CN109161527A - 一种高效的nk细胞扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养的技术领域，公开了一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、使用包被液对用于培养NK细胞的细胞培养瓶进行包被处理；(2)、从外周血中分离出含NK细胞的单个核细胞(PBMC)；(3)、在细胞激活培养液中添加细胞刺激因子进行PBMC激活；(4)、将激活后的PBMC接种到步骤(1)中包被处理后的细胞培养瓶中；(5)、使用诱导培养液对PBMC进行诱导培养，获得高活性和纯度的NK细胞；本发明采用的NK细胞扩增方法具有操作简单、扩增效率高、细胞活性高和细胞纯度高的特点，在培养过程中不添加饲养细胞和异种血清，不会带来医学伦理和GVHD风险问题，适用于大规模NK细胞制备及临床应用。

Description

一种高效的NK细胞扩增方法
技术领域
本发明涉及细胞培养的技术领域，尤其一种高效的NK细胞扩增方法。
背景技术
NK细胞(Natural killer cells，NK cells)即自然杀伤细胞，是机体天然免疫系统的重要组成部分，也是抗病毒、抗肿瘤的重要组成细胞。
NK细胞的发育最早在胚胎肝脏中进行，出生后转移到骨髓。NK细胞是免疫表型的外周血淋巴细胞的子集，细胞表面抗原显著特征为CD56表达阳性而且缺乏CD3以及T细胞受体蛋白。目前较长见的检测NK细胞的表面标志为CD3-、CD16+和CD56+。
研究表明，大多数肿瘤患者体内NK细胞数量下降和或NK细胞的清除癌细胞的能力下降，NK细胞表面活化受体和抑制受体的表达决定其抗肿瘤能力的强弱。肿瘤患者及肿瘤术后患者体内NK细胞的数量及活性都发生了一定的改变。肿瘤的发生、发展及转移与NK细胞的抗肿瘤免疫功能被抑制有密切的联系。
NK细胞杀伤靶细胞不需要识别特异性抗原或预先致敏，也没有MHC(MajorHistocompatibility Complex)限制性，NK细胞的靶细胞可以是同基因、异基因、甚至可以无MHC表达。NK细胞的这些特性，因此成为肿瘤免疫治疗的研究热点。目前NK细胞在肿瘤免疫治疗的研究主要集中在自体NK细胞过继免疫治疗、异体NK细胞过继免疫治疗及基因修饰NK细胞免疫治疗等。
目前获得NK细胞的途径主要是通过脐带血或外周血分离出NK细胞，在体外培养扩增细胞数量，诱导提高NK细胞活性增强其抗肿瘤效果。但NK细胞在脐带血或外周血中的中的比例含量少(只约占淋巴细胞的5％-7％)，因此不管在实验研究还是临床治疗应用，NK细胞都必须进行体外培养和扩增，以达到理想的研究和治疗所需的状态。
NK细胞体外培养和扩增，一方面得到足量且单一高纯度的NK细胞，另一方面在培养中通过加入适当的细胞因子，诱导NK细胞功能分化和增强细胞活性。研究表明，细胞因子如IL-2是体外扩增NK细胞体系中最常用的细胞因子，可以在24h反应期内提高NK细胞杀伤活性并刺激其增殖。IL-15、IL-18和IL-12等细胞因子对NK细胞的活化与扩增也起着非常重要的作用。
目前常见的NK细胞体外扩增和活化的方案，主要包括用细胞因子长期培养和使用不同来源的同种异体饲养细胞。尽管有不错的扩增效果，但这些方案达不到许多国家的临床使用标准，要么是因为培养未使用临床级材料，要么是因为使用同种异体饲养细胞可能会导致其他疾病的传播，以及带来医学伦理问题。
此外，这些方法不能有效的排除CD3+T淋巴细胞，它们在扩增体系中的比例仍然很高。在一些添加饲养细胞的培养系统中加入抗CD3单克隆抗体，虽然能最大限度地激活饲养细胞，但却可能带来扩增和激活残留CD3+细胞的风险。同样的在同种异体饲养环境中存在相关的移植物抗宿主病(GVHD)风险。
为了提高NK细胞的纯度，在获得外周血单个核细胞后，利用免疫磁珠方法进行NK细胞前体或CD56的分选分离，以提高NK细胞的比例。但是这样增加了细胞分选步骤，且目前较为有效的分选分离方法较贵，增加了细胞培养的整体成本；其次是在分选过程中也会造成NK细胞丢失，让细胞量减少，降低了细胞大规模扩增效率，不利于临床应用。
发明内容
鉴于上述现有NK细胞培养技术存在的不足问题，本发明提供了一种高效的NK细胞体外培养和扩增方法。本发明采用的NK细胞扩增方法具有操作简单、扩增效率高、细胞活性高和细胞纯度高的特点，在培养过程中不添加饲养细胞和异种血清，不会带来医学伦理和GVHD风险问题，适用于大规模NK细胞制备及临床应用。
一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、使用包被液对用于培养NK细胞的细胞培养瓶进行包被处理；
(2)、从外周血中分离出含NK细胞的单个核细胞(PBMC)；
(3)、在细胞激活培养液中添加细胞刺激因子进行PBMC激活；
(4)、将激活后的PBMC接种到步骤(1)中包被处理后的细胞培养瓶中；
(5)、使用诱导培养液对PBMC进行诱导培养，获得高活性和纯度的NK细胞。
进一步地，所述包被液使用添加有抗体，所述抗体的组合为：Heceptin、CD16和NKP46。
优选地，所述抗体的组合的使用浓度为：Heceptin(500-1000ug/ml)、CD16(0.5-1ug/ml)和NKP46(0.5-1ug/ml)。
进一步地，所述细胞刺激因子为：抗癌药Krestin。
优选地，所述细胞刺激因子的使用浓度为：抗癌药Krestin(20-50ug/ml)。
进一步地，所述诱导培养液中添加有以下细胞因子中的一种或多种：IL-2、IL-12和IL-15。
优选地，多种所述细胞因子的浓度分别为：IL-2(500-1000IU/ml)，IL-12(50-100ng/ml)，IL-15(50-100ng/ml)。
进一步地，在步骤(5)中，每隔2-3天根据细胞生长状况，向培养体系中直接补充添加有所述细胞因子的诱导培养液。
进一步地，培养体系中使用有基础培养液，所述的基础培养液为CTS AIM V无血清培养基或通用DMEM F12无血清培养基。
与现有技术相比，本发明采用的NK细胞扩增方法具有操作简单、扩增效率高、细胞活性高和细胞纯度高的特点，在培养过程中不添加饲养细胞和异种血清，不会带来医学伦理和GVHD风险问题，适用于大规模NK细胞制备及临床应用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的NK细胞扩增效率结果图；
图2是本发明实施例提供的NK细胞流式细胞仪检测结果图；
图3是本发明实施例提供的NK细胞杀伤检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。
参照图1-3所示，为本发明提供较佳实施例。
本发明提供的一种NK细胞扩增方法，其具体实施步骤如下：
(1)细胞培养瓶包被：
本发明中使用的培养瓶包被液，使用添加以下抗体并稀释至优选浓度Heceptin(800ug/ml)、CD16(0.5ug/ml)和NKP46(0.5ug/ml)的PBS。包被液加入培养瓶中，使液体均匀的铺开，37℃，孵育1h后吸弃包被液。
(2)PBMC分离：
本发明使用的NK细胞来源于外周血，利用以下步骤和方法分离得到外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)：采集患者的外周血，并转移到有抗凝剂的瓶中，再将收集到的血液轻轻倒入含有淋巴细胞分离液试管中(不要混匀)。室温下以2000rpm/min，离心20min。血液被分为四层，上层的血浆、血浆和分离液之间的单核细胞处于第二层、第三层的淋巴细胞分离液及第四层的红细胞。取第二层单核细胞和三层分离液，生理盐水离心洗净两次，获得目的PBMC。
(3)细胞激活
本发明中使用的细胞激活培养液，为添加了细胞刺激因子Krestin的无血清培养基，刺激因子Krestin的优选浓度为50ug/ml。
将步骤(2)获得的PBMC，用细胞激活培养液重悬，并调整细胞浓度1×106/ml接种到步骤(1)包被处理的培养瓶中。
加入体积比为10％自体血浆，并加入500IU/ml IL-2、50ng/ml IL-12和50ng/mlIL-15。控制培养体系在10-15ml。
温度37℃,5％CO2环境下培养。
(4)细胞诱导扩增培养
本发明中细胞诱导扩增培养使用诱导培养液，的诱导培养液为添加了IL-2、IL-12和IL-15中的一种或多种细胞因子的无血清培养基。添加的细胞因子优选浓度为：IL-2(1000IU/ml、50ng/ml IL-12和50ng/ml IL-15)；该无血清培养基为CTS AIM V无血清培养基或通用DMEM F12无血清培养基，该无血清培养基也可以是A无血清培养基。
上述的A无血清培养基包括基础培养基和添加物，添加物包括白蛋白、氨基酸、缓冲剂、油酸、亚油酸和胰岛素；所述添加物中的组分的浓度为：白蛋白(1g/L)、油酸(0.05-0.2mg/L)、亚油酸(0.2-0.5mg/L)、胰岛素(5-10mg/L)；所述添加物中的氨基酸包括L-酪氨酸(30mg/L)、L-胱氨酸(70mg/L)、L-谷氨酰胺酸(50mg/L)、L-谷氨酰胺(350mg/L)、甘氨酸(20mg/L)、L-缬氨酸(60mg/L)、L-色氨酸(20mg/L)、L-苯丙氨酸(30mg/L)、L-丝氨酸(20mg/L)和L-苏氨酸(60mg/L)；所述缓冲剂包括L-磷酸甘油二钠盐水合物(1g/L)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(1g/L)。
上述步骤(3)激活的细胞，激活培养24h后，直接补充添加诱导培养液，将培养体系补充至40ml。并加入一定比例和浓度(10％)的自体血浆，在温度37℃,5％CO2环境下继续培养；中间根据细胞生长情况每2-3天一次补充诱导培养液，倍增培养体系。
当培养体系超过400ml时，将细胞悬液转移到细胞培养袋中继续培养，并调整血浆比例为1％，维持IL-2和IL-12不变，但不再添加细胞因子IL-15。培养11天后，培养体系补液至至1.6L。第十三天从培养袋中取出细胞，收获扩增的NK细胞，进行计数、流式分析检测和细胞活性检测。
(5)NK细胞扩增效率检测
步骤(3)(4)在细胞刺激和扩增培养过程中，记录细胞生长状况，在培养的不同时间段(从接种时间算起第0、2、4、6、8、10、12、14天)，进行细胞计数并绘制NK细胞生长曲线。
(6)NK细胞流式分析
步骤(4)收获的NK细胞，利用流式细胞仪检测分析细胞表面抗原表型，检测细胞的纯度。
方法如下：收集待测细胞，用台式低速自动平衡离心机离心细胞，相对离心力为1200g，缓升缓降均为5，离心5min后弃上清。PBS重悬细胞，洗涤细胞三次。用细胞计数仪进行计数，重新用PBS调整细胞密度为1.0×106个/ml。取100微升加入流式专用管中，加入不同抗体(抗CD3和CD56抗体)。置于冰盒内避光孵育30分钟，分别上样进行分析。
(7)NK细胞杀伤活性检测
步骤(4)收获的NK细胞，采用乳酸脱氢酶(LDH)释放方法，检测NK细胞对靶细胞K562杀伤效果。乳酸脱氢酶存在于细胞内，正常情况下不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。检测释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，可产生在特定波长(450nm)下具备吸收峰的化合物，因此可以在酶联检测仪读取450nm时的OD值，计算NK细胞的杀伤活性。
结果：
细胞扩增效率结果如附图1所示；
分别在第0、2、4、6、8、10、12、14天，对培养细胞进行计数，绘制细胞生长曲线图。如图可见，细胞生长效率高，在扩增周期内获得了100-200倍的增长。
流式细胞检测结果如附图2所示；
图2是本实施例扩增的NK细胞流式细胞仪检测结果图，图象左上象限：CD56阳性、CD3阴性，代表NK细胞，占84％；如图所示，可以看出本实施例的扩增得到的NK细胞纯度高。
NK细胞杀伤检测结果如附图3所示；
采用NK细胞与靶细胞K562共培养的方法检测NK细胞的杀伤活性，同时用PBMC做对照组，按0.156、0.625、2.5、10、40的效靶比将效应细胞(E)和靶细胞(T)混合。如图所示，与PBMC相比，NK细胞的杀伤活性得到了显著的提高。。
本发明提供的NK细胞扩增方法具有以下优点：
(1)、方法简单，外周血分离获取的PBMC，用细胞激活剂处理后，直接用于后续培养，不需要要增加磁珠分选NK细胞的步骤。磁珠分选NK细胞增加了细胞扩增成本，且降低了NK细胞获得量以及NK扩增效率。简化步骤，降低成本，提高NK细胞获取效率。
(2)、培养瓶使用三种抗体组合进行包被处理，使用抗癌药Krestin对细胞进行激活细胞，减少PBMC中的杂细胞，提高NK细胞的比例和纯度。
(3)、培养使用多种白介素细胞因子组合，诱导NK细胞分化和增殖的活性。
(4)、培养过程中根据细胞生长状况补充培养液，扩大培养体系，使细胞生长浓度不会太高，这样能提升细胞扩增效率并保持细胞活性。
(5)、实验数据显示，本发明在NK细胞扩增效率、收获细胞纯度以及细胞活性上均获得了很好的预期效果。在13-15天的培养周期内，细胞扩增了200倍；NK细胞纯度达到80％以上；NK细胞杀伤力得到显著提高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、使用包被液对用于培养NK细胞的细胞培养瓶进行包被处理；
(2)、从外周血中分离出含NK细胞的单个核细胞(PBMC)；
(3)、在细胞激活培养液中添加细胞刺激因子进行PBMC激活；
(4)、将激活后的PBMC接种到步骤(1)中包被处理后的细胞培养瓶中；
(5)、使用诱导培养液对PBMC进行诱导培养，获得高活性和纯度的NK细胞。
2.如权利要求1所述的一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，所述包被液使用添加有抗体，所述抗体的组合为：Heceptin、CD16和NKP46。
3.如权利要求2所述的一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，所述抗体的组合的使用浓度为：Heceptin(500-1000ug/ml)、CD16(0.5-1ug/ml)和NKP46(0.5-1ug/ml)。
4.如权利要求3所述的一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，所述细胞刺激因子为：抗癌药Krestin。
5.如权利要求4所述的一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，所述细胞刺激因子的使用浓度为：抗癌药Krestin(20-50ug/ml)。
6.如权利要求1-5任意一项所述的一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，所述诱导培养液中添加有以下细胞因子中的一种或多种：IL-2、IL-12和IL-15。
7.如权利要求6所述的一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，多种所述细胞因子的浓度分别为：IL-2(500-1000IU/ml)，IL-12(50-100ng/ml)，IL-15(50-100ng/ml)。
8.如权利要求7所述的一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，在步骤(5)中，每隔2-3天根据细胞生长状况，向培养体系中直接补充添加有所述细胞因子的诱导培养液。
9.如权利要求8所述的一种高效的NK细胞扩增方法，其特征在于，在步骤(5)中，培养体系中使用有基础培养液，所述的基础培养液为CTS AIM V无血清培养基或通用DMEM F12无血清培养基。
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