CN108404211A - 一种肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织工程与再生医学技术领域，公开了肝组织诱导性水凝胶材料一种肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法及用途，一种肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法，包括步骤：B.大鼠肝脏ECM水凝胶的制备：将脱细胞肝脏组织冷冻干燥后做成粉末，然后按比例与盐酸‑胃蛋白酶溶液混合，调节pH值至生理状态，即得大鼠肝脏ECM水凝胶。本发明的肝组织诱导性水凝胶材料的用途，有望发展为一种用于治疗缺血性肝脏疾病的药物用途。

Description

一种肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法及用途
技术领域
本发明属于组织工程与再生医学技术领域，具体涉及肝组织诱导性水凝胶材料一种肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法及用途。
背景技术
各种终末期肝病包括急性肝衰竭、肝硬化和肝癌，病情凶险，死率高，严重危害着人们的身体健康。肝移植是目前治疗终末期肝病的唯一有效办法。然而，供体器官短缺、免疫抑制以及继发感染等问题限制了其在临床上的应用。近年来，随着再生医学的不断进步，干细胞移植技术在各种终末期肝病治疗方面也取得了令人鼓舞的进展，但据研究报道，其疗效尚欠佳，这是由于肝脏病变部位处于相对恶劣的微环境，如缺血性缺氧、炎症反应和氧化应激等，均会影响干细胞的黏附与存活。因此，亟待寻找新的策略来提高干细胞修复肝病的疗效。
近年来，可注射水凝胶作为一种新颖的工具可用于干细胞/药物递送，受到再生医学研究者的极大关注。可注射性水凝胶种类繁多，常见的有胶原、Matrigel、壳聚糖、纤维蛋白等。最近的研究表明，基于天然胞外ECM(Extracellular matrix，ECM)材料的组织工程研究有望为组织损伤的修复提供一种新策略。ECM脱细胞支架材料是指通过物理、化学和生物学方法将器官组织的细胞成分全部清除，从而完整地保留血管系统、超微结构以及主要细胞外ECM成分。因此，脱细胞ECM材料能够提供最天然的细胞外微环境，已成为组织再生领域有应用前景的支架材料。特别是ECM水凝胶材料，其不但包含天然胞外ECM中的生物活性分子，而且可通过微创注射的方法可将材料或者细胞递送到组织损伤部位，其微创、安全、可控性强等优点大大增强了脱细胞ECM材料在临床上的应用。迄今，国际上已将ECM水凝胶应用于心脏、软骨和皮肤的组织再生领域，研究表明其可调控内源性细胞的行为进而促进组织的修复与重建。然而，针对肝脏ECM水凝胶材料的研究相对较少，特别是目前尚无关于肝脏ECM水凝胶用于肝脏再生的报道。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供肝组织诱导性水凝胶材料一种肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法及用途。
本发明所采用的技术方案为：
肝组织诱导性水凝胶材料在制备促进肝脏修复的药物中的用途。
肝组织诱导性水凝胶材料在制备治疗缺血性肝脏疾病的药物中的用途。
进一步的，所述药物为注射剂。
进一步的，所述注射剂为含有大鼠脱细胞肝脏组织的盐酸-胃蛋白酶溶液。
进一步的，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有大鼠脱细胞肝脏组织8mg。
进一步的，所述含有大鼠脱细胞肝脏组织的盐酸-胃蛋白酶溶液的pH值为7.4。
一种肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法，包括步骤：
B.大鼠肝脏ECM水凝胶的制备：
将脱细胞肝脏组织冷冻干燥后做成粉末，然后按比例与盐酸-胃蛋白酶溶液混合，调节pH值至生理状态，即得大鼠肝脏ECM水凝胶。
进一步的，所述的肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法，还包括步骤：
A.肝脏的脱细胞化：
(1)将肝脏组织切成薄片，并用生理盐水漂洗，得到肝脏组织薄片；
(2)将所述肝脏组织薄片浸于含有TritonX-100溶液中搅拌，得到肝脏组织；
(3)将所述肝脏组织浸于十二烷基硫酸钠(SDS)的生理盐水溶液中搅拌至所述肝脏组织透明后，用生理盐水漂洗后得到脱细胞肝脏组织。
进一步的，所述步骤B中采用浓度为0.1mol/L氢氧化钠溶液和10x PBS调节pH值至7.4；所述脱细胞肝脏组织与盐酸-胃蛋白酶溶液的比例关系为：在调节pH值之前，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞肝脏组织的量为10mg；在调节pH值之后，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞肝脏组织的量为9mg。
进一步的，所述盐酸-胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的质量占所述盐酸-胃蛋白酶溶液总重的1％，所述盐酸-胃蛋白酶溶液中盐酸的浓度为0.1mol/L；所述Triton X-100溶液中Triton X-100的重量百分数为1％；所述含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液中十二烷基硫酸钠的重量占含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液总重的0.1％。
本发明的有益效果为：本发明的肝脏ECM水凝胶不但具有温敏性、低免疫原性及能提供最天然的细胞外微环境等优点，而且操作工艺简单、实施条件温和，为肝脏组织再生提供了一种新型水凝胶材料。该材料移植于缺血再灌注肝损伤部位后，肝细胞坏死和炎症细胞浸润显著减少，肝功能显著改善，因此有望发展为一种用于治疗缺血性肝脏疾病药物用途的产品，这对改进肝脏疾病的临床治疗具有重要意义。
附图说明
图1HE染色观察脱细胞化的肝脏组织。
图2免疫荧光染色观察细胞外I型胶原保留情况图像。
图3免疫荧光染色观察细胞外层粘连蛋白保留情况图像。
图4免疫荧光染色观察细胞外纤连蛋白保留情况图像。
图5本发明的大鼠肝脏ECM水凝胶在常温下的状态示意图。
图6本发明的大鼠肝脏ECM水凝胶在37℃下的状态示意图。
图7扫描电镜下观察本发明的大鼠肝脏ECM水凝胶图像。
具体实施方式
以下通过附图结合实施例来描述说明但不限制本发明。以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，应当说明的是，以下仅是本发明的优选实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些应当都属于本发明的保护范围。
0.1％十二烷基硫酸钠/生理盐水指的是十二烷基硫酸钠的重量占含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液总重的0.1％。
肝组织诱导性水凝胶材料在制备促进肝脏修复的药物中的用途。
肝组织诱导性水凝胶材料在制备治疗缺血性肝脏疾病的药物中的用途。
进一步的，所述药物为注射剂。
发明人通过将大鼠的肝脏组织制成大鼠肝脏ECM水凝胶，并将该物质通过注射的方式注入成功造模的实验用SD大鼠的肝脏位置，24小时后，取材观察其对肝脏损伤的修复情况表明，肝功能显著改善，肝细胞坏死和炎症细胞浸润显著减少，组织病理学评分也表明，ECM组与对照组相比评分明显降低。从而，证实本发明对于肝脏损伤和肝脏功能等病症具有较好的改善效果。
进一步的，所述注射剂为含有大鼠脱细胞肝脏组织的盐酸-胃蛋白酶溶液。
进一步的，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有大鼠脱细胞肝脏组织8mg。
进一步的，所述含有大鼠脱细胞肝脏组织的盐酸-胃蛋白酶溶液的pH值为7.4。
一种肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法，包括步骤：
B.大鼠肝脏ECM水凝胶的制备：
将脱细胞肝脏组织冷冻干燥后做成粉末，然后按比例与盐酸-胃蛋白酶溶液混合，调节pH值至生理状态，即得大鼠肝脏ECM水凝胶。
进一步的，所述的肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法，还包括步骤：
A.肝脏的脱细胞化：
(1)将肝脏组织切成薄片，并用生理盐水漂洗，得到肝脏组织薄片；
(2)将所述肝脏组织薄片浸于含有TritonX-100溶液中搅拌，得到肝脏组织；
(3)将所述肝脏组织浸于十二烷基硫酸钠(SDS)的生理盐水溶液中搅拌至所述肝脏组织透明后，用生理盐水漂洗后得到脱细胞肝脏组织。
进一步的，所述步骤B中采用浓度为0.1mol/L氢氧化钠溶液和10x PBS调节pH值至7.4；所述脱细胞肝脏组织与盐酸-胃蛋白酶溶液的比例关系为：在调节pH值之前，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞肝脏组织的量为10mg；在调节pH值之后，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞肝脏组织的量为9mg。
进一步的，所述盐酸-胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的质量占所述盐酸-胃蛋白酶溶液总重的1％，所述盐酸-胃蛋白酶溶液中盐酸的浓度为0.1mol/L；所述Triton X-100溶液中Triton X-100的重量百分数为1％；所述含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液中十二烷基硫酸钠的重量占含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液总重的0.1％。
实施例1大鼠肝脏ECM水凝胶的制备
具体步骤如下:
(1)大鼠肝脏的脱细胞化:首先将大鼠肝脏组织切为约2毫米厚的薄片并用生理盐水漂洗，然后将其浸没于1％Triton X-100溶液中，室温搅拌12小时；最后将其转移于0.5％十二烷基硫酸钠/生理盐水，室温搅拌直至组织透明，约需30分钟，并用生理盐水漂洗3-5次，每次15分钟，去除残余的洗涤剂。
(2)大鼠肝脏ECM水凝胶的制备:将低温冻干的脱细胞肝脏组织，用粉碎机磨成粉末，然后按照10mg/mL比例加入盐酸-胃蛋白酶溶液中，室温缓慢搅拌至溶解状态，通过加入0.1M氢氧化钠和10x PBS调至生理状态(pH＝7.4)，使水凝胶终浓度为8mg/mL，置于37℃下数分钟即可成胶。
大鼠肝脏ECM水凝胶体内移植治疗：使用时，将上述制备的8mg/mL水凝胶悬液注射到缺血再灌注大鼠肝脏组织内，观察其对肝脏损伤的修复情况。
实施例2大鼠肝脏ECM水凝胶在制备促进缺血再灌注大鼠肝脏的药物中的用途
A、大鼠肝脏ECM水凝胶的制备和鉴定
(1)大鼠肝脏ECM水凝胶制备：取大鼠新鲜肝脏，剪去表面的脂肪组织和外膜，将大鼠肝脏组织切为约2毫米厚的薄片并用生理盐水漂洗数次除去血细胞，然后将其浸没于1％Triton X-100溶液中，室温搅拌12小时；最后将其转移于0.5％十二烷基硫酸钠/生理盐水，室温搅拌直至组织透明，约需30分钟，并用生理盐水漂洗3-5次，每次15分钟，去除残余的洗涤剂。脱细胞化的肝脏储存于-80℃。
(2)大鼠肝脏脱细胞鉴定：将脱细胞化的大鼠肝脏组织直接用组织包埋剂OCT(Tissue OCT-Freeze Medium)包埋，做冰冻切片后，一方面用苏木素和伊红染色观察细胞残留情况，可见没有细胞核残留(图1)；另一方面用免疫荧光染色观察胞外ECM成分保留情况。根据图2-图4所示，所制备的大鼠肝脏脱细胞ECM保留了I型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白等主要细胞外ECM成分。
(3)将脱细胞的大鼠肝脏组织置于低温冻干机上进行干燥，用粉碎机将其磨成粉末，并在使用前通过暴露于环氧乙烷中16小时进行灭菌。
(4)按照10mg/mL浓度(每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞肝脏组织的量为10mg)将上述肝脏脱细胞粉末溶解于盐酸-胃蛋白酶溶液中，室温缓慢搅拌至溶解状态，超速离心除去未消化的大颗粒物，取上清液低温储存待用。
(5)通过加入0.1M氢氧化钠和10x PBS调至生理状态(pH＝7.4)，使水凝胶终浓度为8mg/mL，置于37℃数分钟即可成胶，常温下表现为液态(图5)，当置于37℃数分钟即可成胶，如图6所示，即为所制备的大鼠肝脏ECM水凝胶。如图7所示，扫描电镜检测显示大鼠肝脏ECM水凝胶呈现为多孔状结构，不同粗细大鼠肝脏ECM水凝胶纤维呈网状分布。
B、动物的选择和缺血再灌注肝损伤模型制备
本发明选择SD大鼠作为实验对象，实验用SD大鼠(250-300g左右)，用戊巴比妥钠进行腹腔麻醉后，行开腹术，充分暴露肝脏，充分显露第一肝门部，以无创小血管夹阻断肝尾状叶、中叶及左叶血流，造成70％肝脏缺血，保留右肝叶门静脉血流，以防门静脉和胃肠道淤血。30min后撤除血管夹，恢复入肝血流，逐层关腹。
C、大鼠肝脏ECM水凝胶修复肝脏功能
(1)大鼠肝脏ECM水凝胶移植SD大鼠肝脏:将SD大鼠分组进行实验，将SD大鼠分成Sham组、Saline组和ECM组即假手术组、生理盐水组和ECM水凝胶注射组，分别观察各个组内SD大鼠的肝脏修复情况。
通过肝脏内多点注射于成功造模的SD大鼠，24后取材观察其对肝脏损伤的修复情况，ECM组与生理盐水组相比，肝细胞坏死和炎症细胞浸润显著减少，肝脏组织病理学评分表如下表1所示，组织病理学评分也表明，ECM组与生理盐水相比评分明显降低。这表面本发明的大鼠肝脏ECM水凝胶对肝脏损伤具有较好的修复能力。
表1肝脏组织病理学评分表
(2)大鼠肝脏ECM水凝胶可改善肝脏功能：ECM组肝脏功能AST、ALT浓度对比表，如表2所示。肝脏ECM水凝胶移植后，可见肝脏谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的表达水平，结果显示与生理盐水组比较，ECM组AST和ALT水平显著降低，这表明本发明的大鼠肝脏ECM水凝胶降低了肝脏的损伤程度，改善了肝脏功能。从而，本发明的大鼠肝脏ECM水凝胶能够促进肝脏的修复。
表2 ECM组肝脏功能AST、ALT浓度对比表(U/L，n＝6)
综上，本发明的大鼠肝脏ECM水凝胶能够应用在制备促进肝脏内源性修复的药物中。具体地，本发明的肝脏ECM水凝胶能够应用于治疗缺血性肝脏疾病的药物中。较佳地，所述肝脏疾病为急性缺血再灌注肝损伤。所述液态水凝胶为大鼠肝脏来源的脱细胞化细胞外ECM，其中所述水凝胶具有温敏性，可通过注射的方式输送到肝脏受损部位，在体温即可转变为水凝胶形式，其可为受损的肝细胞提供接近天然的肝脏组织微环境，肝细胞坏死和炎症细胞浸润显著减少，肝功能显著改善，因此有望发展为一种用于治疗缺血性肝脏疾病药物用途的产品，这对改进肝脏疾病的临床治疗具有重要意义。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (10)

1.肝组织诱导性水凝胶材料在制备促进肝脏修复的药物中的用途。
2.肝组织诱导性水凝胶材料在制备治疗缺血性肝脏疾病的药物中的用途。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物为注射剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述注射剂为含有大鼠脱细胞肝脏组织的盐酸-胃蛋白酶溶液。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有大鼠脱细胞肝脏组织8mg。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述含有大鼠脱细胞肝脏组织的盐酸-胃蛋白酶溶液的pH值为7.4。
7.一种肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括步骤：
B.大鼠肝脏ECM水凝胶的制备：
将脱细胞肝脏组织冷冻干燥后做成粉末，然后按比例与盐酸-胃蛋白酶溶液混合，调节pH值至生理状态，即得大鼠肝脏ECM水凝胶。
8.根据权利要求7所述的肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法，其特征在于，还包括步骤：
A.肝脏的脱细胞化：
(1)将肝脏组织切成薄片，并用生理盐水漂洗，得到肝脏组织薄片；
(2)将所述肝脏组织薄片浸于含有TritonX-100溶液中搅拌，得到肝脏组织；
(3)将所述肝脏组织浸于十二烷基硫酸钠(SDS)的生理盐水溶液中搅拌至所述肝脏组织透明后，用生理盐水漂洗后得到脱细胞肝脏组织。
9.根据权利要求7或8所述的肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述步骤B中采用浓度为0.1mol/L氢氧化钠溶液和10x PBS调节pH值至7.4；所述脱细胞肝脏组织与盐酸-胃蛋白酶溶液的比例关系为：在调节pH值之前，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞肝脏组织的量为10mg；在调节pH值之后，每毫升盐酸-胃蛋白酶溶液中含有脱细胞肝脏组织的量为9mg。
10.根据权利要求8所述的肝组织诱导性水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述盐酸-胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶的质量占所述盐酸-胃蛋白酶溶液总重的1％，所述盐酸-胃蛋白酶溶液中盐酸的浓度为0.1mol/L；所述Triton X-100溶液中Triton X-100的重量百分数为1％；所述含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液中十二烷基硫酸钠的重量占含有十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液总重的0.1％。
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