CN114317428A

CN114317428A - 一种含中药小分子的干细胞无血清培养基及其制备方法

Info

Publication number: CN114317428A
Application number: CN202210221036.7A
Authority: CN
Inventors: 陈鹏; 苏晗; 杨洪军; 邓世文; 崔钊; 黎彩凤
Original assignee: EXPERIMENTAL RESEARCH CENTER CHINA ACADEMY OF CHINESE MEDICAL SCIENCES
Current assignee: EXPERIMENTAL RESEARCH CENTER CHINA ACADEMY OF CHINESE MEDICAL SCIENCES
Priority date: 2022-03-09
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2042-03-09
Also published as: CN114317428B

Abstract

本发明涉及一种含中药小分子的干细胞无血清培养基及其制备方法。所述培养基包括如下原料：重组人胰岛素、维生素C、重组人转铁蛋白、人血清白蛋白、重组人纤连蛋白、人表皮生长因子EGF、人碱性成纤维生长因子bFGF、血小板衍生生长因子PDGF‑BB、灯盏花乙素、人参皂苷Rg3、黄芩苷、丹酚酸B和黄连素。所述培养基包括细胞所需的营养因子和人源促生长小分子，无异源蛋白，可以提供维持细胞生长和增殖的良好环境。通过添加灯盏花乙素，人参皂苷Rg3，黄芩苷，丹酚酸B和黄连素这五种中药小分子，能够显著提高间充质干细胞的贴壁，促进细胞增殖速率，维持细胞表面表型和细胞多项分化潜能，并能够较好保护干细胞。

Description

一种含中药小分子的干细胞无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种含中药小分子的干细胞无血清培养基及其制备方法。

背景技术

间充质干细胞（MSCs）被认为是潜在的生物学材料应用在再生医学中。MSCs具备快速繁殖、在诱导条件下发生多谱系分化、无伦理问题的优点。近些年，不管是在国内还是国外，应用MSCs移植人体以治疗重大疾病的研究已经陆续获得临床试验审批，如缺血性脑卒中、类风湿关节炎、多发性硬化症、特发性肺纤维化和移植物抗宿主病等。

细胞的标准化生产工艺和培养是MSCs研究的基础。培养基是影响MSCs生长、增殖状态的关键因素。常规的干细胞培养基是采用基础培养基，补充了胎牛血清（FBS）和双抗。但是FBS作为异源物质，有很多缺点和隐患，不适合人源间充质干细胞的培养：首先FBS是混合物，其中含有对维持细胞生长所需的有益营养物质以外，还可能含有病毒、毒素等，这些有害物质可能伴随FBS的加入携带进入人体；其次FBS还存在被疯牛病污染的风险；再次FBS的大量采集和手段不当，可能引发潜在存在的动物伦理问题；最后异源血清的残留，在细胞移植后，可能引发严重的免疫反应，危害人体安全。另外双抗的使用，对于敏感的原代提取的细胞，可能存在毒副作用影响。所以，不管是自体干细胞移植，还是异体干细胞移植，FBS和双抗的使用是限制干细胞生产工艺优化的关键因素。于是，迫切需要成分确定、质量稳定、适合干细胞正常生长和增殖的替代物。

基于此，提出本发明技术方案。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种含中药小分子的干细胞无血清培养基及其制备方法。所述含中药小分子的干细胞无血清培养基，其中包括细胞所需的营养因子和人源促生长小分子，无异源蛋白，可以提供维持细胞生长和增殖的良好环境。通过添加灯盏花乙素，人参皂苷Rg3，黄芩苷，丹酚酸B和黄连素这五种中药小分子，能够显著提高间充质干细胞的贴壁，促进细胞增殖速率，维持细胞表面表型和细胞多项分化潜能，并能够较好保护干细胞。此外，本发明添加的成分明确，效果稳定，无批次间差异，适合标准化的工艺生产。

本发明的方案是，提供一种一种含中药小分子的干细胞无血清培养基，包括如下原料：重组人胰岛素、维生素C、重组人转铁蛋白、人血清白蛋白、重组人纤连蛋白、人表皮生长因子EGF、人碱性成纤维生长因子bFGF、血小板衍生生长因子PDGF-BB和中药小分子；所述中药小分子包括灯盏花乙素、人参皂苷Rg3、黄芩苷、丹酚酸B和黄连素。

优选地，所述含中药小分子的干细胞无血清培养基包括如下浓度的原料：重组人胰岛素5~15mg/L、维生素C 20~100mg/L、人转铁蛋白7~15mg/L、人血清白蛋白1~5g/L、重组人纤连蛋白15~30mg/L、人表皮生长因子EGF 5~20μg/L、人碱性成纤维生长因子bFGF 5~20μg/L、血小板衍生生长因子PDGF-BB 5~20μg/L、灯盏花乙素10~500nM、人参皂苷Rg3 50~500nM、黄芩苷0.1~0.5mg/L、丹酚酸B10~400nM、黄连素20~500nM。

优选地，所述含中药小分子的干细胞无血清培养基包括如下浓度的原料：重组人胰岛素10mg/L、维生素C 50mg/L、人转铁蛋白15mg/L、人血清白蛋白1g/L、重组人纤连蛋白20mg/L、人表皮生长因子EGF 10μg/L、人碱性成纤维生长因子bFGF 10μg/L、血小板衍生生长因子PDGF-BB 20μg/L、灯盏花乙素200nM、人参皂苷Rg3 100nM、黄芩苷0.4mg/L、丹酚酸B200nM、黄连素100nM。

基于相同的技术构思，本发明的再一方案是，提供一种含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：

（1）将所有原料混合，得到浓缩液；

（2）将步骤（1）所述浓缩液加入至DMEM高糖培养基内，均匀搅拌，得到预培养基原料；

（3）将步骤（2）所述预培养基原料经滤膜过滤除菌，即得到含中药小分子的干细胞无血清培养基。

优选地，步骤（1）中，所述浓缩液于-20^oC条件下保存待用。

优选地，步骤（2）中，所述DMEM高糖培养基保存温度为0~8^oC。

基于相同的技术构思，本发明再提供一种含中药小分子的干细胞无血清培养基在间充质干细胞培养中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明所述含中药小分子的干细胞无血清培养基，其中包括细胞所需的营养因子和人源促生长小分子，无异源蛋白，可以提供维持细胞生长和增殖的良好环境。通过添加灯盏花乙素，人参皂苷Rg3，黄芩苷，丹酚酸B和黄连素这五种中药小分子，能够显著提高间充质干细胞的贴壁，促进细胞增殖速率，维持细胞表面表型和细胞多项分化潜能，并能够较好保护干细胞。此外，本发明添加的成分明确，效果稳定，无批次间差异，适合标准化的工艺生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是试验四的检测结果图。

图2是试验五的检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：

（1）将所有原料混合，得到浓缩液，并于-20^oC条件下保存待用；其中各原料浓度为：重组人胰岛素5mg/L、维生素C 20mg/L、人转铁蛋白7mg/L、人血清白蛋白1g/L、重组人纤连蛋白15mg/L、人表皮生长因子EGF 5μg/L、人碱性成纤维生长因子bFGF 5μg/L、血小板衍生生长因子PDGF-BB 5μg/L、灯盏花乙素10nM、人参皂苷Rg3 50nM、黄芩苷0.1mg/L、丹酚酸B10nM、黄连素20nM；

（2）取保存于0^oC条件下的DMEM高糖培养基，将步骤（1）所得浓缩液按照1:1000的重量比加入（即在1L的培养基中加入1mL的浓缩液即可，下同），均匀搅拌，得到预培养基原料；

实施例2

（1）将所有原料混合，得到浓缩液，并于-20^oC条件下保存待用；其中各原料浓度为：重组人胰岛素10mg/L、维生素C 50mg/L、人转铁蛋白15mg/L、人血清白蛋白1g/L、重组人纤连蛋白20mg/L、人表皮生长因子EGF 10μg/L、人碱性成纤维生长因子bFGF 10μg/L、血小板衍生生长因子PDGF-BB 20μg/L、灯盏花乙素200nM、人参皂苷Rg3 100nM、黄芩苷0.4mg/L、丹酚酸B200nM、黄连素100nM；

（2）取保存于4^oC条件下的DMEM高糖培养基，将步骤（1）所得浓缩液按照1:1000的重量比加入，均匀搅拌，得到预培养基原料；

实施例3

（1）将所有原料混合，得到浓缩液，并于-20^oC条件下保存待用；其中各原料浓度为：重组人胰岛素15mg/L、维生素C 100mg/L、人转铁蛋白15mg/L、人血清白蛋白5g/L、重组人纤连蛋白30mg/L、人表皮生长因子EGF 20μg/L、人碱性成纤维生长因子bFGF 20μg/L、血小板衍生生长因子PDGF-BB 20μg/L、灯盏花乙素500nM、人参皂苷Rg3 500nM、黄芩苷0.5mg/L、丹酚酸B400nM、黄连素500nM；

（2）取保存于8^oC条件下的DMEM高糖培养基，将步骤（1）所得浓缩液按照1:1000的重量比加入，均匀搅拌，得到预培养基原料；

对比例1

本对比例提供一种含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，与实施例2的区别在于，不添加灯盏花乙素、人参皂苷Rg3、黄芩苷、丹酚酸B和黄连素，其余操作均相同。

对比例2

本对比例提供一种含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，与实施例2的区别在于，不添加灯盏花乙素，其余操作均相同。

对比例3

本对比例提供一种含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，与实施例2的区别在于，不添加人参皂苷Rg3，其余操作均相同。

对比例4

本对比例提供一种含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，与实施例2的区别在于，不添加黄芩苷，其余操作均相同。

对比例5

本对比例提供一种含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，与实施例2的区别在于，不添加丹酚酸B，其余操作均相同。

对比例6

本对比例提供一种含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，与实施例2的区别在于，不添加黄连素，其余操作均相同。

为验证本发明所述含中药小分子的干细胞无血清培养基的效果，进行试验检测，具体如下：

试验一：间充质干细胞的贴壁检测

从液氮中取出装有干细胞的冻存管融化，分散于基础培养基中，离心去除冻存液后，将干细胞重悬于上述实施例1~3和对比例1~6的含中药小分子的干细胞无血清培养基，并接种在培养瓶中，置于37^oC培养箱中培养。24h培养后，观察并计算干细胞的贴壁率。用0.4%胎盼蓝染色，计算活细胞数和存活率。

表1 无血清培养基的贴壁率

由表1结果可以看出，本发明的含中药小分子的干细胞无血清培养基，能够得到很高的贴壁率，实施例1~3都超过90%的贴壁率，说明本发明能够促进细贴壁，提高细胞的存活率。对比例1中未加任何中药小分子，结果可以看出，贴壁率较低。对比例2~6相比于未添加任何中药小分子的培养基，贴壁率显著提高，但是减少中药小分子的添加，会影响细胞的贴壁率。

试验二：间充质干细胞的细胞增殖检测

干细胞以10⁴个细胞/mL的浓度接种在96孔板中,细胞贴壁后，并更换为实施例1~3和对比例1~6的含中药小分子的干细胞无血清培养基。培养24h后，CCK-8被用来结合活的干细胞并形成可检测的有色沉淀。以工作浓度加入10μL的CCK-8溶液，进行6次生物重复。酶标仪在450nm波长下测定吸光度，并计算相对于对比例1的其他所有实施例和对比例的相对增殖率。

表2 无血清培养基的相对增殖率

由表2结果可以看出，相比于对比例1中未添加任何中药小分子的培养基，实施例1~3本发明的含中药小分子的干细胞无血清培养基能够显著地提高细胞增殖率，这与我们前期实验的中药小分子促进干细胞增殖的结果吻合。对比例2~6相比于未添加任何中药小分子的培养基，细胞增殖率显著提高，但是减少其中某一项中药小分子的添加，会影响细胞的相对增值率。

试验三：间充质干细胞表面标志鉴定

取上述实施例1~3和对比例1~6培养基培养的干细胞，每份取100μL单细胞悬液(约0.2~1×10⁶个细胞)。表面标记物分别与CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-APC、CD90-FITC和CD105-PC5.5结合。室温下避光反应30min。加入500μL PBS重悬成单细胞悬液即可在流式细胞仪上检测。

表3 无血清培养基的表面标志物的阳性率

表3结果为流式细胞术检测干细胞表面标志物的结果。其中，CD73，CD90和CD105是间充质干细胞的阳性标志物，而CD11b，CD19，CD34，CD45和HLA-DR是阴性标志物。从表3结果可以看出，实施例1~3本发明的含中药小分子的干细胞无血清培养基维持了干细胞强阳性表达表面标志物CD73，CD90和CD105且低表达阴性标志物CD11b，CD19，CD34，CD45和HLA-DR的特点。但是对比例1中，未添加中药小分子的无血清培养基的干细胞标志物表达特征不呈现经典阳性或者阴性。对比例2~6中，不同中药的减少添加，对干细胞标志物表达特征收到不同的轻微影响。

试验四：间充质干细胞成骨分化鉴定

实施例1~3和对比例1~6培养基培养的干细胞接种于含有新鲜培养基的6孔板。当细胞融合率达到80~90%时，采用成骨诱导培养基进行诱导培养。每3天更换一次新鲜的诱导培养基,并向其中按照实施例1~3和对比例1~6中中药小分子添加的方式进行中药小分子的添加，每次更换新鲜培养基，就更换不同的中药小分子。培养4周后，用茜素红染色评估成骨分化效率。

结果如图1所示，经过长达4周的诱导，实施例1~3本发明的含中药小分子的干细胞无血清培养基培养的干细胞能够观察到明显的钙结节，表明本发明能够维持干细胞的成骨分化特性。对比例1的成骨分化结果并不明显，表明成骨分化潜能受到很大影响。对比例2~6中也能观察到明显的钙结节，表明干细胞的成骨分化特性不受影响。

试验五：间充质干细胞成脂分化鉴定

实施例1~3和对比例1~6培养基培养的干细胞接种于含有新鲜培养基的6孔板。当细胞融合率达到80~90%时，采用成脂诱导培养基进行诱导培养。每3天更换一次新鲜的诱导培养基A，随后更换诱导培养基B培养1天，再更换A培养3天，循环6~8次。更换诱导培养基时，并向其中按照实施例1-3和对比例1-6中中药小分子添加的方式进行中药小分子的添加，每次更换新鲜培养基，就更换不同的中药小分子。培养4周后，用油红O染色评估成脂分化效率。

结果如图2所示，经过长达4周的诱导，实施例1~3本发明的含中药小分子的干细胞无血清培养基培养的干细胞能够观察到明显的油红O染成红色的脂滴，表明本发明能够维持干细胞的成脂分化特性。对比例1的成脂分化结果并不明显，表明成脂分化潜能受到很大影响。对比例2~6中也能观察到明显的脂滴，表明干细胞的成脂分化特性不受影响。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种含中药小分子的干细胞无血清培养基，其特征在于，包括如下原料：重组人胰岛素、维生素C、重组人转铁蛋白、人血清白蛋白、重组人纤连蛋白、人表皮生长因子EGF、人碱性成纤维生长因子bFGF、血小板衍生生长因子PDGF-BB和中药小分子；所述中药小分子包括灯盏花乙素、人参皂苷Rg3、黄芩苷、丹酚酸B和黄连素。

2.根据权利要求1所述含中药小分子的干细胞无血清培养基，其特征在于，包括如下浓度的原料：重组人胰岛素5~15mg/L、维生素C 20~100mg/L、人转铁蛋白7~15mg/L、人血清白蛋白1~5g/L、重组人纤连蛋白15~30mg/L、人表皮生长因子EGF 5~20μg/L、人碱性成纤维生长因子bFGF 5~20μg/L、血小板衍生生长因子PDGF-BB 5~20μg/L、灯盏花乙素10~500nM、人参皂苷Rg3 50~500nM、黄芩苷0.1~0.5mg/L、丹酚酸B10~400nM、黄连素20~500nM。

3.根据权利要求2所述含中药小分子的干细胞无血清培养基，其特征在于，包括如下浓度的原料：重组人胰岛素10mg/L、维生素C 50mg/L、人转铁蛋白15mg/L、人血清白蛋白1g/L、重组人纤连蛋白20mg/L、人表皮生长因子EGF 10μg/L、人碱性成纤维生长因子bFGF 10μg/L、血小板衍生生长因子PDGF-BB 20μg/L、灯盏花乙素200nM、人参皂苷Rg3 100nM、黄芩苷0.4mg/L、丹酚酸B200nM、黄连素100nM。

4.权利要求1~3任一所述含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

（1）将所有原料混合，得到浓缩液；

5.根据权利要求4所述含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述浓缩液于-20^oC条件下保存待用。

6.根据权利要求4所述含中药小分子的干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述DMEM高糖培养基保存温度为0~8^oC。

7.权利要求1~3任一所述含中药小分子的干细胞无血清培养基在间充质干细胞培养中的应用。