CN113398317B

CN113398317B - 一种止血材料及其制备方法

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Publication number: CN113398317B
Application number: CN202110588984.XA
Authority: CN
Inventors: 王芳芳; 梅劲; 张蕊; 高妞妞
Original assignee: Ningbo First Hospital
Current assignee: Ningbo First Hospital
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2041-05-28
Also published as: CN113398317A

Abstract

本发明公开了一种止血材料及其制备方法。将动物组织脱细胞处理后，冻干、粉碎、胃蛋白酶进一步消化，之后使用低浓度PBS处理，后处理得到止血材料。本发明一些实例的止血材料，具有良好的生物相容性和止血性能，制备工艺更为简单，成本低。本发明一些实例的制备方法，不需要进行交联处理，操作简便，成功率高，用时短。本发明一些实例的制备方法，可以方便地通过控制PBS的浓度调控止血材料的凝血时间。

Description

一种止血材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用材料，具体涉及一种止血材料及其制备方法。

背景技术

在创伤还是手术过程中，止血是都是非常关键的一步，及时有效的止血能够加速伤口的愈合，甚至保证生命安全。对于不同程度的出血，所采取的止血技术也会不一样，严重的出血可能需要夹闭或者直接阻塞血管，而对于更常见的轻度创伤，手术切割伤、术后并发症等所致的出血，使用外部止血材料会更加适用。

现有技术已经开发出多种止血材料，并且在不断被改进。目前止血材料中，主要分无机止血材料和天然止血材料，用于制备止血材料的无机成分主要是沸石、粘土、高岭土、介孔硅等，鉴于生物相容性和降解性差的问题，天然成分的止血材料更受欢迎，主要由壳聚糖、纤维素、明胶、淀粉、海藻酸钠等组成。大多数是将几种成分混合做成多孔止血海绵，或者将成分经过改性的方式，或加到上无纺布或者纱布上等方式，增强材料整体的凝血效果。

去细胞支架直接来源于机体组织，机体器官或组织取下来之后，经过洗涤剂等处理之后，去除细胞，剩余的支架又称去细胞支架，主要保留着细胞外基质的三维结构和活性蛋白成分，为细胞粘附、增殖、迁移提供了很好的微环境，因此，被研究者大量用于再生领域的研究，其最大的优势就是促再生性能和生物相容性，而在去细胞支架的基础上，通过一些化学或物理处理，强化或者支架材料的力学性能，保留其本身优秀的促再生能力，能扩大其应用场景。

Ventrua等人将猪皮切成小片，暴露于胰蛋白酶溶液中，用十二烷基硫酸钠、Triton X-100进行洗涤，脱细胞之后，样品用蒸馏水洗涤并冻干，研磨后保存在-20℃下备用，研磨后的ECM粉在胃蛋白酶缓冲液中溶解48h，得到均匀的溶液。均质溶液的pH用1MNaOH中和。匀浆中和后的ECM溶液用PBS稀释得到10% (HECM10)、15% (HECM15)和20%(HECM20)浓度(w/v)。ECM溶液置于5mm × 5mm的塑料模具中，并与EDC/NHS (50mmol:20mmol)溶液交联24小时。样品在冷冻干燥器中冷冻干燥48小时，得到多孔海绵，该海绵具有止血的潜力，能够吸附血小板，体内实验也证明其明显缩短了鼠尾和兔股动脉出血时间。这是唯一一篇将去细胞猪皮用作止血材料基材的研究。

现有的脱细胞基质止血材料，制备工艺普遍复杂，交联剂的加入在一定程度上增加了细胞毒性，且效果也有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种新型的止血材料及其制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种止血材料，其制备方法包括如下步骤：

S1) 取动物组织，进行脱细胞处理；

S2) 将脱细胞处理后的动物组织清洗干净，冻干后粉碎，得组织粉；

S3) 将组织粉加入溶液中，加入胃蛋白酶消化处理8～36 h；

S4) 消化处理完成后，中止酶解反应，得消化液；

S5) 在消化液中加入磷酸盐缓冲液，使消化液中磷酸盐缓冲液的浓度为0～0.003M，后处理得到止血材料。

在一些实例中，所述动物组织为富含胶原蛋白的动物组织。富含胶原蛋白的动物组织在处理后往往具有更好的机械性能，同时其来源也较为丰富同时易于处理，是更佳的选择。

在一些实例中，所述动物组织为皮肤、肌腱组织、肌肉、肝、肾、心脏等。不同动物组织的制备止血材料都具有止血效果。

在一些实例中，所述动物选自猪、兔、鱼等生物。动物可以根据具体的需要和获得的难易程度进行相应的选择。

在一些实例中，脱细胞处理的方法选自物理法、化学法、酶法及其结合。

在一些实例中，加入磷酸盐缓冲液前，调节消化液的pH为7～8，优选为7.2～7.4。这种pH更接近使用条件。

在一些实例中，组织粉在溶液的浓度为1～20mg/mL。

在一些实例中，磷酸盐缓冲液处理的时间为0～30 min。

在一些实例中，消化液中磷酸盐缓冲液的浓度为0.001～0.003 M。

在一些实例中，所述后处理包括清洗、干燥、成型。

在一些实例中，所述脱细胞处理的操作包括：将动物组织切块之后，PBS清洗3次，每次5min；然后转移至2% triton X-100溶液搅拌24h，每12h换一次新的液体；之后转移至用浓度0.1mol的NaCl溶液的配制0.1% SDS溶液，搅拌48h，每12h更换一次新的液体；最后用ddH₂O清洗24h，每8h换一次新的液体，得到脱细胞组织。

本发明的有益效果是：

本发明一些实例的止血材料，具有良好的生物相容性和止血性能，制备工艺更为简单，来源天然广泛，成本低。

本发明一些实例的制备方法，不需要进行交联剂的处理，操作简便，成功率高，用时短。

本发明一些实例的制备方法，可以方便地通过控制PBS的浓度调控止血材料的凝血时间。

附图说明

图1是止血材料的外观照片；

图2是将止血材料用于大鼠肝脏止血的效果；

图3是含不同PBS浓度的止血材料体外凝血时间测定结果；

图4是PBS对脱细胞溶液在成为止血海绵前成胶的影响。

具体实施方式

脱细胞组织和器官的制备包括从组织或器官中移除细胞和遗传物质，保留复杂的超微结构的细胞外基质(ECM)作为天然支架。目前在去细胞化中应用的技术有物理、化学和生物酶法，这些方法各有优缺点。在脱细胞过程中要满足的两个重要标准是:(i)保留原生结构和(ii)去除最大限度的细胞成分。脱细胞剂的选择取决于组织或器官的性质。本发明对脱细胞的方法没有特别的要求，可以使用现有的脱细胞方法进行，可用的脱细胞方法包括但不限于物理方法包括冻融、直接压力、电穿孔、超声和搅拌；化学方法主要是各种化学试剂，包括酸碱处理（醋酸、过氧乙酸等）、非离子去污剂（Triton X-100）、离子去污剂（SDS、SDC）、两性离子洗涤剂（CHAPS）、三(正丁基)磷酸(TBP)、低渗高渗处理（NaCl）、螯合剂（EDTA）等；生物酶法包括胰蛋白酶、核酸酶、胶原酶、分散酶、磷脂酶等。通常会选用几种方法相结合的方式，一般是物理化学相结合，也有物理、化学和酶三者结合。比如机械搅拌和超声波与化学处理同时被用来帮助细胞裂解和清除细胞碎片。机械搅拌可以通过使用磁力搅拌板，轨道振动筛，或低轮廓辊等应用。在所有这些程序中，最佳速度、试剂的体积和机械搅拌的时间取决于组织的组成、体积和密度。一般再去细胞之后还会使用抗生素避免细菌污染。然而，由于组织的来源，组成和密度等都不同，所以脱细胞方法需要根据不同组织类型进行优化。

脱细胞处理的方法优选搅拌法和化学法，浸泡和搅拌的时间，搅拌强度，洗涤剂浓度取决于组织的厚度和密度，薄的组织比如膀胱，小肠粘膜下层或者切薄的器官可以选择相对短的时间（24～48h）；而对于比较致密的组织（如皮肤、肌腱等）可以调整到（48～84h）。

蛋白酶的用量，可以根据组织粉的用量和预期的消化时间进行确定，以可以充分消化为准。为了避免残留蛋白酶带来不利影响，优选使用免疫原性较弱的蛋白酶，优选为胃蛋白酶。

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

以下实例中，如无特别说明，脱细胞处理的操作包括：

将动物组织切块之后，PBS清洗3次，每次5min；然后转移至2% triton X-100溶液搅拌24h，每12h换一次新的液体；之后转移至用浓度0.1mol的NaCl溶液的配制0.1% SDS溶液，搅拌48h，每12h更换一次新的液体；最后用ddH₂O清洗24h，每8h换一次新的液体，得到脱细胞组织。

止血材料示例性的制备方法包括：

S1）PBS处理完成后的脱细胞组织，清洗完成后3500rpm离心3min，倒入模具，37℃烘箱保温20min~1h预成型；

S2）取出预成型的凝胶，冷冻干燥24h，得到止血海绵材料。

实施例1：不同组织对止血材料的影响

1)分别采用猪皮、猪肝、猪肾、兔皮、鱼皮进行脱细胞处理并制备得到止血材料。

2)脱细胞处理后，清洗干净，冻干后粉碎，得组织粉；

3)将组织粉加入溶液中，加入胃蛋白酶消化处理8～36 h(鱼皮8h，兔皮12h，猪肝、肾12h，猪皮24h)；消化完成后，调节pH至7.2～7.4；

4)之后在消化液中加入磷酸盐缓冲液PBS，使消化液中磷酸盐缓冲液的浓度为0.001 M，处理时间为15min；

5)PBS处理后，清洗、干燥，成型，制备成为止血海绵材料。

止血材料的外观照片如图1所示。不同来源的组织经过处理都能制备成如图所示的白色海绵状材料，均有止血效果。

实施例2：不同脱细胞方法对止血材料的影响

分别使用搅拌法、化学法(同实施例1)和生物酶法对猪皮进行脱细胞处理，之后按相同的方法(同实施例1)制备得到片状止血材料。制备大鼠肝脏出血模型，将大鼠肝脏暴露，打孔器打入直径0.8cm，深度3mm的圆孔，放上止血材料，观察止血效果。

结果如图2所示(图中，A为肝脏出血模型，左图为对照组，为不加材料血液自己凝固，右图为止血材料用于肝脏止血；B左图为对照组和止血材料组的肝脏出血时间测定，止血材料明显缩短了肝脏的出血时间，B右图为对照组和止血材料组的肝脏出血量的测定，止血材料明显减少了肝脏的出血量)，结果显示，不同脱细胞方法对止血材料性能的影响并不显著。

实施例3：不同PBS浓度对材料凝血时间的影响

按实施例1的方法，分别使用不同浓度的PBS溶液处理猪皮脱细胞组织，测试其止血效果。体外凝血实验，即在1.5ml离心管中，加入300μl抗凝血，6mg材料，50μl 0.025mol的CaCl₂溶液，在37℃水浴条件下观察凝血时间。

实验结果如图3所示，图中，纵坐标为体外凝血时间，横坐标Control为不加任何材料的血液凝固的时间，其余为脱细胞材料中PBS的终浓度，不使用PBS处理的止血材料，凝血时间最短，PBS浓度为0.003 mol的止血材料，凝血时间稍有延长。说明PBS的浓度在0～0.003 mol这个范围之间时，均具有相对较好的止血效果。

实施例4：不同PBS浓度对止血材料成型的影响

按实施例1的方法，分别使用不同浓度的PBS溶液处理猪皮脱细胞组织，放置20min~1h，观察成型的效果。

实验结果如图4所示，图中a图为没有PBS的脱细胞猪皮消化液，b图为加入PBS放置20~1h的凝胶，PBS能让脱细胞猪皮的消化液形成凝胶，浓度越高，成胶越好，说明同时也可以通过控制PBS的浓度，方便制备止血凝胶，满足不同止血场景的需要。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种止血材料，其制备方法包括如下步骤：

S1）取动物组织，进行脱细胞处理；所述动物组织为皮肤、肌腱组织、肌肉、肝、肾或心脏；

S2）将脱细胞处理后的动物组织清洗干净，冻干后粉碎，得组织粉；

S3）将组织粉加入溶液中，加入胃蛋白酶消化处理8～36 h；

S4）消化处理完成后，中止酶解反应，得消化液；

S5）调节消化液的pH为7～8，在消化液中加入磷酸盐缓冲液，使消化液中磷酸盐缓冲液的浓度为0.001～0.003 M，磷酸盐缓冲液处理的时间为0～30 min且不为0，后处理得到止血材料，所述后处理包括清洗、干燥、成型。

2.根据权利要求1所述的止血材料，其特征在于：脱细胞处理的方法选自物理法、化学法、酶法及其结合。

3.根据权利要求1所述的止血材料，其特征在于：组织粉在溶液的浓度为1～20mg/mL。

4.根据权利要求1所述的止血材料，其特征在于：所述脱细胞处理的操作包括：

将动物组织切块之后，PBS清洗3次，每次5min；然后转移至2% triton X-100溶液搅拌24h，每12h换一次新的液体；之后转移至用浓度0.1mol的NaCl溶液的配制0.1%SDS溶液，搅拌48h，每12h更换一次新的液体；最后用ddH₂O清洗24h，每8h换一次新的液体，得到脱细胞组织。