CN105039255A

CN105039255A - 一种nkt细胞诱导培养的添加剂及诱导培养的方法

Info

Publication number: CN105039255A
Application number: CN201510571282.5A
Authority: CN
Inventors: 陈海佳; 王一飞; 葛啸虎; 曾维杰
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明涉及细胞领域，公开了一种NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养NKT细胞的方法。本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂包括生长因子IL-21、IL-7和OKT-3。生长因子IL-21、IL-7和OKT-3与公认的生长因子IL-2和IL-15具有协同作用，可以更好地诱导和促进NKT细胞的增殖，能促进NKT细胞大量增殖，而且对于肿瘤细胞具有很好的杀伤效果。本发明所述诱导培养NKT细胞的方法，操作简单，能促进NKT细胞大量增殖，适合NKT细胞的规模化生产。

Description

一种NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养的方法

技术领域

本发明涉及细胞领域，具体涉及一种NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养NKT细胞的方法。

背景技术

自然杀伤T(naturalkillerT，NKT)细胞，是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。NKT细胞能够表达NKT细胞标志NKT1.1的T细胞，其机能具有T细胞和NKT细胞双重特征。NKT细胞在TCR和NKR介导下，产生大量的IL-4及INF-γ，对肿瘤细胞有杀伤作用。

NKT细胞主要包括免疫调节和细胞毒作用，NKT细胞的抗原识别与传统的T细胞不同，不能识别由经典的MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子提呈的脂类、蛋白质抗原，在这些抗原的刺激下NKT细胞被激活，并迅速的产生IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-13等细胞因子，从而在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植免疫中发挥重要的作用。NKT细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。

NKT细胞以双刃剑的方式调节着免疫系统，越来越引起人们的关注，对NKT细胞的免疫活化及与疾病的关联的进一步研究将为人们在抗肿瘤、抗自身免疫性疾病及移植耐受中提供一新的有效的治疗手段，具有广泛的应用前景。

目前，诱导培养NKT细胞的方法是从外周血中分离出单个核细胞，然后使用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基以及IL-2和IL-15两种细胞因子联合诱导培养得到NKT细胞。但现有的诱导培养NKT细胞的方法NKT细胞的扩增倍数不够大，用于免疫治疗或者亚健康保健的话很大程度影响免疫治疗效果。而且现有的诱导培养NKT细胞的方法使用胎牛血清，可能会引入一些支原体和病毒，存在一定的安全隐患。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养NKT细胞的方法。本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂能促进NKT细胞大量增殖，而且对于肿瘤细胞具有很好的杀伤效果。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种NKT细胞诱导培养的添加剂，包括生长因子IL-21、IL-7和OKT-3。生长因子IL-21、IL-7和OKT-3与公认的生长因子IL-2和IL-15具有协同作用，可以更好地诱导和促进NKT细胞的增殖。

其中，在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-21的用量为10ng/mL～100ng/mL。

在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-7的用量为10ng/mL～100ng/mL。

在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子OKT-3的用量为20ng/mL～100ng/mL。

在一些实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂还包括X-VIVO-15培养基。X-VIVO15无血清培养基，不含任何外源生长因子、人造细胞增殖刺激因子或不明成分的添加剂，可提供一个营养成分完全且平衡的体外环境，利于NKT细胞的生长和增殖。

在一些实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂还包括生长因子IL-2和IL-15。

在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-2的用量为100U/mL～1000U/mL。

在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-15的用量为10ng/mL～100ng/mL。

在一些具体实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂由X-VIVO-15培养基、生长因子IL-2、IL-15、IL-21、IL-7和OKT-3组成，其中生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和OKT-3的用量均为50ng/mL。

本发明还提供了一种诱导培养NKT细胞的方法，取外周血单个核细胞，按1×10⁶cell/mL接种于NKT细胞诱导培养的添加剂中，放置37℃、5％CO₂恒温培养箱中诱导培养；其中所述NKT细胞诱导培养的添加剂由X-VIVO-15培养基、生长因子IL-2、IL-15、IL-21、IL-7和OKT-3组成，其中生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和OKT-3的用量均为50ng/mL。

在一些实施方案中，所述诱导培养NKT细胞的方法，还包括每隔2～3天对细胞进行补液的步骤。

在一些优选实施方案中，所述诱导培养NKT细胞的方法中所述补液具体为按照1×10⁶cell/mL密度添加X-VIVO15培养基以及IL-2、IL15、IL-21、IL-7和OKT-3，第七天后的补液只添加X-VIVO15培养基和IL-2、IL15；其中各生长因子的添加量均为培养基体积的1％。

在一些具体实施方案中，所述在一些具体实施方案中补液时生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和OKT-3的用量均为50ng/mL；第七天后的补液的生长因子IL-2的用量为200U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL。

在一个具体实施例中，本发明采用添加不同生长因子及不同培养基的NKT细胞诱导培养的添加剂培养单个核细胞，比较细胞活力。结果显示本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂培养的细胞增殖了45.5倍，远高于其它组细胞诱导培养添加剂，而细胞活力相当。表明本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂对NKT细胞具有很好的诱导增殖作用，而且保持着较高的活性。

乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH在培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。

在一个具体实施例中，本发明通过定量测量LDH来检测细胞的杀伤作用。结果显示本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂培养的细胞毒性增强，远高于其它组细胞诱导培养添加剂，表明用本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂培养NKT细胞可以提高NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

由上述技术方案可知，本发明提供了NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养NKT细胞的方法。本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂包括生长因子IL-21、IL-7和OKT-3。生长因子IL-21、IL-7和OKT-3与公认的生长因子IL-2和IL-15具有协同作用，可以更好地诱导和促进NKT细胞的增殖，能促进NKT细胞大量增殖，而且对于肿瘤细胞具有很好的杀伤效果。本发明所述诱导培养NKT细胞的方法，操作简单，能促进NKT细胞大量增殖，适合NKT细胞的规模化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例2中经组一NKT细胞诱导培养的添加剂培养不同时间的细胞形态图，其中图a为培养第三天细胞形态图，图b培养第十四天细胞形态图，放大倍数均为100倍；

图2示实施例2中经组二NKT细胞诱导培养的添加剂培养不同时间的细胞形态图，其中图a为培养第三天细胞形态图，图b培养第十四天细胞形态图，放大倍数均为100倍；

图3示实施例2中经组三NKT细胞诱导培养的添加剂培养不同时间的细胞形态图，其中图a为培养第三天细胞形态图，图b培养第十四天细胞形态图，放大倍数均为100倍。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1、外周血分离得到PBMC：

1)取40mL人外周血至两个50mL离心管中，用生理盐水对外周血血液进行1:1稀释并混合均匀；

2)另取两个新的50mL离心管，加入15mL淋巴细胞分离液，然后按淋巴细胞分离液:血液稀释液体积比为1:2，把混匀的血液稀释液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液上层，注意不要冲破分离液层；

3)放入冷冻离心机中(Eppendorf)，3000rpm/min离心30min，升降速调为0；

4)离心结束后，用巴氏吸管吸取单个核细胞至15mL离心管中，用10mL生理盐水清洗一遍，400g离心5min。

实施例2、NKT细胞的诱导培养

1、用5mLX-VIVO15培养基重悬实施例1得到的细胞沉淀并计数，根据计数结果，分为3组进行培养：

组一：用X-VIVO-15培养基按1×10⁶cell/mL接种于T75培养瓶中，并加入300U/mLIL-2、30ng/mLIL-15、50ng/mLIL-21、50ng/mLIL-7和50ng/mLOKT-3，放置37℃、5％CO₂恒温培养箱中诱导培养NKT细胞。

组二：用X-VIVO-15培养基按1×10⁶cell/mL接种于T75培养瓶中，并加入300U/mLIL-2、30ng/mLIL-15，放置37℃、5％CO₂恒温培养箱中诱导培养NKT细胞。

组三：用RPMI1640培养基按1×10⁶cell/mL接种于T75培养瓶中，并加入300U/mLIL-2、30ng/mLIL-15、50ng/mLIL-21、50ng/mLIL-7和50ng/mLOKT-3，放置37℃、5％CO₂恒温培养箱中诱导培养NKT细胞。

2、每天观察各组细胞的生长状态，每隔2～3天对细胞进行计数，并补液：

组一：根据结果按照1×10⁶cell/mL密度添加X-VIVO15培养基以及1％培养基体积的IL-2、IL15、IL-21、IL-7和OKT-3，第七天后的补液只添加X-VIVO15培养基和IL-2、IL15，促进NKT细胞扩增，培养至15天。

组二：根据结果按照1×10⁶cell/mL密度添加X-VIVO15培养基以及1％培养基体积的IL-2、IL15，促进NKT细胞扩增，培养至15天。

组三：根据结果按照1×10⁶cell/mL密度添加RPMI1640培养基以及1％培养基体积的IL-2、IL15、IL-21、IL-7和OKT-3，第七天后的补液只添加X-VIVO15培养基和IL-2、IL15，促进NKT细胞扩增。培养至15天。

实施例3、细胞活力检测

分别取实施例2中各组8×10⁶个细胞培养第三天和第十四天的细胞进行细胞观察，结果见图1-3。

同时统计细胞数目，并检测细胞活力，结果见表1和表2。

表1细胞数目

细胞数目	第三天	第十四天	增殖倍数
				组一	3.3×10⁷	1.5×10⁹	45.5
组二	2.5×10⁷	5.2×10⁸	20.8
				组三	1.9×10⁷	2.1×10⁸	11.1

表2细胞活力

细胞活力	第三天	第十四天
			组一	95.2％	94.6％
组二	93.8％	92.4％
			组三	93.2％	91.3％

由图1-3结果可见，组一在培养第三天和第十四天的细胞均优于组二。由表1和表2结果可见组一培养第十四天的细胞较培养第三天的细胞增殖了45.5倍，远高于组二和组三，而细胞活力相当。表明本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂对NKT细胞具有很好的诱导增殖作用，而且保持着较高的活性。

实施例4、细胞毒性

分别取实施例2中各组8×10⁶个细胞培养第3天和第14天的细胞进行对K562的细胞毒性实验。

1)优化靶细胞数目(首次检测)。

A.在96孔细胞培养板中对K562细胞做系列稀释(0cell/100μL，5000cell/100μL、10000cell/100μL、20000cell/100μL)，做三或四个重复孔。

B.轻轻振荡LDH阳性对照，然后取2μL稀释到10mL的PBS+1％BSA(1:5000稀释)，100μL/孔，做三或四个重复孔。

C.向所有孔中按每100μL培养基加入10μL裂解液(10×)，裂解细胞，在细胞培养箱中孵育45分钟，在250g离心平板4min。

D.从每一个孔中取出50μL转移到一个新的96孔板中，向每孔加入50μL配好的底物混合物，室温避光孵育30min。

E.加入50μL终止液，在490nm或492nm测量吸光值，确定靶细胞的吸光值至少是培养基背景对照吸光值的两倍时的靶细胞浓度。

2)NKT细胞毒性检测。

A.设置检测板。

B.250g离心平板4min，以确保NKT细胞和K562充分接触，置于细胞培养箱中孵育4小时。

C.在收集上清前45min，向K562细胞最大释放孔加入10μL裂解液(10X)/100μL，再孵育45min后，250g离心平板4min。

D.用排枪从每孔转移50μL到一个新的96孔板中，向每孔加入50μL配好的底物混合物，室温避光孵育30min。

E.加入50μL终止液，在490nm或492nm测量吸光值。

3)实验结果的计算

A.将所有实验孔、K562自发LDH释放孔和NKT细胞自发LDH释放孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值，得到实验孔校正值、K562自发LDH释放孔校正值和NKT细胞自发LDH释放孔校正值。

B.将K562最大LDH释放对照的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值，得到K562最大LDH释放对照的校正值。

C.计算细胞毒性结果如表3。其中效靶比是指效应细胞和靶细胞的比例，细胞毒性的计算公式如下：

细胞毒性％＝(实验孔校正值-NKT细胞自发LDH释放孔的校正值-K562自发LDH释放孔的校正值)/(K562最大LDH释放对照的校正值-K562自发LDH释放孔的校正值)×100。

表3细胞毒性

由表3结果可见组一培养第十四天的细胞较培养第三天的细胞毒性增强，且远高于组二和组三。表明用本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂培养NKT细胞可以提高NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

Claims

1.一种NKT细胞诱导培养的添加剂，包括生长因子IL-21、IL-7和OKT-3。

2.根据权利要求1所述的添加剂，所述生长因子IL-21的用量为10ng/mL～100ng/mL，所述生长因子IL-7的用量为10ng/mL～100ng/mL，所述生长因子OKT-3的用量为20ng/mL～100ng/mL。

3.根据权利要求1或2所述的添加剂，还包括X-VIVO-15培养基。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的添加剂，还包括生长因子IL-2和IL-15。

5.根据权利要求4所述的添加剂，所述生长因子IL-2的用量为100U/mL～1000U/mL，所述生长因子IL-15的用量为10ng/mL～100ng/mL。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的添加剂，由X-VIVO-15培养基、生长因子IL-2、IL-15、IL-21、IL-7和OKT-3组成，其中生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和OKT-3的用量均为50ng/mL。

7.一种诱导培养NKT细胞的方法，取外周血单个核细胞，按1×10⁶cell/mL接种于NKT细胞诱导培养的添加剂中，放置37℃、5％CO₂恒温培养箱中诱导培养；其中所述NKT细胞诱导培养的添加剂由X-VIVO-15培养基、生长因子IL-2、IL-15、IL-21、IL-7和OKT-3组成，其中生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和OKT-3的用量均为50ng/mL。

8.根据权利要求7所述的方法，还包括每隔2～3天对细胞进行补液的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，所述补液具体为按照1×10⁶cell/mL密度添加X-VIVO15培养基以及IL-2、IL15、IL-21、IL-7和OKT-3，第七天后的补液只添加X-VIVO15培养基和IL-2、IL15；其中各生长因子的添加量均为培养基体积的1％。

10.根据权利要求9所述的方法，补液时生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和OKT-3的用量均为50ng/mL；第七天后的补液的生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL。