CN112029723A - 一种体外培养脐带血cik细胞的方法 - Google Patents

一种体外培养脐带血cik细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，包括以下步骤：(1)从脐带血中分离得到脐带血单个核细胞，用无血清培养基制备为单核细胞悬液；(2)向上述步骤(1)的细胞悬液中添加IFN‑γ850‑950U/mL，培养1天后添加IL‑2 600‑700U/mL、单抗CD3 20‑30ng/mL、三肽‑1铜20‑50ng/mL，继续培养；(3)培养至第3‑4天添加甜叶菊苷110‑120ng/mL，积雪草苷80‑100ng/mL，诱导培养至第12天收集细胞，在诱导培养过程中每隔1‑2天添加无血清培养基使细胞浓度保持在1‑2×106个/mL，无血清培养基中含有甜叶菊苷35‑40ng/mL，积雪草苷20‑30ng/mL。本发明采用无血清培养基，在培养过程中添加三肽‑1铜，甜叶菊苷和积雪草苷，诱使扩增得到的CIK细胞数量多，并且保持较好的细胞活性，提高其在临床应用中的价值。

Description

一种体外培养脐带血CIK细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种体外培养脐带血CIK细胞的方法。
背景技术
多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)是将人外周血或者脐带血的单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又称为NK样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因其在体外扩增速度快，杀伤活性高，杀瘤谱广，不良反应少，可提高患者的免疫功能，消除微小残留，被认为是抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
现有技术中的CIK细胞制备方法大多采用人的外周血单个核细胞，CIK细胞在正常的人外周血中极其罕见，仅1％-5％，需要进行体外扩增才能满足使用需求，体外扩增过程先加入IFN-γ，24小时后再加入其他细胞因子如IL-2、IL-I、CD3单抗，在37℃、5％二氧化碳的条件下直接诱导成CIK细胞。但是这种方法诱导培养的这种方法制备出的CIK细胞存在繁殖能力差，CIK细胞中含有数量较多的CD4+CD25+调节性T细胞，效应细胞比例(CD3+CD56+)普遍不高，细胞活性低，肿瘤杀伤性差等问题，传统的CIK细胞体外扩增培养方法多采用添加牛源性血清(多采用胎牛血清)或人AB型血清的培养基进行培养，存在传播疾病的隐患、并有内毒素残留和感染其它外源性疾病的风险，存在一定的安全隐患，造成在临床推广应用细胞过继免疫治疗受到很大的局限，且因异体CIK细胞输注易引发严重的移植物抗宿主病(GVHD)。
因此，CIK细胞在临床上应用受到其在体外增殖活性及体内杀瘤活性的限制，提高其体外的增殖活性和体内杀瘤活性具有重要临床应用价值。寻找一种成本低、安全性好、扩增倍数高的CIK细胞体外培养方法是很有必要的。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，有效提高CIK细胞体外增殖的活性，扩增倍数高，安全性好。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，包括以下步骤：
(1)从脐带血中分离得到脐带血单个核细胞，用无血清培养基制备为单核细胞悬液；
(2)向上述步骤(1)的细胞悬液中添加IFN-γ850-950U/mL，培养1天后添加IL-2600-700U/mL和单抗CD3 20-30ng/mL，三肽-1铜20-50ng/mL，继续培养；
(3)培养至第3-4天添加甜叶菊苷110-120ng/mL，积雪草苷80-100ng/mL诱导培养至第12天收集细胞，在诱导培养过程中每隔1-2天添加无血清培养基使细胞浓度保持在1-2×106个/mL，无血清培养基中含有甜叶菊苷35-40ng/mL，积雪草苷20-30ng/mL。
进一步地，所述无血清培养基为无血清AIM-V medium CTS培养基。
进一步地，所述步骤(1)中单核细胞悬液中细胞的浓度为1-2×105个/mL。
进一步地，所述步骤(2)和步骤(3)中在37℃，5％CO2条件下进行细胞培养。
进一步地，所述步骤(1)中采用密度梯度离心法得到脐带血单个核细胞。具体过程为：取健康人脐带血加入肝素抗凝，离心(1000g，15min)后取上层血浆，添加人淋巴细胞分离液(血浆：人淋巴细胞分离液＝1:1)，放入离心机离心(800g，15min)，离心结束后取脐带血单个核细胞层加PBS吹打均匀，离心，相同方法洗涤细胞两次，得到脐带血单个核细胞备用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，在培养一天后添加IL-2和单抗CD3的同时添加三肽-1铜，刺激细胞的生长和增殖，提高细胞的增殖活性，在培养3-4天时加入甜叶菊苷和积雪草苷进一步刺激细胞的生长和增殖，提高增殖速度，进而提高细胞的增殖数量，诱导培养过程中不断的添加含有甜叶菊苷和积雪草苷的无血清培养基，使扩增得到的CIK细胞保持较好的细胞活性，效应细胞比例较高，对肿瘤细胞杀伤效果好，提高其在临床应用中的价值。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
采用密度梯度分离法制备实施例1至3中所用的脐带血单个核细胞，过程如下：取健康人脐带血加入肝素抗凝，离心(1000g，15min)后取上层血浆，添加人淋巴细胞分离液(血浆：人淋巴细胞分离液＝1:1)，放入离心机离心(800g，15min)，离心结束后取脐带血单个核细胞层加PBS吹打均匀，离心，相同方法洗涤细胞两次，得到脐带血单个核细胞备用。
实施例1
一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度梯度离心法得到脐带血单个核细胞，用无血清AIM-V medium CTS培养基制备为单核细胞悬液，细胞的浓度为1×105个/mL；
(2)取上述步骤(1)的细胞悬液10mL加入T75细胞培养瓶中，添加IFN-γ850U/mL，在37℃，5％CO2培养箱中进行培养，培养1天后添加IL-2 600U/mL和单抗CD3 20ng/mL，三肽-1铜20ng/mL，继续培养；
(3)继续在37℃，5％CO2条件下培养至第3天添加甜叶菊苷110ng/mL，积雪草苷80ng/mL，诱导培养至第12天收集细胞，在诱导培养过程中每隔1天添加无血清清AIM-Vmedium CTS培养基，使细胞浓度保持在1×106个/mL，上述无血清培养基中含有甜叶菊苷35ng/mL，积雪草苷20ng/mL。
实施例2
一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度梯度离心法得到脐带血单个核细胞，用无血清清AIM-V medium CTS培养基制备为单核细胞悬液，细胞的浓度为1.5×105个/mL；
(2)取上述步骤(1)的细胞悬液10mL加入T75细胞培养瓶中，添加IFN-γ900U/mL，在37℃，5％CO2培养箱中进行培养，培养1天后添加IL-2 650U/mL和单抗CD3 25ng/mL，三肽-1铜35ng/mL，继续培养；
(3)继续在37℃，5％CO2条件下培养至第4天添加甜叶菊苷115ng/mL，积雪草苷90ng/mL，诱导培养至第12天收集细胞，在诱导培养过程中每隔2天添加无血清清AIM-Vmedium CTS培养基，使细胞浓度保持在1.5×106个/mL，上述无血清培养基中含有甜叶菊苷38ng/mL，积雪草苷25ng/mL。
实施例3
一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度梯度离心法得到脐带血单个核细胞，用无血清清AIM-V medium CTS培养基制备为单核细胞悬液，细胞的浓度为2×105个/mL；
(2)取上述步骤(1)的细胞悬液10mL加入T75细胞培养瓶中，添加IFN-γ950U/mL，在37℃，5％CO2培养箱中进行培养，培养1天后添加IL-2700U/mL和单抗CD3 30ng/mL，三肽-1铜50ng/mL，继续培养；
(3)继续在37℃，5％CO2条件下培养至第3天添加甜叶菊苷120ng/mL，积雪草苷100ng/mL，诱导培养至第12天收集细胞，在诱导培养过程中每隔2天添加无血清清AIM-Vmedium CTS培养基，使细胞浓度保持在2×106个/mL，上述无血清培养基中含有甜叶菊苷40ng/mL，积雪草苷30ng/mL。
对比例1
对比例1提供一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，和实施例1的区别为：省去步骤(2)中的三肽-1铜，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，和实施例1的区别为：将步骤(2)中的三肽-1铜替换为棕榈酰三肽-1，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，和实施例1的区别为：省去步骤(3)中的甜叶菊苷，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，和实施例1的区别为：省去步骤(3)中的积雪草苷，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，和实施例1的区别为：将步骤(3)中的培养至第3天添加甜叶菊苷110ng/mL，积雪草苷80ng/mL调整为在步骤(2)中培养1天后加入，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，和实施例1的区别为：将步骤(3)中在诱导培养过程中添加的无血清AIM-V medium CTS培养基中的甜叶菊苷和积雪草苷调整为IL-2，用量为600U/mL，其余均和实施例1相同。
试验例
采用台盼蓝染色法统计实施例1，对比例1至6中细胞在培养第0天和第12天的数量，计算每组的增殖倍数，结果如表1所示。
表1
样品 增殖倍数
实施例1 242
对比例1 189
对比例2 195
对比例3 203
对比例4 199
对比例5 185
对比例6 180
由表1可知，实施例1中的培养方法细胞增殖倍数高，在第12天时得到的细胞数量最多。对比例1至2中分别省去了三肽-1铜或将三肽-1铜替换为棕榈酰三肽-1后细胞的增殖能力下降。对比例3至6中调整了甜叶菊苷和积雪草苷的用量及添加时机，细胞的增殖能力也不及实施例1，说明本发明的方法通过选择在细胞培养过程中添加三肽-1铜、甜叶菊苷和积雪草苷，提高细胞的增殖活性，经诱导培养后得到大量的CIK细胞。
表型检测：取实施例1，对比例1至6中培养第12天的CIK细胞以流式抗体染色，测定CIK细胞CD3+CD56+双阳性细胞的百分比，结果如表2所示。
表2
样品 CD3<sup>+</sup>CD56<sup>+</sup>双阳性细胞的百分比(％)
实施例1 79.32±5.21
对比例1 60.27±3.97
对比例2 62.19±4.35
对比例3 65.46±3.84
对比例4 63.77±4.79
对比例5 58.96±3.15
对比例6 56.87±3.76
由表2可知实施例1中CD3+CD56+双阳性细胞的比例较高，对比例1至6中调整了培养过程，最终诱导扩增得到的CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞的比例均有不同程度的降低，说明采用本发明的培养方法有助于提高CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞的比例。
杀伤活性检测：分别收集实施例1，对比例1至6中培养至12天的CIK细胞，采用无血清AIM-V medium CTS培养基制成细胞悬液作为效应细胞，细胞浓度为1×106个/mL，检测其对K562细胞的杀伤作用，以效靶比5:1将CIK效应细胞和K562细胞各50微升放入96孔板中，同时设置靶细胞组、效应细胞组和空白培养基对照组，每组设3个孔，37℃、5％CO2的培养箱中培养3h，采用CCK-8显色法测定各组吸光度值(A)，并计算杀伤活性，结果如表2所示，杀伤活性计算公式如下：
杀伤活性(％)＝[1-(实验孔A值-效应细胞A)]/(靶细胞A值-空白空A值)×100％
表3
Figure BDA0002688572540000071
Figure BDA0002688572540000081
由表3可以看出实施例1得到的CIK细胞的杀伤活性超过90％，对比例1至6中诱导得到的CIK细胞的杀伤活性均有不同程度的降低，说明采用本发明的培养方法得到的CIK细胞不仅增殖活性强，而且细胞能保持较好的杀瘤活性，极大的提高了CIK细胞的临床应用价值。
综上，本发明通过在体外培养脐带血CIK细胞的过程中，采用无血清培养基，并在培养过程中选择合适的时机添加三肽-1铜、甜叶菊苷和积雪草苷，有效提高CIK细胞的增殖活性，通过扩增得到大量的CIK细胞，并且得到的CIK细胞活性较好，效应细胞比较高，对肿瘤细胞杀伤效果好，使用安全，提高了CIK细胞在临床应用中的价值。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种体外培养脐带血CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从脐带血中分离得到脐带血单个核细胞，用无血清培养基制备为单核细胞悬液；
(2)向上述步骤(1)的细胞悬液中添加IFN-γ850-950U/mL，培养1天后添加IL-2 600-700U/mL、单抗CD3 20-30ng/mL、三肽-1铜20-50ng/mL，继续培养；
(3)培养至第3-4天添加甜叶菊苷110-120ng/mL，积雪草苷80-100ng/mL，诱导培养至第12天收集细胞，在诱导培养过程中每隔1-2天添加无血清培养基使细胞浓度保持在1-2×106个/mL，无血清培养基中含有甜叶菊苷35-40ng/mL，积雪草苷20-30ng/mL。
2.根据权利要求1所述体外培养脐带血CIK细胞的方法，其特征在于，所述无血清培养基为无血清AIM-V medium CTS培养基。
3.根据权利要求1所述体外培养脐带血CIK细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中单核细胞悬液中细胞的浓度为1-2×105个/mL。
4.根据权利要求1所述体外培养脐带血CIK细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中在37℃，5％CO2条件下进行细胞培养。
5.根据权利要求5所述体外培养脐带血CIK细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用密度梯度离心法得到脐带血单个核细胞。
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