CN117736987A - 一种体外扩增外周血nkt细胞培养体系及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种体外扩增外周血NKT细胞培养体系及其培养方法，属于细胞培养技术领域。该培养体系包含NKT激活培养基和NKT扩增培养基、本发明体外扩增外周血NKT细胞培养方法无需通过流式分选或磁珠分选，也无需包被抗体，极大程度的简化了操作流程且大大降低了成本，同时通过该方法培养NKT细胞，第21天时NKT细胞比例62.2％，扩增数量及扩增倍数分别达到了148倍和225倍，NKT细胞产量高和纯度高，在临床使用中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种体外扩增外周血NKT细胞培养体系及其培养方法。
背景技术
自然杀伤T细胞(NKT细胞)是继自然杀伤细胞(NK细胞)、T淋巴细胞、B淋巴细胞之后又一类新型的T淋巴细胞，属于第4类免疫细胞。NKT细胞主要分布在骨髓、肝和胸腺，在脾、淋巴结和外周血中也有少量存在。研究显示NKT细胞在人体内发挥着细胞毒作用，NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的靶细胞，主要效应分子为穿孔素，Fas配体以及IFN-γ。NKT可以通过调节Th1/Th2型T淋巴细胞间的平衡而发挥免疫调节作用，NKT细胞的减少是这些免疫系统疾病的主要致病原因。因此NKT细胞作为一类新型的免疫调节细胞在抗感染、肿瘤免疫、器官免疫排斥和抑制自身免疫性疾病发生中均发挥着重要作用。
目前，NKT在临床应用于治疗恶性肿瘤主要有以下特点：(1)NKT细胞是人体内抗肿瘤活性最强的细胞，可直接识别、杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长及扩散；(2)NKT细胞会通过其分泌的因子抑制肿瘤附近新血管的增生，限制肿瘤生长；(3)NKT细胞可直接改善并调节患者的免疫力，间接提高患者的生活质量；(4)NKT细胞会分泌多种细胞因子，减少患者疼痛，且治疗天然无副作用。
目前培养NKT细胞的常规方法是在外周血单个核细胞的培养基中加入活化抗体和细胞因子，但不同的活化抗体、细胞因子组合，培养得到的NKT细胞产量、纯度差异很大，且产量和纯度均偏低。还有通过采用磁珠分选或流式分选后进行扩增培养的。但是磁珠分选及流式分选操作繁琐，无疑增加了细胞污染的风险，并且成本也较高。
因此，亟需研发一种NKT细胞产量高和纯度高且低风险、低成本、简洁的NKT细胞培养方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种体外扩增外周血NKT细胞培养体系及其培养方法。
本发明提供了一种NKT细胞体外扩增体系，所述培养体系包含NKT激活培养基和NKT扩增培养基；
所述NKT激活培养基的组分为：终浓度为200-2000IU/ml的IL-2；终浓度为1-50ng/ml的IL-7；终浓度为10-500ng/ml的IL-15；终浓度为10-500ng/ml的IL-21；其余为无血清基础培养基；
所述NKT扩增培养基的组分为：终浓度为200-2000IU/ml的IL-2；终浓度为1-50ng/ml的IL-7；终浓度为10-80ng/ml的IL-15；终浓度为10-150ng/ml的IL-21；其余为无血清基础培养基。
进一步地，所述NKT激活培养基的组分为：终浓度为500IU/ml的IL-2；终浓度为10ng/ml的IL-7；终浓度为100ng/ml的IL-15；终浓度为180ng/ml的IL-21；其余为无血清基础培养基。
进一步地，所述NKT扩增培养基的组分为：终浓度为500IU/ml的IL-2；终浓度为10ng/ml的IL-7；终浓度为50ng/ml的IL-15；终浓度为100ng/ml的IL-21；其余为无血清基础培养基。
本发明还提供了一种应用如权利要求1-3任意一项所述NKT细胞体外扩增体系的NKT细胞扩增培养方法，所述的培养方法步骤包括如下步骤：
1)分离人外周血单个核细胞，或者使用冻存外周血单个核细胞；
2)将单个核细胞置于NKT激活培养基中培养3-8天，进行激活，细胞接种密度为(1～5)*106个/mL；
3)将步骤2)得到细胞群置于NKT扩增培养基培养9-18天，即得。
进一步地，步骤2)中，培养天数为5天；所述外周血单个核细胞接种量为2*106个/mL。
进一步地于，步骤3)中培养天数为16天。
进一步地，步骤2)中，激活第3天按细胞密度(0.8～1.0)*106个/mL补液，控制NKT细胞密度在(0.8～1.0)*106个/mL之间。
进一步地，步骤3)中，培养第6天将细胞取出，用NKT扩增培养基重悬使细胞浓度维持在0.8E6/mL-1E6/mL，后每隔2天对细胞进行计数并补加扩增培养基使细胞浓度维持在(0.8～1.0)*106个/mL之间。
综上，本发明提供了一种体外扩增外周血NKT细胞培养体系及其培养方法，该方法无需通过流式分选或磁珠分选，也无需包被抗体，极大程度的简化了操作流程且大大降低了成本，同时通过该方法培养NKT细胞，第21天时NKT细胞比例62.2％，扩增数量及扩增倍数分别达到了148倍和225倍，NKT细胞产量高和纯度高，在临床使用中具有广泛的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为分离PBMC的流式结果：流式细胞仪分析PBMC中的NKT(CD3+CD56+)比例为21.4％
图2为对照例1及实施例1培养至第21天的NKT细胞(CD3+CD56+)比例检测结果，NKT细胞比例分别为29.4％、62.2％。
图3为对照例1及实施例1培养至第21天NKT细胞的扩增数量及倍数，扩增数量分别为8.89E8和1.35E9，扩增倍数分别为148倍和225倍。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
无血清培养基购买自同立海源，货号GMP-AS-HY11。
细胞密度为2E6个/mL表示细胞密度为2*106个/mL，以此类推。
实施例1、本发明NKT细胞培养体系的制备
一、实验方法(一)配制激活培养基和扩增培养基
1、激活培养基
激活培养基制备方法：取IL-2、IL-7、IL-15、IL-21加入无血清基础培养基中混匀即可，其中IL-2终浓度为500IU/ml；IL-7终浓度为10ng/ml；IL-15终浓度为100ng/ml；IL-21终浓度为180ng/ml。
2、扩增培养基
扩增培养基制备方法：取IL-2、IL-7、IL-15、IL-21加入无血清基础培养基中混匀即可，其中IL-2终浓度为500IU/ml；IL-7终浓度为10ng/ml；IL-15终浓度为50ng/ml；IL-21终浓度为100ng/ml。
(二)实验步骤
1、外周血中分离出PBMC细胞
将新鲜采集的外周血(健康的志愿者提供)。预先把人淋巴细胞分离液Ficoll平衡到室温。将Ficoll缓慢加入到50ml体积的无菌离心管中，倾斜离心管45度，在离Ficoll液面上1cm处把等体积的外周血缓慢加到Ficoll上面。把离心管放入水平离心机，用梯度离心30分钟。
从离心管里面吸取中间的PBMC细胞层，加入到新的50ml离心管中。用同立海源无血清培养基定容至40ml，吹打均匀，400g离心10分钟。离心后弃上清，补加红细胞裂解溶液，静置3-5min，400g离心10分钟，弃上清，补加同立海源无血清培养基吹打细胞至混匀，再次以400g离心10分钟，弃上清后得到外周血单个核细胞。
2、激活阶段
使用激活培养基重悬细胞，同时细胞计数，按细胞密度为2E6个/mL接种于6孔板中，并置于中37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。在激活第3天按细胞密度0.8～1.0E6个/mL补液。共培养5天。
3、扩增细胞
培养第6天将细胞转至培养袋或培养瓶，添加扩增培养基，使得细胞密度0.8～1.0E6个/mL。
之后每隔2天按细胞密度0.8～1.0E6个/mL补加扩增培养基。总共培养21天。
对照例1、不使用激活培养基和扩增培养基
使用含终浓度为200IU/ml的IL-2的同立海源无血清培养基替代实施例中的激活培养基和扩增培养基，其余操作与实施例1相同。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、本发明NKT细胞分化比例及扩增倍数检测结果
一、NKT细胞分化比例
取实施例1及其对照例1最终所得细胞，收集细胞到离心管中，以1200r/min的速度离心5分钟，弃去上清液后，用1mL含2％(v/v)血清的PBS重悬，加入抗体CD3-F ITC、CD56-PE，4℃孵育30min后用含2％血清的PBS洗一遍。然后以5E6/ml的密度重悬细胞，使用BD流式仪细胞仪检测并分析其分化效率。在流式检测过程中，将经过激活阶段和扩增阶段，但未用流式抗体染色的细胞作为阴性对照。
二、实验结果
图2为对照例1及实施例1培养至第A21天的NKT细胞(CD3+CD56+)比例，NKT细胞比例分别为29.4％、62.2％。
图3展示了对照例1和实施例1在培养至第21天时，NKT细胞相对于阴性对照的扩增数量和扩增倍数。具体来说，对照例1的扩增数量为8.89E8，扩增倍数为148倍；而实施例1的扩增数量为1.35E9，扩增倍数为225倍。
综上，本发明提供了一种体外扩增外周血NKT细胞培养体系及其培养方法，该方法无需通过流式分选或磁珠分选，也无需包被抗体，极大程度的简化了操作流程且大大降低了成本，同时通过该方法培养NKT细胞，第21天时NKT细胞比例62.2％，扩增数量及扩增倍数分别达到了148倍和225倍，NKT细胞产量高和纯度高，在临床使用中具有广泛的应用前景。
Claims (8)
1.一种NKT细胞体外扩增体系，其特征在于，所述培养体系包含NKT激活培养基和NKT扩增培养基；
所述NKT激活培养基的组分为：终浓度为200-2000IU/ml的IL-2；终浓度为1-50ng/ml的IL-7；终浓度为10-500ng/ml的IL-15；终浓度为10-500ng/ml的IL-21；其余为无血清基础培养基；
所述NKT扩增培养基的组分为：终浓度为200-2000IU/ml的IL-2；终浓度为1-50ng/ml的IL-7；终浓度为10-80ng/ml的IL-15；终浓度为10-150ng/ml的IL-21；其余为无血清基础培养基。
2.根据权利要求1所述的NKT细胞体外扩增体系，其特征在于，所述NKT激活培养基的组分为：终浓度为500IU/ml的IL-2；终浓度为10ng/ml的IL-7；终浓度为100ng/ml的IL-15；终浓度为180ng/ml的IL-21；其余为无血清基础培养基。
3.根据权利要求2所述的NKT细胞体外扩增体系，其特征在于，所述NKT扩增培养基的组分为：终浓度为500IU/ml的IL-2；终浓度为10ng/ml的IL-7；终浓度为50ng/ml的IL-15；终浓度为100ng/ml的IL-21；其余为无血清基础培养基。
4.应用如权利要求1-3任意一项所述NKT细胞体外扩增体系的NKT细胞扩增培养方法，其特征在于，所述的培养方法步骤包括如下步骤：
1)分离人外周血单个核细胞，或者使用冻存外周血单个核细胞；
2)将单个核细胞置于NKT激活培养基中培养3-8天，进行激活，细胞接种密度为(1～5)*106个/mL；
3)将步骤2)得到细胞群置于NKT扩增培养基培养9-18天，即得。
5.根据权利要求4所述的NKT细胞扩增培养方法，其特征在于，步骤2)中，培养天数为5天；所述外周血单个核细胞接种量为2*106个/mL。
6.根据权利要求5所述的NKT细胞扩增培养方法，其特征在于，步骤3)中培养天数为16天。
7.根据权利要求6所述的NKT细胞扩增培养方法，其特征在于，步骤2)中，激活第3天按细胞密度(0.8～1.0)*106个/mL补液，控制NKT细胞密度在(0.8～1.0)*106个/mL之间。
8.根据权利要求7所述的NKT细胞扩增培养方法，其特征在于，步骤3)中，培养第6天将细胞取出，用NKT扩增培养基重悬使细胞浓度维持在0.8E6/mL-1E6/mL，后每隔2天对细胞进行计数并补加扩增培养基使细胞浓度维持在(0.8～1.0)*106个/mL之间。
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