CN108291205A - 用于产生树突细胞的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了采用识别肿瘤抗原的经引发的树突细胞治疗疾病，特别是癌症的组合物和方法。所述方法可包括储存、运送和/或培养树突细胞，其中所述树突细胞在硬表面上储存。描述了裂解方案，其中所述裂解不会导致细胞的完全裂解，以提供维持在细胞表面嵌入状态的细胞表面分子。还提供了用于治疗目的的非致死性登革病毒株。

Description

用于产生树突细胞的组合物和方法

交叉引用

本申请要求2015年9月26日提交的美国临时申请号62/284,434的权益，该美国临时申请通过引用以其全文并入本文。

序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且通过引用将其全部内容并入本文。于2016年9月22日创建的所述ASCII副本被命名为48253-703_601_SL.txt，并且大小是1831字节。

背景技术

树突细胞(DC)是免疫系统的抗原呈递细胞。树突细胞吞没并加工少量细菌、病毒和其他病原体，之后将有关的蛋白质链靶标(抗原肽)呈递给识别并杀死病毒感染的细胞或癌细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)以及产生抗体的B淋巴细胞。DC还吞没受损或死亡的细胞，并且DC是诱导1型应答(激活)、2型应答(耐受性)或0型应答(中性)所必需的。由于相同的20种氨基酸构成身体部分(自身)以及病原体(非自身)，因此DC必须不仅评估抗原结构，而且还要评估细胞因子和当时存在的其他信号传导环境。这种多层系统适当地防止免疫系统将自身误认为非自身的自身免疫性；以及需要中性应答来维持平衡的变态反应。这种内部检查和平衡的复杂系统被来源于“自身”细胞的肿瘤细胞所利用。肿瘤细胞通常分泌因子，如将应答免疫细胞转换为T_H2型耐受性应答的转化生长因子β(TGFβ)。这使得肿瘤细胞的生长不受检查，并且常常得到免疫细胞的帮助。DC具有对CD4⁺和CD8⁺CTL进行编程以识别呈递的MHC(自身-蛋白质ID复合物)和相关肽的能力。然而，CTL随后必须决定是否将该细胞视为自身而加以忽略，或者，例如通过Fas/FasL或穿孔蛋白/粒酶B细胞死亡系统来启动裂解。该决定通常将依赖于CTL的激活状态、细胞因子环境和细胞损伤因子的存在或不存在，例如，热激蛋白质、Toll样受体激活信号等。在活动性病原体感染期间，这些系统被激活并帮助控制CTL对1型攻击模式的应答。

与细胞毒性药物、辐射和手术不同，免疫疗法刺激免疫系统识别并杀死肿瘤细胞。已经在刺激免疫系统识别并破坏肿瘤细胞方面进行了许多尝试。由于选择作为免疫疗法之靶标的肽的自身性(self-identity)、免疫活化的缺乏、不良事件和/或肿瘤免疫逃避机制，因此这些尝试已经取得的成功较为有限。

目前的细胞疗法例如树突细胞疗法在晚期癌症患者中诱导持久的、完全应答的能力很低(在大多数免疫原性癌症类型中为5-10％，在其他癌症类型中更低)。通常，树突细胞疗法由于低激活(例如，没有足够的免疫细胞来完全杀死全部癌细胞)、低靶向(例如，健康细胞被杀死并且/或者肿瘤细胞未被杀死)或免疫抑制的肿瘤微环境限制了药效而产生不太理想的结果。

发明内容

本文提供了用于产生经引发的树突细胞的方法，该方法包括：在硬表面上培养树突细胞；用次氯酸盐溶液裂解至少一个细胞以产生裂解物；使所述树突细胞与所述裂解物接触以产生经引发的树突细胞；以及使所述经引发的树突细胞成熟化，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂接触。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约6ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约6.5ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生约19ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述硬表面为塑料表面。本文进一步提供了方法，其中所述硬表面包含聚苯乙烯。本文进一步提供了方法，其中所述硬表面基本上不含降低由经引发的树突细胞产生的1型应答的组分。本文进一步提供了方法，其中所述组分选自氟化聚乙烯、氟化聚丙烯和邻苯二甲酸酯。本文进一步提供了方法，其中所述裂解物包含多个完整细胞。本文进一步提供了方法，其中所述toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂为咪唑并喹啉化合物。本文进一步提供了方法，其中所述咪唑并喹啉化合物为R848。本文进一步提供了方法，其中成熟化包括使经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂或(ii)干扰素γ接触。本文进一步提供了方法，其中所述toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂为脂多糖。本文进一步提供了方法，其中成熟化进一步包括使经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂和(ii)干扰素γ接触。本文进一步提供了方法，其中成熟化包括使经引发的树突细胞与R848、脂多糖和干扰素γ接触。本文进一步提供了方法，其中所述至少一个细胞为肿瘤细胞。本文进一步提供了方法，其中所述树突细胞对受试者而言是自体的或同种异体的。本文进一步提供了方法，其中所述树突细胞是与受试者相HLA匹配的同种异体细胞。本文进一步提供了方法，该方法包括从受试者获得至少一个细胞，其中所述细胞与有害的疾病状态有关。本文进一步提供了方法，其中所述有害的疾病状态为增生性病症或自身免疫病症。本文进一步提供了方法，其中成熟化进一步包括使经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂、toll样受体4激动剂或(ii)干扰素γ接触。本文进一步提供了方法，其中所述toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂为脂多糖。本文进一步提供了方法，其中成熟化进一步包括使经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂和(ii)干扰素γ接触。本文进一步提供了方法，其中成熟化包括使经引发的树突细胞与R848、脂多糖和干扰素γ接触。本文进一步提供了方法，其中经引发的树突细胞群体在冷冻和解冻之后具有超过70％的活力。本文进一步提供了方法，其中经引发的树突细胞群体在冷冻和解冻之后具有约71％至约79％的活力。

本文提供了用于产生经引发的树突细胞的方法，该方法包括：在硬表面上培养树突细胞；从受试者获得至少一个癌细胞；用次氯酸盐溶液裂解所述至少一个癌细胞以产生裂解物；使所述树突细胞与所述裂解物接触以产生经引发的树突细胞；以及使所述经引发的树突细胞成熟化，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂接触。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少6ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约6.5ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生约19ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述硬表面为塑料表面。本文进一步提供了方法，其中所述硬表面包含聚苯乙烯。本文进一步提供了方法，其中所述硬表面基本上不含降低由经引发的树突细胞产生的1型应答的组分。本文进一步提供了方法，其中所述组分选自氟化聚乙烯、氟化聚丙烯和邻苯二甲酸酯。本文进一步提供了方法，其中所述裂解物包含多个完整细胞。本文进一步提供了方法，其中所述多个完整细胞为多个增殖未激活的癌细胞。本文进一步提供了方法，其中所述toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂为咪唑并喹啉化合物。本文进一步提供了方法，其中所述咪唑并喹啉化合物为R848。本文进一步提供了方法，其中所述toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂为脂多糖。本文进一步提供了方法，其中所述树突细胞对受试者而言是自体的或同种异体的。本文进一步提供了方法，其中所述树突细胞是与受试者相HLA匹配的同种异体细胞。本文进一步提供了方法，其中成熟化进一步包括使经引发的树突细胞与toll样受体2激动剂、toll样受体4激动剂、干扰素γ或其组合接触。

本文提供了用于治疗或减轻有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括：在硬表面上培养树突细胞；获得至少一个癌细胞；用次氯酸盐溶液裂解所述至少一个癌细胞以产生裂解物；使树突细胞与裂解物接触，从而生成经引发的树突细胞；以及向有需要的受试者施用经引发的树突细胞。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约6ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约6.5ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生约19ng/mLIL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生19ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生约15ng/mL IL-12p70至约23ng/mLIL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生15ng/mL IL-12p70至23ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述树突细胞对受试者而言是自体的或同种异体的。本文进一步提供了方法，其中所述至少一个癌细胞来自受试者。本文进一步提供了方法，该方法包括使经引发的树突细胞成熟化，其中成熟化包括添加熟化试剂，其中所述熟化试剂包含toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂。权利要求47的方法，其中成熟化进一步包括使经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂或(ii)干扰素γ接触。本文进一步提供了方法，其中所述toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂为脂多糖。本文进一步提供了方法，其中成熟化进一步包括使经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂和(ii)干扰素γ接触。本文进一步提供了方法，其中成熟化包括使经引发的树突细胞与R848、脂多糖和干扰素γ接触。

本文提供了用于治疗或减轻有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括：从受试者获得树突细胞；在硬表面上培养树突细胞；从受试者获得癌细胞；用次氯酸盐溶液裂解所述癌细胞以产生裂解物；使树突细胞与裂解物接触，从而生成经引发的树突细胞；向受试者施用经引发的DC；以及向有需要的受试者施用登革病毒(Dengue virus)。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒为DENV-2株#1710。本文进一步提供了方法，其中所述硬表面为硬塑料表面。本文进一步提供了方法，其中所述硬塑料表面为聚苯乙烯表面。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少6ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约6.5ng/mL IL-12p70。本文进一步提供了方法，其中所述经引发的树突细胞产生约19ng/mL IL-12p70。

本文提供了用于清除受试者中的癌细胞的方法，该方法包括：向有需要的受试者施用登革病毒血清型2；引发树突细胞，其中引发包括：将树突细胞暴露于裂解物以产生经引发的树突细胞，其中所述裂解物包含多个癌细胞，每个癌细胞包含在所述癌细胞表面上存在的抗原；以及向受试者施用经引发的树突细胞，其中所述施用在受试者中提供了占癌细胞群体的33％或更高的清除率。本文进一步提供了方法，其中所述施用在受试者中提供了占癌细胞群体的33％的清除率。本文进一步提供了方法，该方法进一步包括静脉内施用登革病毒血清型2并且静脉内施用经引发的树突细胞群体。本文进一步提供了方法，其中所述多个癌细胞来自受试者。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒血清型2为DENV-2株#1710。

本文提供了用于治疗或减轻有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括施用通过包括以下步骤的方法产生的经引发的树突细胞：在硬表面上培养树突细胞；用次氯酸盐溶液裂解至少一个细胞以产生裂解物；使所述树突细胞与所述裂解物接触以产生经引发的树突细胞；以及使所述经引发的树突细胞成熟化，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂接触。本文进一步提供了方法，其中静脉内施用所述经引发的树突细胞。本文进一步提供了方法，该方法包括向受试者施用登革病毒2。本文进一步提供了方法，其中所述登革病毒2为毒株#1710。

本文提供了由以下方法产生的经引发的树突细胞，该方法包括：在硬表面上培养树突细胞；用次氯酸盐溶液裂解至少一个细胞以产生裂解物；使所述树突细胞与所述裂解物接触以产生经引发的树突细胞；以及使所述经引发的树突细胞成熟化，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂接触。本文进一步提供了细胞，其中所述经引发的树突细胞用于癌症的治疗。

本文提供了由以下方法制备的经引发的树突细胞的用途，该方法包括：在硬表面上培养树突细胞；用次氯酸盐溶液裂解至少一个细胞以产生裂解物；使所述树突细胞与所述裂解物接触以产生经引发的树突细胞；以及使所述经引发的树突细胞成熟化，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂接触，以用于治疗癌症。

本文提供了有效量的由以下方法制备的经引发的树突细胞，该方法包括：在硬表面上培养树突细胞；用次氯酸盐溶液裂解至少一个细胞以产生裂解物；使所述树突细胞与所述裂解物接触以产生经引发的树突细胞；以及使所述经引发的树突细胞成熟化，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂接触，以用于治疗癌症。

附图说明

图1描绘了采用登革病毒和经引发的树突细胞的示例性治疗方法。

图2举例说明了采用登革病毒和经引发的树突细胞的治疗方法和采用登革病毒和经引发的树突细胞的治疗时间表。

图3示出了对应于在各种治疗条件下小鼠中黑素瘤细胞的肺转移数的图。带有斜线的条代表每种情况下肺转移的平均数。

图4示出了对应于在各种治疗条件下小鼠中黑素瘤细胞的肺转移数的图。带有斜线的条代表每种情况下肺转移的平均数。

图5示出了流式细胞术数据的图，其证实了CD14+单核细胞的分离。

图6示出了一幅图，其代表相对于由几种比较物方法产生的DC的蛋白质表达，通过由本文公开的方法产生的DC的IL-12p70的蛋白质表达。

具体实施方式

本文提供了用于制备经引发的树突细胞(DC)的方法。本文进一步提供了用于将经引发的树突细胞暴露于与疾病状态有关的抗原例如肿瘤抗原的方法，从而产生能够诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对癌细胞的特异性且鲁棒的(robust)应答的经引发的树突细胞。本文进一步提供了用于将这类DC施用于受试者中以治疗与所述疾病状态有关的病症的方法。在一些情况下，所述病症为癌症。在一些情况下，所述病症为自身免疫病症，例如，类风湿性关节炎和多发性硬化。在一些情况下，所述病症为人免疫缺陷病毒(HIV)感染或获得性免疫缺陷综合征。在一些情况下，在施用经引发的DC之前向所述受试者施用登革病毒。

引发树突细胞一般包括使树突细胞与目标癌细胞上存在的一种或多种肿瘤抗原接触。在一些情况下，单独采用已合成、分离或纯化的肿瘤抗原引发树突细胞。备选地或另外地，采用肿瘤细胞裂解物引发树突细胞，其中所述肿瘤细胞裂解物含有肿瘤抗原。在一些情况下，采用表达肿瘤抗原的完整癌细胞引发树突细胞。随后将该树突细胞施用于受试者，其中该树突细胞会将肿瘤抗原呈递给CTL，从而使CTL适应于识别和破坏目标癌细胞。

本文提供了限制树突细胞暴露于塑料容器材料中含有的聚合物的方法。例如，在软塑料袋的情况下，聚合物可渗入介质溶液中并影响DC活性。相反，可以在硬容器如聚苯乙烯组织培养板中培养、储存和运输树突细胞。这避免了可通过暴露于软塑料袋中含有的聚合物引起的树突细胞免疫刺激活性的降低。例如，这些聚合物可减少由树突细胞产生的IL-12的量，从而降低其诱导鲁棒的CTL应答的能力。本文提供的实例证明，由本文公开的方法生成的经引发的树突细胞能够分泌至少18pg/mL的IL-12p70，而由标准方法产生的树突细胞通常仅产生4-6pg/mL的IL-12p70。

在一些情况下，采用肿瘤裂解物引发树突细胞是可取的或有利的。值得注意的是，本文公开的方法利用保护肿瘤抗原完整性的温和的细胞裂解方案。这种温和的裂解可通过将肿瘤细胞或癌细胞暴露于次氯酸钙或次氯酸钠溶液不超过约30-60分钟来实现。类似地，温和地分解用于引发树突细胞的任何肿瘤细胞，例如，通过Miltenyi GentleMACS系统等。

可向受试者施用通过本文公开的方法制备的经引发的树突细胞以及将会增强受试者的免疫系统的药剂。例如，可在使受试者感染病毒之后向该受试者施用经引发的树突细胞。例如，本文公开的方法和实例使用登革病毒，特别是相对安全的登革病毒血清型2株#1710(例如，没有已知的致死性或严重不良事件发生)。该病毒提供了受抑制的免疫系统的激活(例如，通过产生T_H1极性转变)并提高了靶向特异性，从而提供相对于目前细胞疗法更高的功效和安全性。经引发的树突细胞与病毒感染的组合提供了伴随最少给药(可能仅一次)的有效治疗，这避免了受试者在坚持治疗方面的挑战。所述经引发的树突细胞可以是自体的，意思是来源于受试者自身的细胞，或者是同种异体的，即来源于具有相似组织类型的另一受试者。

定义

贯穿本公开内容，各个实施方案以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应该被解释为对任何实施方案范围的硬性限制。因此，除非上下文另有明确规定，否则对范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及该范围内的单个数值(精确到下限单位的十分之一)。例如，如1至6的范围的描述应该认为具有具体公开的子范围，诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的个别值，例如1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都适用。这些中间范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包含在本发明内，受所述范围内任何具体排除的限值所约束。除非上下文另有明确说明，否则在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除这些所包括的界限中的任一个或两者的范围也包括在本发明内。

本文所使用的术语仅用于描述特定的实施方案，而并非意图限制任何实施方案。除非上下文另有明确说明，否则如本文所使用的单数形式“一种”、“一个”和“该”也旨在包括复数形式。应当进一步理解，当在本说明书中使用时，术语“包括”和/或“包含”指明了所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但是不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其组的存在或添加。如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何组合和所有组合。

除非特别指出或从上下文中明显看出，否则如本文所使用的，涉及数字或数字范围的术语“约”应理解为是指所述数字和其+/-10％的数字，或针对某一范围所列出的值，是指低于所列出的下限的10％，以及高于所列出的上限的10％。

如本文所使用的，术语“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括大鼠、小鼠、非人灵长类动物和灵长类动物(包括人)。

分离和引发树突细胞(DC)的方法

本文提供了用于引发DC并将经引发的DC施用于有需要的受试者的方法，其中所述DC诱导来自细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答，从而导致靶细胞的细胞毒性。DC可包含同种异体的树突细胞或自体的树突细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括向受试者施用同种异体的经引发的树突细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括向受试者施用自体的经引发的树突细胞。包括向受试者施用经引发的DC的本文公开的方法在本文中可被称为“树突细胞接种”。

在一些情况下，本文所述的方法包括从骨髓中的CD34⁺祖细胞获得树突细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括从外周血中的CD1⁺CD14⁺不成熟单核细胞获得树突细胞。在一些情况下，获得树突细胞包括白细胞提取法(leukapheresis)。在一些情况下，白细胞提取法包括从受试者或供体抽取一单位的血液，分离一系列的血液组分：红细胞、血小板和大部分血浆因子，将这些血液组分返回到受试者，而保留白细胞。在一些情况下，本文所述的方法包括评估白细胞的无菌性，将其在冷藏(4℃)下运输或储存，和/或处理来自白细胞提取法产物的DC。

本文公开的DC产生方法可包括分离所述单位血液中的单核细胞与其他白细胞，包括但不限于T细胞、B细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。这可采用免疫磁性选择或通过粘附性质来实现。免疫磁性选择包括使来自所述单位血液的白细胞与具有塑料珠的无菌塑料柱接触，该塑料珠上包被有免疫细胞抗体，例如，作为非限制性实例，CD表面蛋白质(CD4、CD8、CD56等)抗体。不需要(非单核细胞)的细胞将粘附于珠子，使得单核细胞通过并被收集。在阳性选择中，可用CD1和/或CD14的抗体包被磁珠以捕获单核细胞，将磁体抵靠柱子而放置，并用缓冲盐水溶液或能使细胞存活的介质将不需要的细胞冲洗出柱子。随后从珠子上洗掉单核细胞并在以下步骤中收集。在粘附选择中，利用单核细胞附着于特定表面的特性，通过使白细胞提取法产物由上而下地沿着倾斜的柱子流动来分离单核细胞。

本文提供了用于细胞收集的方法，该方法可包括从所述单位血液中收集仅几千个单核细胞。有效的免疫疗法通常需要5000万范围内的DC剂量。因此，本文公开的方法可包括扩充单核细胞及其任何前体，和由其分化的任何细胞(例如，DC)。扩充细胞可包括使细胞与因子如生长因子、集落刺激因子、细胞因子或任何其他增殖或生长诱导因子及其组合进行接触。作为非限制性实例，重组人生长因子rhu白介素-4(IL-4)和rhu粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)可用于实现DC数目的扩充。此外，IL-4和GM-CSF可能是由单核细胞发展为成熟DC所必需的，单核细胞与成熟DC相比具有差的抗原摄取和CTL刺激能力。因此，IL-4和GM-CSF可扩充成熟DC标志物的数目和发展。DC标志物可包括但不限于CD11、CD80和CD83，以及I类(用于将短肽呈递给CD8⁺细胞)和II类(用于将更长的肽呈递给CD4⁺辅助诱导T淋巴细胞)MHC复合物的增加的表达。扩充细胞可在约2天内产生数千万个成熟DC。扩充细胞可在约3天内产生数千万个成熟DC。扩充细胞可在约4天内产生数千万个成熟DC。扩充细胞可在约5天内产生数千万个成熟DC。扩充细胞可在约一周内产生数千万个成熟DC。

在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物进行接触或用它们对DC进行脉冲处理。如本文所用的术语“脉冲处理”通常是指以一个或多个间隔使所述细胞接触超过一次，并且可与接触互换使用，除非另有说明。在一些情况下，所述方法包括使DC与结合MHC I类分子的肽(“MHCI类肽”)接触或用它脉冲处理DC。在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与结合MHC II类分子的肽(“MHC II类肽”)接触或用它脉冲处理DC。在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与MHC I类肽和MHC II类肽接触或用它们脉冲处理DC。在一些情况下，所述接触或脉冲处理使得DC有能力引发CTL并将CTL靶向肿瘤。在一些情况下，本文所述的方法包括使DC与制备/合成的I类和/或II类肽接触或用它们脉冲处理DC。在一些情况下，制备I类和/或II类肽，随后将其任选地以微克量或更少的量添加至DC培养基中。在一些情况下，本文所述的方法包括用于持续的免疫应答的II类肽。在一些情况下，本文所述的方法包括对肽(即肿瘤抗原)进行DNA或RNA测序和/或使用电穿孔将DNA或RNA插入DC中以触发抗原加工。在一些情况下，本文所述的方法不需要对DC进行HLA匹配。在一些情况下，所述肽或其部分由选自EGSRNQDWL(SEQ ID NO：1)、(TAYRYHLL)(SEQ ID NO：2)或其组合的氨基酸序列来表示。

可以制备I类肽，随后将其以微克量添加至DC培养基中。然而，该技术是昂贵的，因为所述肽必须与受试者的HLA类型相匹配，并且如果肿瘤细胞不呈递所述抗原，则该肿瘤细胞可以逃避检测和裂解。缺乏激活CD4⁺辅助细胞的II类肽导致免疫应答能力的快速下降。其他方法可包括对常见肿瘤抗原的RNA测序，随后使用电穿孔将RNA插入DC中以触发抗原加工。该方法不需要HLA匹配，并且包括用于持续的免疫应答的II类肽。然而，RNA测序可能在技术上是复杂的，并且可能仅呈递数千个潜在基因产物的有限数目的抗原。由于这些原因，自体的完整肿瘤细胞或其裂解物具有低成本、易于通过活检获得(1-2g足够)的优点，并且含有用于广泛且深度免疫应答的潜在抗原的全阵列。

本文所述的树突细胞引发方法可包括获得完整肿瘤细胞和/或其裂解物。可通过放射或其他手段杀死肿瘤细胞并通过多种方法制备裂解物。在一些情况下，裂解肿瘤细胞不包括胰蛋白酶消化和冻融循环，它们简单且迅速，但可能损伤其中纤细的肽。本文公开的方法可采用自动化细胞处理器(例如，Miltenyi GentleMACS系统)，其允许将样品手动切碎，悬浮于PBS溶液中，随后使用预先选择的组织特定的、软件控制的转子系统分离肿瘤细胞。单细胞悬浮液可进行膜裂解，其对肿瘤肽的损伤最小。

本文所述的树突细胞引发方法可包括使树突细胞与自体的肿瘤细胞或其裂解物接触。在一些情况下，本文所述的方法包括使树突细胞与自体的完整肿瘤细胞(例如，肿瘤细胞和肿瘤支持细胞)或其裂解物进行接触，所述裂解物含有用于广泛且深度免疫应答的潜在抗原的全阵列。本文所述的树突细胞引发方法可包括使树突细胞与包含凋亡体或坏死体的肿瘤细胞裂解物接触。在进一步的情况下，该肿瘤细胞裂解物包含来自肿瘤细胞周围微环境的肿瘤抗原，如细胞外基质蛋白质。

本文所述的树突细胞引发方法可包括使DC与将会增强DC的引发、增殖或活力的增强剂接触。作为非限制性实例，增强剂可选自淋巴因子、单核因子、细胞因子、生长因子、细胞、细胞碎片、(非蛋白质)小分子、抗体、抗体片段、核酸及其组合。

制备用于DC引发的细胞和抗原的方法可包括使靶细胞(例如，癌细胞)不能发生细胞分裂。例如，所述方法可包括用丝裂霉素C或辐射处理细胞，以使细胞不能发生细胞分裂。这些方法可包括作为增强剂添加的细胞或用于脉冲处理DC的细胞(例如，肿瘤细胞)。

在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理DC约1小时至约24小时。在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理DC约12小时至约48小时。在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理DC约8小时至约24小时。在一些情况下，本文所述的方法包括脉冲处理DC约18小时。脉冲处理可包括使DC与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物接触至少一次。脉冲处理可包括使DC与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物接触至少两次。脉冲处理可包括使DC与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物接触至少三次。脉冲处理可包括使DC与肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物接触少于两次、少于三次、少于四次、少于五次或少于10次。脉冲处理可包括向DC中添加肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物超过一次，使得所述肽/抗原、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞、肿瘤细胞裂解物和/或肿瘤支持细胞裂解物在DC培养基中积累。脉冲处理可包括在一次或多次脉冲处理之间洗涤细胞或去除DC培养基。

本文所述的方法可包括使DC与熟化剂接触来增强、完成或结束DC的成熟化。在一些实施方案中，熟化剂还充当“危险信号”。在没有该危险信号的情况下，肿瘤抗原可诱导T^reg产生或活性，这将最终降低CTL活性。在一些实施方案中，熟化剂/危险信号为炎性信号。炎性信号还可称为炎性介质。炎性介质可包括细胞因子，以及可能不被本领域技术人员分类为细胞因子，但直接或间接地影响炎症的其他因子(例如，趋化因子、粘附分子等)。在一些实施方案中，炎性介质选自趋化因子、细胞因子、病原体、非肽小分子、化合物、抗体、肽、其片段、其部分以及它们的组合。在一些实施方案中，该炎性信号为模式识别受体(PRR)或其途径的调节剂。

在一些实施方案中，炎性信号选自干扰素、toll样受体信号传导调节剂及其组合。作为非限制性实例，该干扰素可以是干扰素γ。在一些实施方案中，该炎性信号为toll样受体信号传导途径调节剂。

在一些实施方案中，所述炎性信号为toll样受体(TLR)信号传导途径调节剂(regulator)。作为非限制性实例，该toll样受体信号传导途径调节剂可以是脂多糖(LPS)、来自细菌细胞壁的多糖。

所述toll样受体信号传导途径调节剂可选自调节TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR 10的toll样受体信号传导途径调节剂。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是TLR的配体、结合蛋白质、抗体、激动剂或拮抗剂。该toll样受体信号传导途径调节剂可选自肽、蛋白质、细胞碎片、细胞壁组分、脂蛋白、肽聚糖、多糖、单糖和小分子化合物。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是动物细胞、植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞及其组合的一部分。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是TLR2信号传导途径调节剂。作为非限制性实例，该TLR2信号传导途径调节剂可以是脂磷壁酸、MALP-2、MALP-4、OspA、孔蛋白、LcrV、脂甘露聚糖、GPI锚、溶血磷脂酰丝氨酸、脂磷聚糖、糖磷脂酰肌醇、酵母聚糖、hsp60和血凝素。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是TLR4信号传导途径调节剂。作为非限制性实例，该TLR4信号传导途径调节剂可以是丁丙诺啡、卡马西平、乙醇、芬太尼、左啡诺、LPS、美沙酮、吗啡、奥卡西平、羟考酮、哌替啶和葡糖醛木甘聚糖。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是TLR7信号传导途径调节剂。作为非限制性实例，该TLR7信号传导途径调节剂可以是单链RNA或咪唑并喹啉化合物。该toll样受体信号传导途径调节剂可以是TLR8信号传导途径调节剂。作为非限制性实例，该TLR8信号传导途径调节剂可以是单链RNA、富含G的寡核苷酸或咪唑并喹啉化合物。该咪唑并喹啉化合物可以是R848。

在暴露于炎性信号之后，DC可上调其CD80/CD83⁺激活标志物，增加IL-12p70的产生以诱导1型CTL应答，以及抵抗进一步的抗原摄取和加工。

本文所述的用于产生经引发的树突细胞的方法可包括使经引发的树突细胞与干扰素γ接触。在一些实施方案中，所述方法包括在具有选自约100U/mL至约10,000U/mL、约500U/mL至约5000U/mL和约500U/mL至约2,000U/mL浓度的干扰素γ的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约500U/mL浓度的干扰素γ的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约1000U/mL浓度的干扰素γ的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约2000U/mL浓度的干扰素γ的培养基中培养经引发的树突细胞。

本文所述的用于产生经引发的树突细胞的方法可包括使经引发的树突细胞与TLR8激动剂R848接触。在一些实施方案中，所述方法包括在具有选自约0.1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL和约1μg/mL至约10μg/mL浓度的R848的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约1μg/mL浓度的R848的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约5μg/mL浓度的R848的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约10μg/mL浓度的R848的培养基中培养经引发的树突细胞。

本文所述的用于产生经引发的树突细胞的方法可包括使经引发的树突细胞与脂多糖接触。在一些实施方案中，所述方法包括在具有选自约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL和约1ng/mL至约25ng/mL浓度的脂多糖的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约5ng/mL浓度的脂多糖的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约10ng/mL浓度的脂多糖的培养基中培养经引发的树突细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在具有约15ng/mL浓度的脂多糖的培养基中培养经引发的树突细胞。

本文所述的方法可包括对DC的无菌性、特异性和活力评估。可在运输或储存DC之前进行该测试。可在运输或储存DC之后进行该测试。所述方法可包括在RNA或蛋白质水平上测量IL-12p70在DC中的表达水平。IL-12p70是临床反应的独立预测指标，近二十年来在大量试验中进行了测试，其中一些具有约40％的反应率。在通过本文公开的方法产生的经引发的DC中，IL-12p70的表达水平可以是通过传统方法产生/储存/运输的经引发的DC中IL-12p70表达水平的至少约两倍。在通过本文公开的方法产生的经引发的DC中，IL-12p70的表达水平可以是通过传统方法产生/储存/运输的经引发的DC(“传统经引发的DC”)中IL-12p70表达水平的至少约两倍。经引发的DC中IL-12p70的表达水平可以比传统经引发的DC中IL-12p70的表达水平大至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。经引发的DC中IL-12p70的表达水平可以是传统经引发的DC中IL-12p70表达水平的至少约三倍。经引发的DC中IL-12p70的表达水平可以是传统经引发的DC中IL-12p70表达水平的至少约四倍。在通过本文公开的方法产生的经引发的DC中，IL-12p70的表达水平可以是传统经引发的DC中IL-12p70表达水平的大约两倍至约二十倍。

本文提供了产生超过6ng/mL的IL-12p70的树突细胞。本文还提供了产生超过10ng/mL的IL-12p70的树突细胞。在一些情况下，由本文所述的方法产生的DC产生至少约10ng/mL、至少约12ng/mL、至少约14ng/mL、至少约16ng/mL、至少约18ng/mL、至少约20ng/mL、至少约22ng/mL或至少约24ng/mL。在一些情况下，由本文所述的方法产生的DC产生约10ng/mL至约30ng/mL。在一些情况下，由本文所述的方法产生的DC产生约10ng/mL至约25ng/mL。在一些情况下，由本文所述的方法产生的DC产生约15ng/mL到至少约23ng/mL。在一些情况下，由本文所述的方法产生的DC产生约6.5ng/mL到至少约23ng/mL。

CTL应答

本文所述的用于产生DC的方法可包括测试DC诱导CTL应答的能力。测量CTL应答的水平可包括测量来自受试者的血液、血清或血浆中的细胞因子或炎性介质。测量CTL应答的水平可包括测量来自受试者的血液、血清或血浆中的细胞因子或炎性介质的水平变化。测量CTL应答的水平可包括测量细胞因子或炎性介质在体外的产生量。细胞因子和炎性介质可包括白介素、迁移抑制蛋白质、单核细胞趋化蛋白质、单核细胞化学吸引蛋白质、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞炎性蛋白质、单核因子、趋化因子、趋化因子配体(CCL)和C-X-C基序趋化因子(CXCL)及其受体。细胞因子和炎性介质包括但当然不限于白介素1β(IL-1b)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素7(IL-7)、白介素8(IL-5)、白介素10(IL-10)、白介素13(IL-13)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素17(IL-17)、Rantes、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、巨噬细胞炎性蛋白质1α(MIP-1a)、巨噬细胞炎性蛋白质1β(MIP-1b)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单核细胞化学吸引蛋白质-1(MCP-1)、干扰素α(IFNa)、干扰素γ(IFNg)、白介素1受体α(IL-1Ra)，白介素2受体(IL-2R)、肿瘤坏死因子α(TNFa)、干扰素γ诱导的蛋白质(IP-10)和γ干扰素诱导的单核因子(MIG)。可通过肿瘤应答基因(MxA等)的表达来测量CTL应答，从而在非应答者或低应答者中实现高癌症杀伤(使“冷”肿瘤变“热”)以及产生进一步的肿瘤收缩。

硬表面

本文所述的DC制备方法可包括在硬表面上培养DC。如本文所用的术语“硬表面”通常是指标准的塑料组织培养板或培养瓶(例如，聚苯乙烯培养板)。本文公开的方法包括在DC可以粘附的硬表面上培养DC。在一些实施方案中，用蛋白质、肽、细胞外基质分子、聚合物或其组合包被所述硬表面。在一些实施方案中，不包被所述硬表面(例如，DC直接粘附于硬塑料表面)。所述硬表面与软组织培养袋(也称为细胞分化袋)形成对照。软组织培养袋可以是包含降低DC的1型应答能力的聚合物或化学物质(例如，邻苯二甲酸酯)的袋子。软组织培养袋可以是包含引起DC的中性0型应答从而使得DC在功能上钝化的聚合物或化学物质的袋子。软组织培养袋可以是包含选自聚乙烯、氟化乙烯丙烯(FEP)、六氟丙烯、四氟乙烯、聚四氟乙烯及其共聚物以及它们的组合的聚合物的袋子。

本文所述的DC制备方法可包括将DC转移至储存单元。该储存单元还可以是运输单元。该储存单元可以选自柔性或软的容器或表面(例如，袋子)或硬的容器或表面(例如，培养瓶或培养板)。该储存单元可包括硬塑料表面。该储存单元可基本上由硬塑料表面组成。该储存单元可由硬塑料表面组成。该储存单元可包括非塑料表面(例如，玻璃)。该储存单元可基本上由非塑料表面组成。该储存单元可由非塑料表面组成。该储存单元可不含将会被该储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。该储存单元可不含或基本上不含在不成熟DC中诱导中性或0型应答的聚合物。中性应答的特征可在于IL-12p70的低表达。该储存单元可基本上不含将会被该储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。基本上不含可意指，储存单元至少90％、至少95％、至少98％或至少99％不含将会被该储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。基本上不含可意指，储存单元至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％不含将会被该储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。

本文提供了用于储存由本文所述方法产生的DC的储存单元，其中所述储存单元包含内表面，其中所述内表面是与其中所储存的细胞接触的该储存单元的表面。内表面可由硬塑料表面组成。内表面可以是玻璃。内表面可不存在将会被储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。内表面可由不被储存单元内储存的不成熟DC或任何细胞摄取的聚合物构成。内表面可不含将会被储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。内表面可基本上不含将会被储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。内表面可至少90％、至少95％、至少98％或至少99％不含在添加细胞和储存介质之后将被储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。内表面可至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％不含在添加细胞和储存介质之后将被储存单元内储存的细胞摄取和/或在所述细胞中诱导应答的任何聚合物。内表面可不含或基本上不含在不成熟DC中诱导中性或0型应答的聚合物。中性应答的特征可在于IL-12p70的低表达。

本文提供了用于储存由本文所述方法产生的DC的储存单元，其中所述储存单元适合于在液氮中在-70℃下冷冻长达1年，并运输至诊所以供使用。所述方法可包括在储存单元中储存和/或运输成熟DC、不成熟DC、单核细胞或血液。所述方法可包括将细胞在冷却下运输过夜。所述方法可包括解冻或温热细胞至37℃(例如，在温水浴中)。

分离和裂解肿瘤细胞的方法

本文提供了用于治疗受试者的方法，该方法包括将本文公开的DC施用于目标肿瘤细胞。在一些情况下，采用来自受试者的肿瘤细胞引发DC。在一些情况下，该肿瘤细胞是从受试者的肿瘤微环境(在本文中也称为肿瘤支持细胞)分离的细胞。在一些情况下，将树突细胞暴露于肿瘤细胞、肿瘤支持细胞和/或其肽/用它们进行脉冲处理，使得树突细胞将靶向肿瘤细胞和/或支持肿瘤生长和转移的肿瘤支持细胞(例如，内皮细胞、血管细胞、免疫细胞等)。在一些情况下，来自肿瘤细胞和肿瘤支持细胞的肽/抗原诱导具有针对肿瘤细胞和肿瘤支持细胞上的肽/抗原的受体的树突细胞或细胞毒性淋巴细胞，从而导致该树突细胞或细胞毒性淋巴细胞靶向肿瘤微环境，而不是只靶向肿瘤细胞。在一些情况下，从肿瘤组织的活检物获得肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。在一些情况下，该活检物包含选自肿瘤细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、浸润性免疫细胞及其组合的细胞。在一些实施方案中，所述方法包括扩充肿瘤细胞，以具有足够数目的肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物或肿瘤细胞抗原来有效且最佳地引发/脉冲处理DC。扩充可包括肿瘤细胞的体外增殖。

本文提供了用于激活本文公开的DC以靶向肿瘤细胞的方法，其中用裂解的肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞和周围的细胞外基质激活所述DC。在一些情况下，裂解包括使肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞与NH₄Cl酶溶液接触以去除红细胞。在一些情况下，所述裂解包括使肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞与次氯酸溶液接触来诱导免疫原性细胞死亡。在一些情况下，足够温和地裂解所述细胞而不破坏肽。在一些情况下，裂解所述细胞以产生凋亡体或坏死体。在一些情况下，所述方法包括采用酶溶液裂解肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。在一些情况下，所述方法包括采用不含过氧化物的溶液或低过氧化物含量的溶液裂解肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。

本文提供了用于激活本文公开的DC的方法，该方法包括采用次氯酸盐溶液(HOCL)裂解肿瘤细胞。在一些情况系下，该次氯酸盐溶液包含亚氯酸钠。在一些情况系下，该次氯酸盐溶液包含亚氯酸钙。在一些情况下，在悬浮肿瘤细胞的介质中次氯酸盐的浓度为约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM或约100μM。

本文提供了用于激活DC的方法，该方法包括在与DC接触前用去污剂溶液裂解肿瘤细胞和/或肿瘤支持细胞。在一些情况下，该去污剂选自，但不限于Triton X-100、TritonX-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、吐温20、吐温80、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷、SDS、CHAPS和CHAPSO。在一些情况下，该去污剂溶液净化了过氧化物和其他杂质。在一些情况下，该去污剂为约0.1％至约10％v/v的去污剂溶液。在一些情况下，该去污剂为约0.1％至约5％v/v的去污剂溶液。在一些情况下，该去污剂为约0.5％至约5％v/v的去污剂溶液。在一些情况下，该去污剂为约1％至约10％v/v的去污剂溶液。在一些情况下，该去污剂为约1％至约5％v/v的去污剂溶液。在一些情况下，所述方法包括在没有摇动、涡流、冷冻、解冻、剪切压力、超声处理和/或加热细胞的情况下裂解细胞。

在一些情况下，本文所述的细胞裂解方法进一步包括停止或中和裂解。例如，可用缓冲盐水溶液(磷酸盐缓冲盐水溶液或Hank平衡盐溶液)洗涤细胞以中和裂解。

联合疗法

本文提供了包含本文公开的治疗剂与其他类型的剂法以获得最佳结果的联合疗法。例如，在一些情况下，癌症免疫疗法的联合方法可以比单轴攻击(肿瘤可以通过突变来规避)更加有效。在一些实施方案中，所述疗法为癌症疗法。癌症疗法包括但不限于化疗、放射、小分子抑制剂和单克隆抗体。

本文提供了组合物和方法，其中将树突细胞接种与病毒的佐剂作用相结合，以克服肿瘤免疫逃避机制并消耗肿瘤细胞。本文公开的联合疗法的示意图描绘在图1中。本文所述的方法可以用于通过从受试者获得101树突细胞102和肿瘤细胞104，使树突细胞暴露于肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物105(也称为“脉冲处理”树突细胞)以得到经引发的(或“活化的”)树突细胞，在受试者的免疫系统已经用病毒108刺激后，将得到的经引发及肿瘤靶向的树突细胞递送107至受试者，来治疗受试者101的癌症(参见例如图1)。任选地，并非来自该受试者的肿瘤抗原可用于脉冲处理树突细胞。

肿瘤免疫逃避机制是大多数免疫疗法平台缺乏功效的原因。本文所述的组合物和方法提供了将生理学(肿瘤灌注的过热减少，hyperthermic reduction of tumorperfusion)、免疫学(适应性和先天性免疫系统的效应细胞的激活)和凋亡诱导途径(sTRAIL)进行组合以破坏肿瘤细胞的多管齐下的方法。使用病毒如登革病毒(DV)作为佐剂来激活协同作用的许多途径可以支持突变肿瘤细胞的根除，改善癌症免疫疗法的临床效果。与任何单一方法的单独递送相比，本文所述的方法提供了基于多种配合的作用机制的癌症免疫疗法，并且导致肿瘤细胞采用抗性方式的能力下降。

本文提供了用于治疗患有疾病或病况的受试者的方法，该方法包括：获得树突细胞(DC)；将该DC与至少一种肿瘤细胞抗原一起温育；向该受试者施用病毒；以及向该受试者施用所述DC。在一些情况下，该树突细胞为自体的树突细胞。在一些情况下，该树突细胞为同种异体的树突细胞。在一些情况下，将DC与至少一种肿瘤抗原一起温育包括将DC与肿瘤细胞一起温育。在一些情况下，将DC与至少一种肿瘤抗原一起温育包括将DC与肿瘤细胞裂解物一起温育。在一些情况下，将DC与至少一种肿瘤抗原一起温育包括将DC与由肿瘤细胞表达的肽一起温育。在一些实施方案中，所述病况或疾病为癌症。在一些实施方案中，所述病毒为虫媒病毒(Arbovirus)。在一些实施方案中，所述病毒为登革病毒。

本文提供了用于治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括：获得树突细胞(DC)；将该DC与至少一种肿瘤细胞抗原一起温育；向该受试者施用登革病毒2型血清型株；以及向该受试者施用所述DC。在一些情况下，该登革病毒2型血清型株为DENV-2#1710。在一些情况下，该树突细胞是自体的树突细胞。在一些情况下，该树突细胞是同种异体的树突细胞。在一些情况下，将DC与至少一种肿瘤抗原一起温育包括将DC与肿瘤细胞一起温育。在一些情况下，将DC与至少一种肿瘤抗原一起温育包括将DC与肿瘤细胞裂解物一起温育。

施用病毒可增加癌细胞死亡或癌细胞裂解，超出由DC单独诱导的癌细胞死亡或癌细胞裂解。癌细胞死亡可增加至少约10％至25％、至少约10％至约50％、至少约20％至约100％、至少约20％至约200％。施用病毒可减小肿瘤病变的大小，超出由DC单独减小的肿瘤病变大小。肿瘤病变大小可减小至少约10％至约50％、至少约10％至约30％、至少约15％至约80％。施用病毒可减少肿瘤微环境中髓源性抑制细胞(MDSC)的数目，超出由DC单独减少的髓源性抑制细胞数目。施用病毒可使肿瘤微环境中髓源性抑制细胞(MDSC)的数目减少至少约10％至约65％、至少约10％至约85％、至少约10％至约100％或至少约10％至约200％。

登革病毒

本文提供了用于联合疗法的方法，该方法包括向目标肿瘤细胞施用登革病毒(DV)和本文公开的激活的DC，其中向受试者施用所述DC。如本文所用，术语“登革病毒”包括登革病毒血清型1、2、3、4或5中的任何血清型。术语登革病毒还可包括遗传修饰的DV、体外突变的DV以及DV或其蛋白质/肽的组合。DV可以是活的、死的、重组的或其蛋白质/肽。

在原发感染中，DV引起的死亡率非常低(Manson热带病为1/61,000)。该病毒感染但不杀死单核细胞-巨噬细胞和树突细胞系的APC。这些感染的APC随后开始促炎性(TNF-α和IL-1β)和T_H1(IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21)类型的细胞因子级联。这些细胞因子可导致适应性(CTL)和先天性(NK)免疫系统的强烈激活。在3-5天温育时间段之后，发热升至39.5-40.5℃，并持续升高4-5天。受试者经历剧烈头痛、关节痛、不适和对光敏感。到发热的第3天可能会发生皮疹覆盖胸部、背部，并且有时覆盖腿和手臂。临床上，登革感染导致血小板计数降低，从而导致出血，其范围从轻微到休克综合征情况下的危及生命。在基于合理的液体处置进行适当支持性护理的情况下，99％的病例完全恢复。

登革病毒是虫媒病毒，并且仅由埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedesalbopictus)种的蚊子传播。这种病毒具有复杂的生命周期，涉及未确定的森林哺乳动物群(可能是灵长类动物)和人类宿主。雌蚊从受感染的人身上吸食血液，病毒在肠道上皮细胞中复制达高感染滴度(10⁵/ml)，然后蚊子在另一次吸食血液之后利用背压在抽出其口针时将病毒传递给另一人。登革热流行每年感染5000万人，其中有数千人死亡，通常是继发性感染相关休克治疗不足的儿童。

登革病毒基因组编码结构蛋白质、衣壳蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E和非结构蛋白质：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。在一些情况下，该登革病毒是登革病毒的活株。在一些情况下，该登革病毒是登革病毒的减毒株。在一些情况下，该登革病毒是登革病毒的弱毒株。在一些情况下，该登革病毒选自以下血清型的登革病毒：DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4和DENV-5及其组合。

登革病毒是披膜病毒科、黄病毒亚科(B组)的正链RNA病毒。该病毒具有二十面体(icoashederal)几何形状，且直径约为40-45纳米。11,000个碱基的基因组编码核壳(NC)、蛋白质、prM膜融合蛋白、包膜糖蛋白(E)和5个非结构蛋白质NS1-NS5。NC蛋白形成病毒核心，具有通过prM复合体附接的包膜刺突。E糖蛋白是中和抗体的主要靶标，而NS-3和NS-4蛋白质构成CD4+和CD8+CTL的主要靶标。

登革病毒构成五种不同的血清型：DENV-1至DENV-5。血清型2和4对IgG是交叉中和的，而1型和3型也是交叉中和。然而，免疫并不完全，并且登革热在病毒感染中是独特的，原因在于非交叉中和血清型引起的后续感染由于免疫过度激活引起的休克综合征而具有增加的死亡风险。

本文提供了组合物和使用此类组合物的方法，其中该组合物包含登革病毒血清型1、2、3、4或5。在一些情况下，该DV是血清型2。在一些情况下，该DV血清型2是DENV-2株#1710。DENV-2株#1710相对于其他DV株可能具有优势，因为其在感染受试者方面更温和，因此更加安全。其他毒力更强的毒株可能具有更强的抗肿瘤作用，但它们由于安全性问题可能并不适合。作为非限制性实例，毒力更强的毒株为DENV-2株#1584。DENV-2株#1710来自于1985年从波多黎各(Puerto Rico)采集的样品，并且使用包膜基因区特异性的4种引物(见表1)在限制性位点特异性RT-PCR分析中表征为A型。参见Harris等人,Virology 253,86-95(1999)。用这些引物进行的限制性位点特异性RT-PCR产生了582个碱基对、754个碱基对和可能676个碱基对的扩增产物。将DENV-2株#1710记录在CDC数据库中，条目号为555。参见Harris(1999)。DENV-2株#1710在波多黎各流行期间被分离。这次暴发有9,540例疑似DV病例，其中有一例疑似的、但未经确认的、由于该病毒导致的死亡，这表明DEN-2株#1710的毒性非常低，因此适用于本文所公开的方法。

表1.扩增DENV-2#1710病毒的引物的序列和位置

DV和DV感染的某些特征可能使得该病毒对于本文公开的方法尤其有用。例如，DV的独特特征在于原发性感染导致CD4+和CD8+辅助细胞诱导物和细胞毒性效应CTL的T_H1型应答的激活。通过感染但不杀死抗原呈递细胞(APC)(例如树突细胞)，DV上调APC上的CD80和CD83表达，导致促炎性T_H1细胞因子谱。原发性DV感染诱导激活的CD4⁺和CD8⁺效应T细胞以及淋巴因子激活的杀伤细胞的T_H1型应答。这可增加对癌症免疫疗法，如利用本文公开的经引发的树突细胞的疗法的完全应答的可能性。

在一些情况下，登革病毒可提供对肿瘤免疫逃避机制的反击。作为非限制性实例，该肿瘤免疫逃避机制可以是肿瘤细胞上低水平的MHC以防止CTL识别，而反击可以是高干扰素γ通过上调MHC基因表达来提高MHC水平。作为非限制性实例，该肿瘤免疫逃避机制还可以是肿瘤肽中的一个或多个点突变以防止TCR结合，而反击可以是刺激淋巴因子激活的杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞，以靶向表达异常肽或MHC的“逃脱的”肿瘤细胞。在一些实施方案中，该肿瘤免疫逃避机制是肿瘤血管缺乏用于CTL附着和运输的因子，而反击是高TNF-α通过改变PECAM-1恢复间隙、恢复ICAM-1/VCAM-1表达以及P和E-选择蛋白。在一些情况下，该肿瘤免疫逃避机制是通过触发凋亡而对Fas⁺CTL的FasL杀伤，而反击是高IL-6和/或IL-15通过上调FLIP配体保护Fas⁺CTL。在一些实施方案中，该肿瘤免疫逃避机制是HLA-G保护免遭NK细胞的攻击，而反击可以是高IL-2、IL-7、IL-12和/或IL-15提高NK的激活。该肿瘤免疫逃避机制可以是基质屏障抑制CTL，而反击可以是高IFN-γ将巨噬细胞激活为M₁。该肿瘤免疫逃避机制可以是髓源性抑制细胞(MDSC)，而反击可以是iNKT细胞减少MDSC。该肿瘤免疫逃避机制可以是通过TGF-β使CTL失活，而反击可以是T_H1细胞因子重新激活耐受性CTL。该肿瘤免疫逃避机制可以是肿瘤PI-9阻止CTL杀伤，而反击可以是高CD8和ICAM-1表达通过稳定TCR与MHC+自身肽之间的弱相互作用来恢复低亲合力CTL识别和裂解。该肿瘤免疫逃避机制可以是T调节细胞阻止CTL，而反击可以是高CD4^Helper细胞攻克CD4^Reg细胞。

在一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用登革病毒来激活或增强受试者的免疫应答。激活或增强可包括诱导或增加细胞因子和炎性介质的表达。DV感染可以增加其表达的受试者细胞中的基因包括但不限于IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、CD8抗原、ICOSLG、CCL3、CCL5、TRAIL、IP10、GNLY、GZMA、HLA-DRA、HLA-DPα1、HLA-DPβ1和ZAP70。

在一些情况下，本文公开的方法包括向受试者施用DV，其中所述施用导致免疫系统释放TNF-α。TNFα是一种炎性细胞因子，其具有多效性，包括经由TRAIL(TNF凋亡诱导配体)直接杀伤肿瘤细胞。在受试者的组织和循环体液中也可以观察到与这些基因相对应的蛋白质的水平升高。水平可以升高至少2倍。水平可以升高2-1000倍。水平可以升高2-100倍。水平可以升高2-10倍。

在一些情况下，施用DV诱导来自多种细胞(包括γδCTL、活化的M1巨噬细胞和浆细胞样DC(pDC))的高水平的可溶性TRAIL(sTRAIL)。在一些情况下，DV激活IFNβ——一种对于与IFNα相同的受体具有10倍亲和力的多功能细胞因子。IFNβ在抑制病毒RNA转录方面具有相似的抗病毒性质，但在诱导肿瘤细胞凋亡方面比IFNα有效得多。一氧化氮和IFNβ在登革感染期间可以协同作用。这些分子可以接连工作以克服对由M₁巨噬细胞、pDC和δγCTL诱导的高水平sTRAIL介导的凋亡的抗性。

激活或增强受试者的免疫系统可包括诱导或增加受试者中存在的细胞类型。这些细胞类型包括但不限于CD8+CD44+62L-细胞、CD4+CD44+CD62L^lo细胞、HLA-DR+CD8+细胞、Tia-1CD8+细胞、VLA-4CD8+细胞、ICAM-1CD8+细胞和LFA-1CD8+细胞。

癌症

本文提供了用于癌症疗法的方法，该方法包括施用本文公开的治疗剂。本文所述的方法还用于清除癌细胞。在一些情况下，向受试者施用DV诱导免疫应答。在一些情况下，该免疫应答与普通病毒如感冒病毒相比是有效的。在一些情况下，该免疫应答导致肿瘤消退。本文公开的方法可包括开发能够诱导导致消除受试者体内所有肿瘤细胞的免疫应答的DC。

DNA微阵列分析显示，在一个晚期肿瘤受试者中可能存在数百个遗传学上不同的肿瘤克隆。O₂供应与基因突变率之间存在负相关模式。大多数药剂，如细胞毒性药物、抗体和小分子，几乎总是以血液为载体，对逃脱治疗机制的肿瘤克隆施加达尔文(Darwinian)选择压力。具有最低灌注率的克隆既具有低药物暴露量，又具有逃避免疫系统检测的高容量，从而使其对常规疗法具有抗性。本文提供了用于癌细胞靶向的方法，其包括通过向患有癌症的受试者施用DV诱导发热性高热，使得具有突变表型的低流量抗性克隆发生饥饿(starving)，留下更多遗传稳定的克隆以供被活化的淋巴细胞和免疫系统的其他武器(arms)消除。在一些情况下，所述方法包括通过施用经脉冲处理的DC将发热与CTL活化和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)进行组合，导致比常规癌症疗法(例如，抗体药物缀合物、激酶抑制剂、小分子等)或单独的CTL更高的响应率。在晚期癌症受试者中所见的免疫抑制是一个复杂而动态的过程。它涉及对肿瘤抗原本身的耐受性，肿瘤抗原通常被CTL识别为“自身的”。在一些情况下，本文所述的方法包括破坏这种耐受性并获得DV感染所诱导的高水平的T_H1细胞因子。

本文靶向的癌症可以是复发性和/或难治性癌症。在一些情况下，该癌症是急性癌症或慢性癌症。在一些情况下，该癌症是加速的难治性癌症。在一些情况下，该癌症处于缓解期。在一些情况下，该癌症是I期、II期、III期或IV期癌症。在一些情况下，该癌症是青少年癌症或成年癌症。癌症的实例包括但不限于肉瘤、癌、淋巴瘤或白血病。在一些情况下，该癌症是实体瘤或脂肪肉瘤。

在一些情况下，所述癌症是肉瘤。该肉瘤可以是骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症。在一些情况下，肉瘤包括但不限于骨癌、纤维肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、双侧前庭神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤(例如，软组织腺泡状肉瘤、血管肉瘤、叶状囊性肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、上皮样肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤)。该肉瘤可包括尤因肉瘤。

在一些情况下，所述癌症是癌。癌是起源于上皮细胞的癌症，该上皮细胞是覆盖身体表面、产生激素和组成腺体的细胞。作为非限制性实例，癌包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、脑癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、口癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、皮肤癌、输卵管癌、头颈癌、胃肠间质癌、腺癌、皮肤或眼内黑素瘤、肛区癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、垂体癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脑干胶质瘤和脊柱肿瘤。在一些情况下，所述癌症是皮肤癌，诸如基底细胞癌、鳞状、黑素瘤、非黑素瘤或光化性(日光性)角化病。在一些情况下，该癌症是膀胱癌。

在一些情况下，所述癌症是神经内分泌癌。在一些情况下，该癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，该癌症是甲状腺癌。在一些情况下，该癌症是上皮癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、间质卵巢癌或宫颈癌。在一些情况下，该癌症是前列腺癌。在一些情况下，该癌症是皮肤癌。在一些情况下，该癌症是新生血管性皮肤癌。在一些情况下，该癌症是黑素瘤。在一些情况下，该癌症是肾癌、肺癌。示例性肺癌包括但不限于小细胞肺癌或非小细胞肺癌。在一些情况下，该癌症是结直肠癌，例如胃癌或结肠癌。在一些情况下，该癌症是脑癌。在一些情况下，该癌症是脑瘤。在一些情况下，该癌症是胶质母细胞瘤或星形细胞瘤。

在一些情况下，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，该乳腺癌是三阴性乳腺癌(对雌激素受体、孕酮受体和Her2均呈阴性)。在一些实施方案中，该乳腺癌是雌激素受体阳性的(ER+)。

在一些情况下，所述癌症是肺癌。在一些情况下，该肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌或间皮瘤(mesotheliomia)。NSCLS的实例包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。在一些情况下，该间皮瘤是肺和胸腔内衬(胸膜)或腹腔内衬(腹膜)的癌性肿瘤。在一些情况下，该间皮瘤是由于石棉暴露而导致的。

在一些情况下，所述癌症是中枢神经系统(CNS)肿瘤。在一些情况下，该CNC肿瘤被分类为胶质瘤或非胶质瘤。在一些情况下，该胶质瘤是恶性胶质瘤、高分化胶质瘤、弥漫性内因性脑桥胶质瘤。胶质瘤的实例包括星形细胞瘤、少突神经胶质瘤(或少突神经胶质瘤和星形细胞瘤元素的混合型)和室管膜瘤。星形细胞瘤包括但不限于低分化星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、纤维状细胞性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤和室管膜下巨细胞星形细胞瘤。少突神经胶质瘤包括低分化少突神经胶质瘤(或少突星形细胞瘤)和间变性少突神经胶质瘤。非胶质瘤包括脑膜瘤、垂体腺瘤、原发性CNS淋巴瘤和髓母细胞瘤。在一些情况下，该癌症是脑膜瘤。

在一些情况下，所述癌症是血癌。在一些情况下，该癌症是白血病。在一些情况下，该癌症是髓样白血病。在一些情况下，该癌症是淋巴瘤。在一些情况下，该癌症是非霍奇金淋巴瘤。在一些情况下，该癌症选自髓性白血病、淋巴母细胞性白血病、髓样白血病、急性髓样白血病、髓单核细胞白血病、嗜中性粒细胞白血病、骨髓增生异常综合征、B-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、混合细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、复发性小淋巴细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、嗜碱细胞白血病、嗜酸细胞白血病、巨核母细胞性白血病、单核母细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病、红细胞系白血病和肝细胞癌。在一些情况下，该癌症是恶性血液肿瘤。在一些情况下，该恶性血液肿瘤是B细胞恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是慢性淋巴细胞白血病。在一些情况下，该癌症是急性淋巴母细胞性白血病。在一些情况下，该癌症是CD19阳性伯基特淋巴瘤。在一些情况下，该白血病是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病或慢性髓细胞白血病。其他类型的白血病包括但不限于毛细胞白血病、慢性髓单核细胞白血病和青少年髓单核细胞白血病。

在一些情况下，所述淋巴瘤从B淋巴细胞或T淋巴细胞发展而来。两种主要类型的淋巴瘤是先前称为霍奇金病的霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在一些情况下，非霍奇金淋巴瘤是惰性的(indolent)。在一些情况下，非霍奇金淋巴瘤是侵袭性的。非霍奇金淋巴瘤包括但不限于弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、结节边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、结外边缘区B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤和淋巴瘤样肉芽肿病。

施用方法

本文提供了用于治疗受试者中的病况的方法，该方法包括施用本文公开的细胞。该方法可包括施用DC。该方法可包括在不储存或运输DC的情况下在脉冲处理DC之后施用DC。该方法可包括在储存或运输DC之后施用DC。该方法可包括在选自脉冲处理DC之后约1小时至约24小时的时间点施用DC。该方法可包括在选自脉冲处理DC之后约1天至约30天的时间点施用DC。该方法可包括在选自脉冲处理DC之后约1周至约12周的时间点施用DC。

本文提供了用于治疗受试者中的病况的方法，该方法包括向有需要的受试者施用DC。在一些情况下，DC提供于溶液中。在一些情况下，DC通过选自皮下注射、肌肉内注射、皮内注射、经皮给药、静脉内(“i.v.”)给药、鼻内给药、淋巴管内注射和口服给药的途径施用。在一些实施方案中，优选静脉内给药，其引起比其他给药形式(例如，皮下注射)更理想的应答。在一些情况下，通过淋巴管内微导管向受试者输注DC。

本文所述的方法可包括在溶液(例如，0.9％NaCl溶液)中悬浮或混合细胞以用于静脉内(i.v.)给药。静脉内DC可运输至肺，在其中一部分将被捕获，而大多数可传递至次级淋巴器官如肝和脾白髓T细胞区域以引发CTL。

在一些情况下，在施用树突细胞之前至少24小时先施用登革病毒。在一些情况下，在施用树突细胞之前约12小时至约96小时先施用登革病毒。在一些情况下，在施用经引发的树突细胞之前约24小时至约72小时先施用登革病毒。在一些情况下，在施用经引发的树突细胞之前1天至4天先施用登革病毒。在一些情况下，登革病毒仅施用一次。在一些情况下，登革病毒施用不止一次。在一些情况下，登革病毒仅在接收树突细胞之前施用。在一些情况下，登革病毒在接收经引发的树突细胞之后施用。在一些情况下，登革病毒在接收经引发的树突细胞之前和之后施用。

如图2中所见，所述方法可包括在第0天施用经引发的DC，接着两次病毒注射，使得在一周或更短的时间内进行整个治疗。在一些情况下，受试者仅接受整个治疗一次。在一些实施方案中，整个治疗重复不超过一次。在一些实施方案中，整个治疗重复不超过两次。在一些实施方案中，整个治疗重复不超过三次。在一些实施方案中，整个治疗重复不超过十次。

在一些情况下，所述方法包括以约0.5ml 10⁶pfu/ml的剂量施用登革病毒。在一些情况下，该剂量在约10³pfu/ml与约10⁸pfu/ml之间。在一些情况下，该剂量在约10³pfu/ml与约10⁶pfu/ml之间。

在一些情况下，高热或发热的发生证实了登革病毒对受试者的成功感染或接种。在一些情况下，受试者血液/血浆中循环细胞因子的存在或增加证实了登革病毒对受试者的成功感染或接种。细胞因子可以包括但不限于白介素-2和干扰素-γ。

在一些情况下，本文所述的方法包括向有需要的受试者施用经引发的树突细胞仅一次。在一些情况下，经引发的树突细胞施用不止一次。在一些情况下，第一次和第二次施用经引发的树突细胞，其中第一次和第二次相隔约1天、约2天、约3天、约4天、约5天或约6天、约8天、约10天、约12天或约18天。在一些情况下，第一次和第二次相隔约1周、约2周、约3周或约一个月。在一些情况下，第一次和第二次相隔超过一个月。在一些情况下，第一次和第二次相隔不到12个月。在一些情况下，第一次和第二次相隔超过12个月。

在一些情况下，本文所述的方法提供了当受试者高热时向该受试者施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者突发发热后施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到约37.5℃至约42℃之后施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到约38℃至约42℃之后施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到至少约38.5℃之后施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温升高到38.5℃之后施用经引发的树突细胞。在一些情况下，在受试者的体温达到38摄氏度或更高之后向该受试者施用经引发的树突细胞。在一些情况下，通过鼓室或口腔方法来测量受试者的体温。

本文所述的用于产生经引发的DC的方法可包括采用由本文公开的方法产生的DC在体外激活T细胞。在一些情况下，所述受试者不能发生有效的免疫应答。例如，所述受试者可能是免疫受损的。该受试者可能已经接受了使其免疫受损的疗法。该受试者可能患有使其免疫受损的疾病。在这种情况下，所述方法可包括使来自HLA匹配的受试者的T细胞与DC接触。使T细胞与DC在体外接触可诱导CTL应答。使T细胞与DC在体外接触还可诱导T细胞的增殖。

实施例

实施例1.鼠树突细胞(DC)的产生和脉冲处理

使用如Lutz M.等人(J.Immunol.Methods 223:77-92,1999)描述的方法由小鼠骨髓产生成熟DC。将骨髓悬浮液在培养皿中于补充有重组鼠GM-CSF的培养基中温育10天。收集非贴壁细胞，离心并重悬于含有GM-CSF和脂多糖的培养基中。两天后，收集DC并通过台盼蓝排除法测定其活力。通过流式细胞术分析测定DC的纯度。用10μg/ml的合成肽来脉冲处理DC 18小时。温育18小时后，收获DC，在HBSS中洗涤两次，并重悬于HESS中以进行另外的研究(参见实施例2和3)。

实施例2.用于在第一个小鼠模型中治疗黑素瘤的登革病毒和树突细胞

使用登革病毒(DV)株和肿瘤抗原引发的树突细胞(DC)进行小鼠模型测定以观察癌细胞联合靶向的结果。通过尾部注射，向DV C57BL/6小鼠接种0.05ml的1x10⁶或1x10⁷pfu/m1的登革病毒(DEN-2株#1710)。在施用登革病毒(DEN-2株#1710，CDC数据库条目号555，由Duane Gubler博士提供)后第5天、第10天、第15天和第20天，通过静脉内输注以2,000(rIL-2)和500IU(rIFN-γ)施用重组鼠IL-2(Genzyme)和IFN-γ(Sigma Pharmaceuticals)。登革病毒施用后7天，用分开与2种肽一起温育并静脉内注射的小鼠DC免疫C57BL/6小鼠。合成肽。使用来自卵清蛋白(OVA-8)——SIINFEKL(SEQ ID NO：7)的H-2b-限制性肽作为对照。使用来源于抗原gp100/pme117(EGSRNQDWL(SEQ ID NO：1))和来源于TRP-1/75(TAYRYHLL(SEQID NO：2))的B16黑素瘤相关的H-2b-限制性肽来脉冲处理鼠DC(详情参见实施例1)。以14天的间隔进行另外两次DC免疫。在最后一次DC输注后三天，用5×10⁴个活B16黑素瘤细胞在侧尾静脉中静脉内攻击小鼠，然后跟踪记录存活率，将其记录为在肿瘤注射后随时间推移(以天计)的存活动物百分比。记录来自每组五只或更多只小鼠的数据(参见表2和图3)。

表2

在组2(登革病毒血清型2株#1710和肿瘤肽引发的DC)中施用的小鼠中观察到的肺转移数比组1中的对照小鼠低7.5％，组1施用肿瘤肽引发的DC但未施用登革病毒。

实施例3.用于在第二个小鼠模型中治疗黑素瘤的登革病毒和树突细胞

使用登革病毒(DV)株和肿瘤抗原引发的树突细胞(DC)进行小鼠模型测定以观察癌细胞联合靶向的结果。向小鼠施用细胞因子以模拟(parallel)在人类中所观察到的对DV的应答。

使用H-²b-限制性B16小鼠黑素瘤细胞系(ATCC#CRL-6322)在小鼠中建立肿瘤。合成用于脉冲处理树突细胞的肽(来源于抗原gp100/pme117和来源于TRP-1/gp75的B16黑素瘤相关的H-²b限制性肽)。根据如Lutz等人(J.Immunol.Methods 223:77-92,1999)描述的方法从小鼠骨髓产生树突细胞。

在第0天，小鼠在侧尾静脉内通过静脉内注射接受5x10⁴个活B16黑素瘤细胞以建立肺转移。在第7天，通过尾部注射，向小鼠接种0.05ml的1x10⁶或1x10⁷pfu/m1的登革病毒(DEN-2株#1710，CDC数据库条目号555)。在施用登革病毒(DEN-2株#1710)后，每隔5天，通过静脉内输注以2000IU(rIL-2)和500IU(rIFN-γ)来施用重组鼠IL-2(Genzyme)和IFN-γ(Sigma Pharmaceuticals)。在第21天、第35天和第49天，将小鼠DC分别与2种肽一起温育，并在同一天以2次连续给药的方式静脉内注射，以匹配受试者的给药途径和时间表(其他细节参见实施例2)。对照组小鼠未接受登革病毒或接受来自卵清蛋白(OVA-8)——SIINFKEL的H-²b-限制性肽脉冲处理的树突细胞。表3列出了治疗组和对照组。

表3

在第90天，处死动物并对肺肿瘤集落进行计数。吹入Fekette溶液并固定肺后，以盲法编码方式对肺转移进行计数。数据被报告为转移的平均数；每组四只小鼠(参见表4和图4)。进行以下主要器官系统的组织病理学分析：脑、心脏、肺、肝、肾、脾和性腺(数据未示出)。

表4.

在C组小鼠(施用肿瘤抗原引发的DC并且未施用病毒)中观察到的肺转移数比D对照组(施用DENV-2#1710和暴露于对照肽的DC)低47％。在A组小鼠(施用DENV-2#1710和肿瘤抗原引发的DC)中观察到的肺转移数比D对照组(施用DENV-2#1710和暴露于对照肽的DC)低54％。在B组小鼠(施用DENV-2#1710和肿瘤抗原引发的DC)中观察到的肺转移数比D对照组(施用DENV-2#1710和暴露于对照肽的DC)低51％。A组和B组相比于D组平均减少52.8％。

实施例4.致病性较低的登革病毒的制备和筛选

生成具有来自Vero(非洲绿猴肾细胞)的经验证和认证的细胞系的主细胞库，并且测试其没有任何污染物和外来的生物体。世界卫生组织使用Vero系来生产多种病毒疫苗。根据FDA生物制剂中心(CBER)制定的指导方针，将登革病毒在源自主细胞库并确立为工作细胞库的经验证的Vero系中传代。将来自初始种子储备物的两个2型登革病毒株(DNV-2#1584和DENV-2#1710)以10^-5的MOI添加至WCB的Vero细胞中。

在200-ml病毒接种物在37℃下吸附1.5小时后添加第一份4-ml覆盖培养基——其含有在营养培养基(0.165％乳白蛋白水解物[Difco Laboratories,Detroit,Mich.])中的1％SeaKem LE琼脂糖(FMC BioProducts,Rockland,Maine)、0.033％酵母提取物[Difco]、Earle平衡盐溶液、25mg硫酸庆大霉素[BioWhittaker,Walkersville,Md.]和1.0mg/L两性霉素B[Fungizone；E.R.Squibb&Sons,Princeton,N.J.]和2％FBS。在37℃温育7天后，加入每毫升含有另外80mg的中性红活性染色剂(GIBCO-BRL,Gaithersburg,Md.)的第二份2-ml覆盖物。感染后8至11天对噬斑进行计数。

在最终的病毒培养物上进行噬斑测定。如由噬斑测定所估算的，DNV-2#1584的滴度约为5E+06PFU/ml，而DENV-2#1710的滴度为3.5E+06pfu/mL。在感染后5天，来自ATCC的登革病毒2(DNV-2；#1584)显示Vero细胞中有明显的致细胞病变效应，而在盲传#2(#1710病毒)感染后11天，Vero细胞似乎具有形态学变化。(数据未示出)。所述测定显示DENV-2#1710病毒的致细胞病变效应远低于DNV-2#1584株。

实施例5.在有和没有DV的情况下，用脉冲处理的DC进行的癌症杀伤测定

在对照组中，将正常的人肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)直接应用于人黑素瘤FEMX细胞。T细胞受体经由HLA A2.1+与FEMX黑素瘤细胞系相匹配。在治疗组中，将人TIL暴露于含有干扰素和白介素的DV上清液。将暴露的TIL+DV上清液置于具有FEMX肿瘤细胞的培养物中。在T细胞与肿瘤细胞之比为5:1(100,000个细胞比20,000个细胞)的情况下使两组杀伤癌细胞4小时。通过流式细胞术将存活的肿瘤细胞计数为起始细胞的百分比。表5中显示的结果表明，DV诱导35％的额外癌细胞杀伤，超出经脉冲处理的DC的抗癌应答。

表5.经脉冲处理的DC的抗癌活性的DV增强

	FL2-A-％	FL2-A+％(凋亡细胞％)
			CTL	86.1％	13.9％
CTL+DV上清液	81.2％	18.8％

实施例6.人树突细胞分离以及用黑素瘤裂解物抗原进行的脉冲处理

以下实施例表明了由分离的纯CD14+单核细胞生成表达高水平的人IL-12p70的高纯度CD11a+成熟DC群体，以及采用黑素瘤细胞裂解物引发DC，整个过程在短于一周的时间内完成。细胞在硬塑料板上培养并且不暴露于软塑料袋。

分离CD14+单核细胞并分析其CD14、CD15、CD45和7AAD的表达。预运行后，90.25％的输入细胞为CD14+(参见图5)。在接种后24小时，用GM-CSF和IL-4处理CD14+细胞，以生成不成熟的树突细胞。

来自ATCC的RPMI-7951黑素瘤细胞在预运行当天到达，并进行重悬、计数和接种。随后用次氯酸钙溶液处理黑素瘤细胞。或者，用亚氯酸钠溶液处理细胞。将黑素瘤细胞裂解物添加至不成熟的DC，并添加熟化剂IFNγ(1000U/mL)、R848(5μg/mL)和LPS(10ng/mL)。

在用黑素瘤细胞裂解物脉冲处理后22小时以及在添加熟化剂后18小时，收集来自成熟DC的上清液并检查支原体和内毒素。未观察到致病生物体。使用来自DC培养基的上清液进行ELISA测定以测量IL-12p70水平。在第一批细胞中，IL-12p70的浓度为19+/-4ng/mL，与4-6ng/mL的工业标准形成对照。通过相同方案产生的多个批次的细胞显示出浓度为15-23ng/mL的IL-12p70。在细胞被冷冻、解冻和培养之后进行活力测定并记录平均活力为79.2％(与显示70％的比较物相比)。图6显示了相对于数种比较物的IL-12p70产量的DCIL-12p70产量(参见图6中的样品1)。这些比较物方法包括将细胞暴露于软塑料袋，采用除亚氯酸盐溶液以外的溶液裂解细胞，并且不使用LPS、IFNγ和R848的组合使细胞成熟。

将细胞进一步冷冻，随后在4℃下解冻，以检测细胞在冷冻和解冻之后的计数和活力。在解冻开始后约16h、18h、20h和22h测量细胞计数和活力。结果参见表6。在冷冻保存研究中测试非脉冲处理的DC的额外收获物，并显示出超过70％的活力。冷冻保存前活力的范围为85-89％。

表6.经脉冲处理的DC在冻融后的活力

开始解冻后的时间	活力	30ml中的活细胞总数
			16h	68.9％	8.52 x 10^6
18h	67.9％	8.25 x 10^6
			20h	66.3％	7.23 x 10^6
22h	70.3％	11.46 10^6

从这样的缓慢解冻(16h至22h，示于表6中)转变为快速解冻(37℃水浴，约30sec至约5分钟)导致71-79％的活力。未脉冲处理的细胞用作冷冻保存研究。活力的范围为71.4％至79.2％。

实施例7.采用登革病毒在人白细胞中诱导细胞因子

人白细胞(WBC)，包括单核细胞、树突细胞和T淋巴细胞，在时间＝0时以0.1、0.5和2这三种不同的感染复数(MOI)用模拟病毒或登革病毒进行感染。在感染后48h、72h和96h测量多种细胞因子的水平(pg/mL)。一式三份地进行处理。每个时间点的结果示于表7-表9中。(M＝模拟病毒。0.1、0.5和2为MOI)。计算在评估的MOI下模拟病毒与登革病毒之间的一式三份变化平均值，并以百分比的形式示于表10中。

表7.在登革病毒感染后48h由人WBC产生的细胞因子水平

表8.在登革病毒感染后72h由人WBC产生的细胞因子水平

表9.在登革病毒感染后96h由人WBC产生的细胞因子水平

表10.在模拟感染与登革热感染之间WBC细胞因子水平的相对变化

实施例8.额外的病毒制备方案

除了实施例4的方法以外，还分别使用来自盲传#2、DENV-2#1710和DNV-2#1584的上清液的稀释液感染Vero和FRhL细胞。为了提高检测灵敏度，开发免疫荧光染色来检测采用来自盲传#2的上清液感染的细胞中的病毒。

必要时，使用超速离心法来浓缩病毒。在确认病毒滴度后，过滤最终产物以去除任何细胞碎片，评估是否存在任何外来生物体，并且在得到最终批次后，将其装入5ml瓶子中，并在4℃下储存直到准备运输及施用。

实施例9.从供体收集PBMC

由受过训练的人员使用适当的设备在设施中对供体(自体的或HLA匹配的同种异体的)进行白细胞提取程序。在白细胞提取法结束后，将红细胞、血小板和血浆蛋白质返回至供体。针对细菌污染的存在对白细胞提取法产物进行现场评估(革兰染色测试和鲎变形细胞裂解[LAL])。通过后，用供体特定的信息对收集容器(附接小的测试样品容器)进行条形编码，并置于符合FDA和DOT关于储存和运输非感染性生物材料的规定的经批准的运输容器中。该运输容器中包装有冷却物(例如，固体CO₂、液氮)和温度监测器。该运输容器为硬塑料瓶。快递员在24小时内将该容器运送至GMP制造设施。

实施例10.用肿瘤抗原脉冲处理的树突细胞的制备和使用

将单核细胞与其他收集的白细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)分离。这通过免疫磁性选择或备选地通过粘附性质来实现。免疫磁性选择包括将白细胞倒入具有塑料珠的无菌塑料柱中，该塑料珠上包被有针对免疫细胞CD表面蛋白质(CD4/CD8/CD56等)的抗体。

免疫磁性选择的实例是可从Stem Cell Technologies(Vancouver,B.C,Canada,www.stemcell.com)获得的EasySep单核细胞富集试剂盒。为了使用EasySep试剂盒，将白细胞提取法产物悬浮于无菌PBS中并倒入EasySep塑料柱中，该塑料柱含有与针对人CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD56、CD66b、CD123和血型糖蛋白A的鼠抗体的四聚体抗体复合物。在温育10分钟之后，添加EasySep磁性颗粒。粘附于珠子上的细胞在电磁分选中被去除。倒置磁体，并将所需的细胞级分(单核细胞)倒入无菌聚苯乙烯瓶中以进行另外的处理。或者，在阳性粘附选择测定中，将用CD1+/CD14+抗体包被的磁珠与单核细胞混合，将磁体抵靠柱子而放置，并用PBS溶液将未结合细胞冲洗出柱子。随后从珠子上洗掉单核细胞。在阳性粘附选择中，利用单核细胞附着于特定表面的特性，通过使白细胞提取法产物由上而下地沿着倾斜的柱子流动来分离单核细胞。

或者，采用针对CD3、CD4和CD8的单克隆抗体，通过荧光激活细胞分选(FACS)除去骨髓细胞中的淋巴细胞和MHC类阳性细胞。将剩余的细胞在37℃下、5％CO₂气氛中在补充有人AB血清的基底细胞培养基中培养过夜。选择人AB血清是因为其比其他血清类型以更快的速率使细胞生长，并且不含血清的培养基产生具有低得多的T细胞刺激能力的DC。24小时后，将细胞在粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)和900U/ml的重组IL-4的存在下重新接种并培养。3至4天后，将培养基换成新鲜的细胞因子培养基。

或者，使用以下方法制备真皮树突细胞(DDC)：将来自健康人志愿者的Keratome在RPMI 1640中终浓度为1.2U/ml的细菌蛋白酶分散酶2型溶液中于37℃下温育1小时。温育期后，表皮和真皮得以轻松分离。然后用PBS洗涤几次后，将表皮和真皮片切成小块(1-10mm)，并置于补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640中，并置于10cm组织培养板中。2-3天后，去除组织块，并收集培养基。将离开组织切片迁移到培养基中的细胞离心，重悬于1-2ml的新鲜培养基中，并用台盼蓝染色。通过在甲泛葡胺梯度上分离来实现进一步富集。将细胞铺在3ml高渗14.5％甲泛葡胺柱上，并在室温下以650g沉降10分钟。收集低密度的间期细胞，并用连续两次较低高渗性的洗液(含有10％FBS和40mM NaCl的RPMI 1640)进行洗涤，以使细胞恢复至等渗。

当收集单核细胞时，它们可能只有几千个。在多步骤方案中使用重组人生长因子rhu白介素-4(IL-4)和rhu粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)来实现将DC数扩充至5000万左右。在IL-4和GM-CSF加入后，评估细胞数目的扩充和其中成熟DC标志物(CD11+、CD80+、CD83+)的发展，以及I类(用于将短肽呈递给CD8+细胞)和II类MHC复合物(用于将更长的肽呈递给CD4+辅助诱导T淋巴细胞)的增加的表达。大约3-4天后，测量成熟DC的数目。例如，将单核细胞富集的级分置于Nuclon包被的Cell Factory(Thermoscientific)中，其中在前24小时之后添加不含血清的DC培养基(CellGro,Inc.)，该培养基中补充有GMP-2％人AB血清、500IU/ml(约50ng/ml)rhuIL-4(CellGenix)和500IU/ml(约50ng/ml)rhuGM-CSF(CellGenix)。最终产物约为1L的总培养基体积。在培养约72小时后，针对以下标志物对不成熟DC群体进行评估：CD1⁺、CD11⁺、CD14⁺。

实施例11.脉冲处理树突细胞

多种肿瘤抗原来源用于高质量DC：肽、来自自体肿瘤的裂解物、全肿瘤细胞和编码特定肿瘤抗原的RNA。通过手术或抽血获得含有白血病细胞或淋巴瘤细胞的切除活检物或血液样品，然后进行磁性选择以获得白血病/淋巴瘤细胞。一旦获得肿瘤细胞，便将它们进行条形编码并在类似于先前对于白细胞提取法所述的经批准的容器中运输至GMP设施。通过细菌污染测试后可在-70℃下冷冻样品。

通过几种方法制备全自体肿瘤细胞裂解物。为了制备该裂解物，可使用水浴或其他程序将肿瘤样品再温热至约35℃。像Miltenyi GentleMACS系统这样的自动化细胞处理器的开发使得样品可以被手动切碎，悬浮在PBS溶液中，然后用预先选择的组织特定的、软件控制的转子系统分离肿瘤细胞。将细胞添加至酶混合物中，然后转移至MiltenyiGentleMACS离解器。可使用次氯酸盐溶液在对肿瘤肽的损伤最小的情况下将单细胞悬浮液进行膜裂解，该次氯酸盐溶液将杀死任何残留的肿瘤细胞，中和dT_H2细胞因子，并且由于较好的CTL亲和力、亲合力和激活而增加免疫原性。添加次氯酸盐之后，将培养板在37摄氏度、5％CO₂下温育1小时，轻轻地手动搅拌30min以将次氯酸盐分散开。将细胞洗涤两次以中和裂解反应(例如，采用HBSS)。次氯酸盐处理的细胞可经历后续的冻融循环。或者，样品不分离肿瘤细胞。相反，留下的样品含有肿瘤细胞和支持细胞(例如，来自肿瘤微环境的细胞)。用次氯酸钙裂解细胞以消除红细胞并产生凋亡体和坏死体，而不破坏CTL诱导所需的肽。

在产生不成熟的DC的第三天添加来自GentleMACS的裂解物。将不成熟的DC与肿瘤裂解物共培养约16小时。最后一步是采用炎性信号进行成熟化。将临床等级的LPS(60EU/ml)(R&D Invivogen)和干扰素-γ(2000IU/ml，约100ng/ml)(R&D Systems)添加至培养瓶中并温育约12小时，以使脉冲处理的DC成熟。在暴露于LPS之后，评估DC中CD80/CD83⁺激活标志物的上调，以及IL-12p70产量的增加。该阶段的过程中测试包括无菌性(如前所述)、活力(通过台盼蓝染料排除法确定的活细胞％)和特异性(通过CD11c流式细胞术测量的DC％)。

在最后的无菌性、特异性和活力评估后，将DC转移到适合在液氮中在-70℃下冷冻的硬塑料容器中，储存至多1年，然后运送到诊所以供使用。将该容器在冷却下运输过夜，然后在温水浴中再温热至37℃，之后在30分钟内与0.9％NaCl溶液同时静脉内施用。所述DC静脉内施用。

实施例12.用于癌症治疗的联合递送

登革病毒的施用与其他病毒疫苗注射相似。受试者的肩部(三角肌)区域的皮肤区域用酒精清洁，然后在皮下注射0.5ml病毒以模仿蚊子叮咬。一旦在DV注射2-3天后受试者发热达到38.5℃，即通过淋巴管内微导管向受试者输注脉冲处理的(经引发的)树突细胞。重复注射，直到受试者呈疾病阴性。DC融合将使用如实施例6中制备的细胞。

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案均可用于实施本发明。旨在由以下权利要求来限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

序列表

<110> 普莱瓦克斯免疫肿瘤学公司

<120> 用于产生树突细胞的组合物和方法

<130> 48253-703.601

<140>

<141>

<150> 62/284,434

<151> 2015-09-26

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 1

Glu Gly Ser Arg Asn Gln Asp Trp Leu

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 2

Thr Ala Tyr Arg Tyr His Leu Leu

1 5

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 3

ggatcccaag aaggggccat 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 4

ggcagctcca tagattgct 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 5

ggtgttgctg cagatggaa 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成引物

<400> 6

gtgtcacaga cagtgaggt 19

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 7

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

Claims (71)

1.一种用于产生经引发的树突细胞的方法，该方法包括：

a)在硬表面上培养树突细胞；

b)采用次氯酸盐溶液裂解至少一个细胞以产生裂解物；

c)使所述树突细胞与所述裂解物接触以产生经引发的树突细胞；以及

d)使所述经引发的树突细胞成熟化，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少6ng/mL IL-12p70。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约6.5ng/mL IL-12p70。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生约19ng/mL IL-12p70。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述硬表面为塑料表面。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述硬表面包含聚苯乙烯。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述硬表面基本上不含降低由所述经引发的树突细胞产生的1型应答的组分。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述组分选自氟化聚乙烯、氟化聚丙烯和邻苯二甲酸酯。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解物包含多个完整细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂为咪唑并喹啉化合物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述咪唑并喹啉化合物为R848。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个细胞为肿瘤细胞。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述树突细胞对受试者而言是自体的或同种异体的。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述树突细胞是与所述受试者相HLA匹配的同种异体细胞。

15.根据权利要求1所述的方法，该方法包括从受试者获得所述至少一个细胞，其中所述细胞与有害的疾病状态有关。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述有害的疾病状态为增生性病症或自身免疫病症。

17.根据权利要求1所述的方法，其中成熟化进一步包括使所述经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂、toll样受体4激动剂或(ii)干扰素γ接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述toll样受体2激动剂或所述toll样受体4激动剂为脂多糖。

19.根据权利要求1所述的方法，其中成熟化进一步包括使所述经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂和(ii)干扰素γ接触。

20.根据权利要求1所述的方法，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与R848、脂多糖和干扰素γ接触。

21.一种用于产生经引发的树突细胞的方法，该方法包括：

a)在硬表面上培养树突细胞；

b)从受试者获得至少一个癌细胞；

c)采用次氯酸盐溶液裂解所述至少一个癌细胞以产生裂解物；

d)使所述树突细胞与所述裂解物接触以产生经引发的树突细胞；以及

e)使所述经引发的树突细胞成熟化，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂接触。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少6ng/mL IL-12p70。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约6.5ng/mLIL-12p70。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生约19ng/mL IL-12p70。

25.根据权利要求21所述的方法，其中所述硬表面为塑料表面。

26.根据权利要求21所述的方法，其中所述硬表面包含聚苯乙烯。

27.根据权利要求21所述的方法，其中所述硬表面基本上不含降低由所述经引发的树突细胞产生的1型应答的组分。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述组分选自氟化聚乙烯、氟化聚丙烯和邻苯二甲酸酯。

29.根据权利要求21所述的方法，其中所述裂解物包含多个完整细胞。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述多个完整细胞为增殖未激活的癌细胞。

31.根据权利要求21所述的方法，其中所述toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂为咪唑并喹啉化合物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述咪唑并喹啉化合物为R848。

33.根据权利要求21所述的方法，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂或(ii)干扰素γ接触。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述toll样受体2激动剂或所述toll样受体4激动剂为脂多糖。

35.根据权利要求21所述的方法，其中成熟化进一步包括使所述经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂和(ii)干扰素γ接触。

36.根据权利要求21所述的方法，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与R848、脂多糖和干扰素γ接触。

37.根据权利要求21所述的方法，其中所述toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂为脂多糖。

38.根据权利要求21所述的方法，其中所述树突细胞对所述受试者而言是自体的或同种异体的。

39.根据权利要求21所述的方法，其中所述树突细胞是与所述受试者相HLA匹配的同种异体细胞。

40.根据权利要求21所述的方法，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与选自toll样受体2激动剂、toll样受体4激动剂、干扰素γ及其组合的至少一种熟化剂接触。

41.一种用于治疗或减轻有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括：

a)在硬表面上培养树突细胞；

b)获得至少一个癌细胞；

c)采用次氯酸盐溶液裂解所述至少一个癌细胞以产生裂解物；

d)使所述树突细胞与所述裂解物接触，从而产生经引发的树突细胞；以及

e)向有需要的受试者施用所述经引发的树突细胞。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少6ng/mL IL-12p70。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少约6.5ng/mLIL-12p70。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生约19ng/mL IL-12p70。

45.根据权利要求41所述的方法，其中所述树突细胞对所述受试者而言是自体的或同种异体的。

46.根据权利要求41所述的方法，其中所述至少一个癌细胞来自所述受试者。

47.根据权利要求41所述的方法，该方法进一步包括使所述经引发的树突细胞成熟化，其中成熟化包括添加熟化试剂，其中所述熟化试剂包含toll样受体7激动剂或toll样受体8激动剂。

48.根据权利要求47所述的方法，其中成熟化进一步包括使所述经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂或(ii)干扰素γ接触。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述toll样受体2激动剂或所述toll样受体4激动剂为脂多糖。

50.根据权利要求47所述的方法，其中成熟化进一步包括使所述经引发的树突细胞与(i)toll样受体2激动剂或toll样受体4激动剂和(ii)干扰素γ接触。

51.根据权利要求47所述的方法，其中成熟化包括使所述经引发的树突细胞与R848、脂多糖和干扰素γ接触。

52.一种用于治疗或减轻有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括：

a)从受试者获得树突细胞；

b)在硬表面上培养所述树突细胞；

c)从所述受试者获得癌细胞；

d)采用次氯酸盐溶液裂解所述癌细胞以产生裂解物；

e)使所述树突细胞与所述裂解物接触，从而产生经引发的树突细胞；

f)向所述受试者施用所述经引发的DC；以及

g)向所述有需要的受试者施用登革病毒。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述登革病毒为DENV-2株#1710。

54.根据权利要求52所述的方法，其中所述硬表面为硬塑料表面。

55.根据权利要求52所述的方法，其中所述硬塑料表面为聚苯乙烯表面。

56.根据权利要求52所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生至少6ng/mL IL-12p70。

57.根据权利要求52所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生约6.5ng/mL IL-12p70。

58.根据权利要求52所述的方法，其中所述经引发的树突细胞产生约19ng/mL IL-12p70。

59.一种用于清除受试者中的癌细胞的方法，该方法包括：

a)向有需要的受试者施用登革病毒血清型2；

b)引发树突细胞，其中引发包括：将所述树突细胞暴露于裂解物以产生经引发的树突细胞，其中所述裂解物包含多个癌细胞，每个癌细胞包含在所述癌细胞表面上存在的抗原；以及

c)向所述受试者施用所述经引发的树突细胞，其中所述施用在所述受试者中提供了占癌细胞群体的33％或更高的清除率。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述施用在所述受试者中提供了占癌细胞群体的33％的清除率。

61.根据权利要求59所述的方法，该方法进一步包括静脉内施用所述登革病毒血清型2并且静脉内施用所述经引发的树突细胞群体。

62.根据权利要求59所述的方法，其中所述多个癌细胞来自所述受试者。

63.根据权利要求59所述的方法，其中所述登革病毒血清型2为DENV-2株#1710。

64.一种用于治疗或减轻有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括向所述受试者施用通过权利要求1至40的任何一种方法产生的经引发的树突细胞。

65.根据权利要求64所述的方法，其中静脉内施用所述经引发的树突细胞。

66.根据权利要求64所述的方法，该方法包括向所述受试者施用登革病毒2。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述登革病毒2为毒株#1710。

68.一种通过权利要求1至40的任何一种方法产生的经引发的树突细胞。

69.根据权利要求68所述的经引发的树突细胞，其中所述经引发的树突细胞用于癌症的治疗。

70.通过权利要求1至40的任何一种方法制备的经引发的树突细胞在治疗癌症中的用途。

71.有效量的通过权利要求1至40的任何一种方法制备的经引发的树突细胞，其用于治疗癌症。