CN109609452A - 一种高效的巨噬细胞体外制备方法 - Google Patents

一种高效的巨噬细胞体外制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术和细胞培养技术的联合应用，公开了一种高效的巨噬细胞体外制备方法。巨噬细胞是体内重要的免疫细胞，它参与多种免疫学功能，如抗感染、抗肿瘤、参与免疫应答和免疫调节等。本发明通过实施，在体外分离的单个核细胞培养基中，通过加入自体血浆，GM‑CSF和HClO处理致死的肿瘤细胞，得到高效诱导的M1表型巨噬细胞。

Description

一种高效的巨噬细胞体外制备方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种高效的巨噬细胞体外制备方法。
背景技术
巨噬细胞是来源于髓系的细胞，它是三大抗原递呈细胞之一，具有广泛的生物学效应，如抗感染、抗肿瘤、参与免疫应答和免疫调节等，是参与非特异和特异性免疫的重要细胞。巨噬细胞在炎症反应过程中可显示出从促炎到抗炎两种不同的作用，其中M1和M2为两种主要的巨噬细胞表型。研究表明，M1参与促炎这一过程，而M2则具有抗炎作用。
M1促炎巨噬细胞或典型的活化巨噬细胞具有攻击性和高度吞噬性，并会产生大量的活性氧类和活性氮类，从而促进Th1响应。M1巨噬细胞可分泌高水平的重要炎性细胞因子IL-12。IL-12诱导Th17细胞的活化和克隆扩增。这些特征容许M1巨噬细胞控制转移，抑制肿瘤生长，并控制微生物感染。典型的活化巨噬细胞被认为在癌细胞的识别和破坏中起重要的作用，这是由于它们的存在通常表明良好预后。但是，诸如肿瘤微环境可将M1巨噬细胞极化为M2巨噬细胞。
因巨噬细胞功能多样，当前国际上进行CAR-巨噬细胞临床实验，用于实体瘤肿瘤治疗；其原理为通过激活巨噬细胞发挥抗肿瘤和抗原递呈功能，CAR-巨噬细胞与T细胞共同发挥抗肿瘤作用。研究表明主要为M1型巨噬细胞发挥上述免疫作用。
目前，巨噬细胞虽容易获得，但现有技术得到的巨噬细胞M1纯度很低，且细胞扩增效率不高。鉴于其重大抗肿瘤等免疫学作用，开发M1巨噬细胞高效培养方法十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的巨噬细胞的制备方法，以方便进行与肿瘤治疗相关的巨噬细胞技术研究，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种高效的巨噬细胞的制备方法：
1)人外周血PBMC的分离
使用人淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(PBMC)；将分离的单个核细胞静止于培养瓶培养2-8h。
2)HClO处理致死肿瘤细胞
用胰酶消化肿瘤细胞成单细胞状态，制备单细胞悬液；向单细胞状态的肿瘤细胞中加入HClO(终浓度为35μm，处理2小时)，处理获得全部致死的肿瘤细胞悬液；
3)制备巨噬细胞
其制备方法为：第1日，移去T25cm2培养瓶中未贴壁的细胞，向贴壁的单个核细胞加入GT-T551H3培养基(Takara生产)，并依此添加自体血浆至终浓度为5％，GM-CSF(终浓度为30ng/ml)和HClO(终浓度为35μm)处理致死的肿瘤细胞，将培养瓶中的细胞移入37℃，CO2培养箱中培养；培养的第3日，再次添加自体血浆至终浓度为1％和GM-CSF细胞因子(终浓度为30ng/ml)，同时添加CD86抗体(终浓度20ng/ml)；于第7日观察细胞形态；培养至第10日收集细胞，用于鉴定巨噬细胞表型和吞噬功能。
本发明获得M1表型巨噬细胞高效诱导培养方法。该方法是通过加入自体血浆，GM-CSF和HClO处理致死的肿瘤细胞，最终获得纯度占比60.2％的M1表型巨噬细胞。该类细胞与B肿瘤细胞系Raji共培养，表现出对靶细胞具有显著的吞噬作用。
附图说明
图1为巨噬细胞培养流程图。
图2为巨噬细胞分化CD14分子表达效率统计表。
图3为M1表型巨噬细胞纯度检测统计图。
图4为巨噬细胞吞噬Raji的效率统计图。
具体实施步骤
为了对本发明所作进一步说明，下面将结合附图说明和具体实施方式做分别介绍。本发明的实现方式并不仅限于实施方式所公开的内容与技术，因此凡对本方案技术所进行的等同替换，均在本发明的保护范围之内。
实施例1：人外周血单个核细胞(PBMC)分离
(1)采集供者外周血50ml，800g，离心10min。离心后可观察到分层现象。上层为血浆层，中间层为白膜层，最下端为红细胞层。
(2)用吸液管缓慢收集血浆层，56度灭活30min。
(3)淋巴细胞分离液分离白膜层：使用吸管小心抽吸白膜层细胞，加入PBS中，两者完全混匀；将淋巴分离液的加入15ml离心管中，再等体积加入PBS混合液。700g，离心15min。
(4)洗涤PBMC：离心后小心抽吸离心管中间的白膜层细胞，加入PBS混匀清洗一次。离心后，弃PBS；再加入GT-T551H3培养基重悬，再次清洗细胞。
(5)弃去培养基，加入新的培养基重悬PBMC细胞。将单个核细胞平均分瓶于3个T25cm2培养瓶中。
实施例2：HClO处理致死肿瘤细胞
(1)消化肿瘤细胞：将肿瘤细胞传代2代以上，0.05％胰酶消化5min，将其消化成单细胞状态。
(2)HClO处理肿瘤细胞：配制HClO溶液，并将其按照终浓度为25μm
、35μm、45μm和55μm的HClO溶液分别处理肿瘤细胞，处理1-3h。
(3)肿瘤细胞活性鉴定
分别取处理后的肿瘤细胞，对其进行活性鉴定。最终确定为使用HClO(终浓度为35μm)溶液处理肿瘤细胞2h，获得完全致死的细胞悬液。
实施例3：巨噬细胞激活与扩增方法
(1)PBMC获得：将步骤1.1最终分离的PBMC等数量分瓶至3个T25cm2培养瓶中(1.5x107个/瓶)，移入37℃，CO2培养箱中培养8h，移去上清液。此时的贴壁细胞，将经过如下3种方案处理，可诱导形成人巨噬细胞。
(2)巨噬细胞的制备方案：
制备方案1为：第1日，移去T25cm2培养瓶中未贴壁的细胞，向贴壁的单个核细胞加入GT-T551H3培养基(Takara生产)，并依此添加自体血浆至终浓度为5％和GM-CSF细胞因子(终浓度为30ng/ml)，将培养瓶中的细胞移入37℃，CO2培养箱中培养；培养的第3日，再次添加自体血浆至终浓度为1％和GM-CSF细胞因子(终浓度为30ng/ml)；于第7日观察细胞形态；培养至第10日，进行巨噬细胞计数、纯度鉴定和吞噬功能检测。
制备方案2为：第1日，移去T25cm2培养瓶中未贴壁的细胞，向贴壁的单个核细胞加入GT-T551H3培养基(Takara生产)，并依此添加自体血浆至终浓度为5％，GM-CSF细胞因子(终浓度30ng/ml)和HClO(终浓度35μm)处理致死的肿瘤细胞，将培养瓶中的细胞移入37℃，CO2培养箱中培养；培养的第3日，再次添加自体血浆至终浓度为1％和GM-CSF细胞因子(终浓度30ng/ml)；于第7日观察细胞形态；培养至第10日，进行巨噬细胞计数、表型鉴定和吞噬功能检测。
制备方案3为：其制备方法为：第1日，移去T25cm2培养瓶中未贴壁的细胞，向贴壁的单个核细胞加入GT-T551H3培养基(Takara生产)，并依此添加自体血浆至终浓度为5％，GM-CSF(终浓度为30ng/ml)和HClO(终浓度为35μm)处理致死的肿瘤细胞，将培养瓶中的细胞移入37℃，CO2培养箱中培养；培养的第3日，再次添加自体血浆至终浓度为1％和GM-CSF细胞因子(终浓度为30ng/ml)，同时添加CD86抗体(终浓度20ng/ml)；于第7日观察细胞形态；培养至第10日收集细胞，用于鉴定巨噬细胞表型和吞噬功能。
实施例4：M1表型巨噬细胞纯度鉴定
将细胞进行胰酶消化后，400g，离心5min，PBS洗涤一遍；加入100ul PBS溶液，轻柔悬浮细胞沉淀，加入2ul CD14抗体和CD86流式抗体，室温避光孵育30min；其后再用PBS洗涤两次，加入100ul PBS溶液，轻柔悬浮细胞。流式细胞仪上机分别鉴定三个方案中的巨噬细胞纯度和M1表型巨噬细胞纯度。图2为巨噬细胞分化CD14分子表达效率统计表。图3为M1表型巨噬细胞纯度检测统计图。
分别对3种方案获得的细胞进行M1表型巨噬细胞纯度和细胞扩增倍数检测，根据检测结果分析可得；方案3诱导获得M1表型巨噬细胞占比最高，巨噬细胞扩增倍数最大，而方案2的检测结果优于方案1。方案1为常规巨噬细胞诱导培养方法；据此推断：通过添加一定浓度的HClO(终浓度为35μm)致死肿瘤细胞和CD86抗体(终浓度20ng/ml)，可诱导单个核细胞向巨噬细胞转化，尤其促进M1表型巨噬细胞的转化。
实施例5：细胞因子TNF-a水平测定
将Raji加入24孔板中，每孔加入2*105个细胞。然后稀释巨噬细胞成2.5x106个/ml，将巨噬细胞与Raji以5：1，10：1，20：1的效靶比进行共培养，每孔终体积1ml。培养36h后，以3000rpm，离心10min收集上清液，置于-20度保存。测定细胞因子水平前，可对上清夜稀释10倍再进行测定。Human TNF-a测定试剂盒购自达科为生物科技有限公司。
实施例6：CFSE标记测定巨噬细胞对于Raji细胞的吞噬作用
CFSE为荧光染料，可标记活细胞，此处用于验证活化的巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。体内的巨噬细胞具有一定的吞噬作用。Raji细胞为B细胞肿瘤细胞。本发明将诱导培养得到的巨噬细胞与Raji细胞共培养。胰酶消化巨噬细胞，离心重漩配置成单细胞悬液，与CFSE标记的Raji共培养，两者细胞数量比为1：2，移入培养箱中培养2h。收集细胞，用PBS清洗2次，加入流式抗体anti-CD14,孵育1h。PBS洗涤两次，流式上机鉴定CD14+CFSE+双阳性表达的比例，该类巨噬细胞发挥了吞噬作用。巨噬细胞吞噬效果说明见于图4。
统计学分析
所有数据均为表示。使用SPSS18.0(Statistical Product and ServiceSolutions)软件，分析实验结果。当P<0.05时，认为具有统计学意义。
吞噬实验结果分析表明，本发明中方案3培养的活化型巨噬细胞吞噬功能最强；方案3培养的巨噬细胞扩增倍数最大。同时方案3培养的M1表型的巨噬细胞纯度最高，为60.2％；而方案1和方案2所得细胞纯度则分别为28.9％和47.9％。同时由数据分析可得，本发明实施的方案3中的诱导方法切实可行，效果显著。由此，本发明建立了一个高效的巨噬细胞制备方法。

Claims (4)

1.本发明中高效的巨噬细胞体外制备方法，其特征在于，获得主要有以下步骤：人外周血PBMC的分离；制备与培养方案实施；M1表型巨噬细胞纯度鉴定；细胞因子TNF-a水平测定和肿瘤杀伤功能验证。
2.根据权利要求1所述的高效的巨噬细胞体外制备方法，其特征在于第1日，移去T25cm2培养瓶中未贴壁的细胞，向贴壁的单个核细胞加入GT-T551 H3培养基，并依此添加自体血浆至终浓度为5％，GM-CSF(终浓度为30ng/ml)和HClO(终浓度为35μm)处理致死的肿瘤细胞，将培养瓶中的细胞移入37℃，CO2培养箱中培养；培养的第3日，再次添加自体血浆至终浓度为1％和GM-CSF细胞因子(终浓度为30ng/ml)，同时添加CD86抗体(终浓度20ng/ml)；于第7日观察细胞形态；培养至第10日收集细胞，用于鉴定巨噬细胞表型和吞噬功能。
3.根据权利要求1所述的高效的巨噬细胞体外制备方法，可获得纯度占比60.2％的M1表型巨噬细胞，有利于其在细胞治疗中的应用。
4.根据权利要求1所述的高效的巨噬细胞体外制备方法，可有效减少M2表型巨噬细胞库。
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