比例稀释解冻的样品，稀释后的样品温和震荡1-10秒,放置冰上孵育5-30分钟；

(4)稀释后的样品加入包被有IL15Rα抗体的孔中，室温孵育1-5小时；

(5)用pH 7.2-7.4的含0.05％Tween 20的PBS洗涤三次后加入生物素标记的IL15Rα抗体；

(6)室温孵育1-5小时后，如步骤(5)所述洗涤三次，加入HRP标记的亲和素孵育10-30分钟，如步骤(5)所述洗涤三次后用底物TMB显色。

(7)用酶标仪在570nm波长下测定吸光度,450nm测吸光度作为参考波长，根据标准曲线计算样品浓度。根据前述方面，所述方法包括如下步骤：

(1)用IL15Rα抗体包被平板，孵育过夜；

(2)用含有1％BSA的PBS进行封闭处理处理1小时；

(3)用样品处理液按照1:1或1:2的比例稀释解冻的样品，稀释后的样品温和震荡5s,放置冰上孵育15分钟左右；

(4)稀释后的样品加入包被有IL15Rα抗体的孔中，室温孵育2小时；

(5)用pH 7.2-7.4的含0.05％Tween 20的PBS洗涤三次后加入生物素标记的IL15Rα抗体；

(6)室温孵育2小时后，如步骤(5)所述洗涤三次，加入HRP标记的亲和素孵育20分钟，如步骤(5)所述洗涤三次后用底物TMB显色。

(7)用酶标仪在450nm波长下测定吸光度,570nm测吸光度作为参考波长，根据标准曲线计算样品浓度。

在一方面本发明提供了一种包含NP40、SDS和Triton X-100的样品处理液在制备用于检测血液中神经系统相关的蛋白含量的试剂盒中的用途，其中所述神经系统相关的蛋白选自BACE1、NRG1、IL15Rα。

在一方面本发明提供了一种包含NP40、SDS和Triton X-100的样品处理液在制备用于检测血液中IL15Rα含量的试剂盒中的用途，其特征在于所述样品处理液为比例为含有NP40(0.01％-0.125％)SDS(0.02％-0.25％)、Triton X-100(0.2％-2.5％)的缓冲液，优选为含有NP40(0.05％)SDS(0.1％)、Triton X-100(1％)的缓冲液。

在一个实施方案中，所述样品处理液还包含蛋白酶抑制剂。

附图说明

下面参照附图来描述本发明的优选实施方式，附图中：

图1：标准曲线对比；A.标准品在PBS(1％BSA)溶解的标准曲线；B.标准品在样品处理液中溶解的标准曲线。

图2：样品处理液与PBS(1％BSA)稀释溶液处理后测得样品浓度比值对比。

具体实施方式

如在本说明书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。

如无特殊说明，本发明中的比例均为体积比，％含量均为体积％含量。

本领域技术人员可以理解，检测IL15Rα在外周血中的水平可以检测全血、血浆或血清中的IL15Rα的水平，根据具体情况可以检测外周血全血中IL15Rα的水平，或者分离血浆后检测IL15Rα的水平，或者分离血清后检测IL15Rα的水平。

本领域技术人员可以理解，本发明的样品处理液使用的缓冲液可以是本领域常规使用缓冲液，例如HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液。

下面通过具体实施例对本发明进行更加详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明保护范围。

实施例

实施例1

用纯化的IL15Rα抗体(购自R&D公司，货号DY6924))包被微孔板,制成固相抗体孵育过夜。利用含有1％BSA的PBS进行封闭处理1h。同时准备血浆样品。从-80℃的冰冻样品在4℃进行解冻，之后利用样品处理液处理样品。该样品处理液采用温和条件，保证不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，采用按照如下比例(NP40(0.05％)SDS(0.1％)、Triton X-100(1％)溶解于PBS。利用此不同浓度样品处理液按照稀释梯度处理样品和标准品。对照用含有1％BSA的PBS按照稀释梯度处理标准品和样品。稀释后的样品温和震荡5s,放置冰上孵育15min左右。然后依次往包被抗体的微孔中依次加入稀释后的标准品(购自R&D公司，货号DY6924)、样品，室温孵育2h,用洗涤缓冲液(0.05％Tween 20in PBSpH7.2-7.4)洗板子三次。再加入生物素化的IL15Rα抗体(购自R&D公司，货号DY6924)，室温孵育2小时；用洗涤缓冲液洗板子三次、然后HRP标记的亲和素孵育20min，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的蛋白含量呈正相关。用酶标仪在570nm波长下测定吸光度,450nm测吸光度作为参考波长，根据标准曲线计算样品浓度。

结果：利用样品处理液分别处理标准品与含有1％BSA的PBS稀释的标准品相比，标准曲线结果如图1所示。根据该标准曲线测量试剂盒的检测最低限，空白对照的光密度平均值是0.223，根据标准曲线的计算公式(y＝0.003x+0.1972)可知，本发明样品处理液处理的方法能够检测出的IL15Rα的浓度最低限为8.56pg/mL。而根据采用含有1％BSA的PBS稀释的标准品的对照标准曲线可知，IL15Rα的浓度最低检测限为50.6pg/mL。此结果表明，采用本发明的样品处理液大大提高了检测灵敏度。

实施例2

从精神疾病样本人群中选择7个人，3男性，4女性患者。按照实施例1的方法检测外周血样品中的IL15Rα浓度。

用含有1％BSA的PBS稀释处理与样品处理液稀释1倍的数据结果如表1所示，该结果具有统计学差异(图2)。该结果表明采用本发明的样品处理液能够比普通的含有1％BSA的PBS稀释处理提高3倍的灵敏度，并使得检测的浓度范围大大拓宽，能够检测到原来检测不到的IL15Rα。

表1.PBS(1％BSA)与样品处理液稀释1倍血浆样品，所测得血浆中IL15Rα的浓度值

用样品处理液不同配比稀释血浆样品，在1:1-1:3都有明显的增高，但是考虑到仪器检测的信号原始值比较低(即仪器的灵敏度)最优的稀释比例是1:1或者1:2(表2)。

表2.利用样品处理液不同浓度配比稀释所测的样品IL15Rα的含量

实施例3

按照实施例1的方法检测外周血样品中的IL15Rα浓度。其中采用不同浓度的配比样品处理液，依次为浓度配比1：NP40(0.01％)Triton X-100(0.02％)、SDS(0.2％)；浓度配比2：NP40(0.02％)Triton X-100(0.04％)、SDS(0.4％)；浓度配比3：NP40(0.05％)、SDS(0.1％)、Triton X-100(1％)；浓度配比4：NP40(0.125％)SDS(0.25％)、Triton X-100(2.5％)；结果如表3所示，显示浓度配比3为最优的浓度配比。

表3.不同浓度配比所测的样品IL15Rα的含量

	样品1(pg/ml)	样品2(pg/ml)	样品3(pg/ml)
				浓度配比1	1901.16	186.07	13.23
浓度配比2	1994.78	232.60	36.08
				浓度配比3	2047.32	257.28	51.73
浓度配比4	1984.73	238.11	46.70

实施例4与神经系统相关蛋白例如BACE1,NRG1的检测

按照实施例1的方法检测BACE1或NRG1。NRG1在由样品处理液与普通稀释液处理下，ELISA的实验结果如表4所示。样品处理液处理的血浆同样明显的提高检测灵敏度。标准曲线公式为y＝0.0054x+1.2334。根据该公式计算可知，检测限为298.7pg/mL。

表4.PBS(1％BSA)与样品处理液稀释血浆样品所测得血浆中NRG1的浓度值。

NRG1	样品1(pg/ml)	样品2(pg/ml)	样品3(pg/ml)
				PBS	77.29	113.56	1325.42
样品处理液	112.63	196.10	2287.31

在BACE1的ELISA实验中，我们同样观察到，利用样品处理液处理的血浆改进的方法，同样比普通的稀释液处理的样品检测灵敏度大大提高(表5)。标准曲线公式为y＝0.23x+0.55。根据该公式计算可知，检测限为4.26ng/mL。

表5.PBS(1％BSA)与样品处理液稀释血浆样品所测得血浆中BACE1的浓度值。

至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征作出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测外周血中IL15Rα水平的试剂盒，所述试剂盒包括IL15Rα抗体、封闭缓冲液、样品处理液、IL15Rα标准品、洗涤缓冲液，其特征在于，所述样品处理液包含NP40、TritonX-100和SDS。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其中所述IL15Rα抗体包括第一IL15Rα抗体和生物素化的第二IL15Rα抗体。

3.根据权利要求1或2所述试剂盒，所述封闭缓冲液为含有1％BSA的PBS。

4.根据权利要求1-3任一项所述试剂盒，所述样品处理液为比例为含有NP40(0.01％-0.125％)Triton X-100(0.02％-0.25％)、SDS(0.2％-2.5％)的缓冲液，优选为含有NP40(0.05％)、SDS(0.1％)、Triton X-100(1％)的缓冲液，任选地所述样品处理液还包含蛋白酶抑制剂。

5.一种检测IL15Rα的样品处理液，所述样品处理液为含有NP40(0.01％-0.125％)Triton X-100(0.02％-0.25％)、SDS(0.2％-2.5％)的缓冲液，优选为含有NP40(0.05％)、Triton X-100(0.1％)、SDS(1％)的缓冲液，任选地所述样品处理液还包含蛋白酶抑制剂。

6.权利要求5所述样品处理液在制备用于检测血液中神经系统相关的蛋白含量的试剂盒中的用途，其中所述神经系统相关的蛋白选自BACE1、NRG1、IL15Rα。

7.权利要求5所述样品处理液在制备用于检测血液中IL15Rα含量的试剂盒中的用途。

8.一种检测外周血中IL15Rα水平的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)用IL15Rα抗体包被平板；

(2)用含有1％BSA的PBS进行封闭处理；

(3)用样品处理液稀释样品；

(4)稀释后的样品加入包被有IL15Rα抗体的孔中；

(5)洗涤后加入生物素标记的IL15Rα抗体；

(6)孵育后加入HRP标记的亲和素孵育，经过彻底洗涤后用底物显色。

(7)用酶标仪在570nm波长下测定吸光度,450nm测吸光度作为参考波长，根据标准曲线计算样品浓度。

其中，所述样品处理液为比例为含有NP40(0.01％-0.125％)、SDS(0.02％-0.25％)、Triton X-100(0.2％-2.5％)的缓冲液，优选为含有NP40(0.05％)、SDS(0.1％)、Triton X-100(1％)的缓冲液，任选地所述样品处理液还包含蛋白酶抑制剂。

9.根据权利要求8的方法，其中所述步骤(3)中样品处理液与样品的比例为0.1:1-1:10，优选为0.5:1-1:5，更优选为1:1-1:3，最优选为1:1或1:2。

10.根据权利要求8或9的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)用IL15Rα抗体包被平板，孵育过夜；

(2)用含有1％BSA的PBS进行封闭处理处理1小时；

(3)用样品处理液按照1:1或1:2的比例稀释解冻的样品，稀释后的样品温和震荡5s,放置冰上孵育15分钟左右；

(4)稀释后的样品加入包被有IL15Rα抗体的孔中，室温孵育2小时；

(5)用pH 7.2-7.4的含0.05％Tween 20的PBS洗涤三次后加入生物素标记的IL15Rα抗体；

(6)室温孵育2小时后，如步骤(5)所述洗涤三次，加入HRP标记的亲和素孵育20分钟，如步骤(5)所述洗涤三次后用底物TMB显色。

(7)用酶标仪在570nm波长下测定吸光度,450nm测吸光度作为参考波长，根据标准曲线计算样品浓度。