CN102575231B - 制备细胞因子诱导的杀伤细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法等，所述方法包括：（a）在存在CD3配体的条件下，培养含有能够分化成CD3阳性CD56阳性细胞的细胞和/或CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群的步骤；（b）在不存在CD3配体的条件下，培养通过步骤（a）获得的细胞群的步骤；和（c）在存在CD3配体的条件下，培养通过步骤（b）获得的细胞群的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及在过继免疫疗法中高效的细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）的制备方法、通过所述制备方法获得的CIK细胞、含有所述CIK细胞的药物等。
本申请还要求于2009年10月28日申请的日本专利申请第2009-247347号的优先权，日本专利申请第2009-247347号的全部内容并入本申请中。
背景技术
近年来，重新评价如药物疗法和放射疗法的对患者具有沉重肉体负担的治疗方法，对负担更轻的免疫疗法的关注增加。所述疗法中，包括例如在体外培养所取出的免疫相关细胞并增加细胞数、和/或强化与治疗效果相关的活性并移植到患者中的过继免疫疗法。
在过继免疫疗法中作为效应子细胞使用的细胞已知有淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）、肿瘤内浸润淋巴细胞（TIL）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）。
LAK细胞是可在存在白介素（IL）-2的条件下使淋巴细胞增殖而获得的细胞群，其具有溶解肿瘤细胞而不溶解正常细胞的性质。关于LAK细胞的配制，也开发了在培养时使抗CD3抗体与IL-2共存的方法。
TIL是浸润到肿瘤组织中的T细胞，其具有比LAK细胞更显著的肿瘤抗原特异性。该细胞也可以在体外增殖用于治疗。但是，由于TIL必须摘出患者的肿瘤组织而获得，因而存在采集操作复杂并且所获得的细胞数也少的问题。
CTL是可在存在HLA（人白细胞抗原）限制性肿瘤相关抗原（肽、蛋白质等）、抗原呈递细胞和IL-2的条件下肿瘤相关抗原特异性地诱导、增殖淋巴细胞而获得的细胞群，其具有高的肿瘤抗原特异性。但是，CTL难以大量培养，另外，由于其具有只识别表达诱导时使用的肿瘤相关抗原的细胞的性质，因而存在即使是相同的肿瘤也根据有无抗原表达而效果显著不同的问题。
CIK细胞是通过在存在干扰素（IFN）-γ、抗CD3抗体和IL-2的条件下进行培养而从外周血单核细胞（PBMC）中配制的细胞群，其特征是含有CD3阳性且CD56阳性的细胞的细胞群。CD3阳性CD56阳性细胞在PBMC中是稀有的细胞，可以在不存在靶细胞的条件下优先增殖。CIK细胞在体内对肿瘤细胞发挥胜过LAK细胞的细胞毒性活性（例如，非专利文献1）。但是，以传统方法制备的CIK细胞中所含的CD3阳性CD56阳性细胞的比例一般在20%左右，此外，CIK细胞的增殖性也非常低，为培养3周时间增殖10倍左右。因此，常常为了培养大量的CIK 细胞而从患者中进行成分采血，存在肉体负担大的问题（例如，非专利文献2和3）。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：J. Immunol., 1994年，第153卷，第1687-1696页
非专利文献2：Transfusion，2008年，第48卷，第1629-639页
非专利文献3：Biology of Blood and Marrow Transplantation，2005年，第11卷，第181-187页。
发明概述
发明要解决的课题
在CIK细胞的扩大培养过程中，因为PBMC分化成多个性质不同的细胞群，所以扩大后的细胞群中的CD3阳性CD56阳性细胞的比例必然不高。本发明的目的是提供可以有效地大量获得CD3阳性CD56阳性细胞的CIK细胞的制备方法。
用于解决课题的手段
本发明概括而言，本发明的第1种方案涉及细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括：（a）在存在CD3配体的条件下，培养含有能够分化成CD3阳性CD56阳性细胞的细胞和/或CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群的步骤；（b）在不存在CD3配体的条件下，培养通过步骤（a）获得的细胞群的步骤；和（c）在存在CD3配体的条件下，培养通过步骤（b）获得的细胞群的步骤。在第1种方案中， 步骤（a）-（c）中的至少一个步骤中的细胞群的培养可以在存在干扰素-γ和/或白介素-2的条件下实施。此外，在第1种方案中，CD3配体可示例抗CD3抗体。此外，在第1种方案中，步骤（a）中的培养可以在纤连蛋白片段和CD3配体共存下实施。所述纤连蛋白片段可示例含有选自VLA-4结合区、VLA-5结合区和肝素结合区的区域的片段。
本发明的第2种方案涉及可通过本发明的第1种方案的制备方法获得的细胞因子诱导的杀伤细胞。
本发明的第3种方案涉及含有以本发明的第2种方案的细胞因子诱导的杀伤细胞为有效成分的药物。
本发明的第4种方案涉及疾病的治疗方法或预防方法，包括向对象施用有效量的本发明的第2种方案的细胞因子诱导的杀伤细胞的步骤。
本发明的第5种方案涉及本发明的第2种方案的细胞因子诱导的杀伤细胞用于制备药物的用途。
另外，本发明的第6种方案涉及用于治疗疾病的本发明的第2种方案的细胞因子诱导的杀伤细胞。
本发明的第7种方案涉及细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括：（A）在含有CD3配体的培养基中，培养含有能够分化成CD3阳性CD56阳性细胞的细胞和/或CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群的步骤；（B）使上述培养基的CD3配体浓度降低的步骤；（C）在CD3配体浓度降低的培养基中培养细胞群的步骤；和（Ｄ）在培养基中添加CD3配体，进一步培养细胞群的步骤。
发明的效果
根据本发明，提供了CIK细胞的制备方法，其可以大量地扩大培养高度含有具有高细胞毒性活性的CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群。通过所述制备方法大量获得且品质好的CIK细胞在生物体内发挥高的治疗效果，因而对于通过细胞疗法治疗疾病是非常有用的。
实施发明的方案
通过将在存在CD3配体的条件下培养的细胞群在不存在CD3配体的条件下培养、并进一步在存在CD3配体的条件下培养，本发明人令人惊讶地发现，大量获得了以高比例包含在细胞表面表达CD3和CD56两种分子的细胞的细胞群，从而完成了本发明。
下文对本发明进行具体说明。
（1）本发明的CIK细胞的制备方法
本发明的制备方法是制备高度含有CIK细胞、即具有CD3阳性且CD56阳性的特征的亚细胞群的细胞群的方法。本发明的CIK细胞的制备方法包括：（a）在存在CD3配体的条件下，培养含有能够分化成CD3阳性CD56阳性细胞的细胞和/或CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群的步骤；（b）在不存在CD3配体的条件下，培养通过步骤（a）获得的细胞群的步骤；和（c）在存在CD3配体的条件下，培养通过步骤（b）获得的细胞群的步骤。
在传统的CIK细胞的制备方法中，在对含有能够分化成CD3阳性CD56阳性细胞的细胞和/或CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群给予利用CD3配体的刺激之后，在不存在CD3配体的条件下进行培养而完成制备。另外，在利用CD3配体刺激后在不存在CD3配体的条件下进行培养的理由是，CD3配体产生的过剩刺激（高浓度、长时间刺激等）抑制细胞增殖。与此相对，本发明的CIK细胞的制备方法的特征是，将给予利用CD3配体的刺激的细胞群（上述步骤（a）；在下文中，将所述步骤中的CD3配体刺激记载为“初期刺激”）在不存在CD3配体的条件下培养（（上述步骤（b））之后，再次加入利用CD3 配体的刺激（上述步骤（c）；在下文中，将所述步骤中的CD3配体刺激记载为“再刺激”）。
另外，在初期刺激中使用含有CD3配体的培养基的情况下，在初期刺激之后，稀释培养基，使CD3配体的浓度降低到不认为有细胞增殖抑制作用的程度，再继续培养细胞群，由此可以获得与上述步骤（b）相同的效果。即，包括下列步骤的CIK细胞的制备方法也是本发明的制备方法的一种方案：（A）在含有CD3配体的培养基中，培养含有能够分化成CD3阳性CD56阳性细胞的细胞和/或CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群的步骤；（B）使上述培养基的CD3配体浓度降低的步骤；（C）在CD3配体浓度降低的培养基中培养细胞群的步骤；和（Ｄ）在培养基中添加CD3配体，进一步培养细胞群的步骤。该方案的步骤（A）可视为上述初期刺激，步骤（D）可视为上述再刺激。上述步骤（C）中的“CD3配体浓度降低的培养基”中的CD3配体浓度没有特殊的限制，只要是不认为有CD3配体引起的细胞增殖抑制作用的浓度即可，例如，可示例步骤（A）的培养基中的CD3配体浓度的约1/50~1/2倍浓度。
本发明的制备方法中使用的“含有能够分化成CD3阳性CD56阳性细胞的细胞和/或CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群”示例可从外周血、骨髓、脐带血等中获得的细胞群，或者从这些材料中分离的血细胞系细胞的群体。优选地，本发明中使用PBMC。此外，本发明中也可以使用实质上由从这些细胞群中分离的CD3阳性CD56阳性细胞组成的细胞群。分离可以用公知的手段进行，例如细胞分选、磁珠、亲和柱等。对于这些细胞群，本发明中可以使用从生物体采集的原样细胞群、或者冷冻保存的细胞群中的任一种。此外，含有能够分化成CD3阳性CD56阳性细胞的细胞和/或CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群也可以是在用于本发明之前，在存在干扰素-γ的条件下预先预培养的物质。
作为本发明中使用的CD3配体，只要是具有CD3结合活性的物质即可，没有特殊的限制，可示例例如抗CD3抗体，特别优选的是抗CD3单克隆抗体，例如OKT3（J. Immunol.，第124卷，第6号，2708-2713（1980））。
对CD3配体在培养基中的浓度没有特殊的限制，例如，在使用抗CD3单克隆抗体的情况下，初期刺激时优选是例如0.001~500μg/mL，特别优选是0.01~100μg/mL，再刺激时优选是例如0.001~100μg/mL，特别优选是0.005~50μg/mL。CD3配体除了溶解在培养基中而共存以外，也可以固定在合适的固相，例如培养皿、摇瓶、袋等细胞培养用器材（培养用容器；包括开放体系和封闭体系中的任一种），或珠子、膜、载玻片等细胞培养用载体上而使用。这些固相材料只要是细胞培养中可以使用的即可，没有特殊的限制。如果将CD3配体固定在固相上，则在培养结束后，仅通过细胞与固相分离，就可以方便地将上述成分与所获得的细胞群分离，可以防止上述成分混入细胞群内。在为培养提供上述器材或载体时，CD3配体的固定量可以选择为与将所述成分溶解在培养基中应用的情况下期望的浓度相同的比例，只要获得所需的效果即可，没有特殊的限制。
对上述步骤（a）、即“在存在CD3配体的条件下，培养含有能够分化成CD3阳性CD56阳性细胞的细胞和/或CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群的步骤”的培养条件没有特殊的限制，可以使用普通的细胞培养中使用的条件。例如，可以在37℃、5% CO2等的条件下培养。本发明对培养时间没有特殊的限制，可示例例如1-10天，优选1-7天。此外，对培养开始时的细胞数没有特殊的限制，可示例优选1×104~1×108细胞/mL，更优选1×105~5×107细胞/mL。
上述步骤（b）、即“在不存在CD3配体的条件下，培养通过步骤（a）获得的细胞群的步骤”例如这样实施：从通过步骤（a）获得的培养物中分离细胞群和CD3配体，进一步地在不存在CD3配体的条件下培养所述细胞群。对于细胞群和CD3配体的分离，本发明没有特殊的限制，例如，在步骤（a）中使用固定了CD3配体的细胞培养器材的情况下，通过将细胞群转移到没有固定CD3配体的其他细胞培养器材中来实施。此外，例如在步骤（a）中使用含有游离的CD3配体的培养基情况下，可以通过将所述培养基更换为不含CD3配体的培养基来实施。对步骤（b）的培养条件没有特殊的限制，可以使用普通的细胞培养中使用的条件。例如，可以在37℃、5% CO2等的条件下培养。本发明对步骤（b）的培养时间没有特殊的限制，可示例例如1-20天，优选1-10天。
本发明对上述步骤（c）、即“在存在CD3配体的条件下培养通过步骤（b）获得的细胞群的步骤”没有特殊的限制，可以通过在通过步骤（b）获得的培养物中添加CD3配体来实施，也可以通过将通过步骤（b）获得的培养物转移到固定了CD3配体的细胞培养器材中来实施。对步骤（c）的培养条件没有特殊的限制，可以使用普通的细胞培养中使用的条件。例如，可以在37℃、5% CO2等的条件下培养。本发明对培养时间没有特殊的限制，可示例例如1-20天，优选1-15天。
此外，在实施上述步骤（c）后，还可以进一步实施步骤（d），即“在不存在CD3配体的条件下，培养通过步骤（c）获得的细胞群的步骤”。对步骤（d）的培养条件也没有特殊的限制，可以使用普通的细胞培养中使用的条件。例如，可以在37℃、5% CO2等的条件下培养。对实施步骤（d）的情况的培养时间没有特殊的限制，可示例例如1-20天，优选1-15天。
本发明的制备方法中的培养器材可使用培养皿、摇瓶、袋、大型培养槽、生物反应器等细胞培养用器材（容器）。另外，袋优选细胞培养用CO2气体透过性袋。在必需大量细胞的情况下，也可以使用大型培养槽。可以使用开放体系或封闭体系的任一种实施培养，优选用封闭体系实施培养。
对于本发明制备方法中的CD3配体对含有能够分化成CD3阳性CD56阳性细胞的细胞和/或CD3阳性CD56阳性细胞的细胞群的初期刺激，本发明没有特殊的限制，优选在纤连蛋白片段共存的条件下进行。此外，利用CD3配体的再刺激也可以在纤连蛋白共存的条件下进行。
本发明所使用的纤连蛋白片段的浓度没有特殊的限制，例如优选是0.001~500μg/mL，特别优选是0.01~500μg/mL。除了使纤连蛋白片段溶解在培养基中而共存以外，还可以将其固定在细胞培养用器材或细胞培养用载体上使用。纤连蛋白片段对固相的固定化可以通过例如将溶解在恰当缓冲液中的片段与固相接触来实施，也可以通过国际公开第97/18318号小册子或国际公开第00/09168号小册子记载的方法来实施。如果将纤连蛋白片段和CD3配体固定到固相上，则在培养结束后，仅通过细胞与固相分离，就可以方便地将上述成分与所获得的细胞群分离，可以防止上述成分混入细胞群内。
纤连蛋白片段可以是天然获得的（通过酶促消化天然的纤连蛋白而片段化的），或者通过重组DNA技术生产中的任一种。纤连蛋白片段可以例如基于Ruoslahti E.等人（J. Biol. Chem.，第256卷，第14号，第7277~7281页（1981））的公开内容，从天然来源的物质以实质上纯的形式生产。在本文中，本说明书中记载的“实质上纯的形式的纤连蛋白片段”意指其本质上不含与天然中纤连蛋白共同存在的其他蛋白质。在本发明中，纤连蛋白片段可以使用单一分子种类，也可以将多数分子种类混合使用。
本发明中可使用的纤连蛋白片段以及与配制所述片段相关的有用信息可以通过例如Koarnblihtt，A．R．等人（EMBO J，第4卷，第7号，1755~1759（1985））和sekiguchi K.等人（Biochemistry，第25卷，第17号，4936~4941（1986））等获得。此外，编码纤连蛋白的核酸序列或纤连蛋白的氨基酸序列公开在Genbank登录号NM_002026、NP_002017中。
本发明中可以优选使用具有细胞粘附活性和/或肝素结合活性的纤连蛋白片段。在纤连蛋白中，存在具有结合细胞表面的整联蛋白的活性的区域。上述区域可示例VLA（极迟抗原）-4或VLA-5结合区。在靠着纤连蛋白C端侧的部位存在被称为IIICS的区域。此处包含称为CS-1的由25个氨基酸组成的区域，所述区域表现出对VLA-4的结合活性。CS-1区域的氨基酸序列显示在序列表的序列号1中。
此外，纤连蛋白中存在被称为III型的重复序列，自N端起第10个III型重复序列中存在与细胞的结合区。第10个III型重复序列的氨基酸序列显示在序列表的序列号2中。上述序列中对结合VLA-5起关键作用的序列是序列表的序列号3所示的4个氨基酸Arg-Gly-Asp-Ser（RGDS）。由序列表的序列号4所示氨基酸序列组成的C-274是包含序列号2的氨基酸序列的多肽，其是具有强的细胞粘附活性的重组纤连蛋白片段。
纤连蛋白还具有结合肝素的活性。纤连蛋白的肝素结合区相当于上述III型重复序列的N端起第12位-第14位。由序列表的序列号5所示氨基酸序列组成的H-271是包含该肝素结合区的重组纤连蛋白片段。
本发明中，除单独含有各区域的片段以外，也可以使用由2个以上的这些区域直接结合或通过合适的接头结合成的片段。包含在上述片段中的纤连蛋白衍生的区域可以是相同的，也可以是不同的。分子内具有复数个结合区的纤连蛋白片段可示例含有VLA-4结合区和肝素结合区的H-296（序列表的序列号6所示的氨基酸序列），含有VLA-5结合区和肝素结合区的CH-271（序列表的序列号7所示的氨基酸序列），含有VLA-4结合区、VLA-5结合区和肝素结合区的CH-296（序列表的序列号8所示的氨基酸序列），含有VLA-4结合区和VLA-5结合区的C-CS1（序列表的序列号9所示的氨基酸序列）等多肽。上述各种多肽记载在非专利文献2中，可以根据其公开内容制备。CH-296以レトロネクチン（Retronectin；注册商标）的名称由TaKaRa BIO公司销售。
此外，本发明使用的片段只要通过纤连蛋白片段获得所需效果即可，也可以由这样的多肽组成，其具有与包含至少一部分上述所示天然纤连蛋白的氨基酸序列的片段相同的功能，其具有在构成所述片段的多肽的氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列。此外，例如也可以在C-247、H-271中缺失1个或2个III型重复序列。
对于细胞粘附活性，可以使用公知的方法检测本发明中使用的片段（其细胞结合结构域）与细胞的结合进行调查。例如，此类方法包括Williams D. A.等人的方法（Nature，第352卷，第438~441页（1991））。所述方法是测定细胞与固定在培养平板中的片段的结合的方法。此外，肝素结合活性可以通过使用公知方法测定本发明中使用的片段（其肝素结合结构域）与肝素的结合进行调查。例如，在上述Williams D. A.等人的方法中，通过使用肝素（例如，标记肝素）代替细胞，可以以同样的方法评估片段与肝素的结合。
重组纤连蛋白片段在本发明中的使用除了易于获得、操作以外，在其品质均一、混入病毒等的危险性低的安全性方面也是优选的。本发明使用的纤连蛋白片段的分子量没有特殊的限制，优选1~200kDa，更优选5~190kDa，更优选10~180kDa。所述分子量可以通过例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定。
在本发明的CIK细胞的制备方法中使用的培养基对于（a）-（c）的任一步骤都没有特殊的限制，可以使用淋巴细胞扩大培养等中可使用的公知培养基，例如，可以适当地选择使用市售的培养基。这些培养基也可以在其本来的构成成分以外含有细胞因子类、适当的蛋白质或其他成分。通常，本发明中使用含有选自IFN-γ和IL-2中至少一种的培养基。培养基中的IFN-γ的浓度没有特殊的限制，是50~10000U/mL，更优选100~5000U/mL。培养基中的IL-2的浓度没有特殊的限制，是10~5000U/mL，优选50~2000U/mL。培养基中还可以添加IL-1α、IL-7、IL-12等细胞因子类。所述成分在培养基中的浓度只要获得所需效果即可，没有特殊的限制。
这些成分可以在上述步骤（a）-（c）中的任一个步骤中使用，本发明没有特殊的限制，例如优选在上述步骤（a）中使用IFN-γ，优选在上述步骤（a）-（c）的全部步骤中使用IL-2。
此外，培养基中也可以添加血清或血浆。它们在培养基中的添加量没有特殊的限制，示例是大于0容量%~20容量%，此外可以对应于培养阶段改变使用的血清或血浆的量。例如，也可以逐步递减使用血清或血浆浓度。此外，血清或血浆的来源可以是自体（意指与培养细胞来源相同）或非自体（意指与培养细胞来源不同）中的任一种，从安全性的观点而言，优选自体来源。此外，也可以添加如人血清白蛋白的分离的血清成分。
此外，培养基中还可以添加实施了剥夺增殖能力的处理的细胞。本说明书中的“剥夺增殖能力的处理”是使细胞的增殖能力丧失或降低的处理即可，没有特殊的限制，例如可以通过化学处理和/或物理处理来实施。上述化学处理可示例，例如利用化学药剂（福尔马林等）、抗癌剂（有丝分裂抑制剂，例如丝裂霉素C等）、加热、加温、冷冻解冻或超声波的处理。此外，上述物理处理例如通过放射线照射实施上述处理的情况，例如使用γ射线、X射线。放射线照射量只要使被照射的细胞丧失增殖能力即可，没有特殊的限制，例如是100~20000R（0.88~175.40Gy），优选是1000~8000R（8.77~70.16Gy）。在本发明的制备方法中，通过在培养基中添加实施了剥夺增殖能力的处理的细胞，可以使所获得的CIK细胞数增加。此外，可以获得对肺癌细胞株等表现出高的细胞毒性活性的细胞群。
实施了剥夺增殖能力的处理的细胞丧失了细胞分裂或DNA合成等与增殖相关的能力，或者是所述能力降低的细胞。例如，进行过放射线处理的细胞的增殖能力降低，但刚处理后表现出与活细胞相同的形态和特性，保持了分泌细胞因子等蛋白质的代谢能力。“实施了剥夺增殖能力的处理的细胞”期望是患者自身来源的。本发明中使用的“实施了剥夺增殖能力的处理的细胞”在本发明中没有特殊的限制，优选可示例通过放射线照射而实施了剥夺增殖能力的处理的、患者自身来源的细胞（自体照射细胞；AIC）。
本发明的方法中使用的“实施了剥夺增殖能力的处理的细胞”的细胞浓度没有特殊的限制，可示例例如1~1×108细胞/mL，优选10~5×107细胞/mL，更优选1×102~2×107细胞/mL。
此外，本发明的CIK细胞的制备方法中使用的培养基中还可以含有生物应答修饰剂。“生物应答修饰剂”也称为BRM，意指在生物体内提高非特异性免疫应答能力的一群物质。
生物应答修饰剂已知有细胞来源的制剂（OK-432、BCG（卡介苗）、化脓性链球菌（Streptcoccus pyogenes）、小棒杆菌（Corynebacterium parvum）及其细胞壁骨架）、担子菌来源的多肽（香菇多糖、裂裥菌素、PSK等）、合成物质（吡喃共聚物、左旋咪唑等）或细胞因子类。“OK-432”意指用青霉素处理A类3型溶血性化脓链球菌（Streptcoccus pyogenes）的减毒天然突变菌株（Su菌株）而获得的细菌来源的制品的一般名称。该制品以Picibanil（注册商标）的商标名销售。在优选的方案中，本发明中使用作为微生物来源制剂的生物应答修饰剂，特别优选地使用OK-432。
培养基中的生物应答修饰剂的浓度在本发明中没有特殊的限制，例如在使用OK-432的情况下，可示例0.001~1 KE/mL，优选0.005~0.5 KE/mL，更优选0.01~0.2 KE/mL。一般而言，可以在开始培养时向培养基中添加生物应答修饰剂。
在本发明的CIK细胞的制备方法中，还可以包括向所述细胞群中导入外源基因的步骤。此外，“外源基因”意指向基因导入对象CIK细胞中人为导入的基因，也包括与基因导入对象的细胞同种来源的基因。
外源基因的导入手段没有特殊的限制，可以通过公知的基因导入方法选择使用恰当的手段。基因导入步骤可以在本发明的制备方法中的任何时间点实施。例如，在制备上述细胞群的同时或中间、或者在该步骤之后实施，从工作效率的观点出发是优选的。基因导入可以使用病毒载体或者不使用病毒载体来实施。关于此类方法的细节，许多文献都已公开。
上述病毒载体没有特殊的限制，一般使用在基因导入方法中所使用的公知的病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体等。可以将载体中包含的外源基因稳定地整合到导入细胞的染色体DNA中的逆转录病毒载体或慢病毒载体是特别优选的。上述病毒载体优选是在感染细胞中不能自主复制的复制能力缺陷载体。此外，在导入基因时，还可以使用RetroNectin（注册商标）等提高基因导入效率的物质。
不使用病毒载体的基因导入方法可以使用应用脂质体、配体-多聚赖氨酸等载体的方法，或者磷酸钙法、电穿孔法、基因枪法等。在此情况下，导入整合到质粒DNA、直链DNA或RNA中的外源基因。
所导入的外源基因没有特殊的限制，可以使用期望导入上述细胞的任何基因（例如，编码酶、细胞因子、受体等的蛋白质的基因，加上编码反义核酸、siRNA（小干扰RNA）、核酶等的基因）。这些外源基因可以例如插入到载体或质粒等中而使用，以便在适当的启动子的控制下表达。此外，载体内还可以存在如增强子序列或终止子序列的调控序列。
根据本发明的方法，可以导入编码与对治疗癌症等患者中使用的药剂的耐受性相关的酶的基因（例如，多重耐药性基因）而赋予CIK细胞耐药性。使用这样的细胞群，可以使免疫疗法和药物疗法组合，从而可以获得更高的治疗效果。另一方面，与上述方案相反，导入赋予对特定药物的敏感性的基因（例如，胸腺嘧啶核苷激酶基因），可以赋予CIK细胞对所述药剂的敏感性。在此情况下，通过施用所述药剂，可以去除移植到生物体中之后的细胞。
此外，除上述的以外，导入的外源基因还可以使用例如编码肿瘤抗原特异性T细胞受体（TCR）的核酸、或者编码这样的嵌合受体的核酸，所述嵌合受体由肿瘤细胞上表达的分子的特异性抗体（抗CD19抗体等）、受体分子（TCR等）、配体、或包含它们的一部分的细胞外区域、跨膜结构域和在细胞内传递信号的其他1种以上的信号相关分子的细胞内区域组成。关于所述嵌合受体的有用信息例如通过マルク-マリナ V.等人（Expert Opin. Biol. Ther.，第9卷，第5号，579~591（2009））获得。通过向CIK细胞中导入编码上述TCR或嵌合受体的核酸，可以赋予CIK细胞对目标肿瘤细胞的特异性细胞毒性活性。上述嵌合受体的细胞外区域可示例例如抗体或受体分子的细胞外区域、或者抗体的抗原识别位点或受体分子的配体识别位点与其它抗体或受体分子（CD28等）来源的间隔子/铰链部位融合而成的细胞外区域。此外，上述嵌合受体的细胞内区域可示例例如存在于淋巴细胞上的信号关联分子的细胞内区域。所述信号关联分子的细胞内区域可列举例如CD3ζ链、CD28、4-1BB、CD134、FcR-γ、Syk-PTK的细胞内区域，或者它们的信号传递结构域。
本发明的制备方法也可以包括从上述方法获得的细胞群进一步分离CD3阳性且CD56阳性的细胞群的步骤。分离可以使用例如抗CD3抗体或抗CD56抗体，利用细胞分选、磁珠、亲和柱等以公知的方法进行。如此分离的细胞群富集了具有高的细胞毒性活性的细胞，预期发挥更高的治疗效果。
（2）本发明的CIK细胞
本发明提供了可用上述本发明的CIK细胞的制备方法获得的CIK细胞。本发明的CIK细胞与常规方法制备的CIK细胞相比含有高比例的CD3阳性CD56阳性细胞，因而在生物体内发挥更强力的细胞毒性活性，产生高的治疗效果。
对于本发明的CIK细胞中的CD3阳性CD56阳性细胞的比例，本发明没有特殊的限制，例如可示例总细胞数的20%以上、优选25%以上、更优选30%以上。
（3）本发明的药物
本发明提供了含有CIK细胞为有效成分的药物（治疗剂或预防剂）。含有所述CIK细胞的上述治疗剂适用于免疫疗法。在免疫疗法中，适用于患者治疗的CIK细胞通过例如利用注射或点滴的施用方法，经静脉、经动脉、皮下、腹腔内等途径施用于患者。本发明的治疗剂在本发明中没有特殊的限制，其在例如癌症、白血病、恶性肿瘤、肝炎、感染性疾病（例如，流感、结核、AIDS、MRSA感染、VRE感染或深部真菌病）等具有CIK细胞敏感性的疾病的治疗中非常有用。此外，所述治疗剂可以与以预防在骨髓移植、放射线照射后等的免疫缺陷状态下的感染病或减轻复发白血病为目的的供体淋巴细胞输注、抗癌剂治疗、放射线治疗、抗体疗法、温热疗法、其他免疫疗法等传统的治疗方法组合利用。
可以根据制药领域公知的方法，制备本发明的治疗剂和预防剂，例如以通过本发明的方法制备的细胞群为有效成分，与公知的适合不经口施用的有机或无机载体、赋形剂、稳定剂等混合，配制成点滴剂或注射剂。此外，可以根据公知的免疫疗法，适当地确定治疗剂中本发明的CIK细胞的含量、治疗剂的施用量和与所述治疗剂相关的各种条件。药物中的本发明的CIK细胞的含量没有特殊的限制，可示例例如优选1×103~1×1011细胞/mL，更优选1×104~1×1010细胞/mL，进一步优选1×105~2×109细胞/mL。此外，本发明的药物的施用量没有特殊的限制，可示例例如成人每天优选1×106~1×1012细胞/日，更优选1×107~5×1011细胞/日，进一步优选1×108~2×1011细胞/日。进一步地，利用所述治疗剂的免疫疗法也可以与公知的利用药剂施用的药剂治疗、放射线治疗或利用外科手术的治疗联合应用。
（4）本发明的治疗方法或预防方法
本发明还提供了疾病的治疗方法或预防方法，包括向对象施用有效量的通过上述方法可以获得的CIK细胞。本说明书中的对象表示例如患有前述疾病的患者。
本说明书中的有效量指在施用上述CIK细胞的情况下能够发挥治疗或预防效果的所述细胞群的量。具体的有效量根据施用形式、施用方法、使用目的或对象的年龄、体重、症状等适当设定，并非恒定。施用方法也没有限制，例如与上述药物相同地通过点滴、注射等施用即可。
此外，根据本发明，还提供了可通过本发明获得的CIK细胞用于药物制备的用途。进一步地，根据本发明，还提供了可通过本发明获得的CIK细胞，其用于疾病治疗。所述药物的制备方法与上述药物相同地进行。此外，对于施用所述药物的疾病也没有特殊的限制，与上述药物相同。
实施例
下文列举实施例更详细地说明本发明，但本发明决不限于其中的记载。
实施例1 使用抗人CD3抗体和Retronectin的CIK细胞培养
（1）PBMC的分离和保存
从获得知情同意书的健康人供体A、供体B和供体C中，分别实施成分采血（在本文中所谓的成分采血是以采集单核细胞为目的的采血）。用Dulbecco PBS（由Invitrogen公司生产或由日水制药公司生产；在下文中称为DPBS）或含有1%人血清白蛋白（制剂名称：ブミネート；由バクスター公司生产，在下文中称为HSA）的生理盐水（在下文中称为1% HSA/生理盐水）将所获得的成分采血液稀释约2倍后，在Ficoll-Paque PREMIUM或Ficoll-Paque PLUS 15mL上（任一种都由GE Healthcare Biosciences公司生产）将稀释的成分采血液以各30mL分别分层，在700×g、室温下离心20分钟。离心后，在分离的层中用移液器回收PBMC层，用RPMI1640（由Invitrogen公司生产、由sigma公司生产或和由光纯药公司生产）或1% HSA/生理盐水补充至45mL后，在650×g、4℃离心10分钟，去除上清液。边600×g、500×g逐步降低离心加速度边进行总计3次相同的洗涤操作。
将如此从各供体采集的PBMC悬浮在由含有8% HAS的CP-1（由极东制药公司生产）和RPMI1640的等量混合液组成的保存液中，保存在液氮中。将如此保存的PBMC在37℃水浴中快速解冻，用含有10μg/mL DNA酶（由Calbiochem公司生产）的GT-T503（由TaKaRa BIO公司生产）洗涤后，通过台盼蓝染色法测量活细胞数后，用于以下各实验。
（2）抗人CD3抗体和Retronectin固定化平板的制备
向12孔细胞培养板（由Corning公司生产）中，添加0.45mL/孔的含有终浓度5μg/mL或1μg/mL的抗人CD3抗体（制剂名称：オルソクローンOKT3注，由janssen公司生产）和终浓度为5μg/mL的Retronectin（注册商标，由TaKaRa BIO公司生产）的ACD-A液（由Terumo公司生产）。然后，在37℃、在存在5%CO2的条件下温育5小时后，从各孔去除ACD-A液而获得固定了抗人CD3抗体和Retronectin的细胞培养板。此外，通过除用含有终浓度5μg/mL或1μg/mL的抗人CD3抗体而不含Retronectin的ACD-A液之外进行与上述相同的操作，也制备固定了抗人CD3抗体的细胞培养板（没有固定Retronectin的平板）。并且，此处所制备的各平板用DPBS洗涤2次和RPMI1640洗涤1次后用于以下各实验。
（3）CIK细胞的培养
将实施例1-（1）中配制的供体A来源的PBMC按0.53×106细胞/mL悬浮在含有0.5%人AB型血清（Lonza公司生产）和0.2% HAS的GT-T503（下文中称为0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503）中。向实施例1-（2）制备的各种固定化培养平板中，添加1mL/孔的上述PBMC悬浮液，进一步添加0.75mL/孔的0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503，共计1.75mL/孔。然后，向各孔中添加终浓度分别为1000U/mL的IL-2（制剂名称：プロロイキン；由カイロン公司生产或由ノバルティス公司生产）和IFN-γ（制剂名称：イムノマックス―γ注；由盐野义制药公司生产），在37℃、在存在5%CO2的条件下开始培养这些平板（培养第0天）。在培养第4天时，用0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503将各孔的一部分细胞液稀释12.5倍，将10mL稀释液注入到立着的Ｔ-25细胞培养瓶（培养面积10cm2，由Corning公司生产）中，向其中以终浓度500U/mL加入IL-2后，继续培养该瓶。在培养的第8天，用0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503将各瓶内的一部分细胞液稀释4倍，将10mL稀释液注入新的（立着的）Ｔ-25细胞培养瓶中，向其中以终浓度500U/mL加入IL-2后，进一步以终浓度50ng/mL加入游离抗人CD3抗体（抗人CD3抗体再刺激组）。此时，设置作为对照组的不添加抗人CD3抗体的组。继续培养抗人CD3抗体再刺激组和对照组，在培养的第11天，用0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503将各组的各瓶内的一部分细胞液稀释4倍，将10mL稀释液注入新的（立着的）Ｔ-25细胞培养瓶中，向其中以终浓度500U/mL加入IL-2后，继续培养该瓶。
继续培养至开始培养第14天，在第14天，通过台盼蓝染色法测量活细胞数，将其与开始培养时的细胞数比较，计算扩大培养率（按总细胞数换算）。结果显示在表1中。此外，在下表中，-表示未使用，+表示使用。
【表1】
（4）CD3阳性CD56阳性（CD3+CD56+）细胞和CD8阳性（CD8+）细胞含有比例的分析
对于实施例1-（3）中配制的开始培养后第14天的细胞，用流式细胞仪（Cytomics FC500；beckmancoulter公司生产）分析CD3+CD56+细胞含有比例和CD8+细胞含有比例。换言之，用DPBS洗涤开始培养后第14天的细胞后，将细胞悬浮在含有1%牛血清白蛋白（sigma公司生产，下文中称为BSA）的DPBS（下文中称为1%BSA/DPBS）中，加入PC5标记的小鼠抗人CD3抗体、FITC标记的小鼠抗人CD8和RD1标记的小鼠抗人CD56抗体（都由beckmancoulter公司生产）。同样地，在各细胞群的一部分中，添加作为阴性对照的FITC标记的小鼠IgG1/RD1标记的小鼠IgG1/PC5标记的小鼠IgG1（都由beckmancoulter公司生产）。添加了各种抗体后，在4℃温育30分钟。温育后，用含有0.1%BSA的DPBS（下文中称为0.1%BSA/DPBS）洗涤细胞，将细胞再次悬浮在DPBS中。将这些细胞供给流式细胞仪，计算CD3+CD56+细胞含有比例和CD8+细胞含有比例。结果显示在表2中。
【表2】
如表2所示，通过使用抗人CD3抗体的再刺激，以高比例获得CD3+CD56+细胞。此外，以高比例获得称为CIK细胞的活性主体的CD8+细胞。此外，通过组合抗人CD3抗体和Retronectin给予细胞群初期刺激，进一步提高了这些效果。进一步地，这些效果不依赖于作为初期刺激使用的抗人CD3抗体的固定化浓度，发挥了显著的效果。如表1所示，具有高的扩大培养率，同时获得了含有非常高比例的CD3+CD56+细胞的CIK细胞。
由此可见，本发明的制备方法为有效获得对CIK细胞的抗肿瘤活性起重要作用的CD3+CD56+CD8+细胞的方法。此外清楚的是，由于可以大量培养CD3+CD56+细胞含有率高的CIK细胞，它是制备发挥高治疗效果的细胞群的方法。
（5）CD3+CD56+细胞的扩大培养率的评估
分别对于实施例1-（1）中配制的供体A来源的PBMC和实施例1-（3）中配制的开始培养后第14天的细胞，按与实施例1-（4）相同的方法测定CD3+CD56+细胞含有比例。但是，考虑到PBMC中混有红细胞，使用FITC标记的小鼠抗人CD3抗体、RD1标记的小鼠抗人CD56抗体和PC5标记的小鼠抗人CD45抗体（都由beckmancoulter公司生产），将CD45阳性CD3+CD56+细胞定义为开始培养时的CD3+CD56+细胞。
使用如此计算出的CD3+CD56+细胞含有比例和实施例1-（3）计算出的扩大培养率（按总细胞数换算），计算培养期内（14天）CD3+CD56+细胞增殖的倍率，即CD3+CD56+细胞扩大培养比例（下述式（1））。另外，此次解冻使用的PBMC中的CD3+CD56+细胞的含有比例（开始培养时的CD3+CD56+细胞含有比例）是1.54%。结果显示在表3中。
【数学式1】
CD3+CD56+细胞扩大培养率（倍） =
扩大培养率（按总细胞换算）× （培养第14天的CD3+CD56+细胞含有比例/培养开始时的CD3+CD56+细胞含有比例） 式（1）。
【表3】
如表3所示，通过组合抗人CD3抗体和Retronectin给予细胞群初期刺激、并进一步在培养中用抗人CD3抗体再刺激，显著增加了在培养14天内的CD3+CD56+细胞增殖性。此外，这些效果不依赖于作为初期刺激使用的抗人CD3抗体的固定化浓度，其在广泛的浓度范围发挥作用。
由此可见，通过本发明的制备方法，可以优先增殖考虑为CIK细胞的活性成分的CD3+CD56+细胞，有效地获得对CIK细胞的抗肿瘤活性起重要作用的CD3+CD56+细胞。
实施例2 使用抗人CD3抗体和Retronectin培养CIK细胞（添加IFN-γ和使用自体照射细胞的比较）
（1）自体照射细胞（下文中称为AIC）的配制
将实施例1-（1）中配制的供体A来源的PBMC悬浮在0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503中后，使用X射线照射装置照射3400R（29.8Gy）的X射线（下文中称该X射线照射后的细胞为PBMC AIC）。将该配制的PBMC AIC按1.06×106细胞/mL再次悬浮在0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503中。
（2）CIK细胞的培养
将实施例1-（1）中配制的供体A来源的PBMC按1.06×106细胞/mL悬浮在0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503中（称为IFN-γ前一天不处理组）。但是，还设立这样的组，所述组在开始培养前一天将同样配制的PBMC在存在IFN-γ（终浓度1000U/mL）的条件下培养过夜后，在开始培养时按上述细胞浓度悬浮（下文中称为IFN-γ前一天处理组）。
向以与实施例1-（2）相同的方法制备的抗人CD3抗体和Retronectin固定化平板（但是，抗人CD3抗体的固定化浓度为0.1μg/mL）中加入0.875mL/孔的上述PBMC（IFN-γ前一天不处理组）或PBMC（IFN-γ前一天处理组），进一步在使用AIC的组中加入0.875mL/孔的实施例2-（2）中配制的PBMC AIC，共计1.75mL/孔。对于不使用AIC的组，添加0.875mL/孔的0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503代替AIC。向各孔加入终浓度分别为1000U/mL的IL-2和IFN-γ，将这些平板在37℃、在存在5%CO2的条件下开始培养（培养第0天）。培养方法按与实施例1-（3）相同的方法进行，培养第4天、第8天和第11天的稀释，以及抗人CD3抗体再刺激组和不添加抗人CD3抗体的组的设置等也与实施例1-（3）相同地实施。继续培养至第14天，在开始培养后第11天和第14天，通过台盼蓝染色法测量活细胞数，将其与开始培养时的细胞数比较而计算扩大培养率（按总细胞数换算）。结果显示在表4中。
【表4】
（3）CD3+CD56+细胞和CD8+细胞含有比例的分析
对于实施例2-（2）中配制的开始培养后第14天的细胞，按与实施例1-（4）相同的方法，分析CD3+CD56+细胞含有比例和CD8+细胞含有比例。结果显示在表5中。
【表5】
如表5所示，通过组合抗人CD3抗体和Retronectin给予细胞群初期刺激、并进一步在培养中用抗人CD3抗体再刺激，以高比例获得CD3+CD56+细胞。此外，这些效果不依赖于对PBMC的IFN-γ处理方法差异或AIC使用的有无而广泛发挥。由此可见，本发明的制备方法可广泛适应于现有CIK细胞培养方法，是有效获得CIK细胞中的重要组成成分CD3+CD56+细胞的方法。
（4）CD3+CD56+细胞的扩大培养率的评估
分别对于实施例1-（1）中配制的供体A来源的PBMC和实施例2-（2）中配制的开始培养后第14天的细胞，按与实施例1-（4）相同的方法测定CD3+CD56+细胞含有比例。
使用计算出的CD3+CD56+细胞含有比例和实施例2-（2）中计算出的扩大培养率（按总细胞数换算），与实施例1-（5）同样地计算在培养期内（14天）CD3+CD56+细胞增殖的倍率（即，CD3+CD56+细胞扩大培养率）。另外，在开始培养时，CD3+CD56+细胞的含有比例是0.6%。结果显示在表6中。
【表6】
如表6所示，通过组合抗人CD3抗体和Retronectin给予细胞群初期刺激、并进一步在培养中用抗人CD3抗体再刺激，CD3+CD56+细胞的增殖性显著增加，培养的14天的CD3+CD56+细胞扩大培养率显著增加。此外，与AIC组合进一步提高了该扩大培养率。此外，这些效果不依赖于对PBMC的IFN-γ处理方法差异而发挥。
由此可见，本发明的制备方法是有效获得CIK细胞中的重要组成成分CD3+CD56+细胞的方法。
实施例3 使用抗人CD3抗体和Retronectin培养CIK细胞（再刺激时的抗人CD3抗体浓度的比较）
（1）PBMC AIC的配制
除了使用供体B来源的PBMC或供体C来源的PBMC代替供体A来源的PBMC以外，按与实施例2-（1）相同的方法配制PBMC AIC。
（2）CIK细胞的培养
按与实施例2-（2）相同的方法培养CIK细胞。但是，PBMC使用供体B来源的PBMC或供体C来源的PBMC（使用与实施例3-（1）使用的供体相同的供体来源的PBMC），不进行IFN-γ前一天处理。此外，在开始培养第8天通过抗人CD3抗体再刺激时，使抗人CD3抗体的浓度为50ng/mL或200ng/mL。
继续培养至开始培养第14天，在开始培养后第14天，通过台盼蓝染色法测量活细胞数，将其与开始培养时的细胞数比较而计算扩大培养率（按总细胞数换算）。结果显示在表7中。
【表7】
（3）CD3+CD56+细胞和CD8+细胞含有比例的分析
对于实施例3-（2）中配制的开始培养后第14天的细胞，按与实施例1-（4）相同的方法，分析CD3+CD56+细胞含有比例。结果显示在表8中。
【表8】
如表8所示，通过组合抗人CD3抗体和Retronectin给予细胞群初期刺激、并进一步在培养中用抗人CD3抗体再刺激，以高比例获得CD3+CD56+细胞。此外，这些效果不依赖于供体或再刺激时的抗人CD3抗体浓度而发挥。
由此可见，本发明的制备方法是有效获得CIK细胞中的重要组成成分CD3+CD56+细胞的方法。
（4）CD3+CD56+细胞的扩大培养率的评估
分别对于实施例1-（1）中配制的供体B来源的PBMC、供体C来源的PBMC和实施例3-（2）中配制的开始培养后第14天的细胞，按与实施例1-（4）相同的方法测定CD3+CD56+细胞含有比例。
使用计算出的CD3+CD56+细胞含有比例和实施例3-（2）计算出的扩大培养率（按总细胞数换算），与实施例1-（5）同样地计算在培养期内（14天）CD3+CD56+细胞增殖的倍率（即，CD3+CD56+细胞扩大培养率）。另外，在开始培养时，两个供体的CD3+CD56+细胞的含有比例都是1.62%。结果显示在表9中。
【表9】
如表9所示，通过组合抗人CD3抗体和Retronectin给予细胞群初期刺激、并进一步在培养中用抗人CD3抗体再刺激，在培养14天的CD3+CD56+细胞的增殖性显著提高。此外，这些效果不依赖于供体或再刺激时的抗人CD3抗体浓度而发挥。
由此可见，本发明的制备方法是可以有效获得CIK细胞中的重要组成成分CD3+CD56+细胞的方法。
实施例4 使用透气性培养袋培养CIK细胞
（1）抗人CD3抗体和Retronectin固定化CultiLife 215的制备
向培养面积为86cm2的密封的透气性培养袋CultiLife（注册商标）215（由TaKaRa BIO公司生产）中，添加10.4mL含有终浓度为0.1或0.3μg/mL的抗人CD3抗体和终浓度为5μg/mL的Retronectin（注册商标）的ACD-A液，在37℃、在存在5%CO2的条件下温育5小时。此外，在使用前立即用1% HSA/生理盐水对如此制备的抗人CD3抗体/Retronectin固定化CultiLife 215洗涤3次。
（2）CIK细胞群的扩大培养
在实施例4-（1）制备的抗人CD3抗体/Retronectin固定化CultiLife 215中，各添加1.2×107细胞的实施例1-（1）中配制的PBMC，分别加入终浓度为1000U/mL的IL-2、终浓度为1000U/mL的IFN-γ，用含有0.5%自体血浆（PBMC供体来源的经过失活处理的血浆）和0.2% HAS的GT-T503（在下文中称为0.5%血浆/0.2% HSA/GT-T503）使总液体量最终为40mL。将添加了细胞液的培养袋在37℃、在存在5%CO2的条件下开始培养（培养第0天）。在开始培养第4天，将23.4mL细胞液转移到培养面积为300cm2的密封的透气性培养袋CultiLife（注册商标）Eva（由TaKaRa BIO公司生产）中，加入终浓度为500U/mL的IL-2后，用0.5%血浆/0.2% HSA/GT-T503使总液体量最终为300mL。在第8天，将CultiLife（注册商标）Eva中的75mL细胞液转移到培养面积为300cm2的新的密封的透气性培养袋CultiLife（注册商标）Eva中，用0.5%血浆/0.2% HSA/GT-T503稀释4倍，使总液体量为300mL，之后加入终浓度为500U/mL的IL-2。再添加终浓度为50ng/mL的抗人CD3抗体进行再刺激。在第11天，用0.5%血浆/0.2% HSA/GT-T503稀释2倍，使总液体量为600mL，之后加入终浓度为500U/mL的IL-2。继续培养至第15天。在开始培养后第15天，对取样的细胞通过台盼蓝染色法测量活细胞数，将其与开始培养时的细胞数比较，计算扩大培养率。此外，按与实施例1-（4）相同的方法，测定CD3+CD56+细胞含有比例。结果显示在表10中。
【表10】
如表10所示，即使使用透气性培养袋实施本发明的制备方法，也以高扩大培养率获得了高比例含有CD3+CD56+细胞的细胞群。此外，这些效果不依赖于初期刺激时的抗人CD3抗体浓度而发挥。
实施例5 使用OK-432培养CIK细胞（有无AIC的比较）
（1）抗人CD3抗体和Retronectin固定化平板的制备
按与实施例1-（2）相同的方法，制备抗人CD3抗体和Retronectin固定化平板。但是，抗人CD3抗体的终浓度为0.1μg/mL。
（2）CIK细胞群的扩大培养
使用实施例5-（1）制备的抗人CD3抗体和Retronectin固定化平板，按与实施例2-（2）相同的方法进行培养。但是，不设立IFN-γ前一天处理组，所有的组都添加终浓度为0.05 KE/mL的OK-432（制品名称：ピシバニール；由中外制药公司生产）。此外，也研究添加AIC的影响。继续培养至第15天。在开始培养后第15天，对取样的细胞通过台盼蓝染色法测量活细胞数，将其与开始培养时的细胞数比较而计算扩大培养率。此外，按与实施例1-（4）相同的方法，测定CD3+CD56+细胞含有比例。结果显示在表11中。
【表11】
如表11所示，即使在添加OK-432的情况下，也以高扩大培养比例获得了高比例含有CD3+CD56+细胞的细胞群。此外，通过添加AIC，大大增加了扩大培养率。
（3）细胞毒性活性的测定
对于实施例5-（2）中配制的开始培养后第15天的细胞，测定其细胞毒性活性。用钙荧光素-AM（Calcein-AM）细胞毒性活性测定法（Lichtenfels R.等人，J. Immunol. Methods，第172卷，第2号，第227~239页（1994））评估细胞毒性活性。换言之，将慢性骨髄性白血病细胞株K562细胞和肺癌细胞株A549细胞分别按（1~2）×106细胞/mL悬浮在含有5%胎牛血清（Hyclone公司生产）的RPMI1640中，之后加入终浓度为25μM的钙荧光素-AM（同仁化学研究所公司生产），在37℃培养1小时。用不含钙荧光素-AM的培养基洗涤如此获得的细胞，作为钙荧光素-标记的靶细胞。
将实施例5-（2）中配制的开始培养后第15天的细胞作为效应子细胞，以3×106细胞/mL、1×105细胞/mL，用含有5%人AB型血清、0.1mM NEAA混合物、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺（都由Lonza公司生产）和1%青霉素-链霉素（Gibco BRL公司生产）或100μg/mL 硫酸链霉素（明治制果公司生产）的RPMI1640稀释后，向96孔细胞培养板（Corning公司生产）的各孔中分别加入100μL/孔。之后，向每个孔各加入100μL配制为1×105细胞/mL的钙荧光素-标记的靶细胞。此时，效应子细胞（E）相对于钙荧光素-标记的靶细胞（T）的比，即E/T比为30和10两种。将装有上述细胞悬浮液的平板在400×g离心1分钟后，在37℃、在存在5%CO2的条件下温育4小时。之后，从每个孔采集培养上清液100μL，用荧光读板器（Mithras LB 940：Berthold公司生产）（激发485nm/测定535nm）测定释放到培养上清液中的钙荧光素量。按下述式（2）计算“细胞毒性活性（%）”。
【数学式2】
细胞毒性活性（%） =
{（各孔的测定值-最小释放量）/（最大释放量-最小释放量）} × 1
式（2）。
在上述式中，最小释放量是仅含有钙荧光素标记的靶细胞的孔的钙荧光素释放量，表示来自钙荧光素标记的靶细胞的钙荧光素自然释放量。此外，最大释放量表示向钙荧光素标记的细胞中添加0.1%表面活性剂Triton X-100（Nacalai Tesque 公司生产）而完全破坏细胞时的钙荧光素释放量。细胞毒性活性测定的结果显示在表12中。
【表12】
如表12所示，通过本发明的制备方法获得的细胞群发挥高的细胞毒性活性。此外，明确了通过添加AIC，获得对肺癌细胞株表现出高的细胞毒性活性的细胞群。
实施例6 向CIK细胞中导入基因
（1）抗人CD3抗体和Retronectin固定化平板的制备
按与实施例1-（2）相同的方法制备抗人CD3抗体和Retronectin固定化平板。但是，抗人CD3抗体的终浓度为0.3μg/mL。
（2）AcGFP表达逆转录病毒载体-质粒的构建
如下制备AcGFP表达载体-MT-AcGFP。以pIRES2-AcGFP1（CLontech公司生产）为模板，使用由序列表的序列号10记载的核酸序列组成的AcGFP5引物和由序列表的序列号11记载的核酸序列组成的AcGFP3引物进行PCR，将扩增片段插入到pMT载体（Gene Therapy 第7卷，第797-804项（2000）记载的pM载体）中，制备MT-AcGFP质粒。
（3）生产细胞的制备
用逆转录病毒包装试剂盒（TaKaRa BIO公司生产）中包含的质粒pGP、pE-eco和实施例6-（1）中配制的MT-AcGFP转化的293T细胞，生产携带亲嗜性包膜（ecotropic envelope）的逆转录病毒。用所获得的逆转录病毒感染生产细胞PG13（ATCC#：CRL-10686）3次后，进行限度稀释，获得多个克隆。以通过实时PCR测定培养上清液中的病毒RNA量的结果、和用流式细胞仪测定与上清液接触的培养细胞的AcGFP阳性细胞率的结果为指标，选择1株克隆，将其作为逆转录病毒载体生产细胞用于以下实验。
（4）病毒溶液的配制
去除实施例6-（3）中制备的生产细胞的培养上清液，用DPBS洗涤1次后，用胰蛋白酶/EDTA处理使细胞剥离，将其悬浮在含有10%胎牛血清（Invitrogen公司生产）和50U/mL青霉素/50mg/mL链霉素（Nacalai Tesque 公司生产）的DMEM（sigma-Aldrich公司生产）中，之后按25000细胞/cm2的细胞密度接种在100mm培养皿（Iwaki公司生产）中。在培养24小时后，去除培养上清液，添加8mL新培养基。再培养24小时，回收上清液并用0.45μm滤器过滤，保存在-80℃。
（5）Retronectin固定化平板的制备（导入基因时）
向12孔未处理平板（Corning公司生产）中加入0.95mL/孔的含有终浓度为5μg/mL的抗人CD3抗体和终浓度为25μg/mL的Retronectin（注册商标）的DPBS液。之后，在37℃、在存在5%CO2的条件下温育5小时，然后从各孔去除DPBS液，获得抗CD3抗体和Retronectin固定化细胞培养板。此外，本文中制备的平板在用DPBS洗涤3次后用于以下各实验中。
（6）用于导入基因的平板的制备（病毒固定化）
向实施例6-（5）中制备的平板中加入1mL/孔的实施例6-（4）中制备的病毒液，在32℃、1000×g下离心2小时。但也制备不添加病毒液的孔。此时，添加1mL/孔的不含病毒的病毒稀释液（含有5%胎牛血清的DMEM），同样地进行离心。离心后，吸去病毒液，添加1mL/孔的含1.5% HAS的DPBS而洗净。
（7）向CIK细胞群导入基因和扩大培养
使用实施例6-（1）中制备的抗人CD3抗体和Retronectin固定化平板，按与实施例2-（2）相同的方法进行培养。但是，不设立IFN-γ前一天处理组。进一步地，设立在开始培养第4天导入基因（下文中称为1次感染组），在开始培养第4天和第5天连续导入基因（下文中称为2次感染组），或者与各感染组对应的不感染病毒的非基因导入组（下文中称为对照组）。换言之，在1次感染组中，在开始培养第4天，向实施例6-（6）中制备的平板中转移0.4 mL细胞液，加入4.6mL 的0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503，稀释12.5倍后，加入终浓度为500U/mL的IL-2。继续培养该平板至第8天。在2次感染组中，在开始培养第4天，向实施例6-（6）中制备的平板中转移1.5mL细胞液，加入1.5mL 的0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503，稀释2倍后，加入终浓度为500U/m的IL-2。进一步地，在开始培养第5天，向实施例6-（6）中制备的平板中转移0.8mL细胞液，加入4.2mL 的0.5% HAB/0.2% HSA/GT-T503，稀释6倍后，加入终浓度为500U/mL的IL-2。继续培养该平板至第8天。在对照组中，与1次感染组和2次感染组同时使用不固定病毒的平板，进行相同的操作。继续培养直到第14天。在开始培养后第14天，对取样的细胞通过台盼蓝染色法测量活细胞数，将其与开始培养时的细胞数比较，计算扩大培养率。此外，按与实施例1-（4）相同的方法，测定CD3+CD56+细胞含有比例。进一步地，用流式细胞仪分析通过导入基因而表达的蛋白质AcGFP的表达率，作为基因导入效率。结果显示在表13中。
【表13】
| 病毒感染次数 | 扩大培养率 | CD3+CD56+细胞比例（%） | 基因导入效率（%） |
| 1次感染 | × 171.9 | 47.5 | 17.7 |
| 1次感染对照组 | × 145.5 | 48.8 | 0.1 |
| 2次感染 | × 251.2 | 45.8 | 24.1 |
| 2次感染对照组 | × 289.2 | 53.5 | 0.1 |
如表13所示，在CIK细胞的扩大培养中，即使实施基因导入，也在保持高的CD3+CD56+细胞比例下获得表达目标基因的CIK细胞。另外明确了，感染次数越多，越获得高的基因导入效率。
产业实用性
通过本发明，可以大量提供以高比例含有CD3阳性CD56阳性细胞的CIK细胞，所述CD3阳性CD56阳性细胞被称为适合过继免疫疗法的亚细胞群。可通过本发明获得的细胞群在过继免疫疗法中是有用的。
SEQ ID NO:1：被称为 CS-1的纤连蛋白的部分区域。
SEQ ID NO:2：被称为III-10的纤连蛋白的部分区域。
SEQ ID NO:3：III-10中的纤连蛋白的部分区域。
SEQ ID NO:4：被称为C-274的纤连蛋白片段。
SEQ ID NO:5：被称为H-271的纤连蛋白片段。
SEQ ID NO:6：被称为H-296的纤连蛋白片段。
SEQ ID NO:7：被称为CH-271的纤连蛋白片段。
SEQ ID NO:8：被称为CH-296的纤连蛋白片段。
SEQ ID NO:9：被称为C-CS1的纤连蛋白片段。
SEQ ID NO:10：用以扩增编码AcGFP的DNA片段的设计的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:11：用以扩增编码AcGFP的DNA片段的设计的寡核苷酸引物。
序列表
<110> TAKARA BIO INC.
<120> 制备细胞因子诱导的杀伤细胞的方法
<130> 669884
<150> JP 2009-247347
<151> 2009-10-28
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 被称为 CS-1的纤连蛋白的部分区域
<400> 1
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly
1 5 10 15
Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
20 25
<210> 2
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 被称为III-10的纤连蛋白的部分区域
<400> 2
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr
20 25 30
Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp
65 70 75 80
Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr
85 90
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> III-10中的纤连蛋白的部分区域
<400> 3
Arg Gly Asp Ser
<210> 4
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 被称为C-274的纤连蛋白片段
<400> 4
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val
1 5 10 15
Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg
20 25 30
Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu
50 55 60
Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp
85 90 95
Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro
100 105 110
Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe
115 120 125
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
130 135 140
Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val
145 150 155 160
Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser
165 170 175
Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
180 185 190
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr
195 200 205
Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu
210 215 220
Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
225 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly
245 250 255
Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Asp
<210> 5
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 被称为H-271的纤连蛋白片段
<400> 5
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile
35 40 45
Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val
50 55 60
Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro
85 90 95
Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile
100 105 110
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala
115 120 125
Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp
130 135 140
Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys
145 150 155 160
Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val
165 170 175
Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu
180 185 190
Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala
195 200 205
Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro
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Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile
225 230 235 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu
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<211> 296
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 被称为H-296的纤连蛋白片段
<400> 6
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Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val
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225 230 235 240
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245 250 255
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290 295
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 被称为CH-271的纤连蛋白片段
<400> 7
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<213> 人工的
<220>
<223> 被称为CH-296的纤连蛋白片段
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405 410 415
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485 490 495
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<213> 人工的
<220>
<223> 被称为C-CS1的纤连蛋白片段
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用以扩增编码AcGFP的DNA片段的设计的寡核苷酸引物
<400> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用以扩增编码AcGFP的DNA片段的设计的寡核苷酸引物
<400> 11
ggatcctcac ttgtacagct c 21
Claims (4)
1.细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括下述步骤（a）-（c）：
（a）在纤连蛋白片段和抗CD3抗体共存的条件下，培养外周血单核细胞的步骤；
（b）在不存在抗CD3抗体的条件下，培养通过步骤（a）获得的细胞群的步骤；和
（c）在存在抗CD3抗体的条件下，培养通过步骤（b）获得的细胞群的步骤。
2.权利要求1记载的制备方法，其中步骤（a）-（c）中的至少一个步骤中的细胞群的培养在存在干扰素-γ和/或白介素-2的条件下实施。
3.权利要求1记载的制备方法，其中纤连蛋白片段含有选自以下的区域：
VLA-4结合区；
VLA-5结合区；和
肝素结合区。
4.细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其包括下述步骤（A）-（D）：
（A）在含有纤连蛋白片段和抗CD3抗体的培养基中，培养外周血单核细胞的步骤；
（B）使所述培养基的抗CD3抗体浓度降低的步骤；
（C）在抗CD3抗体浓度降低的培养基中培养细胞群的步骤；和
（D）在培养基中添加抗CD3抗体，进一步培养细胞群的步骤。
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