CN113564117B - 一种冻存脐带血来源调节性t细胞体外扩增优化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冻存脐带血来源调节性T细胞体外扩增优化方法，包括以下步骤：冻存脐带血复苏后经离心洗涤获得总有核细胞，之后将总有核细胞接种于预包被Anti‑human CD3抗体的培养皿中，添加诱导培养基进行诱导培养。在培养至第8天时经CD4磁珠分选纯化获得CD4+调节性T细胞，再继续进行第二阶段诱导培养扩增，最终获得高纯度调节性T细胞。本发明提供的方法能够自冻存脐带血中经体外扩增优化获得高纯度的调节性T细胞。本方法同样适用于新鲜脐带血调节性T细胞体外扩增优化培养。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种冻存脐带血来源调节性T细胞体外扩增优化方法。
背景技术
CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)是一种T细胞亚群，在体内可以通过多种方式发挥免疫抑制反应，包括与效应T细胞直接接触抑制，抑制抗原呈递细胞(APC)成熟及递呈作用，分泌抑炎因子IL-10、IL-35和TGF-β1等，通过穿孔素、颗粒酶等发挥免疫抑制作用。
脐带血中CD4+CD25+Tregs细胞是独立的细胞亚群，主要是CD4+CD25highCD127low细胞。脐带血中CD4+CD25+Tregs比例(0.35％-9.07％)高于成人外周血的(1.64％-6.45％)。研究发现脐带血中新鲜分离的CD4+CD25+Tregs抑制活性较成人外周血中分离的CD4+CD25+Tregs弱一些，然而经体外诱导扩增获得的CD4+CD25+Tregs其免疫抑制功能增强了，并且在体内存活率更高，这说明脐带血来源的Tregs细胞具有更高的临床应用价值。传统冻存脐带血来源的Tregs体外扩增方法一般是复苏脐带血后Ficoll分离单个核细胞(MNCs)，然后经CD25磁珠分选(一步法)或者先CD4富集，然后CD25纯化(两步法)，之后添加IL-2，CD3/CD28抗体刺激增殖；或者复苏脐带血后分离总有核细胞(TNCs)，然后经CD3/CD28抗体刺激，IL-2和TGF-β1诱导扩增。虽然，前者报道经体外扩增可以获得纯度比较高的Tregs，然而步骤繁琐——复苏后的脐带血需经Ficoll分离MNCs，然后再磁珠分选CD25+T细胞或者CD4+CD25+T细胞。由于冻存脐带血复苏后CD4+CD25+T比例很低，分选获得的细胞数量也很少，操作误差较大。而后者的诱导培养方法获得的Tregs纯度较低(CD4+CD25+CD127-比例60％左右)。因此，探索一种成本较低，操作简便，获得较高纯度冻存脐带血来源Tregs的体外诱导扩增优化方法，才能满足大量的临床应用需求。
发明内容
本发明是针对现有技术不足，公开了一种冻存脐带血来源调节性T细胞体外扩增优化方法，通过分离获得冻存脐带血的总有核细胞，并将其接种于预包被Anti-human CD3抗体的培养皿中，用含IL-2，Anti-Human CD28抗体和TGF-β1的诱导培养基诱导扩增培养Tregs，培养中期用CD4磁珠分选纯化细胞以提高冻存脐带血Tregs纯度。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种冻存脐带血来源调节性T细胞体外扩增优化方法，包括以下步骤：
(1)总有核细胞分离：冻存脐带血复苏后，用含质量分数为1-3％人血清白蛋白的PBS缓冲液离心洗涤，弃上清，获得总有核细胞TNCs，再次分离清洗，获得总有核细胞TNCs沉淀；
(2)细胞诱导培养：将步骤(1)中获得的总有核细胞TNCs沉淀用诱导培养基重悬，接种于预包被Anti-human CD3抗体的细胞培养皿中，诱导培养6天；
(3)细胞休整及分选纯化：诱导培养至第6天，收取所有细胞，更换休整培养基并培养2-4天，休整结束后，收取细胞并用CD4磁珠分选获得CD4+调节性T细胞亚群；将分选纯化后的细胞再次接种于预包被Anti-human CD3抗体的细胞培养皿中，用诱导培养基继续诱导培养6-8天，收获调节性T细胞。
具体地，上述步骤(1)中，复苏的操作为：将冻存脐带血从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中复苏。
具体地，上述步骤(1)中，离心的设定温度为4℃，1500rpm离心10min。
具体地，上述步骤(1)中，再次分离清洗的具体操作为：将获得的总有核细胞TNCs用10mL含质量分数为1-3％人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬，再补加90mL上述缓冲液混匀，温度设定4℃后，1000rpm离心5min，吸弃上清，再重复上述步骤一次后，最终获得TNCs沉淀。
具体地，上述步骤(2)中，诱导培养基为RPMI 1640培养基，所述RPMI 1640培养基中胎牛血清的质量分数为10％，重组人白细胞介素-2的浓度为2000IU/m，抗人CD28单克隆抗体的浓度为100ng/mL，TGF-β1重组蛋白的浓度为5ng/mL。
具体地，上述步骤(3)中，休整培养基为含有10％质量分数胎牛血清、2000IU/mL重组人白细胞介素-2的RPMI 1640培养基。
具体地，上述步骤(2)中，接种密度为接种密度培养皿。
具体地，上述步骤(3)中，分选纯化后的细胞再次接种的密度为培养皿。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
1)冻存脐带血来源Tregs体外扩增优化方法简便、高效，可以利用丰富的冻存脐带血资源；
2)本发明方法体外扩增优化培养获得的Tregs纯度高，较未分选组可以显著提高30％以上；
3)本发明方法体外扩增优化培养获得的Tregs可以释放高浓度抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β1；
4)本发明方法体外扩增优化培养获得的Tregs具有良好的体外抑制功能，在Tregs：效应T细胞(Teff)比例分别为1:1、1:2和1:5时均能有效抑制Teff细胞体外增殖。
附图说明
图1是细胞诱导扩增第0天、6天、8天分选前及分选后，以及第14天收获的Tregs细胞流式检测表型结果。
图2是经体外诱导扩增优化方法收获的Tregs细胞体外抑制第三方无关供者外周血效应T细胞的增殖结果。
图3是经体外诱导扩增优化方法收获的Tregs细胞释放的抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β1ELISA检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明所提供的体外扩增脐血来源调节性T细胞的优化方法中所使用的试剂及仪器均可由市场所购得。
实施例1
用Anti-Human CD3抗体预包被培养皿：用PBS缓冲液配制Anti-Human CD3抗体工作液(5μg/mL)，取5.5mLAnti-Human CD3抗体工作液包被φ100mm培养皿，37℃静置4h或4℃包被过夜，吸弃液体，用PBS缓冲液轻轻漂洗培养皿1次，于操作台中晾干培养皿底部，备用。
一种冻存脐带血来源调节性T细胞体外扩增优化方法，包括以下步骤：
(1)总有核细胞分离：冻存脐带血复苏后，用含质量分数为1-3％人血清白蛋白的PBS缓冲液离心洗涤，弃上清，离心的设定温度为4℃，1500rpm离心10min，获得总有核细胞TNCs，再次分离清洗，获得总有核细胞TNCs沉淀，其中复苏的操作为：将冻存脐带血从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中复苏，再次分离清洗的具体操作为：将获得的总有核细胞TNCs用10mL含质量分数为1-3％人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬，再补加90mL上述缓冲液混匀，温度设定4℃后，1000rpm离心5min，吸弃上清，再重复上述步骤一次后，最终获得TNCs沉淀；
(2)细胞诱导培养：将步骤(1)中获得的总有核细胞TNCs沉淀用诱导培养基重悬，接种于预包被Anti-human CD3抗体的细胞培养皿中，诱导培养6天，所述诱导培养基为RPMI1640培养基，所述RPMI 1640培养基中胎牛血清的质量分数为10％，重组人白细胞介素-2的浓度为2000IU/m，抗人CD28单克隆抗体的浓度为100ng/mL，TGF-β1重组蛋白的浓度为5ng/mL，接种密度为接种密度培养皿；
(3)细胞休整及分选纯化：诱导培养至第6天，收取所有细胞，更换休整培养基并培养2-4天，休整结束后，收取细胞并用CD4磁珠分选获得CD4+调节性T细胞亚群；将分选纯化后的细胞再次接种于预包被Anti-human CD3抗体的细胞培养皿中，用诱导培养基继续诱导培养6-8天，收获调节性T细胞，其中休整培养基为含有10％质量分数胎牛血清、2000IU/mL重组人白细胞介素-2的RPMI 1640培养基，分选纯化后的细胞再次接种的密度为培养皿。
实施例2
收取扩增后的调节性T细胞(Treg细胞)，用PBS缓冲液重悬，计数，取部分细胞经40-100μm细胞筛网过滤，离心，弃上清，再次用PBS缓冲液重悬，调整细胞密度1-2×106/mL。取若干新流式管并标记，分为空白管、同型对照管和试验管等，每管分别加入100μL细胞悬液，然后按要求分别加入流式抗体：Anti-human CD4-FITC，Anti-human CD25-APC，Anti-human CD127-PE，同型抗体等，混匀后室温避光孵育15-20min或者4℃避光孵育30min。孵育结束后用PBS缓冲液离心洗涤1-2遍，用200μLPBS缓冲液重悬细胞，加入200μL鞘液，上机流式检测。结果如图1所示，起始冻存脐带血TNCs中CD4+CD25+比例仅为0.45％(图1，Day 0)，经体外诱导扩增(未经CD4磁珠分选)后比例上升至65.83％，而体外诱导扩增联合CD4磁珠分选CD4+CD25+比例则显著上升至89.67％(图1，Day 14)。
实施例3
扩增获得的调节性T细胞体外抑制效应T细胞增殖功能检测
使用Ficoll淋巴细胞分离液经密度梯度离心分离获得成人外周血单个核细胞(PBMCs)，采用免疫磁珠分离纯化得到CD4+CD25-T细胞作为效应T细胞(Teff)，用CFSE染色，按照1×105/孔接种于Anti-human CD3抗体预包被的96孔培养板中，Tregs：Teff比例分别为0:1、1:1、1:2和1:5，分别向96孔培养板中接种扩增后收获的调节性T细胞，培养液为RPMI1640+10％FBS+2000IU/mL IL-2+100ng/mL Anti-human CD28，每孔补加培养液终体积为200μL。置于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下共培养4天。共培养结束后收集96孔培养板内所有细胞，用流式细胞仪进行结果分析。结果表明：经体外诱导扩增优化培养的Tregs在不同效靶比条件下均可以有效抑制Teff细胞的增殖，体现出一定的抑制功能。
表1经体外诱导扩增优化方法收获的Tregs细胞流式检测表型结果
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
Claims (1)
1.一种冻存脐带血来源调节性T细胞体外扩增优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）总有核细胞分离：冻存脐带血复苏后，用含质量分数为1-3%人血清白蛋白的PBS缓冲液离心洗涤，弃上清，获得总有核细胞TNCs，再次分离清洗，获得总有核细胞TNCs沉淀；
（2）细胞诱导培养：将步骤（1）中获得的总有核细胞TNCs沉淀用诱导培养基重悬，接种于预包被Anti-human CD3抗体的细胞培养皿中，诱导培养6天；
（3）细胞休整及分选纯化：诱导培养至第6天，收取所有细胞，更换休整培养基并培养2-4天，休整结束后，收取细胞并用CD4磁珠分选获得CD4+ 调节性T细胞亚群；将分选纯化后的细胞再次接种于预包被Anti-human CD3抗体的细胞培养皿中，用诱导培养基继续诱导培养6-8天，收获调节性T细胞；
上述步骤（1）中，复苏的操作为：将冻存脐带血从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中复苏；
上述步骤（1）中，离心的设定温度为4℃，1500rpm离心10 min；
上述步骤（1）中，再次分离清洗的具体操作为：将获得的总有核细胞TNCs用10 mL含质量分数为1-3%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬，再补加90 mL上述缓冲液混匀，温度设定4℃后，1000 rpm离心5 min，吸弃上清，再重复上述步骤一次后，最终获得TNCs沉淀；
步骤（2）中，诱导培养基为RPMI 1640培养基，所述RPMI 1640培养基中胎牛血清的质量分数为10%，重组人白细胞介素-2的浓度为2000 IU/m，抗人CD28单克隆抗体的浓度为100ng/mL，TGF-β1重组蛋白的浓度为5ng/mL；
步骤（3）中，休整培养基为含有10%质量分数胎牛血清、2000 IU/mL 重组人白细胞介素-2的RPMI 1640培养基；
步骤（2）中，接种密度为接种密度1-10×107/φ100 mm培养皿；
步骤（3）中，分选纯化后的细胞再次接种的密度为1-5×107/φ100 mm培养皿。
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