CN106689115A - 一种脐带保存液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学领域，公开了一种脐带保存液及其应用。本发明所述脐带保存液包括生理盐水、葡萄糖、维生素H、叶酸、青霉素和链霉素。发明选择生理盐水、葡萄糖、维生素H、叶酸以及双抗作为脐带保存液的组分，相比传统的PBS加双抗的保存液，本发明组成更加简单，而在脐带保存效果上却表现出较为出色的功效，不仅能够保证脐带正常化，而且缩短爬出细胞的所需天数，为脐带原代分离hUC‑MSCs提供了较好地条件。

Description

一种脐带保存液及其应用
技术领域
本发明涉及医学领域，具体的说是涉及一种脐带保存液及其应用。
背景技术
脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，其外被羊膜，内含2条脐动脉、1条脐静脉，在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织-华尔通氏胶(Whartonps Jelly)，从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)。
1991年McElreavery首次从人脐带华通氏胶分离培养出一种具有多项分化潜能的成纤维样细胞，即人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stemcells，hUC-MSCs)。hUC-MSCs比来源于骨髓、脂肪以及其他组织的MSCs更具有优势，首先，脐带来源不受伦理争议，并且成本较低；其次，hUC-MSCs不会引起畸胎瘤，并且具有抑癌性，由于hUC-MSCs还具有低免疫原性、免疫调节、基质支持、旁分泌、迁移和基因稳定性，故具有良好的临床治疗潜能。
脐带在采集、运输、分离的过程中都需要处于无菌状态，由于孕妇分娩时间的不确定性，脐带在采集后不能完全保证马上用于原代分离，大多数情况下都需要保存一段时间，脐带保存液的功效决定了脐带原代分离的成功率，传统采用将脐带组织浸没在含多种组分的PBS中，例如专利CN101868536A公开了一种保存液，配方为186μg/mL CaCl2·2H2O，400μg/mL KCl，60μg/mL KH2PO4，200μg/mLMgSO4·7H2O，8000μg/mL NaCl，350μg/mL NaHCO3，90μg/mL NaH2PO4·7H2O，2000μg/mL葡萄糖、及青霉素和链霉素的1％等摩尔混合物。但是，这种PBS保存液配制较为复杂和繁琐，自行配置工作量较大，而购买成品，因为其价格昂贵导致成本增加。
针对上述问题，现有专利CN102550543A公开了一种成分简单的脐带保存液，由生理盐水、青霉素和链霉素组成。虽然在该保存液制备上比较简单，而且成本也较低，但是在保存脐带的效果方面却较差，易造成脐带肿胀或遍体通红，而且保存的脐带在制备hUC-MSCs时，爬出细胞所需天数普遍较长。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种脐带保存液及其应用，使得所述脐带保存液组成简单，同时保证脐带较好的保存效果，减少hUC-MSCs爬出细胞所需天数。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种脐带保存液，包括生理盐水、葡萄糖、维生素H、叶酸、青霉素和链霉素。
针对现有脐带保存制剂成分复杂以及保存效果不佳的问题，本发明简化保存液中的成分，同时从脐带的保存效果角度考虑，选择几种适宜的组分组成一种能够保证脐带较好的保存效果，减少hUC-MSCs爬出细胞所需天数的新型脐带保存液。
其中，作为优选，葡萄糖浓度为2000-4000mg/L，维生素H浓度为0.1-0.6mg/L，叶酸浓度为1.0-5.0mg/L，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL。在本发明具体实施方式中，上述各组分浓度可选择如下：
(1)葡萄糖浓度为2000mg/L，维生素H浓度为0.2mg/L，叶酸浓度为2.0mg/L，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL；
(2)葡萄糖浓度为4000mg/L，维生素H浓度为0.6mg/L，叶酸浓度为5.0mg/L，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL；
(3)葡萄糖浓度为3000mg/L，维生素H浓度为0.4mg/L，叶酸浓度为3.0mg/L，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL。
此外，为了能够及时掌握保存液是否已经产生变质，本发明保存液中还可以加入酚红。优选地，所述酚红的浓度为5.0mg/L。
本发明保存液和传统的PBS保存液以及专利CN102550543A实施例1保存液进行保存效果和爬出细胞所需天数的对比试验，结果显示，经过本发明保存液保存48h后，所有脐带均表现正常，而传统的PBS保存液和专利CN102550543A实施例1保存液在保存脐带48h后，分别出现了脐带遍体通红和肿胀的异常状态，无法用于hUC-MSCs的制备；在通过组织块培养法制备hUC-MSCs时，经过本发明保存液保存的脐带在爬出细胞所需天数上较另外两者时间短，表现出更好的活力。
由此，本发明随之提供了本发明所述脐带保存液在保存脐带和/或制备保存脐带的产品中的应用。
同时，本发明提供了一种保存脐带的方法，将脐带分离后置于权利要求1-5任意一项所述脐带保存液中，于4℃下保存。
由以上技术方案可知，本发明选择生理盐水、葡萄糖、维生素H、叶酸以及双抗作为脐带保存液的组分，相比传统的PBS加双抗的保存液，本发明组成更加简单，而在脐带保存效果上却表现出较为出色的功效，不仅能够保证脐带正常化，而且缩短爬出细胞的所需天数，为脐带原代分离hUC-MSCs提供了较好地条件。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种脐带保存液及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明产品和应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种脐带保存液及其应用做进一步说明。
实施例1：本发明所述脐带保存液
葡萄糖浓度为2000mg/L，维生素H浓度为0.2mg/L，叶酸浓度为2.0mg/L，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL，酚红浓度为5.0mg/L。
实施例2：本发明所述脐带保存液
葡萄糖浓度为4000mg/L，维生素H浓度为0.6mg/L，叶酸浓度为5.0mg/L，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL。
实施例3：本发明所述脐带保存液
葡萄糖浓度为3000mg/L，维生素H浓度为0.4mg/L，叶酸浓度为3.0mg/L，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL。
实施例4：脐带保存试验
保存液A-C：实施例1-实施例3保存液；
保存液D：传统PBS+1倍双抗(青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL)；传统PBS 1L配方:氯化钠(NaCl)，8g；氯化钾(KCl)，0.2g；磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1.44g；磷酸二氢钾(KH2PO4)，0.24g；调pH 7.2,定容1L，然后高压蒸汽灭菌，4℃保存。
保存液E：专利CN102550543A实施例1保存液；
方法：
采集脐带20条(均经过产妇授权同意，胎儿均足月生产且产妇无传染性疾病)，每条脐带平均截断5份，分别置于中保存液A-E中，均置于4℃保存48h。
保存48h后，观察脐带形态和颜色，同时使用组织块培养法分离接种，加入DMEM/F12+20％FBS，置于37℃，体积分数为5％的CO2培养箱中培养，统计爬出细胞的天数，待细胞融合度达80％以上进行传代。结果见表1。
表1脐带保存试验结果
实施例5：细胞免疫表型分析
取保护液A组第3代细胞，消化后清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体，流式细胞仪检测分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。结果见表2。
表2
CD73 CD90 CD105 CD11b CD19 CD34 CD45 HLA-DR
100.00％ 99.70％ 96.30％ 0.00％ 0.00％ 0.00％ 0.10％ 0.20％
由表2的流式细胞学检测结果可知，保护液A组第3代细胞不表达造血细胞标记CD34，CD45，CD11，HLA-DR和CD19，而整合素和黏附分子CD90，以及常用的人间充质干细胞标记CD73，CD105则均呈高表达，符合脐带间充质干细胞的特性。此外，将保护液B、C两组第3代细胞进行检测，结果相同。
实施例6：体外向脂肪细胞诱导分化检测
取保护液A组第3代细胞，按2.5*104细胞浓度接种于含有DMEM/F12+20％FBS培养基的24孔板中，至细胞80％融合时，更换为含有1nmol/L地塞米松、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的培养液，每周换液2次，3周后用多聚甲醛固定，油红O染色。
结果显示，保护液A组第3代细胞可以形成脂肪细胞，油红O染色发现后者细胞浆充满了油滴空泡，说明该保存液保存脐带后得到的细胞具有正常的分化能力。此外，将保护液B、C两组第3代细胞进行成脂分化，结果相同。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。

Claims (7)

1.一种脐带保存液，其特征在于，包括生理盐水、葡萄糖、维生素H、叶酸、青霉素和链霉素。
2.根据权利要求1所述脐带保存液，其特征在于，葡萄糖浓度为2000-4000mg/L，维生素H浓度为0.1-0.6mg/L，叶酸浓度为1.0-5.0mg/L，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL。
3.根据权利要求2所述脐带保存液，其特征在于，葡萄糖浓度为2000mg/L，维生素H浓度为0.2mg/L，叶酸浓度为2.0mg/L，青霉素含量为10kU/mL，链霉素含量为10mg/mL。
4.根据权利要求1-3任意一项所述脐带保存液，其特征在于，还包括酚红。
5.根据权利要求4所述脐带保存液，其特征在于，所述酚红的浓度为5.0mg/L。
6.权利要求1-5任意一项所述脐带保存液在保存脐带和/或制备保存脐带的产品中的应用。
7.一种保存脐带的方法，其特征在于，将脐带分离后置于权利要求1-5任意一项所述脐带保存液中，于4℃下保存。
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