CN113957051B - 一种cik细胞培养基及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CIK细胞培养基，由基础培养基和添加在培养基中的A组分和B组分组成，所述A组分为：辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白、IL‑2、IL‑12、IFN‑γ、CD3单抗；所述B组分为刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM‑CSF。本发明提供的培养基，先在基础培养基中添加辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白等成分对外周血中单个核细胞进行诱导培养，提高诱导效率，然后，补充添加刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM‑CSF等成分的基础培养基，提高CIK细胞的增殖效率，短时间内可收获大量的CIK细胞，并且细胞活率高，可充分满足临床的使用需求。本发明还提供一种CIK细胞的培养方法，采用本发明的培养基，分阶段添加，有效提高CIK细胞的增殖效果。

Description

一种CIK细胞培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及免疫细胞培养领域，尤其涉及一种CIK细胞培养基及培养方法。
背景技术
CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达 CD3 和 CD56 两种膜蛋白分子，故又称为NK 细胞（自然杀伤细胞）样 T 淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗瘤活性，和 NK 细胞的非 MHC 限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同 “细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK 细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
随着CIK的应用越来越广泛，对CIK细胞的数量及活性要求越来越高。体外诱导培养决定着CIK细胞的质量。现有的CIK细胞培养多是从外周血或脐带血中分离、诱导培养得到、脐带血由于来源受限，更多的采用分离的外周血单个核细胞(PBMC)用CD3单克隆抗体、白细胞介素-1、白细胞介素-2以及γ-干扰素等因子进行活化、扩增，然而这种方式普遍存在诱导效率低、细胞生长慢、最终获得的CIK细胞增殖效果差、细胞活率低等问题，难以满足临床需要。因此有必要提供一种提高CIK细胞体外增殖活性的培养基。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种CIK细胞培养基，不添加血清、血浆等血液制品，成分明确安全，有效提高CIK细胞的增殖效率。
本发明的目的之二在于提供一种CIK细胞的培养方法
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种CIK细胞培养基，由基础培养基和添加在培养基中的A组分和B组分组成，所述A组分为：辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白、IL-2、IL-12、IFN-γ、CD3单抗；所述B组分为刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM-CSF。
优选地，所述A组分中各原料在基础培养基中的终浓度为：辛弗林5.3-6.8ng/mL、芦荟苷2.5-3.2μg/mL、纤维粘连蛋白1.5-5μg/mL、IL-2 1000-1500IU/mL、IL-12 500-800IU/mL、IFN-γ600-1000IU/mL、CD3单抗15-20ng/mL；所述B组分在基础培养基中的终浓度为：刺芒柄花素4.1-4.9μg/mL、谷氨酰胺5.5-7.5μg/mL、黄芪多糖8.5-10μg/mL、GM-CSF2.5-3.5μg/mL。
优选地，所述A组分中各原料在基础培养基中的终浓度为：辛弗林6.2ng/mL、芦荟苷2.8μg/mL、纤维粘连蛋白3μg/mL、IL-2 1200IU/mL、IL-12 650IU/mL、IFN-γ850IU/mL、CD3单抗18ng/mL；所述B组分在基础培养基中的终浓度为：刺芒柄花素4.5μg/mL、谷氨酰胺6.5μg/mL、黄芪多糖9μg/mL、GM-CSF 3μg/mL。
优选地，所述基础培养基为RPMI-1640培养基。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）取基础培养基，加入A组分：辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白、IL-2、IL-12、IFN-γ、CD3单抗，备用
（2）自外周血中分离单个核细胞，用步骤（1）的培养基重悬，在37℃，5%CO2条件下培养2-3天；
（3）向基础培养基中加入B组分：刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM-CSF，备用；
（4）向步骤（2）培养细胞中补充添加步骤（3）的培养基继续培养，每隔2-3天补充一次上述培养基，使细胞密度保持在1-5×106个/mL，连续培养14天。
优选地，步骤（2）培养基中单个核细胞密度为1-2×106个/mL。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种CIK细胞培养基，先在基础培养基中添加辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白等成分对外周血中单个核细胞进行诱导培养，提高诱导效率，然后，补充添加刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM-CSF等成分的基础培养基，提高CIK细胞的增殖效率。通过上述成分的配合有效提高CIK细胞的体外扩增效率，短时间内可收获大量的CIK细胞，并且细胞活率高，可充分满足临床的使用需求。
本发明还提供一种CIK细胞的培养方法，采用本发明的培养基，分阶段添加，有效提高CIK细胞的增殖效果。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种CIK细胞培养基，由RPMI-1640培养基和添加在培养基中的A组分和B组分组成，A组分为：辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白、IL-2、IL-12、IFN-γ、CD3单抗；B组分为刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM-CSF；
A组分中各原料在基础培养基中的终浓度为：辛弗林6.2ng/mL、芦荟苷2.8μg/mL、纤维粘连蛋白3μg/mL、IL-2 1200IU/mL、IL-12 650IU/mL、IFN-γ850IU/mL、CD3单抗18ng/mL；所述B组分在基础培养基中的终浓度为：刺芒柄花素4.5μg/mL、谷氨酰胺6.5μg/mL、黄芪多糖9μg/mL、GM-CSF 3μg/mL。
一种CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）取RPMI-1640培养基，加入A组分：辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白、IL-2、IL-12、IFN-γ、CD3单抗，备用
（2）自外周血中分离单个核细胞，用步骤（1）的培养基重悬转移至T75培养瓶中，培养基体积为15mL，细胞密度为1×106个/mL，在37℃，5%CO2条件下培养2天；
（3）向RPMI-1640培养基中加入B组分：刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM-CSF，备用；
（4）向步骤（2）培养瓶中补充添加步骤（3）的培养基继续培养，B组分在培养基中的终浓度为：刺芒柄花素4.5μg/mL、谷氨酰胺6.5μg/mL、黄芪多糖9μg/mL、GM-CSF 3μg/mL，每隔2天补充一次上述培养基，使细胞密度保持在1×106个/mL，连续培养14天。
实施例2
一种CIK细胞培养基，由RPMI-1640培养基和添加在培养基中的A组分和B组分组成，A组分为：辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白、IL-2、IL-12、IFN-γ、CD3单抗；B组分为刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM-CSF；
A组分中各原料在基础培养基中的终浓度为：辛弗林5.3ng/mL、芦荟苷2.5μg/mL、纤维粘连蛋白1.5μg/mL、IL-2 1000IU/mL、IL-12 500IU/mL、IFN-γ600IU/mL、CD3单抗15ng/mL；所述B组分在基础培养基中的终浓度为：刺芒柄花素4.1μg/mL、谷氨酰胺5.5μg/mL、黄芪多糖8.5μg/mL、GM-CSF2.5μg/mL。
一种CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）取RPMI-1640培养基，加入A组分：辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白、IL-2、IL-12、IFN-γ、CD3单抗，备用
（2）自外周血中分离单个核细胞，用步骤（1）的培养基重悬转移至T75培养瓶中，培养基体积为15mL，细胞密度为2×106个/mL，在37℃，5%CO2条件下培养3天；
（3）向RPMI-1640培养基中加入B组分：刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM-CSF，备用；
（4）向步骤（2）培养瓶中补充添加步骤（3）的培养基继续培养，B组分在培养基中的终浓度为：刺芒柄花素4.1μg/mL、谷氨酰胺5.5μg/mL、黄芪多糖8.5μg/mL、GM-CSF2.5μg/mL，每隔3天补充一次上述培养基，使细胞密度保持在3×106个/mL，连续培养14天。
实施例3
一种CIK细胞培养基，由RPMI-1640培养基和添加在培养基中的A组分和B组分组成，A组分为：辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白、IL-2、IL-12、IFN-γ、CD3单抗；B组分为刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM-CSF；
A组分中各原料在基础培养基中的终浓度为：辛弗林6.8ng/mL、芦荟苷3.2μg/mL、纤维粘连蛋白5μg/mL、IL-2 1500IU/mL、IL-12 800IU/mL、IFN-γ1000IU/mL、CD3单抗20ng/mL；所述B组分在基础培养基中的终浓度为：刺芒柄花素4.9μg/mL、谷氨酰胺7.5μg/mL、黄芪多糖10μg/mL、GM-CSF3.5μg/mL。
一种CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）取RPMI-1640培养基，加入A组分：辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白、IL-2、IL-12、IFN-γ、CD3单抗，备用
（2）自外周血中分离单个核细胞，用步骤（1）的培养基重悬转移至T75培养瓶中，培养基体积为15mL，细胞密度为1×106个/mL，在37℃，5%CO2条件下培养3天；
（3）向RPMI-1640培养基中加入B组分：刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM-CSF，备用；
（4）向步骤（2）培养瓶中补充添加步骤（3）的培养基继续培养，B组分在培养基中的终浓度为：刺芒柄花素4.9μg/mL、谷氨酰胺7.5μg/mL、黄芪多糖10μg/mL、GM-CSF3.5μg/mL，每隔2天补充一次上述培养基，使细胞密度保持在5×106个/mL，连续培养14天。
对比例1
对比例1提供一种CIK细胞培养基，和实施例1的区别为：省去辛弗林，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种CIK细胞培养基，和实施例1的区别为：省去芦荟苷，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种CIK细胞培养基，和实施例1的区别为：省去刺芒柄花素，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种CIK细胞培养基，和实施例1的区别为：省去刺芒柄花素，将谷氨酰胺的用量调整为11μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种CIK细胞培养基，和实施例1的区别为：省去谷氨酰胺，将刺芒柄花素的用量调整为11μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种CIK细胞培养基，和实施例1的区别为：在A组分中省去辛弗林、芦荟苷，加入刺芒柄花素4.5μg/mL、谷氨酰胺6.5μg/mL，其他成分不变，在B组分中省去刺芒柄花素、谷氨酰胺，加入辛弗林6.2ng/mL、芦荟苷2.8μg/mL，其他成分不变，其余均和实施例1相同。
采用流式细胞仪对实施例1至实施例3，对比例1至对比例6中收获的CIK细胞表型进行检测，分析同时表达CD3+CD56+的细胞百分比，结果如表1所示。
表1
样品 CD3+CD56+（%）
实施例1 73.49
实施例2 72.88
实施例3 71.04
对比例1 47.92
对比例2 55.76
对比例3 62.29
对比例4 65.41
对比例5 67.68
对比例6 51.39
由表1可以看出实施例1至实施例3中同时表达CD3+CD56+细胞的比例较高。对比例1和对比例2中分别省去了辛弗林、芦荟苷，对比例2至对比例5中分别省去刺芒柄花素、谷氨酰胺中的一种，对比例6中调整了辛弗林、芦荟苷、刺芒柄花素、谷氨酰胺的添加时机，表达CD3+CD56+的细胞占比均低于实施例1。说明采用本发明的培养基及培养过程可以有效的提高培养得到的细胞中同时表达CD3+CD56+细胞的比例。
采用台盼蓝染色法分别统计实施例1至实施例3，对比例1至对比例6中细胞初始接种量以及培养后收获的细胞总数，计算增殖倍数，统计收获的CIK细胞活率，结果如表2所示。
表2
样品 增殖倍数 CIK细胞活率（%）
实施例1 279 97.45
实施例2 274 96.28
实施例3 272 97.21
对比例1 178 82.79
对比例2 196 85.64
对比例3 198 88.96
对比例4 201 87.62
对比例5 194 90.15
对比例6 137 83.05
由表2可以看出实施例1至实施例3中细胞增殖活性较好，增殖倍数高，并且得到的细胞中CIK的活率较高。对比例1至对比例6中细胞增殖活性有不同程度的下降，细胞活率也低于对比例1至6。对比例1和对比例2中分别省去了辛弗林、芦荟苷，细胞增殖倍数降低，这是因为上述成分在培养基中发挥诱导作用，提高CIK细胞的诱导效率，进而为后续增殖培养提供更多的种子细胞。对比例2至对比例5中分别省去刺芒柄花素、谷氨酰胺中的一种，无论是否增加剩余成分的用量，CIK细胞的增殖活性和CIK细胞活率均不及实施例1，这说明以上两种成分对提高CIK细胞的增殖活性协同作用。对比例6中调整了辛弗林、芦荟苷、刺芒柄花素、谷氨酰胺的添加时机，CIK细胞增殖活性下降显著。以上说明本发明通过辛弗林、芦荟苷、刺芒柄花素、谷氨酰胺等成分的添加有效提高了CIK细胞的体外增殖效率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种CIK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取基础培养基，加入A组分：辛弗林、芦荟苷、纤维粘连蛋白、IL-2、IL-12、IFN-γ、CD3单抗，备用；
（2）自外周血中分离单个核细胞，用步骤（1）的培养基重悬，在37℃，5%CO2条件下培养2-3天；
（3）向基础培养基中加入B组分：刺芒柄花素、谷氨酰胺、黄芪多糖、GM-CSF，备用；
（4）向步骤（2）培养细胞中补充添加步骤（3）的培养基继续培养，每隔2-3天补充一次上述培养基，使细胞密度保持在1-5×106个/mL，连续培养14天；
所述基础培养基为RPMI-1640培养基；
所述A组分中各原料在基础培养基中的终浓度为：辛弗林5.3-6.8ng/mL、芦荟苷2.5-3.2μg/mL、纤维粘连蛋白1.5-5μg/mL、IL-2 1000-1500IU/mL、IL-12 500-800IU/mL、IFN-γ600-1000IU/mL、CD3单抗15-20ng/mL；所述B组分在基础培养基中的终浓度为：刺芒柄花素4.1-4.9μg/mL、谷氨酰胺5.5-7.5μg/mL、黄芪多糖8.5-10μg/mL、GM-CSF2.5-3.5μg/mL。
2. 根据权利要求1所述CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述A组分中各原料在基础培养基中的终浓度为：辛弗林6.2ng/mL、芦荟苷2.8μg/mL、纤维粘连蛋白3μg/mL、IL-21200IU/mL、IL-12 650IU/mL、IFN-γ850IU/mL、CD3单抗18ng/mL；所述B组分在基础培养基中的终浓度为：刺芒柄花素4.5μg/mL、谷氨酰胺6.5μg/mL、黄芪多糖9μg/mL、GM-CSF 3μg/mL。
3.根据权利要求1所述CIK细胞的培养方法，其特征在于，步骤（2）培养基中单个核细胞密度为1-2×106个/mL。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114600868A (zh) * 2022-02-22 2022-06-10 张帅军 一种细胞保存液及其在保存cik细胞中的应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102575231A (zh) * 2009-10-28 2012-07-11 宝生物工程株式会社 制备细胞因子诱导的杀伤细胞的方法
WO2013191664A1 (en) * 2012-06-22 2013-12-27 Piamkulvanich Olan Method of producing cik cells and the cik cells produced by the method thereof and the use for treating cancer cells
CN104593326A (zh) * 2014-12-30 2015-05-06 杭州特马赛生物技术有限公司 一种中药诱导增强型dc-cik细胞的制备方法及其应用
WO2016169295A1 (zh) * 2015-04-20 2016-10-27 烟台赛泽生物技术有限公司 一种免疫细胞用培养基及该培养基的添加剂
CN106119192A (zh) * 2016-06-29 2016-11-16 湖南丰晖生物科技有限公司 组合物及其在cik细胞培养中的应用
CN110358730A (zh) * 2019-07-12 2019-10-22 赛德特生物科技开发有限公司 一种用于capri细胞的培养基组合物及其制备方法和应用
CN110938595A (zh) * 2019-12-27 2020-03-31 谭啸 一种高效体外培养脐血cik细胞的培养基及培养方法
CN111117959A (zh) * 2020-01-08 2020-05-08 山东龙辰生物技术有限公司 Dc-cik细胞培养基、dc-cik细胞的培养方法及应用
CN112029723A (zh) * 2020-09-18 2020-12-04 郑州佐爵生物科技有限公司 一种体外培养脐带血cik细胞的方法
CN112795536A (zh) * 2019-11-13 2021-05-14 苏州易迈吉生物医药科技有限公司 人t细胞的培养方法及无血清培养基组合

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2010347018A1 (en) * 2010-02-24 2012-09-20 Ingo Schmidt-Wolf Method for the generation of a CIK cell and NK cell population

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102575231A (zh) * 2009-10-28 2012-07-11 宝生物工程株式会社 制备细胞因子诱导的杀伤细胞的方法
WO2013191664A1 (en) * 2012-06-22 2013-12-27 Piamkulvanich Olan Method of producing cik cells and the cik cells produced by the method thereof and the use for treating cancer cells
CN104593326A (zh) * 2014-12-30 2015-05-06 杭州特马赛生物技术有限公司 一种中药诱导增强型dc-cik细胞的制备方法及其应用
WO2016169295A1 (zh) * 2015-04-20 2016-10-27 烟台赛泽生物技术有限公司 一种免疫细胞用培养基及该培养基的添加剂
CN106119192A (zh) * 2016-06-29 2016-11-16 湖南丰晖生物科技有限公司 组合物及其在cik细胞培养中的应用
CN110358730A (zh) * 2019-07-12 2019-10-22 赛德特生物科技开发有限公司 一种用于capri细胞的培养基组合物及其制备方法和应用
CN112795536A (zh) * 2019-11-13 2021-05-14 苏州易迈吉生物医药科技有限公司 人t细胞的培养方法及无血清培养基组合
CN110938595A (zh) * 2019-12-27 2020-03-31 谭啸 一种高效体外培养脐血cik细胞的培养基及培养方法
CN111117959A (zh) * 2020-01-08 2020-05-08 山东龙辰生物技术有限公司 Dc-cik细胞培养基、dc-cik细胞的培养方法及应用
CN112029723A (zh) * 2020-09-18 2020-12-04 郑州佐爵生物科技有限公司 一种体外培养脐带血cik细胞的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
自然杀伤细胞与癌症 ——杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）的调控;王伟强等;《中国肺癌杂志》;第13卷(第7期);第731-743页 *

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