CN110343663A - 一种从脐带血分离总有核细胞与单个核细胞的方法 - Google Patents

一种从脐带血分离总有核细胞与单个核细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从脐带血分离总有核细胞与单个核细胞的方法：首先分离TNCs：脐带血中加入含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液，离心弃上清，获得TNCs沉淀I；沉淀洗涤后获得TNCs沉淀；将TNCs沉淀用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心，收集单个核细胞白膜层，离心后获得单个核细胞沉淀。该方法高效、方便、省时、可重复性高，可以利用脐血库丰富的冻存脐血资源，提高冻存脐带血中衍生干细胞和免疫细胞的分离效率。

Description

一种从脐带血分离总有核细胞与单个核细胞的方法
技术领域
本发明属于医学领域，涉及一种获得有核细胞的方法，具有涉及一种从脐带血中分离总有核细胞与单个核细胞的方法。
背景技术
脐带血（Umbilical cord blood，UCB）已成为除骨髓以外的重要干细胞来源，据不完全统计，迄今为止全世界范围内先后建立起多个标准化、规范化的脐血库，共储存了几十万份冻存的脐血，并且以每日近千例的速度迅速增加，旨在将来能够用于临床治疗。脐血中富含多种干/祖细胞和多种免疫细胞，包括造血干细胞和内皮祖细胞等，对治疗多种恶性血液肿瘤、获得性或者遗传性骨髓衰竭综合征和非恶性疾病（脊髓损伤、肝硬化、糖尿病、心肌损伤和自身免疫性）等疾病效果显著，且具有来源充足、免疫原性更弱、供者无痛苦、不涉及伦理问题、传播疾病的几率低等优点。
目前公共脐血库利用率不足10%，为拓展脐血的临床应用，越来越多的学者开始关注脐血中除造血干细胞外，其它衍生的间充质干细胞、内皮祖细胞、调节性T细胞、NK细胞等在临床治疗中的应用前景。脐带血中各种衍生细胞的来源主要为脐带血总有核细胞（Totalnuclear Cell，TNC），尤其是单个核细胞（Mononuclear Cell，MNC）。冻存脐带血的再利用需经过深低温状态和复苏两个过程，不可避免地会引起细胞理化性质的变化，从而影响干细胞及免疫细胞的生物特性，尤其是增殖能力。因此选择合适的脐带血复苏方法，高效获得总有核细胞和单个核细胞，尽可能完整地保有其生物学功能，能够有效提高总有核细胞和单个核细胞衍生的干/祖细胞和免疫细胞的分离效率，确保脐血库公共库脐带血资源的利用率，具有巨大的市场需求及重要的临床意义。
虽然国内外不同脐血库先后报道多种冻存脐带血复苏的方法，但是受脐带血个体差异、脐带血血浆红细胞去除方法、冻存液不同等因素影响，脐带血的复苏方法不统一而且效率存在很大差异。因此如何高效复苏冻存脐带血中获得高活率的总有核细胞和单个核细胞仍是一大难题。
发明内容
针对目前冻存脐带血获得有核细胞活率低的问题，本发明提供了一种从冻存脐血中高效复苏获得总有核细胞及单个核细胞的方法。该方法高效、方便、省时、可重复性高，提高了冻存脐带血中衍生干细胞和免疫细胞的分离效率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种从脐带血分离总有核细胞与单个核细胞的方法，包括以下步骤：
（1）分离TNCs：脐带血中加入含5%w/v右旋糖酐及2%w/v人血清白蛋白的PBS缓冲液，离心弃上清，获得TNCs（总有核细胞）沉淀I；
（2）洗涤TNCs：将TNCs沉淀I用含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，离心弃上清，获得TNCs沉淀；
（3）分离单个核细胞白膜层：将TNCs沉淀再次用含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，加入等体积Ficoll淋巴细胞分离液中，密度梯度离心，然后收集单个核细胞白膜层；
（4）分离MNCs：将单个核细胞白膜层离心，弃上清液，获得MNCs（单个核细胞）沉淀。
步骤（1）中，所述脐带血与PBS缓冲液的体积比为1:3-1:4。
所述脐带血可以为新鲜获取的脐带血，也可以为液氮冻存复苏后的脐带血。
所述PBS缓冲液配方为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸二氢钾和10mM磷酸氢二钠，pH为7.3-7.5。
步骤（1）中，所述离心条件为0-4℃下1500rpm，升速9，降速7；离心时间为10min。
步骤（2）中，所述PBS缓冲液用量为脐带血的2-3体积倍。
步骤（2）中，所述离心条件为0-4℃下1000rpm，升速9，降速9；离心时间为5min。
优选的，所述步骤（2）重复1-2次。
步骤（3）中，所述离心条件为0-4℃下2000rpm，离心30min，升速1，降速1。
步骤（4）中，所述离心条件为0-4℃条件下1000rpm离心5min，升速9，降速7。
本发明具有以下优点：
本发明的从冻存脐带血中分离总有核细胞和单核细胞的方法，改变了以血浆直接密度梯度离心的方法，采用先分离总有核细胞、然后将总有核细胞离心的方法获得单核细胞的步骤，分离纯度高。采用的试剂成本低，对细胞毒性损伤、渗透性损伤低，获得总有核细胞及单个核细胞可应用于后续内皮祖细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞培养，或者CD34+干祖细胞磁珠分选。该方法高效、方便、省时、可重复性高，可以利用脐血库丰富的冻存脐血资源，提高冻存脐带血中衍生干细胞和免疫细胞的分离效率。
附图说明
图1是不同方法冻存脐带血复苏获得总有核细胞得率比较；
图2是不同方法冻存脐带血复苏获得总有核细胞活率比较；
图3是不同方法冻存脐带血复苏获得单个核细胞活率比较。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 脐带血中总有核细胞的分离
冻存脐血取自山东省脐血造血干细胞库，经检测合格的正式入库的脐血。
离心机采用Thermo Fisher Scientific Sorvall ST 16R高速冷冻离心机。
PBS缓冲液的组成：
所述PBS缓冲液配方为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸二氢钾和10mM磷酸氢二钠，pH约为7.3-7.5。
（1）脐血复苏：自液氮罐中迅速取出一份冻存的脐血，置于37℃水浴锅中，边孵育边摇晃冻存袋，快速复苏；
（2）分离TNCs：将30mL复苏后的脐血转入250mL离心管中，添加4℃预冷的含质量体积比5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液至150mL，充分混匀，4℃条件下1500rpm离心10min，升速9，降速7，吸弃上清，获得总有核细胞（TNCs）沉淀I；
（3）洗涤TNCs：将TNCs沉淀I用4℃预冷的含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬，充分混匀，4℃条件下1000rpm离心5min，升速9，降速7，弃上清，重复两次，获得总有核细胞（TNCs）沉淀。
对比例1 脐带血中总有核细胞的分离
按照实施例1中的方法复苏脐血、分离并洗涤TNCs，不同在于分离与洗涤TNCs时，采用含质量体积比0.5%人血清白蛋白的PBS缓冲液。
实施例2 TNCs的得率与活率
1. 复苏得率
将实施例1和对比例1中获得的TNCs沉淀再次用100mL含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬，吸取20μL用于细胞计数，用血球计数板计算细胞总数，并得出TNCs的复苏得率，计算公式如下：
TNCs复苏得率（%）=TNC沉淀细胞数/冻存前脐带血TNC数量
结果如图1所示：对比例1中的TNCs的复苏得率为75.34%±10.41%；显著低于实施例1中TNCs的复苏得率96.38%±2.40%（t-检验）。
2. 复苏活率
采用流式细胞术对实施例1中复苏获得的TNCs进行细胞活率测定，取TNCs细胞悬液以含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液稀释至1×106/mL，取4支流式上样管，分别添加200μL细胞悬液，1号管为空白对照，2和4号管添加5μL Annexin V抗体避光孵育10min后，向3号和4号管分别添加5μL PI染料，再次避光孵育5min后，1-4号管添加100μL鞘液后，上机检测细胞活率。对比例2中TNCs进行同样的操作，结果显示实施例1和对比例1复苏获得TNCs的活率达90%以上。其代表性结果如图2所示：实施例1和对比例1复苏获得的TNCs的活率分别为96.94%和95.05%。
实施例3 脐带血中单个核细胞的分离
将实施例1中TNCs沉淀再次用100mL含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，取50mL细胞悬液，缓慢加入等体积Ficoll淋巴细胞分离液中，密度梯度离心，2000rpm/min，离心30min，升速1，降速1；收集单个核细胞白膜层，4℃条件下1000rpm/min离心5min，升速9，降速7，离心，弃上清液，获得MNCs沉淀。
对比例2 脐带血中单个核细胞的分离
按照实施例3中的方法，将对比例1的中TNCs沉淀再次用100mL含0.5%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，其余操作相同，获得MNCs沉淀。
实施例4 单个核细胞的活率
采用流式细胞术对实施例3中复苏获得的MNCs进行细胞活率测定，取MNCs细胞以5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液稀释至1×106/mL，取4支流式上样管，分别添加200μL细胞悬液，1号管为空白对照，2和4号管添加5μL Annexin V抗体避光孵育10min后，向3号和4号管分别添加5μL PI染料，再次避光孵育5min后，1-4号管添加100μL鞘液后，上机检测细胞活率。对比例2中获得的MNCs进行相同操作，结果显示，实施例3分离获得的MNCs活率高达90%以上，而对比例2获得的MNCs活率不足80%。其代表性结果如图3显示：实施例3的MNCs活率活率为94.36%，对比例2的MNCs活率为77.96%。

Claims (10)

1.一种从脐带血分离单个核细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）脐带血中先分离总有核细胞沉淀；
（2）总有核细胞中分离单个核细胞。
2.一种从脐带血分离总有核细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分离TNCs：脐带血中加入含5%w/v右旋糖酐及2%w/v人血清白蛋白的PBS缓冲液，离心弃上清，获得TNCs沉淀I；
（2）洗涤TNCs：将TNCs沉淀I用含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，离心弃上清，获得TNCs沉淀。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述脐带血与PBS缓冲液的体积比为1:3-1:4。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述离心条件为0-4℃下1500rpm，升速9，降速7；离心时间为10min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PBS缓冲液用量为脐带血的2-3体积倍。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述离心条件为0-4℃下1000rpm，升速9，降速9；离心时间为5min。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）重复1-2次。
8.一种从脐带血分离单个核细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分离单个核细胞白膜层：将TNCs沉淀用含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，加入等体积Ficoll淋巴细胞分离液中，密度梯度离心，然后收集单个核细胞白膜层；
（2）分离MNCs：将单个核细胞白膜层离心，弃上清液，获得MNCs沉淀。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述离心条件为0-4℃下2000rpm，离心30min，升速1，降速1。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述离心条件为0-4℃条件下1000rpm离心5min，升速9，降速7。
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