CN109364298A - 一种脱细胞真皮基质材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脱细胞真皮基质材料的制备方法,其特点是将动物皮去肉去毛后取断层皮片，经脱脂、脱毛、病毒灭活、脱细胞、交联改性、清洗保湿、包装和辐照灭菌工艺得到的脱细胞真皮基质。本发明的特点：工艺时间短，清除抗原物质效果好，材料具有非常好的贴附性、保湿性和透气性等特点。

Description

一种脱细胞真皮基质材料的制备方法
技术领域
本发明涉及一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，属于生物医用材料制备领域。
背景技术
近二十年来，治疗皮肤缺损材料的研发进展很快，主要在于两个方向，一是个自体皮或异体捐献皮的处理，另一个是异种皮或器官的处理，包含了牛羊猪动物的皮、肌腱、内脏膜、肠粘膜等。在国内已有数家公司已经取得了相关的注册证并在实际临床使用，关于脱细胞真皮基质材料的制备，近年来也公开了相关发明专利，例如：
发明专利申请201710682043.6公开提供了一种脱细胞真皮基质的制备方法，其中包括以下步骤：灭毒断层皮片以脱脂剂脱脂后，经脱细胞液脱细胞，获得产生A；产物A以橄榄苦苷溶液交联后，依次经酒精漂洗、PBS溶液漂洗、干燥、辐照消毒，获得产物B；产物B以羧甲基壳聚糖溶液处理后，经水漂洗，获得产物C；产物C以戊二醛溶液浸泡后，经柔化、保湿处理、再以生理盐水漂洗、病毒灭活后，冻干制得脱细胞真皮基质。
发明专利申请20170323525.2公开了一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征包括以下步骤：(1)选用巴马香猪为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮机取下大张皮肤，无菌生理盐水清洗，皮鼓反取成0.25-0.5mm的断层皮片，采用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，备用；(2)将步骤(1)制得的断层皮片浸泡于0.5-1.0％(m/v)的邻苯基苯酚钠水溶液中，处理6-8min，无菌生理盐水清洗3-4次，然后加入1-2％(m/v)三羟基甲基甲胺基乙磺酸水溶液，超声震撼处理6-12h，每2h更换一次溶液，其中加入的三羟基甲基甲胺基乙磺酸与断层皮片的重量比为10：1,得到去表皮的真皮；(3)将步骤(2)得到的去表皮的真皮置于0.2—0.4％TritonX-100(v/v)溶液中，室温下振荡洗涤6-12h，用含4000U/L庆大霉素生理盐水溶液洗涤3次，加入脱细胞处理液，在37℃条件下作用12-24h，所述的脱细胞处理液与去表皮的真皮的重量比为10：1，用含4000U/L庆大霉素生理盐水溶液洗涤3次，再用无菌生理盐水洗涤3-4次，得到脱细胞真皮；(4)将步骤(3)得到的脱细胞真皮放入转鼓中，然后分次加入温度为35℃、pH为5.7的羧甲基壳聚糖溶液，反应30min后调节pH值到5.0，再反应75min，调节pH值到6.8,处理完毕后放净废液，再将处理后的材料用无菌生理盐水洗涤2次，每次15分钟，洗后控干水，得到脱细胞真皮基质；(5)将步骤(4)处理得到的脱细胞真皮基质浸泡于体积浓度为0.1—0.3％(v/v)的戊二醛溶液中交联15-30min,无菌生理盐水冲洗10-15min，然后置于柔化剂溶液中浸泡30-60min，清洗后再放入保湿剂溶液中，37℃保温处理30-60min，最后用无菌生理盐水充分冲洗去除残留；(6)将经步骤(5)处理得到的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机的冷冻室内冻干后，成型包装，再经γ射线辐照消毒灭菌，即为成品。
发明专利申请201710247775.2披露了一种医用脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：(1)将新鲜动物皮肤去肉后，依次进行消毒、清洗、高渗盐处理，撕去表皮，得待处理真皮皮片；(2)将步骤(1)制得的真皮皮片放入碱液和过氧化氢的混合溶液中浸泡3-24小时；(3)将步骤(2)处理后的真皮皮片进行裁切、剖层后浸泡在含有胰蛋白酶的溶液中，在35-40℃温度下，pH7-9，浸泡1-12小时；(4)将步骤(3)处理后的真皮皮片清洗后，冷冻存放，即完成。
上述的一些脱细胞真皮基质材料中，尚存在以下不足：
1.手工操作，劳动强度偏大；
2.脱脂、脱毛、病毒灭活、交联等工艺不全，产品可能带有脂肪和毛根；
3.物理强度低，因为戊二醛交联剂毒性高，用量不能高，处理时间也不能久，不能超过2小时，过高过久会造成材料变黄变脆，因而正常时候充当消毒杀菌的作用，处理时间约30min，而这个时间太短，根本不能达到实际的交联提升物理强度的效果，而物理强度低会造成材料易在拉伸过程撕裂，易在覆盖创面治疗过程中降解破碎，结痂后因碎解原因脱落不完全，厚度也不够均匀，使用后易腐烂异味；
4.冻干技术虽然能够便于产品保存，但因为交联处理容易给真皮皮片固定塑形，相比于湿态/半干，材料的柔软性和贴附性能均降低，需要控制交联剂用量减少冻干对材料柔软性、贴附性能的影响。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特点是采用健康动物皮为原料，巧妙使用物理、化学及生化方法，制备出良好生物相容性、贴附性、保湿性和透气性的脱细胞真皮基质材料。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种脱细胞真皮基质材料的制备方法,包含如下步骤，其中，所述原辅材料的用量％除特殊说明外，均表示为被处理的称重断层皮片的重量百分数，即原辅材料重量＝被处理的断层皮片的重量×百分数：
(1)选取健康的猪、牛或羊，经屠宰剥皮后，修剪边缘，并去除多余浮肉，清洗后，用剖皮机将动物皮肤剖制成厚度为0.3～1.0mm的断层皮片，并将断层皮片称重，然后对这些断层皮片在转鼓中依次进行以下工艺处理。作为优选，在液压去肉机上去除多余浮肉。作为优选，清洗时，使用大量水清洗。
(2)使用脱脂剂进行化学脱脂。作为优选，使用脱脂剂进行化学脱脂的具体工艺为：设置转鼓温度30～32℃，加入水150％，平平加1～3％，脱脂剂1～5％，匀速转动40～120min，控干废液；并使用水闷洗10～15min排尽废液2次，重复一次脱脂过程。作为优选，所述脱脂剂为十二烷基苯磺酸钠。
(3)碱处理脱毛，病毒灭活。作为优选，具体工艺为：加入水300％，Na2S 1～2％，NaOH 0.1～2％，匀速转动30～120min，控干废液，流水冲洗至废液pH值为8.0～9.0；设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，NH4Cl 1～3％，平平加0.5～1.5％，匀速转动30～60min，至废液pH值为6.5～7.5控干废液；使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干。
(4)使用生化胰酶进行脱细胞处理。作为优选，使用生化胰酶进行脱细胞的具体工艺为：设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，生化胰酶0.05～0.1％，平平加0.3～0.6％，匀速转动30～60min，控干废液；再使用纯化水100～300％闷洗10～30min 2～3次，控干。
(5)交联改性：设置转鼓温度35～40℃，加入pH＝10～11的缓冲液100％，交联剂GPE 1～20％，三乙醇胺1～2％，匀速转动10～120min；在交联液中加入甘氨酸0.1～1％，匀速转动20～60min，控干。本发明之所以使用GPE作为交联剂，具体原因是：交联采用化学方法，其特点：利于降低抗原性，改善物理机械性能，降低生物降解性。本发明创新性地采用GPE作为交联剂，GPE属于一种新型的含有环氧基的改性剂，相比于戊二醛交联剂讲，细胞毒性更低，具有更好的细胞亲和力，更有利于内皮细胞的生长；而其后添加的甘氨酸，又名氨基乙酸，是氨基酸系列中结构最为简单，人体非必需的一种氨基酸，用甘氨酸有以下优点：可与未反应的交联剂反应，开环并产生羟基，使得水溶性大大提高，在后续的清洗中易被洗除，从而可以有效减少了交联剂的残留。甘氨酸本身属于最基本的氨基酸，易溶于水，可温和调节材料的酸碱性，对人体也没危害。
(6)后处理：使用纯化水冲100～300％闷洗10～30min2～3次，控干；设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，NH4Cl 0.5～2％，平平加1～3％，匀速转动10～30min，至废液pH值为7.0～7.5控干废液；再使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干；设置转鼓温度32～36℃，加入纯化水100％，甘氨酸0.1～1％，匀速转动10～30min,控干废液，用纯化水100～300％闷洗10～30min 2～3次后重复添加甘氨酸1次。
(7)末道清洗，保湿，成型包装：设置转鼓温度35～40℃，使用注射用水100～300％闷洗2～15数次后流水冲洗10～60min，至取上清液滴加AgNO3滴定液数滴无明显白色沉淀为止，控干。加入保湿剂1～20％，匀速转动30～60min，控干，作为优选，保湿的工艺具体是：加入注射用水100％，甘油1～20％和/或乳酸钠1～20％，匀速转动30～60min，控干；分割规格后沥干水分或冷冻干燥，包装，制成脱细胞真皮基质材料，再经钴60所产生的γ射线辐照灭菌，即为成品。作为优选，所述步骤(1)中的动物皮为新鲜的、无重大疾病或传染病史的动物皮。
作为优选，所使用的转鼓为不锈钢恒温控速转鼓。
作为优选，所说的脱脂剂主要成分为十二烷基苯磺酸钠，交联剂GPE是指丙三醇缩水甘油醚(662)，保湿剂为：甘油和/或乳酸钠；
作为优选，所述步骤(5)中的pH＝10～11的缓冲液为：NaHCO3-NaOH缓冲液、磷酸盐缓冲液，或者使用氢氧化钠、纯碱调节得到。
采用此方法所制备的脱细胞真皮基质材料，能够满足以下医学应用的要求：
1.真皮的替代品，用于烧伤创面的修复，尤其是Ⅱ度烧伤创面有显著疗效，对Ⅲ度烧伤也有明显疗效。
2.牙肉组织修复，用于口腔破损或缺损修复后的覆盖。
3.溃疡皮肤的修复，合适的降解性可治疗糖尿病引起的皮肤溃疡。
4.眼科整形、面部软组织缺损的修复等。
与现有技术相比，本发明的优点是：
1.机械化程度高，批生产后能够快速彻底清除猪皮中的非胶原成分，如脂肪、毛根、细胞及细胞碎片和其它细胞外基质成分，并维持动物皮三维组织构造不变，末道清洗后无化学试剂残留，抗原性极低，细胞毒性低。
2.工艺中含有碱处理和辐照灭菌两道去病毒工序，降低动物含病毒的风险。
3.断层皮可以通过降低碱浓度，缩短反应时间，使材料在去除杂质的过程中尽最大限度保持完整，并保证材料柔软却有强度，空隙多却不散塌。
4.经交联剂GPE交联处理的材料物理性能好，比戊二醛的毒性低，亲水性能好，有良好的降解速率。
5.因为交联剂GPE交联处理，使得材料具有很好的稳定性，经灭菌后不易腐败生菌，可适宜干湿态两种包装存储。交联处理时间短的工艺可适合冷冻干燥，浸泡生理盐水后能够快速回软，贴附性与湿皮几乎相同。
附图说明
为了易于说明，本发明由下述的具体实施例及附图作以详细描述。
图1为本发明实施例1得到的敷料成品在×20倍光学显微镜下HE染色后的微结构图。
具体实施方式
下面通过实例对本发明进一步说明，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
一种脱细胞真皮基质材料的制备方法,包含如下步骤，其中，所述原辅材料的用量％除特殊说明外，均表示为被处理的称重断层皮片的重量百分数，即原辅材料重量＝被处理的断层皮片的重量×百分数：
(1)选取健康的猪经屠宰剥皮后，修剪边缘，并在液压去肉机上去除多余浮肉，大量水清洗后，用剖皮机将动物皮肤剖制成厚度为0.3～1.0mm的断层皮片，将断层皮片称重，然后对这些断层皮片在转鼓中依次进行以下工艺处理。
(2)化学脱脂。设置转鼓温度31℃，加入水150％，平平加2％，脱脂剂35％，匀速转动60min，控干废液。并使用水洗2次后，重复一次脱脂过程。
(3)碱处理，病毒灭活。加入水300％，Na2S 1％，NaOH 1％，匀速转动60min，控干废液，流水冲洗至废液pH值为8.0～9.0。设置转鼓温度31℃，加入纯化水100％，NH4Cl 2％，平平加1％，匀速转动60min，至废液pH值为6.5～7.5控干废液。使用300％纯化水冲洗2遍，控干。
(4)脱细胞。设置转鼓温度31℃，加入纯化水100％，生化胰酶0.05％，平平加0.5％，匀速转动60min，控干废液。使用300％纯化水冲洗2遍，控干。
(5)交联改性。设置转鼓温度37℃，加入pH＝10.5缓冲液100％，GPE 5％，三乙醇胺1％，匀速转动90min。在交联液中加入甘氨酸0.5％，匀速转动30min，控干。
(6)后处理。使用纯化水冲洗数次后控干。设置转鼓温度31℃，加入纯化水100％，NH4Cl 1％，平平加1％，匀速转动30min，至废液pH值为7.0～7.5后控干。再使用纯化水冲洗数次控干。设置转鼓温度35℃，加入纯化水100％，甘氨酸0.5％，匀速转动30min,控干，用300％纯化水冲洗2遍后重复甘氨酸处理1次。
(7)末道清洗，成型包装。设置转鼓温度37℃，使用300％注射用水清洗数次后流水冲洗，至取上清液滴加AgNO3滴定液数滴无明显白色沉淀为止控干。加入保湿剂，匀速转动60min，控干，分割规格后沥干水分或冷冻干燥，包装，制成脱细胞真皮基质材料，再经钴60所产生的γ射线辐照灭菌，即为成品。
图1为本实施例得到的敷料成品在×20倍光学显微镜下HE染色后的微结构图，由此可见，动物皮三维组织构造不变，结构完整，且不带有脂肪和毛根等杂质。
实施例2
一种脱细胞真皮基质材料的制备方法,包含如下步骤，其中，所述原辅材料的用量％除特殊说明外，均表示为被处理的称重断层皮片的重量百分数，即原辅材料重量＝被处理的断层皮片的重量×百分数：
(1)选取健康的羊，经屠宰剥皮后，修剪边缘，并在液压去肉机上去除多余浮肉，大量水清洗后，用剖皮机将动物皮肤剖制成厚度为0.3～1.0mm的断层皮片，将断层皮片称重，然后对这些断层皮片在转鼓中依次进行以下工艺处理。
(2)化学脱脂。设置转鼓温度30℃，加入水150％，平平加2％，脱脂剂5％，匀速转动120min，控干废液。并使用水洗2次后，重复一次脱脂过程。
(3)碱处理，病毒灭活。加入水300％，Na2S 1％，NaOH 0.5％，匀速转动90min，控干废液，流水冲洗至废液pH值为8.0～9.0。设置转鼓温度30℃，加入纯化水100％，NH4Cl 2％，平平加1.5％，匀速转动60min，至废液pH值为6.5～7.5控干废液。使用300％纯化水冲洗数次，控干。
(4)脱细胞。设置转鼓温度32℃，加入纯化水100％，生化胰酶0.05％，平平加0.6％，匀速转动60min，控干废液。使用300％纯化水冲洗数次，控干。
(5)交联改性。设置转鼓温度37℃，加入pH＝10.5缓冲液100％，GPE10％，三乙醇胺2％，匀速转动60min。在交联液中加入甘氨酸1％，匀速转动30min，控干。
(6)后处理。使用纯化水冲洗数次后控干。设置转鼓温度30℃，加入纯化水100％，NH4Cl 2％，平平加3％，匀速转动30min，至废液pH值为7.0～7.5后控干。再使用纯化水冲洗数次控干。设置转鼓温度35℃，加入纯化水100％，甘氨酸1％，匀速转动30min,控干，用300％纯化水冲洗后重复甘氨酸处理1次。
(7)末道清洗，成型包装。设置转鼓温度37℃，使用注射用水清洗数次后流水冲洗，控干。加入保湿剂，匀速转动60min，控干，分割规格后沥干水分，包装，制成脱细胞真皮基质材料，再经钴60所产生的γ射线辐照灭菌，即为成品。
本发明中所用的胰蛋白酶、甘氨酸为上海如吉生物科技发展有限公司生产销售，GPE为上海争锐化工有限公司生产销售，平平加为江阴市华新化工有限公司生产，其余化学试剂均为市售的分析纯制剂。

Claims (9)

1.一种脱细胞真皮基质材料的制备方法,包含如下步骤，其中各原辅材料的用量％除特殊说明外，均为被处理的称重断层皮片的重量百分数，即原辅材料重量＝被处理的断层皮片的重量×百分数：
(1)选取健康的猪、牛或羊：经屠宰剥皮后，修剪边缘，并去除多余浮肉，清洗后，用剖皮机将动物皮肤剖制成厚度为0.3～1.0mm的断层皮片，称重，然后对这些断层皮片在转鼓中依次进行以下工艺处理；
(2)使用脱脂剂进行化学脱脂；
(3)碱处理脱毛、病毒灭活；
(4)使用生化胰酶进行脱细胞处理；
(5)交联改性：设置转鼓温度35～40℃，加入pH＝10～11的缓冲液100％，交联剂GPE 1～20％，三乙醇胺1～2％，匀速转动10～120min；然后在交联液中加入甘氨酸0.1～1％，匀速转动20～60min，控干；
(6)后处理：使用纯化水冲100～300％闷洗10～30min2～3次，控干；设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，NH4Cl 0.5～2％，平平加1～3％，匀速转动10～30min，至废液pH值为7.0～7.5控干废液；再使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干；设置转鼓温度32～36℃，加入纯化水100％，甘氨酸0.1～1％，匀速转动10～30min,控干废液，用纯化水100～300％闷洗10～30min 2～3次后重复添加甘氨酸1次；
(7)末道清洗，保湿，成型包装：设置转鼓温度35～40℃，使用注射用水100～300％闷洗2～15数次后流水冲洗10～60min，至取上清液滴加AgNO3滴定液数滴无明显白色沉淀为止，控干；加入保湿剂1～20％，匀速转动30～60min，控干，分割规格后沥干水分或冷冻干燥，包装，制成脱细胞真皮基质材料，再经钴60所产生的γ射线辐照灭菌，即为成品。
2.根据权利要求1所述一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的动物皮为新鲜的、无重大疾病或传染病史的动物皮。
3.根据权利要求1所述猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特征在于，所使用的转鼓为不锈钢恒温控速转鼓。
4.根据权利要求1所述猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特征在于，所述脱脂剂主要成分为十二烷基苯磺酸钠。
5.根据权利要求1所述猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特征在于交联剂GPE是指丙三醇缩水甘油醚(662)。
6.根据权利要求1所述一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的化学脱脂具体工艺是：设置转鼓温度30～32℃，加入水150％，平平加1～3％，脱脂剂1～5％，匀速转动40～120min，控干废液；并使用水闷洗10～15min排尽废液2次，重复一次脱脂过程。
7.根据权利要求1所述猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，碱处理的工艺具体是：加入水300％，Na2S 1～2％，NaOH 0.1～2％，匀速转动30～120min，控干废液，流水冲洗至废液pH值为8.0～9.0；设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，NH4Cl 1～3％，平平加0.5～1.5％，匀速转动30～60min，至废液pH值为6.5～7.5控干废液；使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干。
8.根据权利要求1所述一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)使用生化胰酶进行脱细胞处理的工艺具体是：设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，生化胰酶0.05～0.1％，平平加0.3～0.6％，匀速转动30～60min，控干废液；再使用纯化水100～300％闷洗10～30min 2～3次，控干。
9.根据权利要求1所述一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中的pH＝10～11的缓冲液为：NaHCO3-NaOH缓冲液、磷酸盐缓冲液，或者使用氢氧化钠、纯碱调节得到。
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