CN105268022A - 一种异种无细胞真皮基质的制备方法 - Google Patents

一种异种无细胞真皮基质的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种异种无细胞真皮基质的制备方法，以新鲜盐腌猪皮为原料，采用物理、化学和生化相结合的方法，对猪皮进行脱脂、碱膨胀、消除碱膨胀、角蛋白酶处理、二次酶处理等一系列处理，制备得到一种性能优良、用途广泛的异种(猪)无细胞真皮基质。本方法采用角蛋白酶处理和二次酶处理，该方法具有环境污染少的优点并且通过该方法处理后的异种(猪)无细胞真皮基质具有胶原三维结构完整、透水汽性好、孔隙率高、材料的力学性能优良的优点，可广泛应用于烧伤及整形美容领域。

Description

一种异种无细胞真皮基质的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，更具体而言，涉及一种制备异种(猪)无细胞真皮基质的方法
背景技术
无细胞基质(acellulardermalmatrix，ADM)是利用物理、化学、生物等方法将皮肤中的表皮层及含抗原成分的细胞彻底去除仅保留真皮中含胶原网架的细胞外基质而得到的，具有创面覆盖、组织缺损填充、引导组织再生等作用。ADM由于完全没有了细胞成分，免疫活性低，故一般不会诱发免疫反应。但ADM保留有正常胶原的三维结构和真皮中含胶原支架的细胞外基质，这些成分可以支持断层皮片的生长，同时也有利于种子细胞的黏附增殖等，因此无细胞基质广泛应用于烧伤及整形美容领域。异种(猪)无细胞真皮基质相对同种异体皮具有来源广泛、价格低廉的优点，因此具有巨大的应用前景。
传统方法制备的猪无细胞真皮基质(porcineacellulardermalmatrix,PADM)存在细胞去除不彻底、渗透性差、孔隙率低、抗张强度低等缺点。专利号为CN1387923的中国专利公开了一种异种无细胞真皮支架及其制备方法，该支架系用胰蛋白酶和戊二醛处理乳猪皮而得，这种方法处理后的真皮支架具有抗张强度高、生物相容性好的优点，但其渗透性差，创面易产生积液、积气，血管化慢，且戊二醛对细胞有毒性，有潜在的危险。专利号为CN1343523的中国专利公开了一种可用作创面修复的微孔异体或异种无细胞真皮替代物，采用机械或激光的方法在无细胞真皮上规则地打上密集的贯穿性的孔，这虽然可以解决无细胞真皮替代物的渗透性差的缺点，但是孔径过大或过密，会增加抗原位点的暴露和抗原提呈细胞等接触ADM的机会，导致细胞相容性差，并且会一定程度上破坏胶原支架的结构。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种具有良好的透水汽性、抗张强度和高孔隙率的异种无细胞真皮基质的制备方法。其特点是以盐腌猪皮为原料，通过一系列物理、化学以及生物等方法，制备具有医学利用价值的组织工程支架材料。
一种异种无细胞真皮基质的制备方法为：
(1)称重：准确称重新鲜盐腌猪皮，作为以下各工序的计料依据；
(2)浸水：将称重过的盐腌猪皮，在与盐腌猪皮质量比为3.5～4.0：1、温度18～25℃、质量浓度为0.30～0.50％的NaCl溶液中浸泡60～90分钟，结束后将猪皮取出控水；
(3)脱脂：将处理后的材料浸入与其质量比为3.0～4.0:1、温度25～45℃、质量浓度为0.20～0.40％的SDS溶液，浸泡90～120分钟后，再将处理后的材料用与其质量比为4.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(4)碱膨胀：将材料放入与其质量比为3.0～4.0:1、温度18～30℃、NaOH质量浓度为0.50～0.80％并且SDS质量浓度为0.3～0.4％的混合溶液中，在GSD不锈钢控温比色转鼓中先转动30分钟，再每间隔50分钟转动一次，转动时间为10分钟，总时间为16小时，处理完毕后放净废液，再将处理后的材料用与其质量比为4.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(5)消除碱膨胀：在与材料质量比为2.0～3.0:1、温度25～30℃、质量浓度为0.3～0.6％的SDS的溶液中，逐滴加入质量浓度为3.00％的NH4Cl溶液，调节pH值为8.0～8.5，将上步处理好的的材料放入其中反应60～90分钟，并且每隔30分钟测一次pH值，再将处理后的材料用与材料质量比为3.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(6)角蛋白酶处理：将材料放入与其质量比为2.0:1、温度40℃、pH值在9.5-10.5之间的含质量浓度0.20～0.40％的角蛋白酶和质量浓度0.2～0.40％的SDS的混合溶液中反应1小时，反应完毕后放净废液，再将处理后的材料用与材料质量比为2.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(7)二次酶处理：在与材料质量比为2.0:1、温度40℃、含质量浓度0.30～0.40％胰酶和含质量浓度0.20～0.40％SDS的混合溶液中加入NH4Cl固体调节pH值，使其pH值范围在7.7-8.5之间，最佳pH值为8；将材料放入调节pH值后的混合溶液中反应30分钟，再在混合溶液加入占溶液质量浓度为0.30％的1398酶再反应2小时，反应完毕后放净废液，再将处理后的材料用与材料质量比为3.0：1的蒸馏水水洗3次，每次15分钟；
(8)PBS溶液清洗：在温度25℃下用与材料质量比为3.0：1的PBS溶液冲洗3次，每次30分钟。
(9)封装：材料装袋封口；
(10)消毒：将封装好的材料用钴-60100Gy剂量照射消毒，放入-4℃无菌环境保存。
其主要技术性能指标如下：
表格1无细胞真皮基质技术性能指标
本发明的方法所制得的异种(猪)无细胞真皮基质具有良好的生物相容性、优良的力学性能、高孔隙率、高透水汽性，可广泛应用于烧伤和整形美容领域。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1.环境污染小。常规脱毛方法是在碱性环境中，通过Na2S/NaHS来破坏双硫键，使角蛋白分解成小分子量的肽或氨基酸，从而达到将毛、毛跟屑和表皮去除的目的。但这种化学除毛工艺会对环境造成严重污染，利用角蛋白酶脱毛，可以彻底放弃硫化物的使用，根除脱毛液对环境的严重污染。
2.胶原三维结构完整。角蛋白酶在有效去除表皮、毛跟屑和脂腺的同时，不会分解胶原，能够保持胶原蛋白良好的三维结构。
3.材料的透水汽性、孔隙率高。实验表明随着角蛋白酶用量的增加，材料的透水汽性能不断增加，当角蛋白酶用量在0.00％-0.30％时，材料的透水汽性能缓慢增加，当用量在0.30％-0.40％时，材料的透水汽性能明显增大。当角蛋白酶用量大于0.30时，材料的透水汽速率大于3400g·m-2·24h-1。同时，实验表明，随着角蛋白酶用量的增加，材料的孔隙率不断增加，当角蛋白酶用量在0.00％-0.30％时，对材料的孔隙率影响最为明显，当用量在0.30％-0.40％时，材料的孔隙率增加缓慢，酶对材料的孔隙率影响趋缓。当角蛋白酶用量大于0.3％时，材料的透水汽速率大于73％。
4.材料的力学性能优良。传统方法会导致胶原纤维的网状结构受到破坏，导致材料机械强度大大降低，用0.30％角蛋白酶处理后的材料，在保证非胶原成分去除彻底的情况下，材料的拉伸强度大于10MPa。
附图说明
图1为本发明的生产工艺流程图。
图2为本发明方法制备的异种(猪)无细胞真皮基质。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述
实施例1：
(1)称重：准确称重盐腌猪皮，作为以下各工序的计料依据；
(2)浸水：将称重过的的盐腌猪皮，在与材料质量比为3.5：1，温度25℃的质量浓度为0.50％的NaCl溶液中浸泡60分钟，结束后将猪皮取出控水；
(3)脱脂：将处理后的盐腌猪皮浸入与材料质量比为3.0：1，40℃的质量浓度为0.40％的SDS溶液，浸泡90分钟后，再将处理后的材料用与材料质量比为4.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(4)碱膨胀:再将材料放入与材料质量比为3.0:1，温度28℃，含质量浓度0.80％的NaOH和质量浓度0.4％的SDS的混合溶液中，在转鼓中先转动30分钟，再每间隔50分钟转动一次，转动时间为10分钟，总时间为16h。处理完毕后放净废液，再将处理后的材料用与材料质量比为4.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(5)消除碱膨胀:在与材料质量比为2.5:1，温度30℃，质量浓度为0.6％SDS的溶液中，逐滴加入质量浓度为3.00％NH4Cl溶液，调节pH值为8.0～8.5，将上步处理好的的材料放入其中反应90分钟，并且每隔30分钟测一次pH值。放净废液，再将处理后的材料用与材料质量比为为3.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(6)角蛋白酶处理:将材料放入与材料质量比为2.0:1，温度40℃，pH值在9.5-10.5之间的含质量浓度0.30％的角蛋白酶和质量浓度0.40％的SDS的混合溶液中反应1小时。反应完毕后放净废液，再将处理后的材料用与材料质量比为2.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(7)二次酶处理：在与材料质量比为2.0:1、温度40℃、含质量浓度0.40％的胰酶和含质量浓度0.40％的SDS的混合溶液中加入NH4Cl固体调节pH值，使其pH值范围在7.7-8.5之间，最佳pH值为8。将材料放入混合酶溶液中反应30分钟，再在溶液加入与溶液质量浓度为0.30％的1398酶再反应2小时。反应完毕后放净废液，再将处理后的材料用与材料质量比为3.0:1的蒸馏水水洗3次，每次15分钟。
(8)PBS液清洗：在温度25℃下用与材料质量比为3.0：1的PBS溶液冲洗3次，每次30分钟；
(9)封装：材料装袋封口；
(10)消毒：将封装好的材料用钴-60100Gy剂量照射消毒，放入-4℃无菌环境保存。

Claims (9)

1.一种异种无细胞真皮基质的制备方法，其特征是，
(1)称重：准确称重新鲜盐腌猪皮，作为以下各工序的计料依据；
(2)浸水：将称重过的盐腌猪皮，在与材料质量比为3.5～4.0：1、温度18～25℃的NaCl溶液中浸泡60～90分钟，结束后将猪皮取出控水；
(3)脱脂：将处理后的盐腌猪皮浸入与材料质量比为3.0～4.0:1、温度25～45℃的SDS溶液，浸泡90～120分钟后，再将处理后的材料用与材料质量比为4.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(4)碱膨胀：将材料放入与材料质量比为3.0～4.0:1、温度18～30℃的NaOH和SDS的混合溶液中，在GSD不锈钢控温比色转鼓中先转动30分钟，再每间隔50分钟转动一次，转动时间为10分钟，总时间为16小时，处理完毕后放净废液，再将处理后的材料用与材料质量比为4.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(5)消除碱膨胀：在与材料质量比为2.0～3.0:1、温度25～30℃的SDS的溶液中，逐滴加入质量浓度为3.00％的NH4Cl溶液，调节pH值为8.0～8.5，将上步处理好的的材料放入其中反应60～90分钟，并且每隔30分钟测一次pH值，再将处理后的材料用与材料质量比为3.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(6)角蛋白酶处理：将材料放入与材料质量比为2.0:1、温度40℃、pH值在9.5-10.5之间的角蛋白酶和SDS的混合溶液中反应1小时，反应完毕后放净废液，再将处理后的材料用与材料质量比为2.0:1的蒸馏水水洗2次，每次15分钟；
(7)二次酶处理：在与材料质量比为2.0:1、温度40℃的胰酶和SDS的混合溶液中加入NH4Cl固体调节pH值，使其pH值范围在7.7-8.5之间，将材料放入混合溶液中反应30分钟，再在溶液加入1398酶再反应2小时，反应完毕后放净废液，再将处理后的材料用与材料质量比为3.0：1的蒸馏水水洗3次，每次15分钟；
(8)PBS溶液清洗：在温度25℃下用与材料质量比为3.0:1的蒸馏水冲洗3次，每次30分钟；
(9)封装：材料装袋封口；
(10)消毒：照射消毒，放入-4℃无菌环境保存。
2.根据权利要求1所述的一种异种无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，步骤(2)，所述NaCl溶液质量浓度在0.20～0.40％之间。
3.根据权利要求1所述的一种异种无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述SDS溶液的质量浓度在0.20～0.40％之间。
4.根据权利要求1所述的一种异种无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述NaOH与SDS混合溶液中NaOH质量浓度在0.50～0.80％之间，SDS溶液质量浓度在0.3～0.4％之间。
5.根据权利要求1所述的一种异种无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，SDS的溶液的质量浓度在0.3～0.6％之间。
6.根据权利要求1所述的一种异种无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所用角蛋白酶质量浓度在0.2～0.40％之间，所用SDS溶液浓度0.20～0.40％之间。
7.根据权利要求1所述的一种异种无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所用胰酶的质量浓度在0.30～0.40％之间，所用SDS溶液浓度0.20～0.40％之间，所用1398酶的质量浓度为0.30％。
8.根据权利要求1所述的一种异种无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，采用钴-60照射消毒，照射剂量为100Gy。
9.权利要求1-8所述的方法制得的异种无细胞真皮基质。
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