CN108066823A - 一种细胞软骨基质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种脱细胞软骨基质及其制备方法，属于关节软骨技术领域。包括如下步骤：(1)在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50‑300rpm/min的速度震荡24‑72h。(2)与离子表面活性剂在温度为37‑40℃、转速为50‑300rpm/min的条件下振荡3‑6h得到第二软骨。(3)、与胰酶以及核酸酶在温度为37‑40℃、转速为50‑300rpm/min的条件下振荡0.5‑2h。(4)、先在紫外线下照射1‑3h后，再浸入交联剂中反应2‑6h。此制备方法得到的脱细胞软骨基质无毒、生物相容性好、不破坏关节软骨本身的结构，具有与宿主骨质高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用。

Description

一种细胞软骨基质及其制备方法
技术领域
本发明涉及关节软骨技术领域，具体而言，涉及一种细胞软骨基质及其制备方法。
背景技术
关节在人体中的作用十分重要，主要是承载负荷、减轻震荡、减少关节间骨骼摩擦等，但因关节软骨结构中缺乏血管、神经及淋巴组织，且软骨细胞本身又是高度分化的组织细胞，自身修复能力极为有限。并且随着人类社会老龄化速度的加快，由各种外伤和退行性变引起的关节软骨损伤患者在骨科中正呈现逐渐增多的趋势。
目前临床常用外科手术移植对软骨损伤进行治疗和修复。作为软骨组织工程载体支架制备材料为人工合成材料，其亲水性不够，对细胞粘附性较弱，并且降解产物偏酸性，引起炎症反应，不利于细胞的生长且大多来源进口，价格昂贵，使其应用收到了一定的限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱细胞软骨基质的制备方法，此制备方法简单，得到的脱细胞软骨基质无毒、生物相容性好、不破坏关节软骨本身的结构，具有与宿主骨质高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用。
本发明的另一目的在于提供一种上述脱细胞软骨基质的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质，无毒、生物相容性好、不破坏关节软骨本身的结构，具有与宿主骨质高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用。
本发明是采用以下技术方案实现的：
一种脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)、对关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨。
(2)、第一软骨与离子表面活性剂在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡3-6h得到第二软骨。
(3)、第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡0.5-2h，得到脱细胞关节软骨支架。
(4)、将脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射1-3h后，再浸入交联剂中反应2-6h后，最后进行干燥得到。
进一步地，本发明较佳的实施例中，上述杀菌按照如下方式进行：将关节软骨放入3-6℃的无菌青链霉素中浸泡2-8h。
进一步地，本发明较佳的实施例中，上述低渗溶液选自质量浓度为0.5％-1％的TritonX-100和质量浓度为0.5％-1％的Tris-HCl中的至少一种。
进一步地，本发明较佳的实施例中，上述离子表面活性剂是质量浓度为0.5％-2％的SDS或APG。
进一步地，本发明较佳的实施例中，上述胰酶1-10u/ml的胰酶；核酸酶为50-100u/ml的DNA核酸酶和1-10u/ml的RNA核酸酶。
进一步地，本发明较佳的实施例中，上述步骤(4)中，紫外照射之前，将脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型。
进一步地，本发明较佳的实施例中，上述紫外线的波长为240-250nm，聚乙烯模具距离紫外线发光装置的距离为10-30cm。
进一步地，本发明较佳的实施例中，上述步骤(4)中，交联剂为：将碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种溶于乙醇中得到的混合溶液；乙醇与混合溶液的体积百分比为40％-95％。
进一步地，本发明较佳的实施例中，上述干燥的方式为冷冻干燥。
一种上述脱细胞软骨基质的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质。
本发明的较佳实施例提供的脱细胞软骨基质的制备方法的有益效果是：对关节软骨杀菌，避免其遭到污染，避免传染增殖，除去关节软骨上的软骨膜，得到的是软骨组织，软骨组织在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒，不仅使后续的各种处理更加充分，且使性质活泼的基团外露，增大了接触面积，以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨，释放出细胞内的核物质，脱去细胞，避免引起免疫排斥反应。第一软骨与离子表面活性剂在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡3-6h得到第二软骨，破坏第一软骨内的细胞膜和脂蛋白，去除油脂。第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡0.5-2h，得到脱细胞关节软骨支架，水解脂肪及核酸物质，去除软骨中的细胞成分，经过了脱细胞处理，在具备低抗原性的同时，仍保留了Ⅱ型胶原和糖胺多糖等细胞外基质成分。将脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射1-3h后，再浸入交联剂中反应2-6h后，进行物理交联和化学交联，紫外照射和无毒的交联剂对支架进行交联使其具有了一定的力学强度，使支架更为稳定。最后进行干燥，进一步降低了组织的免疫源性，具备了良好的安全性，无毒、无疾病传播的风险，同时保留了软骨天然结构，使其具有合适的孔径、孔隙率，有利于营养物质的进入及代谢废物的排出，且便于支架产品的长期保存和运输。
本发明提供的上述脱细胞软骨基质的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质，无毒、生物相容性好、不破坏关节软骨本身的结构，具有与宿主骨质高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的细胞软骨基质及其制备方法进行具体说明。
一种脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)、对关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨。
具体地，关节软骨为异种关节软骨，即为非人的关节软骨，如：猪、兔和犬等的关节软骨，使用的是天然关节软骨，易于获取，可以与患者的骨质保持高度的同源性，减小患者使用后的排异反应。
杀菌按照如下方式进行：将关节软骨放入3-6℃的无菌青链霉素中浸泡2-8h，避免其遭到污染，避免传染增殖。其中，青链霉素为100-500u/ml的青霉素和100-500u/ml的链霉素，青霉素和链霉素的体积比为1:0.5-1.5，其消毒杀菌的效果更好。
杀菌以后，需要对其进行超声PBS冲洗3-5遍，每遍30-90min。除去关节软骨表面残留的试剂，对其进行清洗。本发明中，PBS溶液是一种磷酸缓冲盐溶液，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。
除去关节软骨上的软骨膜，得到的是软骨组织，优选，使用无菌剪刀去除关节软骨上的软骨膜，软骨膜去除的较为干净，避免其遭到细菌污染，避免传染增殖。
在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒，使关节软骨细胞裂解，不仅使后续的各种处理更加充分，且使性质活泼的基团外露，增大了接触面积。以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨，释放出细胞内的核物质，脱去细胞，避免引起免疫排斥反应。震荡速度过快，粉碎效果不好，脱去细胞的效果不好，震荡速度过慢，关节软骨内的基团与低渗溶液的接触效果不好，细胞裂解的效果不好。震荡时间过长，造成资源的浪费，震荡时间过短，脱除细胞的效果不好。在此震荡速度、震荡时间的条件下进行，关节软骨的脱细胞效果更好，使得到脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。
优选地，低渗溶液选自质量浓度为0.5％-1％的TritonX-100和质量浓度为0.5％-1％的Tris-HCl中的至少一种。即，低渗溶液可以是质量浓度为0.5％-1％的TritonX-100或质量浓度为0.5％-1％的Tris-HCl或两者的混合物，都能够使关节软骨细胞裂解。低渗溶液的浓度过高，会破坏关节软骨的结构，过低，细胞去除效果不好，在此质量浓度的低渗溶液下进行，关节软骨的脱细胞效果更好，进一步提高脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。
本实施例中，低渗溶液每24h更换一次，在进行脱细胞反应的时候，关节软骨细胞的裂解效果更好，去除软骨组织中的细胞成分的效果更佳，使患者后续使用的时候，骨细胞粘附和增殖效果更好，成骨效果更佳。
需要对其进行超声PBS冲洗3-5遍，每遍30-90min。除去软骨颗粒表面残留的试剂，对其进行清洗。
(2)、第一软骨与离子表面活性剂在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡3-6h得到第二软骨，破坏第一软骨内的细胞膜和脂蛋白，去除油脂。震荡速度过快，会破坏关节软骨的结构，震荡速度过慢，细胞膜和脂蛋白的破坏效果不好，去除油脂的效果不好。震荡时间过长，造成资源的浪费，震荡时间过短，细胞膜和脂蛋白的破坏效果不好，去除油脂的效果不好。在此震荡速度、震荡时间的条件下进行，细胞膜和脂蛋白的破坏效果更好，进一步提高脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。
优选地，第一软骨与离子表面活性剂的体积比为1：1.8-2.2，离子表面活性剂是质量浓度为0.5％-2％的SDS或APG。离子表面活性剂的含量过多，质量浓度过高，造成试剂的浪费，且试剂会造成过饱和现象，含量过少，浓度过低，细胞膜和脂蛋白的破坏效果不好，去除油脂的效果不好，在此含量、此浓度的离子表面活性剂下进行，细胞膜和脂蛋白的破坏效果更好，进一步提高脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。
优选地，在进行振荡反应的时候，每一小时更换一次离子表面活性剂，使油脂的去除效果更好，细胞膜和脂蛋白的破除更加彻底。
更佳地，将第二软骨用纯水持续冲洗6-24h，流水持续清洗彻底，除去第二软骨表面残留的试剂，对其进行清洗。
(3)、第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡0.5-2h，得到脱细胞关节软骨支架，水解脂肪及核酸物质，去除软骨中的细胞成分，经过了脱细胞处理，在具备低抗原性的同时，仍保留了Ⅱ型胶原和糖胺多糖等细胞外基质成分。震荡速度过快，会破坏关节软骨的结构，，震荡速度过慢，水解脂肪及核酸物质的效果不好，脱细胞处理的效果不好。震荡时间过长，会消化过头，导致软骨结构遭到破坏，影响其机械强度。在此震荡速度、震荡时间的条件下进行，水解脂肪及核酸物质的效果更好，进一步提高脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。在37-40℃下进行反应，酶活性最大，水解脂肪及核酸物质，去除软骨中的细胞成分的效果更好。
优选地，第二软骨与胰酶以及核酸酶的体积比为1：1.8-2.2，即，第二软骨与胰酶以及核酸酶混合物的体积比为1：1.8-2.2。胰酶1-10u/ml的胰酶；核酸酶为50-100u/ml的DNA核酸酶和1-10u/ml的RNA核酸酶，水解脂肪及核酸物质的效果更好。胰酶以及核酸酶的含量过多，质量浓度过高，会破坏关节软骨的结构，含量过少，浓度过低，水解脂肪及核酸物质的效果不好，脱细胞处理的效果不好，在此含量、此浓度的胰酶以及核酸酶下进行，水解脂肪及核酸物质的效果更好，进一步提高脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。
更佳地，将脱细胞关节软骨支架用纯水持续冲洗6-24h，除去脱细胞关节软骨支架表面残留的试剂，对其进行清洗。
(4)、将脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射1-3h后，再浸入交联剂中反应2-6h后，进行物理交联和化学交联的联合作用，紫外照射和无毒的交联剂对支架进行交联使其具有了一定的力学强度，使支架更为稳定。照射时间过长，会破坏关节软骨的结构，过短，则不能起到很好的物理交联的作用。在交联剂中的反应时间过长，则生产速率过慢，反应时间过短，则化学交联的效果不好。在此条件下进行物理交联和化学交联，其联合作用更强，使得到的脱细胞关节软骨支架的力学强度更佳，支架更稳定。
进行干燥得到脱细胞软骨基质，进一步降低了组织的免疫源性，具备了良好的安全性，无毒、无疾病传播的风险，同时保留了软骨天然结构，使其具有合适的孔径、孔隙率，有利于营养物质的进入及代谢废物的排出，且便于支架产品的长期保存和运输。
优选地，在紫外线照射之前，将脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型，不仅能够对脱细胞软骨基质进行塑形，还利于细胞的粘附，增强了其使用价值和应用范围。
紫外线的波长为240-250nm，聚乙烯模具距离紫外线发光装置的距离为10-30cm，物理交联效果更好。距离越大，紫外光照射的强度越小，物理交联不够充分，不能够与化学交联起到协同的作用，距离越小，紫外光照射的强度过大，则会破坏脱细胞关节软骨支架本身的结构。此距离范围内，使细胞软骨基质的结构不会遭到破坏，且强度较高。
交联剂为：将碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种溶于乙醇中得到的混合溶液；乙醇与混合溶液的体积百分比为40％-95％。碳化二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为0-100mmol/L，即碳化二亚胺占混合溶液的浓度为0-100mmol/L；N-羟基琥珀酰亚胺占混合溶液的浓度为
0-100mmol/L，使化学交联的效果更好。交联剂的浓度过高，导致软骨基质与天然软骨结构在韧性上差异较大，过低，化学交联的效果不好，在此体积百分比的交联剂下进行，化学交联的效果更好，同时，与物理交联的协同效果也更好，使细胞软骨基质的结构不会遭到破坏，且强度较高。
优选地，干燥的方式为冷冻干燥，不会对脱细胞软骨基质造成损伤，避免其发生异变，其干燥效果更好。
上述脱细胞软骨基质的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质。在制备的时候使用无毒无害物质，得到的脱细胞软骨基质无毒，生物相容性好，患者在使用过程中不会发生排斥反应，关节软骨本身的结构没有被破坏，是三维网状结构的软骨组织工程的支架载体。利用天然骨质的有机成分或无机成分所特有的天然三维网状孔隙系统结构作为支架载体，与患者骨质具有高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用，具备了良好的安全性，无毒、无疾病传播的风险，同时保留了软骨天然结构，使其具有合适的孔径、孔隙率，有利于营养物质的进入及代谢废物的排出，且便于支架产品的长期保存和运输，增强了其使用的价值和应用范围，是一种理想的软骨组织工程的支架载体。
实施例1
一种脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)、对关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以200rpm/min的速度震荡40h得到第一软骨。
(2)、第一软骨与离子表面活性剂在温度为38℃、转速为250rpm/min的条件下振荡4h得到第二软骨。
(3)、第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为39℃、转速为100rpm/min的条件下振荡1h，得到脱细胞关节软骨支架。
(4)、将脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射2h后，再浸入碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中反应4h后，最后进行干燥得到脱细胞软骨基质。
实施例2
一种脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)、将猪关节软骨放入3℃的100u/ml的青霉素和100u/ml的链霉素(其中，青霉素和链霉素的体积比为1:0.5)中浸泡8h，超声PBS冲洗3遍，每遍30min；使用无菌剪刀除去关节软骨上的软骨膜，在质量浓度为0.5％的TritonX-100的低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50rpm/min的速度震荡24h，超声PBS冲洗3遍，每遍30min，得到第一软骨。
(2)、第一软骨与质量浓度为0.5％的SDS(第一软骨与SDS的体积比为1：1.8)在温度为37℃、转速为50rpm/min的条件下振荡3h，每震荡1h更换一次SDS，用纯水持续冲洗6h，得到第二软骨。
(3)、第二软骨与1u/ml的胰酶以及50u/ml的DNA核酸酶和1u/ml的RNA核酸酶(第二软骨与胰酶以及核酸酶混合物的体积比为1：1.8)在温度为37℃、转速为50rpm/min的条件下振荡0.5h，用纯水持续冲洗6h，得到脱细胞关节软骨支架。
(4)、将脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型，再在距离紫外线发光装置10cm、波长为240nm的紫外线下照射1h后，浸入浓度为100mmol/L的碳化二亚胺与乙醇的混合溶液(乙醇占混合溶液的体积百分比为40％)中反应2h，进行冷冻干燥得到脱细胞软骨基质。
实施例3
一种脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)、将兔关节软骨放入6℃的500u/ml的青霉素和500u/ml的链霉素(其中，青霉素和链霉素的体积比为1:1.5)中浸泡2h，超声PBS冲洗5遍，每遍90min；使用无菌剪刀除去关节软骨上的软骨膜，在质量浓度为1％的Tris-HCl中粉碎成软骨颗粒后以300rpm/min的速度震荡72h，每隔24h更换一次质量浓度为1％的Tris-HCl溶液，超声PBS冲洗5遍，每遍90min，得到第一软骨。
(2)、第一软骨与质量浓度为2％的APG(第一软骨与APG的体积比为1：2.2)在温度为40℃、转速为300rpm/min的条件下振荡6h，每震荡1h更换一次APG，用纯水持续冲洗24h，得到第二软骨。
(3)、第二软骨与10u/ml的胰酶以及100u/ml的DNA核酸酶和10u/ml的RNA核酸酶(第二软骨与胰酶以及核酸酶混合物的体积比为1：2.2)在温度为40℃、转速为300rpm/min的条件下振荡2h，用纯水持续冲洗24h，得到脱细胞关节软骨支架。
(4)、将脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型，再在距离紫外线发光装置30cm、波长为250nm的紫外线下照射3h后，浸入浓度为100mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺与乙醇的混合溶液(乙醇占混合溶液的体积百分比为95％)中反应6h，进行冷冻干燥得到脱细胞软骨基质。
实施例4
一种脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)、将犬关节软骨放入4℃的200u/ml的青霉素和200u/ml的链霉素(其中，青霉素和链霉素的体积比为1:1)中浸泡6h，超声PBS冲洗4遍，每遍60min；使用无菌剪刀除去关节软骨上的软骨膜，在质量浓度为0.8％的TritonX-100和质量浓度为0.8％的Tris-HCl的低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以200rpm/min的速度震荡48h，每隔24h更换一次低渗溶液，超声PBS冲洗4遍，每遍60min，得到第一软骨。
(2)、第一软骨与质量浓度为1％的SDS(第一软骨与SDS的体积比为1：1)在温度为38℃、转速为200rpm/min的条件下振荡4h，每震荡1h更换一次SDS，用纯水持续冲洗15h，得到第二软骨。
(3)、第二软骨与5u/ml的胰酶以及60u/ml的DNA核酸酶和5u/ml的RNA核酸酶(第二软骨与胰酶以及核酸酶混合物的体积比为1：2)在温度为39℃、转速为150rpm/min的条件下振荡1h，用纯水持续冲洗10h，得到脱细胞关节软骨支架。
(4)、将脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型，再在距离紫外线发光装置20cm、波长为245nm的紫外线下照射2h后，浸入50mmol/L的碳化二亚胺和50mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺与乙醇的混合溶液(乙醇与混合溶液的体积百分比为75％)中反应4h，进行冷冻干燥得到脱细胞软骨基质。
实验例1
将30个关节损坏的患者分成5组，每组6人，分别使用实施例1-4制备得到的脱细胞软骨基质作为支架载体形成的支架得到第一组、第二组、第三组和第四组和现有的支架得到第五组，观察患者的感染率，如表1：
表1患者的感染率
感染率(％)
第一组 0
第二组 0
第三组 0
第四组 0
第五组 50
从表1可以看出，使用本发明制备的脱细胞软骨基质作为支架载体得到的支架，患者使用以后，生物相容性好，患者在使用过程中不会发生排斥反应。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种脱细胞软骨基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、对关节软骨杀菌，除去所述关节软骨上的软骨膜，在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨；
(2)、所述第一软骨与离子表面活性剂在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡3-6h得到第二软骨；
(3)、所述第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡0.5-2h，得到脱细胞关节软骨支架；
(4)、将所述脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射1-3h后，再浸入交联剂中反应2-6h后，最后进行干燥得到。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述杀菌按照如下方式进行：将所述关节软骨放入3-6℃的无菌青链霉素中浸泡2-8h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述低渗溶液选自质量浓度为0.5％-1％的TritonX-100和质量浓度为0.5％-1％的Tris-HCl中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离子表面活性剂是质量浓度为0.5％-2％的SDS或APG。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胰酶1-10u/ml的胰酶；所述核酸酶为50-100u/ml的DNA核酸酶和1-10u/ml的RNA核酸酶。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，紫外照射之前，将所述脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述紫外线的波长为240-250nm，所述聚乙烯模具距离紫外线发光装置的距离为10-30cm。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，交联剂为：将碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的至少一种溶于乙醇中得到的混合溶液；所述乙醇与所述混合溶液的体积百分比为40％-95％。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述干燥的方式为冷冻干燥。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的脱细胞软骨基质的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质。
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