CN106754714A

CN106754714A - 脐带血样品稀释液、试剂盒及处理脐带血获得干细胞的方法

Info

Publication number: CN106754714A
Application number: CN201610993092.7A
Authority: CN
Inventors: 唐明淇; 赵涌
Original assignee: North Is Sail (beijing) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: North Is Sail (beijing) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-11-11
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-11-11
Also published as: CN106754714B

Abstract

本发明提供一种体外分离脐带血干细胞的稀释液、试剂盒及分离干细胞的方法。通过细胞稀释剂、细胞沉淀剂和分层剂的配合使用，能够快速分离出脐带血中的干细胞，且分离出来的干细胞活性高，杂质细胞少，在临床应用上具有重要的意义。

Description

脐带血样品稀释液、试剂盒及处理脐带血获得干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，具体地涉及一种体外分离脐带血样品的稀释液、试剂盒及处理脐带血获得干细胞的方法。

背景技术

脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗80多种疾病。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。因此，脐带血是一种非常重要的人类生物资源。

目前，从脐带血、骨髓和外周血中分离提取干细胞的方法包括以下几种：体外扩增培养法、血细胞分离机法、免疫磁珠法、流式细胞仪法等。然而，这些方法中均存在若干缺点。例如，体外扩增培养法污染率较高，干细胞向未知方向分化为未知干细胞，且扩增时间长。血细胞分离机法需要打动员剂增加治疗负担，分离后细胞液体积过大。免疫磁珠法操作步骤复杂，细胞活性低，细胞浓度低。流式细胞仪法成本高，标记物有致癌性，应用于临床不安全，只能适用于科研。

针对现有技术的不足，已公开了如下技术：

CN101089176A公开了一种干细胞分离液及其用于干细胞分离的方法。然而该方法需要配制工作液，需要调节密度，而且只能搜集密度在1.083g/ml范围内的细胞，搜集到的细胞较杂，而可用于治疗所需要的目标细胞数量少，并且对于脐带血来说，使用该方法去除红细胞不净，最终临床应用的时候会导致患者产生排异反应。

CN1948467A的专利申请中公开了用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。虽然使用该试剂盒可以直接分离血液中的干细胞，但是数量不足以临床治疗使用，所以该方法进行了细胞培养，培养的细胞污染率高，体外模拟体内环境使细胞扩增，导致培养出的细胞有形态没功能，不能用于临床治疗。

CN102604892A的专利申请中公开了一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞处理试剂盒及干细胞分离方法。然而该技术获得的干细胞的数量占细胞总数量的比例较低，且存活率不高。

总之，现有技术中仍然存在对于新的脐带血干细胞分离技术的需求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的缺陷，提供了一种操作简便、使用安全、细胞活性高、杂质细胞少的脐带血分离技术。具体地，本发明的一方面，提供一种脐带血样品稀释液，其由氯化钠、细胞保护剂和水组成，其中：

所述氯化钠的含量为0.1-5重量％；

所述细胞保护剂的含量为0.1-3重量％；

余量为水；

所述细胞保护剂由80-90重量％的氨基酸、8-18重量％的磷脂、0.5-2重量％的腺嘌呤和0.1-3重量％的肽类生长因子组成；

所述氨基酸选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的至少一种。

在某一实施方案中，所述细胞保护剂由84重量％的氨基酸、14重量％的磷脂、1重量％的腺嘌呤和1重量％的肽类生长因子组成。

在某一实施方案中，所述细胞保护剂的含量为2重量％。

在某一实施方案中，所述氯化钠的含量为0.9重量％。

本发明的另一方面，提供脐带血干细胞处理试剂盒，其由彼此独立存在的细胞稀释剂、细胞沉淀剂和分层剂组成，其中：所述细胞稀释剂为本发明所述的脐带血样品稀释液，所述细胞沉淀剂为4-10重量％的羟乙基淀粉水溶液，所述分层剂为由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2g/ml的水溶液。

本发明的再一方面，提供处理脐带血获得干细胞的方法，其包括：

将脐带血样品与细胞稀释剂接触的步骤；

随后加入细胞沉淀剂的步骤；

待分层后取出上层细胞液离心浓缩获得沉淀，将沉淀铺到分层剂上层，然后离心分离得到干细胞层的步骤；其中：

所述细胞稀释剂为本发明中所述的脐带血样品稀释液。优选地，所述细胞沉淀剂为4-10重量％的羟乙基淀粉水溶液。优选地，所述分层剂为由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2g/ml的水溶液。

在某一实施方案中，处理脐带血获得干细胞的方法包括：将脐带血样品加入到含有所述细胞稀释剂的培养液瓶中；再加入所述细胞沉淀剂，混合均匀后，静置；待分层后取出上层细胞液离心浓缩后，将沉淀铺到分层剂上层，然后离心分离得到干细胞层。在某一实施方案中，所述离心浓缩的转速为1000-2000转/分钟，离心时间为10-30分钟。

本发明采用的脐带血样品稀释剂作为细胞稀释剂，配合细胞沉淀剂和分层剂使用，能够更好的分理出脐带血中的干细胞，且所获得的干细胞相比于其他方法和试剂分离出的干细胞的存活率高，且含有杂质细胞更少。

具体地，与现有技术相比，本发明的优点包括：

1、本发明的试剂和方法针对性强，对于脐带血效果最佳。

2、干细胞存活率高，且所含杂质细胞少。

3、成本低，所需试剂或材料简单容易得到。

4、对环境及干细胞本身不会产生任何污染，能够很好的用于临床应用。

5、本发明提供的试剂液可以产业化生产，使用便捷。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。本发明中所述的“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

应理解本公开中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本公开的内容。另外，对于本公开中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本公开所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。本发明中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。

本发明中，所述的“脐带血”是指哺乳动物(例如，人类)胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。在一个实施方案中，胎盘和脐带可从动物体分离后经冷冻保存。在另一实施方案中，胎盘和脐带为从动物体分离的新鲜胎盘和脐带。优选地，胎盘和脐带为从动物例如人体分离后1-12小时，优选1-5小时之内的胎盘和脐带。新鲜的胎盘和脐带具有更多高活性的干细胞。因此，本发明的脐带血优选为新鲜胎盘和脐带中的血液。

本发明中，术语“脐带血样品稀释液”(本文中有时也简称为“稀释液”)是由氯化钠、细胞保护剂和水组成的水溶液，其pH值需要保持在6.8至7.2范围内，优选保持于7.0。稀释液用于将脐带血样品进行稀释，从而获得所需浓度或密度的血液样品。稀释液的配制方法不特别限定，例如在市售氯化钠注射液中添加所需量的细胞保护剂，并溶解均匀。优选地，进一步包括无菌处理的步骤，例如，加热灭菌处理步骤，或者过滤除菌的步骤。考虑到加热处理可能影响稀释液成分的稳定性，优选过滤除菌的方法。

本发明中，所述术语“细胞保护剂”是指对细胞起保护作用的试剂。具体地，本发明的细胞保护剂由氨基酸、磷脂、腺嘌呤和肽类生长因子组成。基于稀释液的总重量，细胞保护剂的含量通常在0.1-3重量％范围内。优选为0.5-2.5重量％，更优选为2重量％。

本发明中，基于细胞保护剂的总重量，细胞保护剂含有80-90重量％的氨基酸、8-18重量％的磷脂、0.5-2重量％的腺嘌呤和0.1-3重量％的肽类生长因子。

在某一实施方案中，细胞保护剂含有85-90重量％的氨基酸，更优选86-88重量％的氨基酸。氨基酸为天然小分子物质，对于血液样品无毒、无害。同时，85-90重量％的氨基酸能够使血液中的细胞保持悬浮，有利于细胞的均匀分散。如果氨基酸的含量过高，则稀释液的密度过高，不利于细胞分散。另一方面，如果氨基酸的含量过低，则稀释液的密度过低，不利于细胞的悬浮。在某一实施方案中，氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的至少一种。优选地，氨基酸选自中性氨基酸，或碱性氨基酸与酸性氨基酸的组合物。在优选地实施方案中，氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸组成的混合物。本发明中的氨基酸可通过水解蛋白质来获得。优选地，通过水解蛋白质来获得。

在某一实施方案中，细胞保护剂含有9-15重量％的磷脂，优选10-12重量％的磷脂，例如11重量％的磷脂。磷脂的含量过高，例如，高于15重量％，则容易引起细胞壁的融合，从而产生细胞团，同时影响细胞活性。另一方面，如果磷脂含量过低，例如，低于9重量％，则不利于细胞与其他物质，例如蛋白质、纤维素等大分子的分离，进而影响分离的细胞纯度。

在某一实施方案中，细胞保护剂含有0.6-1.8重量％的腺嘌呤，优选0.8-1.6重量％的腺嘌呤，更优选1-1.5重量％的腺嘌呤，还优选1.2-1.3重量％的腺嘌呤。本发明的发明人发现，从脐带血分离获得的干细胞的细胞活性通常比较低。在进行深入研究后，本发明人发现，在从胎盘或脐带分离出脐带血液，以及在脐带血分离干细胞的过程中，处理条件对于细胞呼吸是不利的。而腺嘌呤是富与能量的腺苷三磷酸(ATP)，与辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等形式发生作用，有利于提高细胞的呼吸作用，并且在蛋白质生物合成过程中作为DNA与RNA的组成物。因此，通过添加适当的腺嘌呤有利于保护干细胞。同时需要说明的是，过高或过低的腺嘌呤含量对于细胞活性是不利的，甚至是有害的。因此，本发明中的腺嘌呤所起的保护作用需要在所述含量范围内。

在某一实施方案中，细胞保护剂含有0.2-2.5重量％的肽类生长因子(GFs)，优选0.5-2.0重量％的肽类生长因子，优选1.0-1.5重量％的肽类生长因子。肽类生长因子的存在是保持细胞活性。

本发明中，所述磷脂是指含有磷酸的脂类，属于复合脂。磷脂可以是例如两性分子，一端为亲水的含氮或磷的头，另一端为疏水(亲油)的长烃基链。磷脂分子亲水端相互靠近，疏水端相互靠近。

本发明中，所述肽类生长因子是一类调节生物正常生长代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的多肽类有机物。通常通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合来调节细胞生长与其他细胞功能等。肽类生长因子可以是例如，神经营养因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子等。

所述的细胞保护剂能够起到保护细胞的作用，具体表现为能够提高分离获得的干细胞数量，提高干细胞的存活率。

本发明中，所述术语“细胞沉淀剂”为本领域内通常使的物质，例如羟乙基淀粉及其等同物质的水溶液，所述等同物质是指功能上等同的物质，包括，但不限于甲基纤维素等。关于羟乙基淀粉的浓度优选为5-8重量％，更优选为6重量％。羟乙基淀粉可以直接在市场购买所得。细胞沉淀剂的作用为结合红细胞，使其重量增加，沉淀到细胞培养器皿的底部。

本发明中，所述术语“细胞分层剂”为密度在1.0-1.2g/ml范围内的水溶液，优选地，其由聚蔗糖和泛影葡胺或者它们的等同物质配制而成。优选的密度为1.05-1.15g/ml，更优选为1.1g/ml。聚蔗糖和泛影葡胺可通过市场购买所得。另外，关于聚蔗糖和泛影葡胺的含量比，没有特别限定，只要能够达到1.0-1.2g/ml的密度范围即可。所述细胞分层剂能够利用各种细胞之间密度的差异来去除脐带血中的红细胞、血浆、血小板、血红蛋白、粒细胞等。

本发明中，CD₃₄(细胞表面的唾液粘蛋白)被认为是造血干细胞(HSCs).的标志物。CD₃₄在原始细胞分化为成熟细胞后表达下降。这点也发现在克隆的祖细胞和一些细胞系的干细胞。因此，可以用来表示干细胞的活性。

本发明中，可进一步包括灭菌的步骤。例如可以采用湿热灭菌的方法，灭菌温度为110-120℃，灭菌的时间为10-20分钟。也可采用例如过滤除菌的方法。

本发明的方法中，包括将脐带血样品与细胞稀释剂接触的步骤，其中接触方式可以是将脐带血样品添加到放置细胞稀释剂的容器中，也可以是将细胞稀释剂添加到放置脐带血样品的容器中，还可以是其他已知的接触方式；接触时通常需要在较为温和的条件下进行，例如，在温度能够使细胞存活的各种温度，或在轻轻搅拌的条件下等。

本发明的方法中，包括加入细胞沉淀剂的步骤，为将适量的细胞沉淀剂添加到含有脐带血样品和细胞稀释剂的容器中，容器可以是试管，也可以是其他常用的器皿。

本发明的方法中，包括静置分层后将上层的细胞液进行离心浓缩的步骤。优选地，离心浓缩的转速为1000-2000转/分钟，优选为1500转/分钟，离心时间为10-30分钟，例如，15分钟、20分钟等。

本发明的脐带血干细胞处理试剂盒中，细胞稀释剂、细胞沉淀剂和分层剂优选以独立存在方式配置。例如，分别将细胞稀释剂、细胞沉淀剂和分层剂放置于不同的容器中，或者同一容器中独立存在的空间内。

本发明的试剂盒可进一步包含其他试剂或成分或装置。例如，用于移动液体的装置，例如吸液器等。这些其他试剂或成分或装置是本领域技术人员已知的，并且可通过公开出版物容易地获知。

优选地，本发明中的试剂盒还进一步包含使用说明书，其中在使用说明书中给出或教导了实施本发明所述方法或使用本发明所述试剂盒的指导、指引或教导。

实施例

实验材料：

氨基酸购自EbewePharmaGes.m.b.H.Nfg.KG的脑蛋白水解物，含18种必须氨基酸，即：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。其他试剂均为本领域内的一般试剂，可通过市场购买。

实施例1

分离人类脐带血干细胞：

试剂盒组成：

细胞稀释剂：配制由84％(重量)的氨基酸、14％(重量)的磷脂、1％(重量)的腺嘌呤C、1％(重量)的肽类生长因子(BDNF)组成的细胞保护剂2g；

取4.5g氯化钠以及上述细胞保护剂，加入水中，稀释至500ml，混合均匀，备用。

细胞沉淀剂：6％(重量)羟乙基淀粉(市场购买)水溶液。

分层剂：将聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.1g/ml的水溶液。

将上述细胞稀释剂、细胞沉淀剂及分层剂经过115℃，20分钟灭菌处理，检测其内毒素含量≤0.5EU/ml，装瓶。

操作方法：将含有枸橼酸钠抗凝液的50ml脐带血一份，加入到200ml的细胞稀释剂中，然后再加入100ml细胞沉淀剂，混合摇匀6-10分钟，静置2小时，待分层后吸取上层细胞液，分装至离心管中，然后以1500转/分钟的速度离心，离心时间为20分钟。

收集下层细胞液，用生理盐水稀释后均匀铺在分层剂上，然后以1500转/分钟的速度离心，离心时间为20分钟，收集中间云雾状的干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至可供临床使用的体积即可得到实施例1数据，如表1所示。

实施例2

分离人类脐带血干细胞：

试剂盒组成：

细胞稀释剂：配制由86％(重量)的氨基酸、12％(重量)的磷脂、1％(重量)的腺嘌呤、1％(重量)的肽类生长因子组成的组合物2g，然后加水稀释至100ml即可得到细胞稀释剂；

取4.5g氯化钠，加入适量水溶解，再加入10ml上述配制的细胞保护剂水溶液，加水稀释至500ml，混合均匀，备用。

细胞沉淀剂：6％(重量)羟乙基淀粉(市场购买)水溶液。

分层剂：将聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.075g/ml的水溶液。

操作方法：将含有枸橼酸钠抗凝液的50ml脐带血加入到200ml的细胞稀释剂中，然后再加入100ml细胞沉淀剂，混合摇匀6-8分钟，静置2小时，待分层后吸取上层细胞液，分装至离心管中，然后以1500转/分钟的速度离心，离心时间为20分钟。

收集下层细胞液，用生理盐水稀释后均匀铺在分层剂上，然后以1500转/分钟的速度离心，离心时间为20分钟，收集中间云雾状的干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至可供临床使用的体积，结果如表1所示。

实施例3

分离人类脐带血干细胞：

试剂盒组成：

细胞稀释剂：配制由88％(重量)的氨基酸、10％(重量)的磷脂、1％(重量)的腺嘌呤、1％(重量)的肽类生长因子组成的组合物2.5g，然后加水稀释至100ml即可得到细胞稀释剂；

取4.5g氯化钠，加入适量水溶解，再加入8ml上述配制的细胞保护剂水溶液，加水稀释至500ml，混合均匀，备用。

细胞沉淀剂：6％(重量)羟乙基淀粉(市场购买)水溶液。

收集下层细胞液，用生理盐水稀释后均匀铺在分层剂上，然后以1500转/分钟的速度离心，离心时间为20分钟，收集中间云雾状的干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至可供临床使用的体积即可，结果如表1所示。

实施例4

分离人类脐带血干细胞：

试剂盒组成：

细胞稀释剂：配制由80％(重量)的氨基酸、18％(重量)的磷脂、1％(重量)的腺嘌呤、1％(重量)的肽类生长因子组成的组合物1.5g，然后加水稀释至100ml即可得到细胞稀释剂；

细胞沉淀剂：8％(重量)羟乙基淀粉(市场购买)水溶液。

分层剂：将聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.05g/ml的水溶液。

实施例5

分离人类脐带血干细胞：

试剂盒组成：

细胞稀释剂：配制由90％(重量)的氨基酸、8％(重量)的磷脂、1％(重量)的腺嘌呤、1％(重量)的肽类生长因子组成的组合物2.5g，然后加水稀释至100ml即可得到细胞稀释剂；

细胞沉淀剂：6％(重量)羟乙基淀粉(市场购买)水溶液。

实施例6

将含有枸橼酸钠抗凝液的50ml脐带血，按照市场售分离试剂说明书(脐带血干细胞分离试剂盒，品牌：BIOSCHINA，规格：HHCL-200)提供的方法进行分离，可以得到实施例6数据，如表1所示。

实施例7

将含有枸橼酸钠抗凝液的50ml脐带血，按照专利CN101638637A提供的分离试剂盒和使用进行分离(不包含任何腺嘌呤)，可以得到丙组数据，如表1所示。

表1：人类脐带血使用本发明提供的干细胞处理试剂盒及市场售和专利CN101638637A提供的试剂盒分离出的干细胞数量对比

实施例	分离后细胞总数	分离后带CD₃₄的干细胞总数
			实施例1	2.5×10⁸	5.0×10⁶
实施例2	2.5×10⁸	4.9×10⁶
			实施例3	2.4×10⁸	4.8×10⁶
实施例4	2.2×10⁸	4.7×10⁶
			实施例5	2.3×10⁸	4.7×10⁶
实施例6	1.9×10⁸	4.0×10⁶
			实施例7	2.1×10⁸	4.2×10⁶

从表1可以看出，针对脐带血样品，对于分离后细胞总数，与实施例6(市售)相比，本发明试验组(实施例1-5)的细胞数提高21-32％；对于分离后带CD₃₄的干细胞总数，与实施例6(市售)相比，本发明试验组(实施例1-5)的干细胞数提高18-25％。

从表1可以看出，针对脐带血样品，对于分离后细胞总数，与实施例7(未加腺嘌呤)相比，本发明试验组(实施例1-5)的细胞数提高10-19％；对于分离后带CD₃₄的干细胞总数，与实施例6(专利CN101638637A)相比，本发明试验组(实施例1-5)的干细胞数提高12-19％。

综上所述，相比市场售分离试剂盒及专利CN101638637A提供的干细胞试剂盒，利用本发明设计的脐带血干细胞处理试剂盒处理脐带血样品，获得的干细胞的数量更多质量更好。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims

1.一种脐带血样品稀释液，其由氯化钠、细胞保护剂和水组成，其中：

所述氯化钠的含量为0.1-5重量％；

所述细胞保护剂的含量为0.1-3重量％；

余量为水；

2.根据权利要求1所述的脐带血样品稀释液，其中所述细胞保护剂由84重量％的氨基酸、14重量％的磷脂、1重量％的腺嘌呤和1重量％的肽类生长因子组成。

3.根据权利要求1或2所述的脐带血样品稀释液，其中所述细胞保护剂的含量为2重量％。

4.根据权利要求1或2所述的脐带血样品稀释液，其中所述氯化钠的含量为0.9重量％。

5.一种脐带血干细胞处理试剂盒，其由彼此独立存在的细胞稀释剂、细胞沉淀剂和分层剂组成，其中：

所述细胞稀释剂为根据权利要求1-4任一项所述的脐带血样品稀释液，所述细胞沉淀剂为4-10重量％的羟乙基淀粉水溶液，所述分层剂为由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2g/ml的水溶液。

6.一种处理脐带血获得干细胞的方法，其包括：

将脐带血样品与细胞稀释剂接触的步骤；

随后加入细胞沉淀剂的步骤；

待分层后取出上层细胞液离心浓缩获得沉淀，随后将所述沉淀铺到分层剂上层，离心分离得到干细胞层的步骤；其中：

所述细胞稀释剂为根据权利要求1-4任一项所述的脐带血样品稀释液。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞沉淀剂为4-10重量％的羟乙基淀粉水溶液。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述分层剂为由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2g/ml的水溶液。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述离心浓缩的转速为1000-2000转/分钟，离心时间为10-30分钟。