CN107385007B - 一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法及其应用 - Google Patents

一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本公开公开了一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法及其应用；所述可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的检测方法包括将待测试剂和阳性对照体系分别用于培养Balb/c3t3细胞，并检测其增殖率；所述阳性对照体系的建立需要经过浓缩与调节浓度的步骤；所述方法可将干细胞生长因子的浓缩到1000‑3000倍；然后通过本公开中所述的技术方案同时对多个待测物进行批量化筛选，可以降低检测成本。所述方法可应用于化妆品、生物药物配方筛选领域，能够简化检测步骤，提高检测的效率，降低检测成本。

Description

一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方 法及其应用
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法及其应用。
背景技术
皮肤覆盖人类整个体表，具有屏障保护、水分保持、感觉及维持新陈代谢等作用。研究发现，皮肤的自我更新、新陈代谢功能维持及组织损伤修复依赖于于干细胞，人间充质干细胞可通过旁分泌作用，分泌诸如表皮生长因子(EGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)等多种细胞因子，对皮肤组织新陈代谢能力的维持及修复、再生起到促进作用。但是，由于人来源的干细胞及细胞分泌因子均不在化妆品原料目录中，人源干细胞生长因子无法直接应用于化妆品领域。如何在纷繁复杂的化妆品原料和配方中筛选出与人源多种干细胞生长因子效果相等同的化妆品成分和配方，有效评判化妆品的安全性和有效性是政府监管部门、化妆品制造企业和消费者共同关注的问题。
建立一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法，可应用于化妆品研发、制造与监管领域，对化妆品配方中的有效成分及浓度进行筛选和测试，替代动物试验以保障化妆品的安全性与功效性，具有极大的实际应用价值。另外，也可以应用于生物医药领域，筛选、评价具有和人源多种干细胞分泌因子相等同的生物学效应的化合物。
发明内容
本公开的目的是提供一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法，该方法可以同时对多个待测物及其浓度进行批量化筛选，筛选出生物活性等同于人源多种干细胞分泌因子的待测试剂，提高筛选效率，降低检测成本。
为了实现上述目的，本公开提供一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法，所述方法包括将80-120μL所述待测试剂与阳性对照体系分别加入80-120μL浓度为5-8×104个/mL的Balb/c3t3细胞培养液中，继续培养70-75h后使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率；
其中，所述阳性对照体系的建立包括如下步骤：
S1.传代培养人源干细胞并收集所述干细胞培养混合物的上清液，于4℃条件下将所述上清液加入超滤管中，3000-5000g离心50-70min收集分子量小于100kDa的蛋白获得超滤液，重复该步骤3-6次；
S2.向所述1体积的超滤液中加入13-15体积的无菌TGE缓冲液，离心后混匀获得干细胞生长因子浓缩液；
S3.检测所述干细胞生长因子浓缩液的总蛋白浓度，向所述干细胞生长因子浓缩液中加入含有0.3-0.5％胎牛血清的维持培养基稀释，获得所述总蛋白浓度分别为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的4个梯度的含有干细胞生长因子的阳性对照体系；
S4.将80-120μL所述总蛋白浓度为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的反应液分别加入体积相同的浓度为5-8×104个/mL的Balb/c3t3细胞培养液中，培养70-75h后使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率。
通过上述技术方案，本公开提供的可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法可将干细胞分泌因子的浓缩倍数达到1000-3000倍；然后将其稀释后作为阳性对照体系可以同时对多个不同浓度的待测试剂进行批量化筛选，提高筛选效率，降低检测成本。
本公开还提供了如上所述的方法在化妆品和/或生物药物配方筛选中的应用。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面提供了一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法，所述方法包括将80-120μL所述待测试剂与阳性对照体系分别加入80-120μL浓度为5-8×104个/mL的Balb/c3t3细胞培养液中，继续培养70-75h后使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率；
其中，所述阳性对照体系的建立包括如下步骤：
S1.传代培养人源干细胞并收集所述干细胞培养混合物的上清液，于4℃条件下将所述上清液加入超滤管中，3000-5000g离心50-70min收集分子量小于100kDa的蛋白获得超滤液，重复该步骤3-6次；
S2.向所述1体积的超滤液中加入13-15体积的无菌TGE缓冲液，离心后混匀获得干细胞生长因子浓缩液；
S3.检测所述干细胞生长因子浓缩液的总蛋白浓度，向所述干细胞生长因子浓缩液中加入含有0.3-0.5％胎牛血清的维持培养基稀释，获得所述总蛋白浓度分别为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的4个梯度的含有干细胞生长因子的阳性对照体系；
S4.将80-120μL所述总蛋白浓度为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的反应液分别加入体积相同的浓度为5-8×104个/mL的Balb/c3t3细胞培养液中，培养70-75h后使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率。
通过上述技术方案，本公开提供的试剂生物活性检测方法可将干细胞分泌因子的浓缩倍数达到1000-3000倍；然后将其稀释后作为阳性对照体系可以同时对多个待测物进行批量化筛选，降低检测成本。
根据本公开第一方面，所述干细胞为人源间充质干细胞；所述人源间充质干细胞可分泌FGF、HGF和VEGF用于作为阳性对照。
根据本公开第一方面，所述超滤管使用前需加入过膜超纯水，冰浴5-10分钟后倒出；所述超滤管为货号910096的Amicon Ultra-15超滤管；加水冰浴步骤可以检测超滤膜状态，并避免超滤管温度过高降低浓缩的干细胞生长因子活性，使用所述超滤管有利于干细胞生长因子的浓缩。
根据本公开第一方面，优选地，所述维持培养基为添加了3-5mmol/L谷氨酰胺、50-200μg/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素的RPMI1640培养基。
根据本公开第一方面，优选地，所述步骤S2中离心速度为3000-5000g，时间为30-45min。
根据本公开第一方面，优选地，所述无菌TGE缓冲液为经超滤膜过滤除菌后的TGE缓冲液；所述过滤除菌的TGE缓冲液有助于TGE缓冲液的保存。
根据本公开第一方面，优选地，所述步骤S2中混匀的操作为使用移液枪沿超滤管边缘轻轻吹打混匀；为了保持所述干细胞生长因子的活性，所述混匀操作应尽可能轻柔。
根据本公开第一方面，优选地，所述步骤S4中Balb/c3t3细胞培养液为含有0.3-0.5％胎牛血清的RPMI1640培养液。
根据本公开第一方面，优选地，所述步骤S4中还设置有阴性对照体系，所述阴性对照体系为去除Balb/c3t3细胞的培养液；所述阴性对照体系有助于排除其他的干扰因素，获得较准确的检测结果。
本公开还提供了如上所述的方法在化妆品和/或生物药物配方筛选中的应用；所述方法应用于化妆品、生物药物配方筛选时，可以避免动物实验的异种差异从而提高检测的精确度，简化检测步骤，提高检测效率，降低筛选成本。
下面通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
按照已公开的文献(CN105176923A)中描述的制备方法分离、获取经血间充质干细胞，干细胞培养所用的培养基为添加了3-5mmol/L谷氨酰胺、4-6mg/L的人血清替代物(武汉维诺赛生物科技有限公司，货号R007)、50-200μg/ml青霉素和50-200μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基；培养至P1代需传代或冻存时，消化细胞后计数并检测存活率；培养至P4或P5代细胞时，培养细胞数量至不低于2×107个/mL，运用流式细胞术对所述细胞进行检测，阳性指标CD73、CD90和CD105率达到90％以上，阴性指标CD34和CD45小于2％的细胞为合格细胞，收集所述合格细胞并继续培养；将P4-P5代的合格细胞，以1×106个/mL的数量接种于T175瓶，培养细胞至密度80％-90％时换液，重新加入18-20ml培养基培养24-72h后收集上清至250-300ml，收集的上清可保存至-80℃冰箱。
用ELISA试剂盒对所述含有干细胞生长因子的培养上清液中的HGF、VEGF、FGF的浓度分别进行检测。
在进行浓缩前，向货号为910096的Amicon Ultra-15超滤管中加入过膜的MillIQ水，冰浴5-10分钟后倒出MillIQ水；将6只超滤管插至冰中，以不超过超滤管顶白线为准，轻柔加入收集到的间充质干细胞培养混合物的上清液15mL，于4℃、4000g离心60min获得第一次超滤液1mL；将超滤管置于冰上继续加入所述间充质干细胞培养混合物的上清液14mL，再次于4℃、4000g离心60min获得第二次超滤液1mL；再次重复上述步骤获得第三次超滤液1mL；向所述第三次超滤液中加入14mL的过滤除菌后的TGE缓冲液，于4℃、4000g离心40min实现缓冲液的置换，然后将离心后的超滤管置于冰上，用移液枪沿超滤管边缘轻轻吹打混匀获得干细胞生长因子浓缩液。
用ELISA试剂盒对所述干细胞生长因子浓缩液中的HGF、VEGF、FGF浓度分别检测。
检测测得总蛋白浓度为1mg/mL的上清液浓缩前HGF的浓度为6.9ng/mL，VEGF的浓度为0.7ng/mL，FGF浓度为0.09ng/mL。浓缩后HGF的浓度为19.6μg/mL，浓缩率约为2800倍；VEGF的浓度为1.26μg/mL，浓缩率约为1800倍；FGF浓度为0.1μg/mL，浓缩率约为1100倍。
实施例2
使用BCA法检测实施例1中所述干细胞生长因子浓缩液的总蛋白浓度，并加入含有0.4％胎牛血清的维持培养基调整总蛋白浓度分别为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL得到4个梯度的含有干细胞生长因子的阳性对照体系，所述维持培养基为添加了3-5mmol/L谷氨酰胺、50-200μg/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素的RPMI1640培养基。
同时接种Balb/c3t3细胞至含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中使细胞量为5-8×104个/mL，将所述含有Balb/c3t3细胞的RPMI1640培养基分装入96孔板中，每孔100μL，将所述96孔板置于37℃、5％二氧化碳浓度条件下培养24h，然后更换培养基为含有0.4％胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养24h获得Balb/c3t3细胞培养液；分别向100μL所述Balb/c3t3细胞培养液中加入100μL含有0.25mg/mL、2.5mg/mL、25mg/mL或250mg/mL重组表皮生长因子(EGF)的待测试剂，于37℃、5％二氧化碳浓度条件下培养72h后，使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率。
分别向100μL所述Balb/c3t3细胞培养液中加入100μL所述总蛋白浓度为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的浓缩后干细胞生长因子阳性对照体系，于37℃、5％二氧化碳浓度条件下培养72h后，使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率。同时设置有阴性对照，所述阴性对照为去除Balb/c3t3细胞的培养液100μL，将所述培养液作为反应液加入所述Balb/c3t3细胞培养液培养72h后，使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率。
经检测，所述含有重组表皮生长因子的待测试剂中EGF浓度为0.25mg/mL时的生物活性为阳性对照体系的0.3％；EGF浓度为2.5mg/mL时的生物活性为阳性对照体系的1.2％；EGF浓度为25mg/mL时的生物活性为阳性对照体系的67％；EGF浓度为250mg/mL时的生物活性为阳性对照体系的8.9％，根据此检测结果后续可在重组表皮生长因子大于25mg/mL小于250mg/mL的浓度范围内继续做合理的倍数稀释继续此试验，筛选出最接近阳性对照的生物活性的EGF溶液浓度。
对比例1
采用0.22μm滤膜过滤实施例1中收集到的间充质干细胞培养混合物的上清液43mL，得到干细胞生长因子第一次过滤液；将所述干细胞生长因子第一次过滤液通过50kDa的有机滤膜得到第二次过滤液，然后将所述第二次过滤液在此通过1000Da的有机滤膜得到干细胞生长因子浓缩液。
用ELISA试剂盒对所述浓缩后的干细胞生长因子中的HGF、VEGF、FGF的浓度进行检测，测得所述三种干细胞因子浓缩前HGF的浓度为5.7ng/mL，VEGF的浓度为0.4ng/mL，FGF浓度为0.07ng/mL。浓缩后HGF的浓度为0.8μg/mL，浓缩率约为140倍；VEGF的浓度为0.05μg/mL，浓缩率约为120倍；FGF浓度为3.8ng/mL，浓缩率约为50倍。
对比例2
根据实施例2中所述的检测方法检测所述待测试剂的活性，不同之处在于未设置阳性对照体系。
该方法无法检测所述含有不同浓度干细胞生长因子的待测试剂的生物活性。
将对比例1与实施例1比较可以看出，本公开提供的检测方法可将干细胞分泌因子的浓缩倍数达到1000-3000倍；实施例2与对比例2比较可以看出，根据本公开中所述的技术方案可以同时对多个待测物进行批量化筛选；将实施例1与实施例2中的方法结合可以提高干细胞生长因子的浓缩与检测效率，降低检测成本。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (9)

1.一种检测待测试剂中人源多种干细胞生长因子的生物等效性的方法，其特征在于，所述方法包括将80-120μL所述待测试剂与阳性对照体系分别加入80-120μL浓度为5-8×104个/mL的Balb/c3t3细胞培养液中，继续培养70-75h后使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率；
其中，所述阳性对照体系的建立包括如下步骤：
S1.传代培养人源干细胞并收集所述干细胞培养混合物的上清液，于4℃条件下将所述上清液加入超滤管中，3000-5000g离心50-70min收集分子量小于100kDa的蛋白获得超滤液，重复该步骤3-6次；其中，所述超滤管使用前需加入过膜超纯水，冰浴5-10分钟后倒出；
S2.向所述1体积的超滤液中加入13-15体积的无菌TGE缓冲液，离心后混匀获得干细胞生长因子浓缩液；
S3.检测所述干细胞生长因子浓缩液的总蛋白浓度，向所述干细胞生长因子浓缩液中加入含有0.3-0.5％胎牛血清的维持培养基稀释，获得所述总蛋白浓度分别为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的4个梯度的含有干细胞生长因子的阳性对照体系；
S4.将80-120μL所述总蛋白浓度为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的反应液分别加入体积相同的浓度为5-8×104个/mL的Balb/c3t3细胞培养液中，培养70-75h后使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞为人源间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述超滤管为货号910096的Amicon Ultra-15超滤管。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述维持培养基为添加了3-5mmol/L谷氨酰胺、50-200μg/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素的RPMI1640培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S2中离心速度为3000-5000g，时间为30-45min。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述无菌TGE缓冲液为经超滤膜过滤除菌后的TGE缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S2中混匀的操作为使用移液枪沿超滤管边缘轻轻吹打混匀。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S4中Balb/c3t3细胞培养液为含有0.3-0.5％胎牛血清的RPMI1640培养液。
9.权利要求1-8中任意一项所述的方法在化妆品和/或生物药物配方筛选中的应用。
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