CN102228695A - 一种碱性成纤维细胞生长因子缓释载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碱性成纤维细胞生长因子缓释制剂的制备方法。碱性成纤维细胞生长因子缓释制剂的制备方法为：1.制备包封0.00001%-0.001%bFGF的bFGF-PLGA缓释微球；2.将I型胶原蛋白溶解于乙酸溶液中，制备成胶原蛋白溶液；3.将bFGF-PLGA缓释微球和胶原蛋白溶液混合并搅拌，冷冻干燥，进行固化后再次冷冻干燥制备成bFGF-PLGA胶原蛋白缓释载体；4.经过体外释放实验和促Balb/c3T3细胞增殖实验，实验结果表明该缓释载体具有良好的生物相容性，能够缓慢控制bFGF的释放，有效地促进Balb/c3T3细胞生长，是理想bFGF的缓释载体。
Description
技术领域
本发明涉及运用I型胶原蛋白和乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）微球构建碱性成纤维细胞生长因子的缓释载体的制备方法。
背景技术
1.碱性成纤维细胞生长因子是一种能广泛地促进来源于中胚层及神经外胚层细胞增殖的生物活性物质,如上皮细胞、神经细胞、血管内皮细胞等。外源性的bFGF还可以促进内源性bFGF和其他生长因子的释放，上调生长因子的活性和生长因子受体的表达，发挥生物学作用。近年来，在临床药用及化妆品的应用上都相当广泛，在烧伤、创伤、神经损伤及血管损伤的修复等领域显示出巨大的应用潜力。但碱性成纤维细胞存在体内半衰期短，局部用药浓度低，对热酸敏感，易被酶水解，对一些深度创伤修复和慢性疾病的治疗应用上非常不理想。针对这些问题，国内外有很多有关bFGF的缓释载体方面的研究，这也将是临床应用成功的第一步。
2.常用的GFs(Growth Factors)缓释载体材料有两种，人工合成材料和天然材料，而人工的又分为可降解的和不可降解的合成材料。目前研究最多的人工合成支架材料包括聚羟基乙酸（PGA），聚乳酸（PLA）、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物（PLGA），聚乙内酯（PCL）和聚丙交酯等。其中聚羟基乙酸（PGA），聚乳酸（PLA）、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物（PLGA）是最早FDA认证的同意应用于人体的合成可降解的生物高分子材料。PLGA共聚物是由聚羟基乙酸（PGA），聚乳酸（PLA）各50%的比例混合，结合了这两者的优点，能够完全降解，但强度较高，降解时间延长，可精确调节降解时间，但是存在生物相容性差的缺点。天然材料包括胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸等，其生物相容性好，无抗原性，能促进细胞黏附和增殖，且可根据需要制成不同的形状。而天然材料中，胶原蛋白是脊柱动物含量最多，分布最广的蛋白质，体内具有广泛的生物学活性；体外应用具有低免疫原性，良好的生物相容性、可降解性、可参与组织修复重建等优越性，并且其来源丰富，是最重要的天然可降解的生物医用材料。胶原蛋白在生长因子截获，储存、运输等方面有很重要的作用，可以作为生长因子的载体。很多研究报导利用胶原蛋白作为支架，接种碱性成纤维细胞，构建人工皮肤。在众多的胶原蛋白中，I型胶原蛋白属于序列保守性的蛋白质，是被人们了解得最为清楚的，也是组织分布最为广泛的胶原蛋白，在哺乳动物不同种属之间氨基酸种类、数目和排列顺序上基本相同，抗原性很低，因此应用比较广泛。
3.近年来，国内外很多学者也致力于GFs(Growth Factors)缓释载体的研究，但有效的bFGF缓释系统中，理想的缓释载体是应用的关键。中国专利02133476.5公开的bFGF-PLGA缓释载体只能应用在关节间隙，骨折或静脉给药，在大创伤口愈合应用方面存在不足，应用范围比较窄，并且由于是人工合成的高分子材料，具有疏水性，因此在使用过程，存在组织生物相容性差的缺点。中国专利200710010844.4公开的bFGF-胶原海绵载体，胶原海绵吸水性好，具有高的生物相容性，但是单独做为bFGF的载体，胶原海绵的微纤维与bFGF只有较低的亲和力，以物理吸附方式负载bFGF，因其具有多孔性，一旦接触体液或者是水，导致海绵溶胀及降解过快，不利于bFGF的活性保持，且不能有效地缓慢释放bFGF。
发明内容
本发明的目的之一是针对上述问题，提出一种新型bFGF缓释载体，达到既能很好的保持bFGF生物活性，并且在应用上有较长时间缓释的效果，该缓释载体又能与人体有很好的生物相容性。
本发明的目的之二是提出上述新型bFGF缓释载体的制备方法。
本发明的技术方案为：
1. 0.00001%-0.001% bFGF溶液作为内水相，20%～70%PLGA二氯甲烷溶液作为油相，两者经过复乳法得到bFGF-PLGA溶液，除去有机溶剂离心沉淀后经过冷冻干燥得到bFGF-PLGA微球。
2.I型胶原蛋白加入0.1%～0.3%乙酸溶液中，搅拌均匀，制备成胶原蛋白溶液。
3.将第1步制备的微球加入到第2步胶原蛋白溶液中，搅拌均匀，-70℃进行预冻8h～30h,然后进行冷冻干燥，使用60%～90%的乙醇进行固化20min～40min后再次进行冷冻干燥即得包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体。
4.体外释放实验：取一部分包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体，浸在释放溶液（PH=7.4的PBS缓冲溶液）中，每隔一段时间取上清液，并补充一定的释放溶液。使用ELISA法测定bFGF的含量，绘制成体外释放曲线。由结果可得出单独使用胶原海绵bFGF释放比较快，PLGA微球与包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体比较相差不大，两者都呈现了缓慢释放的效果。
5. bFGF-PLGA微球的胶原海绵细胞培养实验：将包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵溶液加入到96孔板中，经过同样冷冻干燥处理后即得96孔板包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体。将Balb/c3T3细胞悬液分别接种到包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体96孔板中，每隔24h取3～5个孔加入MTT显色，加入DMSO溶解，然后在490nm下进行检测，根据OD值间接反映包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体对促进细胞生长的影响。由结果可得出包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体相较于单纯的胶原海绵对细胞有更好促进Balb/c3T3细胞生长的作用。
附图说明
图1 bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体体外释放曲线图。
图2 bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体对Balb/c3T3细胞增殖作用曲线图。
与现有的技术相比，本发明的有益效果是：解决了使用人工合成可降解高分子材料作为bFGF缓释载体存在生物相容性差和使用天然可降解材料作为bFGF缓释载体具有多孔性，易吸水溶胀导致负载，不利于bFGF的活性保存和缓释调控这两个方面的两个难题。单纯的胶原海绵因为具有高亲水性，bFGF与水接触后，活性保存会受到影响，与PLGA微球结合后，可利用高分子材料的疏水性防止bFGF与水接触，保证bFGF在水环境中的活性。本发明的包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体应用范围比单纯的PLGA微球载体要广泛，因为胶原海绵具有迅速止血的功效，并且可以作为细胞生长的支架材料，可应用于大创伤的治疗和皮肤损伤修复等方面。
用作缓释载体的材料需要具备几个基本的条件：1.无毒，安全性好，具备优良的生物相容性和生物可降解性；2.具有良好的可加工性，能在温和的条件下加工成各种形状的载体；3.能够固定生长因子，有效保持生长因子活性和缓慢控制释放。由此可知，本发明的包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体均符合这几个基本条件，是理想的细胞生长因子载体。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1:
1.将100mg的PLGA（PLA:PLG=50：50）溶于二氯甲烷中为油相，将70ug的bFGF样品溶于双蒸水中为水相，然后将bFGF溶液加入油相中，均化后形成初乳。加入1%的PVA溶液40ml，通过高速乳均机作用（20000rpm,2min），形成W/O/W，通过旋转蒸发仪减压旋转除去有机溶剂，离心沉淀微球后冷冻干燥即得包封了bFGF的PLGA微球。
2. I型胶原蛋白加入0.15%乙酸溶液中，搅拌均匀，制备成胶原蛋白溶液。
3. 将第1步制备的微球加入到第2步胶原蛋白溶液中，搅拌均匀，加入到模具中（或者是96孔板上），-70℃进行预冻24h,然后进行常规冷冻干燥，使用80%的乙醇进行固化25min后再次进行常规冷冻干燥即得包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体。
实施例2:
1.将140mgPLGA（PLA:PLG=50：50）溶于二氯甲烷中为油相，将90ug的bFGF样品溶于双蒸水中为水相，然后将bFGF溶液加入油相中，均化后形成初乳。加入1%的PVA溶液40ml，通过高速乳均机作用（20000rpm,2min），形成W/O/W，通过旋转蒸发仪减压旋转除去有机溶剂，离心沉淀微球后冷冻干燥即得包封了bFGF的PLGA微球。
2. I型胶原蛋白加入0.2%乙酸溶液中，搅拌均匀，制备成胶原蛋白溶液。
3. 将第1步制备的微球加入到第2步胶原蛋白溶液中，搅拌均匀，加入到模具中（或者是96孔板上），-70℃进行预冻12h,然后进行常规冷冻干燥，使用75%的乙醇进行固化30min后再次进行常规冷冻干燥即得包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体。
实施例3:
1.将155mgPLGA（PLA:PLG=50：50）溶于二氯甲烷中为油相，将100ug的bFGF样品溶于双蒸水中为水相，然后将bFGF溶液加入油相中，均化后形成初乳。加入1%的PVA溶液40ml，通过高速乳均机作用（20000rpm,2min），形成W/O/W，通过旋转蒸发仪减压旋转除去有机溶剂，离心沉淀微球后冷冻干燥即得包封了bFGF的PLGA微球。
2. I型胶原蛋白加入0.15%乙酸溶液中，搅拌均匀，制备成胶原蛋白溶液。
3. 将第1步制备的微球加入到第2步胶原蛋白溶液中，搅拌均匀，加入到模具中（或者是96孔板上），-70℃进行预冻18h,然后进行常规冷冻干燥，使用80%的乙醇进行固化35min后再次进行常规冷冻干燥即得包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体。
实施例4:
1.将180mgPLGA（PLA:PLG=50：50）溶于二氯甲烷中为油相，将115ug的bFGF样品溶于双蒸水中为水相，然后将bFGF溶液加入油相中，均化后形成初乳。加入1%的PVA溶液40ml，通过高速乳均机作用（20000rpm,2min），形成W/O/W，通过旋转蒸发仪减压旋转除去有机溶剂，离心沉淀微球后冷冻干燥即得包封了bFGF的PLGA微球。
2. I型胶原蛋白加入0.25%乙酸溶液中，搅拌均匀，制备成胶原蛋白溶液。
3. 将第1步制备的微球加入到第2步胶原蛋白溶液中，搅拌均匀，加入到模具中（或者是96孔板上），-70℃进行预冻24h,然后进行常规冷冻干燥，使用85%的乙醇进行固化35min后再次进行常规冷冻干燥即得包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体。
Claims (3)
1.一种碱性成纤维细胞生长因子缓释载体的制备方法，该缓释载体的制备方法包括以下步骤：
a. 将0.00001%-0.001%的bFGF溶液作为内水相，20%～70%PLGA的二氯甲烷溶液作为油相，两者经过复乳法得到bFGF-PLGA溶液，除去有机溶剂离心沉淀后经过冷冻干燥得到bFGF-PLGA微球；
b. 将I型胶原蛋白加入0.1%～0.3%乙酸溶液中，搅拌均匀，制备成胶原蛋白溶液；
c. 将a步骤制备的微球加入到b步骤的胶原蛋白溶液中，搅拌均匀，并于-70℃进行预冻8h～30h,然后进行冷冻干燥，再使用60%～90%的乙醇进行固化20min～40min后，再次进行冷冻干燥即得包埋bFGF-PLGA微球的胶原海绵载体。
2. 根据权利要求1所述的碱性成纤维细胞生长因子缓释载体的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂是通过旋转蒸发仪的减压旋转功能所除去的。
3. 一种bFGF的缓释载体，其特征为所包裹的生物活性因子为bFGF，载体是由PLGA微球与I型胶原蛋白所构成，该缓释载体具有良好的生物相容性和缓慢控制释放bFGF的效果。
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