CN114557336B - 可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞技术领域,具体涉及一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液及其制备方法和应用。本发明的组织处理液,既包含了具有消毒作用的酒精,对于组织中可能存在的细菌等微生物进行消杀,又包含有与生理环境相似的等渗等离子的溶液环境,并含有对细胞活性起到保护作用的血清白蛋白,可起到保护组织中细胞的作用,可提高组织原代分离数量及活性。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域,具体涉及一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液及其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,广泛存在于脐带、骨髓、牙髓、脂肪或胎盘组织中,具有易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议、刺激组织再生、调节免疫功能等诸多优点。目前对于间充质干细胞的来源组织的没有统一的要求,但是,组织来源决定了后期细胞生产,对已干细胞研究乃至干细胞制剂的生产具有重要的作用。
脐带、脂肪等组织作为间充质干细胞的重要来源,一般操作为新鲜组织进行原代分离培养,也可以将组织进行冻存,一般可通过酒精或缓冲液进行浸泡清洗等操作减少污染。但现有技术中冻存液存在以下缺陷:酒精的长时间浸泡或缓冲液的多次清洗会引起脐带组织中细胞的死亡,减少原代细胞的获得率及细胞数量;如果缩短酒精浸泡时间,减少酒精清洗次数,会存在清洗不完全的情况,细胞后期存在污染的风险。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液,所述组织处理液是由氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清白蛋白、注射用水、无水乙醇按照1-5g:200-400mg:10-50mg:1000-2000mg:500-2000mg:250ml:750ml的比例制备而成。
优选的,上述可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液中,所述组织处理液是由氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清白蛋白、注射用水、无水乙醇按照5g:400mg:50mg:1000mg:500mg:250ml:750ml的比例制备而成。
优选的,上述可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液中,所述组织处理液是由氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清白蛋白、注射用水、无水乙醇按照1g:200mg:10mg:2000mg:2000mg:250ml:750ml的比例制备而成。
本发明的第二个目的是提供一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:按配方比例称取各原料组分,将称取的氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清蛋白、注射用水混合,将混合液搅拌直至溶液澄清,然后再加入称取的无水乙醇,混匀,除菌,收集上清液,即获得组织处理液。
优选的,上述可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法中,所述注射用水采用除菌或灭菌后的水。
优选的,上述可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法中,除菌的方法为:用0.22μm滤膜过滤除菌。
本发明的第三个目的是提供一种上述组织处理液在提高组织原代分离数量及活性中的应用。
优选的,上述组织处理液在提高组织原代分离数量及活性中的应用中,组织处理方法如下:
将生物组织表面消毒后,置于组织处理液中浸泡10-15分钟,弃去上清,再加入组织处理液10-15分钟后取出,用生理盐水清洗3-5次;剪去生物组织周边样本,剩余样本切段,生理盐水清洗3-5次,除去动脉和静脉,剥离Wharton胶,生理盐水清洗2-3次,剪碎后,向组织块中加入培养液,进行细胞培养。
优选的,上述组织处理液在提高组织原代分离数量及活性中的应用中,所述生物组织为脐带组织。
优选的,上述组织处理液在提高组织原代分离数量及活性中的应用中,所述脐带组织为离体的人脐带组织。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、本发明的组织处理液,既包含了具有消毒作用的酒精,对于组织中可能存在的细菌等微生物进行消杀,产生蛋白变性,消除细菌等微生物的残留,保持组织的微生物安全性;又包含有与生理环境相似的等渗等离子的溶液环境,并含有对细胞活性起到保护作用的血清白蛋白,可起到保护组织中细胞的作用。
2、本发明主要通过组织处理液保存组织,对组织进行前期处理,组织处理液既可提高组织原代分离数量及活性,又可保证组织的微生物安全性。这种方法,简单经济,易于产业化操作。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施,下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
在本发明的描述中,如未特殊说明,所用试剂均为市售,所用方法均为本领域常规技术。下述所有实验中所用生理盐水浓度为0.9g/100ml。
实施例1
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液,其是由氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清白蛋白、注射用水、无水乙醇按照5g:400mg:50mg:1000mg:500mg:250ml:750ml的比例制备而成。
实施例2
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液,其是由氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清白蛋白、注射用水、无水乙醇按照1g:200mg:10mg:2000mg:2000mg:250ml:750ml的比例制备而成。
实施例3
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液,其是由氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清白蛋白、注射用水、无水乙醇按照2g:300mg:20mg:1500mg:1500mg:250ml:750ml的比例制备而成。
实施例4
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入氯化钠5g,氯化钾400mg,海藻糖50mg,葡萄糖1000mg,人血清白蛋白500mg后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为A液。
实施例5
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入氯化钠1g,氯化钾200mg,海藻糖10mg,葡萄糖2000mg,人血清白蛋白2000mg后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为A1液。
实验例1
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入海藻糖50mg后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为B液。
实验例2
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入氯化钠5g后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为C液。
实验例3
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入氯化钾400mg后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为D液。
实验例4
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入葡萄糖1000mg后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为E液。
实验例5
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入人血清白蛋白500mg后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为F液。
实验例6
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入海藻糖10mg后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为B1液。
实验例7
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入氯化钠1g后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为C1液。
实验例8
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入氯化钾200mg后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为D1液。
实验例9
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入葡萄糖2000mg后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为E1液。
实验例10
一种可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,包括以下步骤:
S1,取250ml注射用水,加入人血清白蛋白2000mg后充分混匀,将混合液置于磁力搅拌器上搅拌直至溶液澄清;
S2,在上述液体中加入750ml的无水乙醇,充分混匀后,进行0.22μm滤膜进行过滤,收集上清液,即获得组织处理液,此组织处理液为F1液。
利用上述实施例4以及实验例1-5制备的A液-F液,实施例5以及实验例6-10制备的A1液-F1液进行实验,观察各个组织处理液的功效,具体实验操作如下:
1、试验组织处理:
新鲜离体人脐带组织置于保存液(保存液采用a-MEM培养液,gibco)中放入采集瓶,运输至实验室,从装有样本的便携式恒温生物运输箱取出采集瓶,用体积分数75%酒精消毒表面后,置于超净工作台内,弃掉多余保存液后,将组织样本平均分为14份。
2、实验方法:
(1)取12份样本,分别加入组织处理液A液,B液,C液,D液,E液,F液,A1液,B1液,C1液,D1液,E1液,F1液中,以没过脐带组织为宜,浸泡10分钟后取出样本,弃去上清,再加入组织处理液,以没过脐带组织为宜,浸泡10分钟后取出,最后放入含有生理盐水的培养皿中清洗3次。
(2)向第13份样本中加入体积分数75%酒精,以没过脐带组织为宜,浸泡10分钟后取出样本,弃去上清,再加入体积分数75%酒精,以没过脐带组织为宜,浸泡10分钟后取出,最后放入加有生理盐水的培养皿中清洗3次。该方法处理的细胞作为对照组1。
向第14份样本中加入体积分数75%酒精,以没过脐带组织为宜,浸泡5分钟后取出样本,弃去上清后,再加入体积分数75%酒精,以没过脐带组织为宜,浸泡5分钟后取出,最后放入加有生理盐水的培养皿中清洗3次。该方法处理的细胞作为对照组2。
(3)剪切:在样本脐带两头部位内侧1cm处剪掉并废弃,将脐带组织均匀分成约2cm的小段,生理盐水清洗3次去掉残留血液;沿脐静脉剪开脐带,去除脐静脉和脐动脉,剥离Wharton胶,生理盐水清洗3次,并将其剪碎至1mm×1mm×1mm大小的组织块。
(4)组织块加入培养液(含体积分数10%胎牛血清的a-MEM)后置于二氧化碳培养箱,细胞生长至80%后消化,得到原代细胞,对各A液-F液处理的细胞进行计数,对A1液-F1液采用台盼蓝拒染法进行活性的检测,结果如表1-2所示,采用组织处理液A的组织原代细胞获得数量最高。
表1不同处理液处理后的细胞数量对比
组别 | 细胞数量(个/ml) | 细胞活率 |
A液 | <![CDATA[5.4×10<sup>4</sup>]]> | 96% |
B液 | <![CDATA[4.7×10<sup>4</sup>]]> | 92.4% |
C液 | <![CDATA[2.9×10<sup>4</sup>]]> | 83.5% |
D液 | <![CDATA[3.0×10<sup>4</sup>]]> | 84.6% |
E液 | <![CDATA[3.9×10<sup>4</sup>]]> | 82.7% |
F液 | <![CDATA[4.1×10<sup>4</sup>]]> | 87.6% |
75%酒精(对照组1) | <![CDATA[2.4×10<sup>4</sup>]]> | 77% |
表2不同处理液处理后的细胞活性对比
需要说明的是,本发明中涉及数值范围时,应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用,由于采用的步骤方法与实施例相同,为了防止赘述,本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液,其特征在于,所述组织处理液是由氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清白蛋白、注射用水、无水乙醇按照1-5g:200-400mg:10-50mg:1000-2000mg:500-2000mg:250ml:750ml的比例制备而成。
2.根据权利要求1所述的可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液,其特征在于,所述组织处理液是由氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清白蛋白、注射用水、无水乙醇按照5g:400mg:50mg:1000mg:500mg:250ml:750ml的比例制备而成。
3.根据权利要求1所述的可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液,其特征在于,所述组织处理液是由氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清白蛋白、注射用水、无水乙醇按照1g:200mg:10mg:2000mg:2000mg:250ml:750ml的比例制备而成。
4.根据权利要求1所述的可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:按配方比例称取各原料组分,将称取的氯化钠、氯化钾、海藻糖、葡萄糖、人血清蛋白、注射用水混合,将混合液搅拌直至溶液澄清,然后再加入称取的无水乙醇,混匀,除菌,收集上清液,即获得组织处理液。
5.根据权利要求4所述的可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,其特征在于,所述注射用水采用除菌后的水。
6.根据权利要求4所述的可提高组织原代分离数量及活性的组织处理液的制备方法,其特征在于,除菌的方法为:用0.22μm滤膜过滤除菌。
7.权利要求1所述的组织处理液在提高组织原代分离数量及活性中的应用。
8.根据权利要求7所述的组织处理液在提高组织原代分离数量及活性中的应用,其特征在于,组织处理方法如下:
将生物组织表面消毒后,置于组织处理液中浸泡10-15分钟,弃去上清,再加入组织处理液10-15分钟后取出,用生理盐水清洗;剪去生物组织周边样本,剩余样本切段,生理盐水清洗,除去动脉和静脉,剥离Wharton胶,生理盐水清洗,剪碎后,向组织块中加入培养液,进行细胞培养。
9.根据权利要求8所述的组织处理液在提高组织原代分离数量及活性中的应用,其特征在于,所述生物组织为脐带组织。
10.根据权利要求9所述的组织处理液在提高组织原代分离数量及活性中的应用,其特征在于,所述脐带组织为离体的人脐带组织。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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