CN1239712C

CN1239712C - 深海鱼皮组织工程用胶原蛋白和制备方法

Info

Publication number: CN1239712C
Application number: CN 02111683
Authority: CN
Inventors: 王瑾晔; 董健
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Priority date: 2002-05-15
Filing date: 2002-05-15
Publication date: 2006-02-01
Anticipated expiration: 2022-05-15
Also published as: CN1382806A

Abstract

本发明涉及一种深海鱼皮为原料的生物相容性好的胶原蛋白及其制备方法。通过碱溶液处理鱼皮，再利用限制性酶解方法处理上述鱼皮，净化酶解上清液即得可降解生物相容性的鱼皮胶原蛋白。该方法制得的鱼皮胶原蛋白纯度高，细胞相容性好，制备成本低，适合组织工程用材料。

Description

深海鱼皮组织工程用胶原蛋白和制备方法

技术领域

本发明涉及一种深海鱼皮组织工程用胶原蛋白和制备方法。利用深海鱼皮作为原料，提取供制备生物替代物的胶原蛋白，具体地说，本发明涉及利用碱溶液处理鱼皮，再利用限制性酶解方法处理上述鱼皮，净化酶解上清液即得可降解生物相容性的鱼皮胶原蛋白。

背景技术

胶原蛋白是一种结构蛋白，具有多种生物功能。胶原蛋白是组织的支持物和填充物，主动参与细胞的迁移、分化及增殖，并与创伤的修复及胚胎的发育有关。以胶原蛋白为原料制备的生物替代物在动物实验和临床实验获得较好的效果。

目前，国际上已出现一批以胶原蛋白为主要成分的生物制品，包括可溶性胶原、不溶性胶原以及由胶原和非胶原基质组成的复合物。这些材料可用于制备胶原溶液、胶原膏剂、胶原薄膜、胶原缝合线等，从而广泛用于创伤和烧伤的修复、整形美容、神经再生及血瓣膜手术等。

目前临床上应用的胶原制剂的胶原蛋白主要是哺乳动物猪、牛皮肤的胶原蛋白。这类胶原蛋白的提取的前处理比较麻烦，为得到干净卫生的皮肤原材料，屠宰前后清洁皮肤所需的工作量大，需要的成本也就相应的提高。此外，在临床上使用牛皮胶原可能在个别病例中引起不同程度的免疫反应。特别是最近疯牛病的危险性被广泛认识，大大限制了胶原蛋白的来源。

近几年出现了从大马哈鱼、比目鱼等皮肤中提取胶原蛋白的方法。鱼皮胶原蛋白，特别是深海鱼皮胶原蛋白，由于鱼的体温低，胶原蛋白的变性温度相当低，不象牛皮胶原蛋白那样限制细胞的增殖。而且有实验表明它能促进细胞的粘着和增殖，不会诱发细胞的癌化(JP910,246)。由于原料的不同，制备鱼皮胶原时的前处理也就不同于哺乳动物皮肤的前处理，鱼皮的前处理包括去鳞、去脂、去腥、去色等，用有机溶剂去除鱼皮中非胶原蛋白成分，还会有部分脂肪不能除去，且该处理鱼皮的方法成本高，污染环境。Shimizu et.al.(US6,271,350)利用盐渍鱼皮的方法，可以有效的去除鱼皮中的非胶原成分。该方法盐渍处理需一周，耗时长；用70-90℃的蒸馏水提取的胶原蛋白仅供工业和食品的需要。Holzer(US 5,484,888)利用1.6-12.5％的碱浸泡原料3-60天，再用PH5的弱酸溶液于45-55℃提取制备高强度白明胶用于食品填充物、摄影胶片和药物胶囊。Hadden US5,162,506在制备作食品添加剂和营养氨基酸用的胶原纤维时，利用饱和的碱溶液去除原料中残留的可溶性非胶原蛋白和多糖。I型胶原蛋白的β、γ链的非螺旋区是胶原蛋白的抗原决定簇。Piere et.al.(US5420248)利用鱼腹部鱼的皮粉碎后，酸溶提取，所得胶原蛋白中α链占44％，β占56％。若用作生物材料，受体个体产生免疫应答的可能性大大增加。此外，胶原蛋白的纯化程度不高也限制所制备胶原蛋白的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种深海鱼皮组织工程用胶原蛋白，适合组织工程需要的可降解的生物相容性材料。

本发明的目的还提供一种上述深海鱼皮组织工程用胶原蛋白的制备方法。该方法制得的鱼皮胶原蛋白纯度高，细胞相容性好，制备成本低，适合组织工程用材料。

本发明的一种深海鱼皮的胶原蛋白，该深海鱼皮胶原蛋白不含有γ链，其中α链的含量≥75％，β链的含量≤25％。本发明制备的胶原蛋白与Corning细胞培养板生物相容性比较结果如表1所示：

表1：本发明制备的胶原蛋白与Corning细胞培养板生物相容性比较

材料人LA肝细胞人LA肝细胞

细胞增殖率(3d) 细胞存活力(％)

Corning细胞培养板 3.26±1.83 100％

鱼皮胶原蛋白(50μg/ml) 7.58±0.31 100％

本发明的上述深海鱼皮的胶原蛋白制备方法如下；

1.碱溶液处理。清洗干净的深海鱼皮用0.5％-10％稀碱溶液在0-16℃浸泡处理，再用如Ca(OH)₂.Mg(OH)₂或Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等的弱酸盐溶液浸泡1-7天，鱼皮与稀碱溶液的重量与体积比为1∶1-10(公斤/升)，用去离子水充分清洗碱处理后鱼皮，直到pH6.5-7.5左右为止。经本发明的碱溶液处理方法，去除原料中的非胶原蛋白同时，还切除了胶原蛋白的非螺旋端。

2.限制性酶解。将上述处理后的深海鱼皮溶解于0.01-2.0MpH3.5-5.5的醋酸-醋酸钠盐、磷酸盐、邻苯二甲酸钾-氢氧化钠、柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸或磷酸二氢钠-柠檬酸的缓冲液中，添加蛋白酶，酶和鱼皮的重量比为1∶10-100，于0-16℃条件下酶解1-5天，过滤。残渣可以再次限制性酶解处理，合并两次滤液。

3.净化胶原蛋白将上述pH 3.5-5.5的滤液于2,000-10,000rpm低温离心，收集上清液，用醋酸-醋酸钠盐、磷酸盐、邻苯二甲酸钾-氢氧化钠、柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液梯度透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止。

经透析的胶原蛋白液可以0-16℃保存，也可以干燥后于0-16℃保存。

本发明中使用的蛋白酶是胃蛋白酶或胰蛋白酶。

上述清洗干净的深海鱼皮是将新鲜或冰冻保存的深海鱼皮用0-16℃的自来水浸泡冲洗干净，再用去离子水浸泡冲洗3-5次。所述的深海鱼皮是大马哈鱼、比目鱼、马鲛鱼、鲑鱼、鳕鱼或鲨鱼等的皮肤。所述的Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等的弱酸盐，可以是磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐。

本发明的深海鱼皮胶原蛋白其它胶原蛋白(牛)相比，不仅不含有γ链，而且α链的含量高，β链的含量低，如α链的含量可高达79.65％，相对β链的含量为20.35％，生物相容性好。本发明的方法简便，制得的鱼皮胶原蛋白纯度高，制备成本低，适合组织工程用材料。

附图说明

图1、本发明制备的胶原蛋白电泳图谱。

图2、Corning细胞培养板上细胞接种12小时细胞贴壁照片。

图3、本发明制备的胶原蛋白膜上细胞接种12小时细胞贴壁照片。

附图符号说明：1-次高分子量标准蛋白；2-盐渍酶解的胶原蛋白；3-碱渍酶解的胶原蛋白。

本发明制备的胶原蛋白电泳图谱如图1所示，说明本发明制备的胶原蛋白3不含有γ链，而且α链的含量高达79.65％，β链的含量低.仪为20.35％，而盐渍酶解的胶原蛋白2含有小量γ链，β链的含量31.46％，α链的含量为68.54％。(参照US 5420248方法处理鱼皮并本发明的酶解方法)Corning细胞培养板上(图2)和本发明制备的胶原蛋白膜上(图3)分别细胞接种12小时细胞贴壁的照片显示为细胞贴壁分散不呈梭形和细胞贴壁不分散呈梭形。其中图2放大倍率为40倍；图3放大倍率为80倍。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1：鱼皮胶原蛋白制备

1.清洗鱼皮将冰冻保存的大马哈鱼皮肤1公斤用4℃的自来水浸泡冲洗干净，剔除鱼鳞和皮下组织，直到浸泡液中除整块鱼皮外没有其它固形物为止，再用去离子水浸泡冲洗5次。

2.碱处理鱼皮用5％Na₂CO₃溶液10升于4℃浸泡(1)处理后的鱼皮1个星期，每天更换一次3％Na₂CO₃溶液。再用去离子水充分清洗碱处理后鱼皮，直到pH7左右为止。

3.限制性酶解鱼皮将(2)处理的鱼皮溶解于5升1.0M的醋酸盐缓冲液中，添加1.0％胰蛋白酶，于4℃条件下酶解1天，用纱布过滤。残渣再次限制性酶解处理，步骤同上，合并两次滤液。

4.净化胶原蛋白将上述滤液于10,000rpm低温离心，收集上清，用醋酸盐缓冲液剃度透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止。可以得到59克精制胶原蛋白。

精制胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图谱如图1所示。

实施例2：鱼皮胶原蛋白制备

1.清洗鱼皮将冰冻保存的大马哈鱼皮肤1公斤用1-10℃的自来水浸泡冲洗干净，剔除鱼鳞和皮下组织，直到浸泡液中除整块鱼皮外没有其它固形物为止，再用去离子水浸泡冲洗5次。

2.碱处理鱼皮用1％Ca(OH)₂溶液10升于1-10℃浸泡(1)处理后的鱼皮1个星期，每天更换一次1％Ca(OH)₂溶液。再用去离子水充分清洗碱处理后鱼皮，直到pH7左右为止。

3.限制性酶解鱼皮将(2)处理的鱼皮溶解于5升1.0M的醋酸盐缓冲液中，添加1.0％胃蛋白酶，于1-10℃条件下酶解2天，用纱布过滤。残渣再次限制性酶解处理，步骤同上，合并两次滤液。

4.净化胶原蛋白将上述滤液于10,000rpm低温离心，收集上清，用醋酸盐缓冲液剃度透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止。可以得到65克精制胶原蛋白。

实施例3：盐渍鱼皮胶原蛋白制备

1.清洗鱼皮将冰冻保存的大马哈鱼皮肤1公斤用5℃的自来水浸泡冲洗干净，剔除鱼鳞和皮下组织，直到浸泡液中除整块鱼皮外没有其它固形物为止，再用去离子水浸泡冲洗5次。

2.碱处理鱼皮用NaCl盐渍鱼皮(1∶1w/w)7天。再用去离子水充分清洗碱处理后鱼皮，直到pH7左右为止。

3.限制性酶解鱼皮将(2)处理的鱼皮溶解于5升1.0M的醋酸盐缓冲液中，添加2.0％胃蛋白酶，于5℃条件下酶解2天，用纱布过滤。残渣再次限制性酶解处理，步骤同上，合并两次滤液。

4.净化胶原蛋白将上述滤液于10,000rpm低温离心，收集上清，用醋酸盐缓冲液剃度透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止。可以得到78克精制胶原蛋白。

实施例4：生物相容性比较

本发明制备的胶原蛋白与几种基质生物相容性比较：

1.casting制膜：将胶原蛋白配制成100ug/ml的1％醋酸溶液，加200微升于24孔细胞培养板孔中，再将培养板置于离心机转头顶部(重心偏离)，1500rpm 1分钟，更换位置后1500rpm 1分钟，37℃晾干即可。使用前，紫外线处理30分钟。

2.接种细胞：将细胞悬液浓度调至2.5×10⁵个细胞/毫升左右，每孔加细胞悬液1毫升。

3.3天后记数(活细胞染色和记数：将1滴细胞悬液与2滴台盼蓝混合，滴到记数板上，2分钟后记数。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞)：Corning细胞培养板细胞增殖为3.26±1.83，细胞存活率为100％；100ug/ml本发明制备的鱼皮胶原蛋白膜的细胞增殖为3.50±1.75，细胞存活率为100％。

该胶原蛋白电泳图谱如图1-2所示。

Claims

1.一种以深海鱼皮为原料制备的胶原蛋白，其特征在于所制备的深海鱼皮胶原蛋白不含有γ链，其中α链的含量75％-79.65％，其余为β链。

2.一种如权利要求1所述的深海鱼皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于依次按下列步骤进行：

1)经清洗干净的鱼皮用1％-10％稀碱溶液在1-10℃浸泡处理，鱼皮与稀碱溶液的重量与体积比为1∶1-10公斤/升，再用去离子水充分清洗碱处理后鱼皮，直到中性；

2)限制性酶解鱼皮将上述处理的鱼皮溶解于pH3.5-5.5的酸性缓冲液中，添加1％的蛋白酶，酶和鱼皮的重量比为1∶100，在1-10℃酶解1-5天，过滤；

3)净化胶原蛋白将上述酸性的滤液于2,000-10,000rpm低温离心，收集上清，用酸性缓冲液梯度透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止；

经透析的胶原蛋白液可以0-16℃保存或干燥后于0-16℃保存。

3.如权利要求2所述的一种制备深海鱼皮胶原蛋白方法，其特征在于步骤1)中所述的清洗干净的深海鱼皮是将新鲜或冰冻保存的深海鱼皮皮肤用1-10℃的自来水浸泡冲洗干净，再用去离子水浸泡冲洗3-5次。

4.如权利要求2所述的一种制备深海鱼皮胶原蛋白方法，其特征在于所述的深海鱼皮是选自大马哈鱼、比目鱼、马鲛鱼、鲑鱼、鳕鱼或鲨鱼的鱼皮。

5.如权利要求2所述一种制备深海鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于使用的稀碱溶液是Ca(OH)₂、Mg(OH)₂或Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的弱酸盐溶液。

6.如权利要求2所述制备深海鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于所述的2)步骤中缓冲液是醋酸-醋酸钠盐缓冲液。

7.按权利要求2所述一种制备深海鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于使用的蛋白酶是胃蛋白酶或胰蛋白酶。

8.按权利要求2所述一种制备深海鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于所述的步骤2)中过滤残渣再次限制性酶解处理，合并两次滤液。