CN103627672A - Nk细胞体外培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种NK细胞体外培养方法，属于人类细胞的培养。本发明用PBS稀释的赫赛汀与用PBS稀释人免疫球蛋白，合并后均匀铺满培养瓶底，过夜；另取外周血行密度梯度离心，吸取单个核细胞，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1.0×10⁶/ml-3.0×10⁶/ml；然后加入细胞因子IL-2、IL-15，加入到用赫赛汀包被的培养瓶中，孵箱培养。这样在保证了各个细胞亚群扩增倍数的基础上，促进NK细胞的生长和增殖，增强了淋巴细胞的杀伤活性，无血清培养基替代含血清的完全培养基，所得培养产物的数目和细胞活性相当，实现对NK细胞体外大规模培养，用于NK细胞的临床生物治疗，可以增加其临床应用的安全性。

Description

NK细胞体外培养方法

技术领域

本发明涉及人类细胞的培养，具体是一种NK细胞体外培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，是机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线，不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。在杀伤靶细胞的过程中，NK细胞可以非特异性识别靶细胞，并且不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)的限制，对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用。但是正常人体外周血中的NK细胞数量较少，仅占外周血淋巴细胞的10%~20%。因此，获得高质量高纯度的NK细胞成为其临床应用最为关键的问题之一。目前，随着生物治疗临床应用的广泛开展，NK细胞治疗取得了一定的临床疗效。据报道，多种细胞因子组合被广泛应用于NK细胞的体外培养。已知许多细胞因子如IL-2、IL-7、IL-15、IL-18 等单独或组合均能有效地诱导、刺激特定的NK 细胞增殖和促进其分化成熟，其中IL-2 和IL-15的作用尤为明显。

研究发现，骨髓CD34+造血干/祖细胞并无抗人白血病K562细胞增殖的能力，只有经过IL-2等细胞因子诱导刺激培养后，CD34+细胞定向分化为CD3-CD56+的NK细胞群才可抑制K562细胞增殖。IL-2具有激活NK细胞、促进NK细胞增殖分化和细胞因子的产生，通过细胞接触的方式来抑制K562细胞的增殖的特性。IL-15不仅可以上调NK细胞表面的活化性受体，如CD16和NKG2D,产生大量的IFN-γ，还可以诱导骨髓CD34+的淋巴细胞分化为NK细胞。IL-2和IL-15联合应用还可以诱导产生白细胞功能相关抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）,参与效靶细胞结合。

赫赛汀（Herceptin）是针对HER-2受体的人源化的单克隆抗体，可以与HER-2受体细胞外区域特异性结合，展现出显著的抗肿瘤效应，因而目前被广泛应用到HER-2过表达的乳腺癌患者的临床治疗。

发明内容

本发明就是为了解决现有技术中NK细胞体外大规模培养的问题，而提供一种NK细胞体外培养方法。

本发明系采用单克隆抗体联合细胞因子的方法，在保证NK细胞体外扩增倍数、细胞比例的前提下，提高扩增产物的杀伤活性。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种NK细胞体外培养方法，该方法是按照以下步骤进行的：

a.用PBS稀释Herceptin至浓度0.85-1.05mg/ml，取910μl；用PBS稀释人免疫球蛋白至浓度1-2mg/ml，取400μl，合并后再用PBS补齐至20ml，均匀铺满培养瓶瓶底，密封置于4℃冰箱中过夜，次日取出，将液体倒出，用PBS洗2遍；

b.取外周富集血4-10ml，用Ficoll法进行密度梯度离心, 离心速度为350×g，离心时间为15-20分钟，吸取中间界面层的单个核细胞，用PBS洗涤3次，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1.0×10⁶/ml-3.0×10⁶/ml；然后加入细胞因子IL-2至终浓度10ng/ml，IL-15至终浓度50ng/ml，加入到已经用Herceptin包被的培养瓶中，37℃，5% CO₂孵箱中连续培养15天，每3天补加含20ng/ml的IL-2和100ng/ml的IL-15的无血清培养基一次，补液量与补液前液体量相同，即补液后体积为补液前的2倍。

这样设计的本发明可以高效、安全的进行NK细胞体外大规模培养。由于加入Herceptin，在保证各个细胞亚群扩增倍数的基础上，又增强了淋巴细胞的杀伤活性；无血清培养基可替代含血清的完全培养基，二者所得培养产物的数目和细胞活性相当，而且无血清培养基用于NK细胞的临床生物治疗，可以增加其临床应用的安全性；细胞因子IL－2联合IL－15可以促进NK细胞的生长和增殖，可提高活化免疫细胞的杀伤活性。并分别从细胞扩增倍数、细胞表型以及细胞表面活化受体的表达等方面来检测扩增产物的杀瘤活性。

附图说明

图1是扩增产物的扩增倍数的对比图；

图2是扩增产物的细胞表型的对比图；

图3是扩增产物的杀伤活性对比图；

图4是扩增产物NK细胞表面活化受体表达对比图；

图5是扩增产物NKT细胞表面活化受体表达对比图；

图6是扩增产物T细胞表面活化受体表达对比图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

一种NK细胞体外培养方法，该方法是按照以下步骤进行的：

a.用PBS稀释Herceptin至浓度0.85-1.05mg/ml，取910μl；用PBS稀释人免疫球蛋白至浓度1-2mg/ml，取400μl，合并后再用PBS补齐至20ml，均匀铺满培养瓶瓶底，密封置于4℃冰箱中过夜，次日取出，将液体倒出，用PBS洗2遍；

b.取外周富集血4-10ml，用Ficoll法进行密度梯度离心, 离心速度为350×g，离心时间为15-20分钟，吸取中间界面层的单个核细胞，用PBS洗涤3次，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1.0×10⁶/ml-3.0×10⁶/ml；然后加入细胞因子IL-2至终浓度10ng/ml，IL-15至终浓度50ng/ml，加入到已经用Herceptin包被的培养瓶中，37℃，5% CO₂孵箱中连续培养15天，每3天补加含20ng/ml的IL-2和100ng/ml的IL-15的无血清培养基一次，补液量与补液前液体量相同，即补液后体积为补液前的2倍。

一、材料

赫赛汀（Herceptin，Trastuzumab）配方为：曲妥珠单抗440mg，稀释液为含1.1%苯甲醇的20ml灭菌注射用水，溶解后的曲妥珠单抗浓度为21mg/ml。购自Roche Pharma(瑞士) 公司；

静注人免疫球蛋白（Human Immunoglobulin for Intravenous Injection，5%）配方为：人免疫球蛋白（γ球蛋白）含量不低于95%，其余主要为微量的白蛋白和痕迹量的IgA和IgM。购自中国成都蓉生药业有限责任公司； 

磷酸盐缓冲液（PBS）pH=7.4的0.01mol/L，市售；

细胞因子IL-2和IL-15，购自美国PEPRO TECH公司；

培养瓶175cm²，购自CORNING INCORPORATED公司；

无血清培养基，免疫细胞疗法研究用无血清培养液ALyS505N-0，日本细胞科学研究所株式会社。

二、方法

1.用Herceptin和人免疫球蛋白包被板子

用PBS稀释Herceptin（21mg/ml）和人免疫球蛋白（5%）至浓度分别为0.95mg/ml和1mg/ml ，混匀后，用稀释好的Herceptin和人丙球蛋白进行包被板子，均匀的铺满瓶底，置于4℃冰箱中过夜，次日取出，将液体倒出，用PBS洗2遍。

 2．外周血的制备    

取外周血4-10ml，用Ficoll法进行密度梯度离心，离心速度为350×g，15-20分钟，吸取中界面层的单个核细胞用PBS洗涤3次。加入无血清培养基，调整细胞浓度为2.0×10⁶/ml，然后加入细胞因子IL-2至终浓度10ng/ml，IL-15至终浓度50ng/ml，分别加入新的培养瓶（方案1）和已经用Herceptin包被的培养瓶中（方案2）。37℃，5%CO₂孵箱中连续培养15天，每3天补加含细胞因子IL-2（20ng/ml）+IL-15（100ng/ml）的无血清培养基一次，补液量为目前液体量的2倍,补充所需的刺激因子以保持细胞因子的浓度不变。

提前一天用Herceptin和人免疫球蛋白进行包被板子，Herceptin可以提高NK细胞扩增产物的杀伤活性、粘附能力和细胞因子的分泌，这样，在保证扩增数目的基础上，提高扩增产物的杀瘤活性。

由于加入细胞因子IL－2联合IL－15，促进NK细胞的增殖分化，提高活化免疫细胞的杀伤活性。

无血清培养基与含血清培养基相比，二者所得培养产物的数目和细胞活性相当，无血清培养基用于NK细胞的临床生物治疗，增加其临床应用的安全性。

 3.细胞表型的检测

    分别收集0d，5d，10d，15d的细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，分别标记PerCP-CD3，PE-CD4，FITC-CD8，FITC-CD45Ro，FITC-CD45Ra，PerCP-CD45, PE-CCR7（标记T细胞亚群），PerCP-CD4，PE-CD25，APC-CD127（标记Treg细胞）；FITC-CD3,PE-CD16CD 56（ 标记NK,NKT细胞）；FITC-CD158a/h，FITC-CD158b, FITC- Mouse IgG2α，PE- Mouse IgG2α（标记KIR表型）；APC-NKp30，APC-NKp44，APC-NKG2D，APC-CD16，647-NKp46，647-DNAM-1(标记细胞表面活化受体)；同时标记APC-IgG1,647-IgG1对照进行免疫分型检测。

4.NK细胞杀伤活性的检测

采用LDH释放法检测其杀伤活性。调整效应细胞密度至4×10⁶/ml，靶细胞密度至1×10⁵/ml。取96孔圆底培养板，每个样本做3个复孔，按效靶比40:1加入效应细胞与靶细胞，并设效应细胞自然释放对照孔（每孔100 ul效应细胞+100 ul培养液），靶细胞对照孔设最大和最小孔（每孔100 ul靶细胞+100 ul培养液），并设本底和体积纠正孔（每孔200 ul培养液），将培养板放置37℃，5%CO2孵箱4 h，在最大孔和体积纠正孔内加入20 ul的裂解缓冲液，放置30 min。以800×g的转速离心10 min后，每孔吸取50 ul上清到相应平底培养板，再在避光的条件下加50 ul反应底物，室温避光20~30 min，待各孔液体颜色转深，加终止液50 ul/孔。将96孔板置于酶标仪检测492nm波长处的吸光度（D）值。按下列公式计算杀伤率：杀伤率（%）=（实验孔D 值-效应细胞自然释放孔D 值-靶细胞自然释放孔D 值+本底纠正孔D 值）/（靶细胞最大释放孔D 值-靶细胞自然释放孔D 值-体积纠正孔D 值+本底纠正孔D 值）×100%，参见图3。

二、结果

    1.培养产物的扩增倍数和细胞表型的影响

方案1(未加Herceptin)、2(加入Herceptin)的总扩增倍数分别为37.6±26.31，44.82±6.84；NK细胞的扩增倍数分别为89.60±57.17,102.81±94.06；NKT的扩增倍数257.01±149.73，362.74±208.86;T的扩增倍数37.18±16.84,43.20±14.75；两种方案都可以在扩增NK细胞的基础上，同时扩增NKT细胞和T细胞。方案2中Herceptin的加入对于总扩增倍数以及各个细胞亚群扩增倍数无明显影响。但是，Herceptin的加入可以降低CD158b的表达，并具有统计学意义（P＜0.05）参见图1、图2。

2. 细胞表面活化受体表达

分别收集方案1（不加Herceptin）和方案2（加Herceptin）培养0d，5d，10d，15d的细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，用流式细胞仪检测并分别比较2种培养方案培养产物各个细胞表型以及各个细胞亚群表面活化受体的表达； Herceptin的加入，提高NK细胞表面活化受体NKp44的表达（P＜0.05）余无统计学意义，参见图4-6。

3.扩增产物杀伤活性

分别收集方案1（不加Herceptin）和方案2（加Herceptin）培养15d后的细胞，以多种癌细胞系作为靶细胞测定扩增产物的杀伤活性。调整效应细胞和靶细胞的浓度，使其校靶比为40:1，用LDH释放法检测2种方案扩增产物对于各种靶细胞系的杀伤。Herceptin加入之后可以显著提高扩增产物对于各种靶细胞系的杀伤作用（P＜0.05），参见图3。

Claims (4)

1.一种NK细胞体外培养方法，该方法是按照以下步骤进行的：

a.用PBS稀释Herceptin至浓度0.85-1.05mg/ml，取910μl；用PBS稀释人免疫球蛋白至浓度1-2mg/ml，取400μl，合并后再用PBS补齐至20ml，均匀铺满培养瓶瓶底，密封置于4℃冰箱中过夜，次日取出，将液体倒出，用PBS洗2遍；

b.取外周富集血4-10ml，用Ficoll法进行密度梯度离心, 离心速度为350×g，离心时间为15-20分钟，吸取中间界面层的单个核细胞，用PBS洗涤3次，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1.0×10⁶/ml-3.0×10⁶/ml；然后加入细胞因子IL-2至终浓度10ng/ml，IL-15至终浓度50ng/ml，加入到已经用Herceptin包被的培养瓶中，37℃，5% CO₂孵箱中连续培养15天，每3天补加含20ng/ml的IL-2和100ng/ml的IL-15的无血清培养基一次，补液量与补液前液体量相同，即补液后体积为补液前的2倍。

2.根据权利要求1所述NK细胞体外大规模培养方法，其特征在于: PBS稀释的Herceptin至浓度0.95mg/ml。

3.根据权利要求1所述NK细胞体外大规模培养方法，其特征在于:PBS稀释5%的人免疫球蛋白至浓度1mg/ml。

4.根据权利要求1所述NK细胞体外大规模培养方法，其特征在于:吸取中间界面层的单个核细胞，用PBS洗涤3次，加入无血清培养基，调整细胞浓度为2.0×10⁶/ml。

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