CN105670991A - 人类骨髓细胞处理试剂盒及细胞处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人类骨髓细胞处理试剂盒及细胞处理方法，其特征在于，含有以下三种试剂：1号试剂为稀释剂：0.5%-20%氯化钠注射液或PBS液；2号试剂为沉淀剂：0.5%-20%羟乙基淀粉或甲基纤维素；3号试剂为分层液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2的分层液。将含有枸橼酸钠抗凝液的骨髓加入到含有1号试剂的大容量培养液瓶中，再加入2号试剂摇匀，后静置待分层后吸取上层细胞液离心1-20分钟，离心浓缩后用生理盐水稀释并铺到3号液上层，然后离心使分出干细胞层，收集干细胞层后用生理盐水清洗细胞备用。其可操作性强、临床安全性高、便于临床推广，该试剂盒易于存储运输、可产业化生产、使用方便快捷。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学，特别是一种人类骨髓细胞处理试剂盒及细胞处理方法。
背景技术
随着现代科学技术的不断发展，用于人类血液细胞的分离技术也得到了长足的发展，目前主要有以下几种处理方法：免疫磁珠法、流式细胞仪法、血细胞分离机法和培养扩增法，上述方法存在造价高，中低收入患者不适用，对细胞本身活性有损伤，影响细胞治疗疗效，患者承担一定的生命危险，污染率高，干细胞向未知方向分化为未知干细胞，时间长等缺陷。
CN1948467A公开了一种用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒，其缺点是由于使用该专利直接分离血液中的干细胞，数量不足以临床治疗使用，所以该专利进行了细胞培养，培养的细胞污染率高，体外模拟体内环境使细胞扩增，导致培养出的细胞有形态没功能，不能用于临床治疗；CN101144070A公开了一种骨髓脐带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方法，其缺点是该专利试剂中添加了lin抗体，导致成本大大提高，投入到临床使用中后，给中低收入患者造成负担，导致患者看不起病，接受不起细胞治疗，并且使用了lin抗体对细胞清洗造成了较大负担，此种物质进入人体后会发生何种变化还是未知数，还有待进一步研究。
综上，现有细胞分离技术主要存在以下几方面问题：1、治疗成本高。完成细胞分离工作的仪器设备（如：血细胞分离机及流式细胞仪）价格昂贵，导致治疗成本升高，增加了患者的治疗费用，不利于项目的推广和普及；2、细胞活性低。免疫磁珠法和流式细胞仪法筛选出来的均是被标记了的细胞，这些分选方法均存在筛选细胞范围小、细胞负重后活性降低以及标记物留在人体内会变成什么还是未知等问题；3、细胞液体积大。使用血细胞分离机分离的一般为外周血，且需要采集前打2-7天动员剂，将骨髓中干细胞动员到外周血里，经血细胞分离机处理后筛选出的细胞液体积较大，一般都超过50ml，且红细胞去除不干净。最后得到的细胞悬液体积大、质量不佳，只能用于自体皮下注射；4、获取细胞时间过长。培养扩增一周后才能用于临床治疗，时间过长会延误治疗的最佳时机，影响治疗效果，培养期间造成污染率提高；5、传统的分离方法仅限于实验室及科研使用。许多分离方法操作过程繁琐，对人员的专业要求较高，既费时又费力。从实验方法到临床应用还需要技术改进；6、不能产业化。实验成本高、操作环节中污染机率大、细胞液的保存运输条件不备，导致提取的细胞液数量有限，满足不了临床治疗的大量需求；另外，上述相关专利还存在原料来源复杂、配制繁琐、对于分离哪种血液针对性不强（因为人类血和动物血细胞存在一定差异），原料用到质量难以控制的生物制品等缺点。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种可操作性强、临床安全性高、便于临床推广的人类骨髓细胞处理试剂盒及细胞处理方法，该试剂盒易于存储运输、可产业化生产、使用方便快捷。
本发明的技术方案是：
一种人类骨髓细胞处理试剂盒，其特征在于，含有以下三种试剂：
1号试剂为稀释剂：0.5%-20%氯化钠注射液或PBS液，
2号试剂为沉淀剂：0.5%-20%羟乙基淀粉或甲基纤维素，
3号试剂为分层液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2的分层液。
一种人类骨髓细胞处理方法，其特征在于：将含有枸橼酸钠抗凝液的骨髓加入到含有20-350毫升1号试剂的大容量培养液瓶中，再加入4-200毫升2号试剂摇匀，后静置待分层后吸取上层细胞液以500-4000rpm离心1-20分钟，离心浓缩后用生理盐水稀释到10-150毫升铺到1-100毫升3号液上层，然后以500-4000rpm离心1-60分钟使分出干细胞层，收集干细胞层后用生理盐水清洗细胞备用。
本发明的有益效果是：
1、将试剂盒中1号2号3号试剂组合应用，利用人类各种血细胞密度不同，通过2号试剂结合血液中红细胞等不能起到临床治疗效果的细胞，使其重量增加，沉淀到细胞培养液瓶的底部，再利用各种细胞密度差异将它们分散于自上而下的试剂层次中去除人类骨髓中的红细胞，血浆，血小板，血红蛋白，粒细胞等，经过本发明分离的干细胞回收率能够达到90%以上，由于干细胞等细胞没有标记物等负重，使细胞存活率检测大于98%。
2、1-3号试剂原料便宜，配置过程简单质量可控，具有造价低，无任何标记物，保留原有细胞活性，细胞液体积小，干细胞种类齐全，分离操作时间短1小时左右即可完成，细胞数量能够满足临床治疗的需要等优点。
3、本发明试剂盒中原料简单易得，成本低廉，不使用质量难以控制的生物制品。能够实现在最低的价格，最简便的分离方法下分离出治疗所需要的细胞的目的。
4、本明可配有大容量培养液瓶，免除了临床现有少量多次处理细胞的繁琐过程，大大降低了污染机率，对环境及细胞本身不会造成任何污染，是临床上迫切需要的一种分离细胞的试剂盒及方法。
具体实施方式
实施例1
该人类骨髓细胞处理试剂盒，其中包含以下三种试剂：
1号试剂为稀释剂：0.9%氯化钠注射液或PBS液，
2号试剂为沉淀剂：6%羟乙基淀粉或甲基纤维素，
3号试剂为分层液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.075±0.001的分层液。
其中，1号试剂（稀释剂）：选用PBS液，其配制过程是先用少量水溶解下述试剂：氯化钠4g，氯化钾0.1g，12水磷酸氢二钠1.445g，磷酸二氢钾0.1g，然后加水至500ml，即得。使用前利用5.6%的碳酸钠调节pH至7.2；2号试剂（沉淀剂）：6%羟乙基淀粉（市售）；3号试剂（分层液）：将聚蔗糖与泛影葡胺配制成比重为1.075的分层液；将上述1号液经过10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤0.5EU/ml，装瓶，4℃保存。3号液经过10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤5EU/ml，装瓶。
利用上述试剂盒对细胞处理方法：将含有枸橼酸钠抗凝液的人类骨髓200ml加入到含有200ml的试剂1号液中，再加入150ml试剂2号液中，摇匀3分钟，放置30分钟，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以1500rpm离心5分钟，搜集下层细胞液，用生理盐水稀释后铺在试剂3液上，以2000rpm离心20分钟，收集中间干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即得。
表1：实施例1中分离出的干细胞回收率
| 编号 | 分离前CD34 | 分离后CD34 | 回收率 |
| 1 | 6.6×107 | 5.6×107 | 85% |
| 2 | 3.5×107 | 3.0×107 | 86% |
| 3 | 6.4×107 | 5.8×107 | 91% |
实施例2
试剂盒组成如下：
1号试剂（稀释剂）：0.9%氯化钠注射液（即生理盐水）市售。
2号试剂（沉淀剂）：甲基纤维素（进口）50克，加入到500毫升4℃生理盐水中，摇匀。即得10%甲基纤维素。
3号试剂（分层液）：将聚蔗糖与泛影葡胺配制成比重为1.075的分层液。
将上述2号液经过10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤0.5EU/ml，装瓶，4℃保存。3号液经过10分钟灭菌，检测其内毒素含量≤5EU/ml，装瓶。
将含有枸橼酸钠抗凝液的人类骨髓200ml加入到含有200ml的试剂1号液中，再加入150ml试剂2号液中，摇匀3分钟，放置30分钟，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以1500rpm离心5分钟，搜集下层细胞液，用生理盐水稀释后铺在试剂3液上，以2000rpm离心20分钟，收集中间干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即得。
表2：实施例2中分离出的干细胞回收率
| 编号 | 分离前CD34 | 分离后CD34 | 回收率 |
| 1 | 5.8×107 | 4.9×107 | 84.4% |
| 2 | 6.4×107 | 5.3×107 | 83% |
| 3 | 7.5×107 | 6.6×107 | 88% |
Claims (2)
1.一种人类骨髓细胞处理试剂盒，其特征在于，含有以下三种试剂：
1号试剂为稀释剂：0.5%-20%氯化钠注射液或PBS液，
2号试剂为沉淀剂：0.5%-20%羟乙基淀粉或甲基纤维素，
3号试剂为分层液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2的分层液。
2.一种人类骨髓细胞处理方法，其特征在于：将含有枸橼酸钠抗凝液的骨髓加入到含有20-350毫升1号试剂的大容量培养液瓶中，再加入4-200毫升2号试剂摇匀，后静置待分层后吸取上层细胞液以500-4000rpm离心1-20分钟，离心浓缩后用生理盐水稀释到10-150毫升铺到1-100毫升3号液上层，然后以500-4000rpm离心1-60分钟使分出干细胞层，收集干细胞层后用生理盐水清洗细胞备用。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN106434545A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-02-22 | 北正赛欧（北京）生物科技有限公司 | 高纯度脐带血干细胞的分离方法和试剂盒 |
| CN106754714A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-05-31 | 北正赛欧（北京）生物科技有限公司 | 脐带血样品稀释液、试剂盒及处理脐带血获得干细胞的方法 |
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2014
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| CN106434545B (zh) * | 2016-11-11 | 2019-12-03 | 北正赛欧（北京）生物科技有限公司 | 高纯度脐带血干细胞的分离方法和试剂盒 |
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