CN1687132A - 胶原蛋白及由禽类皮肤制备胶原蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以禽类皮肤为原料制备的胶原蛋白，所制备的禽类皮胶原蛋白由α、β链组成，一种用于制备上述胶原蛋白的由禽类皮胶制备原蛋白的方法是：将清洗干净的禽类皮肤用碱溶液浸泡处理，再用去离子水清洗碱处理后的禽类皮肤，将上述处理后的禽类皮肤浸泡酸性缓冲液中，过滤，离心，收集上清，透析，直到透析液呈中性为止，本发明具有不仅不含有γ链，而且α链的含量高，β链的含量低，切除了具有免疫原性的胶原里的非螺旋端，生物相容性好，方法简便，纯度高，制备成本低，工序简便易行等优点。

Description

胶原蛋白及由禽类皮肤制备胶原蛋白的方法

                    技术领域

本发明涉及一种禽类组织工程用胶原蛋白和制备方法。利用禽类的皮肤作为原料，提取I型胶原蛋白。具体地说，本发明涉及利用碱溶液处理清洗的禽类皮肤，再利用酸溶的方法处理上述皮肤，净化酸溶的上清液即得到I型禽类皮肤胶原蛋白。

                    背景技术

胶原蛋白是一种结构蛋白，具有多种生物功能。胶原蛋白是组织的支持物和填充物，主动参与细胞的迁移、分化及增殖，并与创伤的修复及胚胎的发育有关。以胶原蛋白为原料制备的生物替代物在动物实验和临床实验获得较好的效果。

目前，国际上已出现一批以胶原蛋白为主要成分的生物制品，包括可溶性胶原、不溶性胶原以及由胶原和非胶原基质组成的复合物。这些材料可用于制备胶原溶液、胶原膏剂、胶原薄膜、胶原缝合线等，从而广泛用于创伤和烧伤的修复、整形美容、神经再生以及血瓣膜手术等。

目前临床上应用的胶原制剂的胶原蛋白主要是哺乳动物，如猪、牛皮肤的胶原蛋白。这类胶原蛋白的提取的前处理比较麻烦，为得到干净卫生的皮肤原材料，屠宰前后清洁皮肤所需的工作量大，需要的成本也就相应的提高。此外，在临床上使用牛皮胶原可能在个别病例中引起不同程度的免疫反应。特别是最近疯牛病的危险性被广泛认识，大大限制了胶原蛋白的来源。

近几年，胶原蛋白领域的研究在国内外已逐渐成为一个热点。目前，有很多研究都是着重在提取不同类型的胶原，并对其结构、功能、等特性进行探讨。禽类皮肤胶原蛋白，特别是鹌鹑皮胶原蛋白，由于鹌鹑生性怕热，胶原蛋白的变性温度相当低，不象牛皮胶原蛋白那样限制细胞的增殖。由于原料的不同，制备禽类皮肤胶原时的前处理也就不同于哺乳动物皮肤的前处理。禽类皮肤的前处理包括去毛、去脂、去色等，用有机溶剂去除禽类皮肤中非胶原蛋白的成分，还会有部分脂肪不能除去，且该处理禽类皮肤的方法成本高，污染环境。Shimizu et.al.(US 6,271,350)利用盐腌渍皮肤的方法，可以有效的去除禽类皮肤中的非胶原成分。该方法盐渍处理需一周，耗时长；用70-90℃的蒸馏水提取的胶原蛋白仅供工业和食品的需要。Holzer(US 5,484,888)利用1.6-12.5％的碱浸泡原料3-60天，再用pH5的弱酸溶液于45-55℃提取制备高强度白明胶用于食品填充物、摄影胶片和药物胶囊。Hadden(US 5,162,506)在制备作食品添加剂和营养氨基酸用的胶原纤维时，利用饱和的碱溶液去除原料中残留的可溶性非胶原蛋白和多糖。I型胶原蛋白的β、γ链的非螺旋区是胶原蛋白的抗原决定簇。若用作生物材料，受体个体产生免疫应答的可能性大大增加。此外，胶原蛋白的纯化程度不高也会限制所制备胶原蛋白的应用。

                    发明内容

本发明提供一种生物相容性好、纯度高且制备成本低的I型胶原蛋白及由禽类皮肤制备胶原蛋白的方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明所述的胶原蛋白，即：

一种以禽类皮肤为原料制备的胶原蛋白，所制备的禽类皮胶原蛋白由α、β链组成，α链的质量含量为70％-90％，β链的质量含量为10％-30％。

本发明所述的由禽类皮肤制备胶原蛋白的方法，即：

一种用于制备上述胶原蛋白的由禽类皮胶制备原蛋白的方法，依次按下列步骤进行：

①将清洗干净的禽类皮肤用0.5％-10％的碱溶液在0-16℃浸泡处理，禽类皮肤与稀碱溶液的重量体积比为1∶1-10，再用去离子水清洗碱处理后的禽类皮肤，直到pH6.5-7.5为止；

②将上述处理后的禽类皮肤在0-16℃条件下浸泡于0.1-2.0M pH1.0-6.8的酸性缓冲液中，1-4天后，过滤；

③将上述pH1.0-6.8的滤液于2,000-10,000rpm且于0-10℃下离心，收集上清，用pH1.0-6.8的酸性缓冲液透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止。

经透析的胶原蛋白液可以0-16℃保存，也可以干燥后于0-16℃保存。

上述清洗干净的禽类皮肤是将新鲜或冰冻保存的禽类皮肤用0-16℃的自来水浸泡冲洗干净，再用去离子水浸泡冲洗3-5次。所述的禽类皮肤可以是鹌鹑、鸽子、鸡、鸭等的皮肤。所述的Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等的弱酸盐，可以是磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明的禽类皮肤胶原蛋白与其它胶原蛋白(牛)相比，不仅不含有γ链，而且α链的含量高，β链的含量低，切除了具有免疫原性的胶原里的非螺旋端，生物相容性好。本发明的方法简便，只需浸泡和离心处理即可将胶原分子溶解提取出来，也可溶解含有醛胺类交联键的胶原纤维。经本发明制得的禽类皮肤I型胶原蛋白纯度高，制备成本低，工序简便易行。

                            附图说明

图1是本发明制备的鹌鹑皮胶原蛋白电泳图谱。

附图符号说明：1-标准蛋白质marker；2-酸溶胶原蛋白。

本发明制备的胶原蛋白电泳图谱如图1所示，说明本发明制备的胶原蛋白2不含有γ链，而且α链的含量高，β链的含量相对较低。

                          具体实施方式

通过下述实施实例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

                  实施例1：鹌鹑皮胶原蛋白制备

1.清洗鹌鹑皮。将冰冻保存的鹌鹑皮用100ml 4℃的自来水浸泡冲洗干净，剔除鹌鹑毛和皮下组织，直到浸泡液中除整块鹌鹑皮外没有其它绒毛物为止，再用去离子水浸泡冲洗5次。

2.碱处理鹌鹑皮。用0.1M NaOH溶液100ml于4℃浸泡(1)处理后的鹌鹑皮2-3天，每天更换一次0.1M NaOH溶液。再用去离子水充分清洗碱处理后的鹌鹑皮，直到pH7左右为止。

3.酸溶胶原蛋白。将(2)处理后的鹌鹑皮溶解于40ml 0.5M的醋酸-醋酸钠(1∶1/V∶V)缓冲液中，于4℃条件下连续提取3天，用纱布过滤。残渣再次酸溶提取，步骤同上，合并两次滤液。

4.净化胶原蛋白。将上述滤液于10,000rpm低温离心，收集上清，用醋酸盐缓冲液剃度透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止。

精制胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图谱如图1所示。

            实施例2：鹌鹑皮胶原蛋白制备

1.清洗鹌鹑皮。将冰冻保存的鹌鹑皮用100ml 1-10℃的自来水浸泡冲洗干净，剔除鹌鹑毛和皮下组织，直到浸泡液中除整块鹌鹑皮外没有其它绒毛物为止，再用去离子水浸泡冲洗5次。

2.碱处理鹌鹑皮。用3％ Ca(OH)₂溶液100ml于1-10℃浸泡(1)处理后的鹌鹑皮3-4天，早晚更换一次3％ Ca(OH)₂溶液。再用去离子水充分清洗碱处理后的鹌鹑皮，直到pH7左右为止。

3.酸溶胶原蛋白。将(2)处理后的鹌鹑皮溶解于40ml 0.5M的醋酸-醋酸钠(1∶1/V∶V)缓冲液中，于4℃条件下连续提取3天，用纱布过滤。残渣再次酸溶提取，步骤同上，合并两次滤液。

4.净化胶原蛋白。将上述滤液于10,000rpm低温离心，收集上清，用醋酸盐缓冲液剃度透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止。

                实施例3：盐渍鸡皮胶原蛋白制备

1.清洗鸡皮。将冰冻保存的鸡皮用200ml 5℃的自来水浸泡冲洗干净，剔除鸡毛和皮下组织，直到浸泡液中除整块鸡皮外没有其它绒毛物为止，再用去离子水浸泡冲洗5次。

2.碱处理鸡皮。用NaCl盐渍鸡皮(1∶1 w/w)7天，再用去离子水充分清洗碱处理后的鸡皮，直到pH7左右为止。

3.酸溶胶原蛋白。将(2)处理后的鸡皮溶解于100ml 0.5M的醋酸-醋酸钠(1∶1/V∶V)缓冲液中，于4℃条件下提取3-4天，用纱布过滤。残渣再次酸溶提取，步骤同上，合并两次滤液。

4.净化胶原蛋白。将上述滤液于10,000rpm低温离心，收集上清，用醋酸盐缓冲液剃度透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止。

                            实施例4

一种以禽类皮肤为原料制备的胶原蛋白，所制备的禽类皮胶原蛋白由α、β链组成，α链的质量含量为70％-90％，β链的质量含量为10％-30％。

                            实施例5

一种由禽类皮胶制备胶原蛋白的方法，依次按下列步骤进行：

①将清洗干净的禽类皮肤用0.5％-10％的碱溶液在0-16℃浸泡处理，禽类皮肤与稀碱溶液的重量体积比为1∶1-10，再用去离子水清洗碱处理后的禽类皮肤，直到pH6.5-7.5为止；

②将上述处理后的禽类皮肤在0-16℃条件下浸泡于0.1-2.0M pH1.0-6.8的酸性缓冲液中，1-4天后，过滤；

③将上述pH1.0-6.8的滤液于2,000-10,000rpm且于0-10℃下离心，收集上清，用pH1.0-6.8的酸性缓冲液透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止，

上述干净的禽类皮肤的清洗是将新鲜或冰冻保存的禽类皮肤用0-16℃的自来水浸泡并冲洗干净，再用去离子水浸泡冲洗3-5次；禽类皮肤可以是鹌鹑、鸽子、鸡或鸭的皮肤；用于浸泡禽类皮肤的碱溶液是Ca(OH)₂、NaOH、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的弱酸盐溶液中的一种，用于浸泡禽类皮胶的缓冲液是pH在1.0-6.8的醋酸-醋酸钠盐、磷酸盐、邻苯二甲酸钾-氢氧化钠、柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸或磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液中的一种，缓冲液可按现有方法加以配制，通过调整组分，使缓冲液的pH在1.0-6.8之间，在本实施例中，过滤残渣再次酸溶处理，并与前一次滤液合并。

Claims (7)

1.一种以禽类皮肤为原料制备的胶原蛋白，其特征在于所制备的禽类皮胶原蛋白由α、β链组成，α链的质量含量为70％-90％，β链的质量含量为10％-30％。

2.一种用于制备权利要求1所述胶原蛋白的由禽类皮胶制备原蛋白的方法，其特征在于依次按下列步骤进行：

①将清洗干净的禽类皮肤用0.5％-10％的碱溶液在0-16℃浸泡处理，禽类皮肤与稀碱溶液的重量体积比为1∶1-10，再用去离子水清洗碱处理后的禽类皮肤，直到pH6.5-7.5为止；

②将上述处理后的禽类皮肤在0-16℃条件下浸泡于0.1-2.0M pH1.0-6.8的酸性缓冲液中，1-4天后，过滤；

③将上述pH1.0-6.8的滤液于2,000-10,000rpm且于0-10℃下离心，收集上清，用pH1.0-6.8的酸性缓冲液透析，最后用纯水透析，直到透析液呈中性为止。

3.如权利要求2所述的由禽类皮胶制备原蛋白的方法，其特征在于干净的禽类皮肤的清洗是将新鲜或冰冻保存的禽类皮肤用0-16℃的自来水浸泡并冲洗干净，再用去离子水浸泡冲洗3-5次。

4.如权利要求2所述的由禽类皮胶制备原蛋白的方法，其特征在于所述的禽类皮肤是鹌鹑、鸽子、鸡或鸭的皮肤。

5.如权利要求2所述的由禽类皮胶制备原蛋白的方法，其特征在于使用的碱溶液是Ca(OH)₂、NaOH、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的弱酸盐溶液中的一种。

6.如权利要求2所述的由禽类皮胶制备原蛋白的方法，其特征在于用于溶解禽类皮胶的缓冲液是pH在1.0-6.8的醋酸-醋酸钠盐、磷酸盐、邻苯二甲酸钾-氢氧化钠、柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸或磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液中的一种。

7.按权利要求2所述的一种制备禽类皮肤胶原蛋白方法，其特征在于过滤残渣再次酸溶处理，并与前一次滤液合并。

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