CN113249314B - 促进间充质干细胞增殖与分化的培养方法及无血清培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞培养技术领域。更具体地，涉及一种促进间充质干细胞增殖与分化的培养方法及无血清培养基。其包括以下成分：人血小板裂解液0.1～3.5％、L‑谷氨酰胺1～3mmol/L、维生素C衍生物5～30μg/mL，基础培养基补足至1L。本发明无血清培养基通过添加了香菇多糖和2‑O‑乙醚抗坏血酸，实现了仅采用较低浓度的血小板裂解液即可满足间充质干细胞在体外连续扩增培养的需求，并且能够很好的维持间充质干细胞增殖高分化的性能，大大地降低了培养成本的同时降低了临床应用的风险。
Description
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域。更具体地，涉及一种促进间充质干细胞增殖与分化的培养方法及无血清培养基。
背景技术
间充质干细胞能够贴附固相表面生长、细胞表面能表达特异性抗原(阳性表达CD29、CD73、CD90、CD105、同时CD34、CD45等均为阴性)，同时具备在体外诱导分化成脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞的潜能。因此，间充质干细胞在促进造血、免疫调节、促进血管新生等方面均能起到重要的调节作用。
间充质干细胞的临床应用必然需要经过细胞的体外培养和扩增，在体外培养体系中，需要提供类似体液环境的条件和细胞生长和增殖必要的养分，故需要添加血清来为细胞生长、增殖提供所需的养分，但是血清培养存在不同批次间的差异、成分复杂等临床应用风险。
目前已有一些无血清间充质干细胞培养基，如任春红、张昕研发的无动物源成分培养基XF/SF-MSCM，其是以DMEM/F12为基础培养基，加入10g/LrHSA、胰蛋白酶抑制剂、NEAA、转铁蛋白、胰岛素、亚硒酸钠、10ng/mLrhEGF、10ng/mLrhbFGF、L-谷氨酰胺、G-SH、氢化考的松、β-巯基乙醇及双抗制成。该无血清培养基可支持脐带间充质干细胞的体外扩增，维持其免疫学表型及分化潜能，提供数量充足的高质量间充质干细胞，但是在原代分离培养中仍然需要采用含有胎牛血清的培养基进行培养，且细胞贴壁的紧密程度显著低于血清组，这也是目前无血清培养基存在的普遍问题[1]。
鉴于此，人源血小板裂解液在无血清间充质干细胞培养中显示出明显的优势，有学者在分离的原代分离培养到传代扩增培养中全程采用血小板裂解液替代血清，结果发现，全程采用血小板裂解液替代的间充质干细胞仍然具有非常好的形态、细胞表型和分化潜能。血小板裂解液中仍然含有少量的蛋白，使得其安全性虽然比血清可靠，但是仍然具有风险，同时，目前含血小板裂解液的DMEM/F12体系中需要保证血小板裂解液的含量至少在5％以上才能更好的在传代扩增培养中维持间充质干细胞的特性。如中国专利CN111454893A公开了一种无血清间充质干细胞培养基，其包括基础培养基、2～10％的人血小板裂解液及20～100μg/mL人脂质运载蛋白，其中所述人血小板裂解液的含量需要保持在5％以上才能满足间充质干细胞的生长需要；如中国专利CN109402050A公开了一种无血清成分高效间充质干细胞培养液，其包括：10％人血小板裂解液、0.4％青链霉素、2mmol/L长效谷氨酰胺、15ng/ml趋化因子XCL1、25ng/ml趋化因子CCL3、18ng/ml热休克蛋白、26ng/ml端粒酶抑制剂IFN-α2b及基础培养基，其中采用的人血小板裂解液含量高达10％。如果为了降低血小板裂解液应用的临床风险，目前血小板裂解液应用于无血清培养间充质干细胞中的难题是：如何能够使人血小板裂解液在较低的添加浓度的情况下满足间充质干细胞的连续传代扩增培养，并维持干细胞特性。
参考文献1：任春红,张昕.无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究[J].延安大学学报(医学科学版),2015,13(01):1-4.
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有无血清培养基的缺陷和不足，提供一种含低浓度人血小板裂解液的无血清培养基，该无血清培养基能够应用于间充质干细胞的原代分离培养和传代连续培养，且细胞扩增效率与血清培养基无明显差异，多次传代后细胞表型及分化潜能稳定。
本发明的目的是提供一种间充质干细胞无血清培养基，包括以下成分：人血小板裂解液0.1～3.5％、L-谷氨酰胺1～3mmol/L、维生素C衍生物5～30μg/mL，基础培养基补足至1L。
人血小板裂解液(hPL)来源于含多种生长因子的血小板，如TGF-β1、TGF-β2、EGF、FGF、PDGF-BB、IGF-1等，能够对细胞的生长起到很好的支持的作用，同时能够很好的维持间充质干细胞的干性，使其在体外能够连续传代，并保持较好的细胞表型及分化潜能。本发明所述人血小板裂解液(hPL)来源于市购，购于北京诺为生物技术有限公司，产品货号：902010。
需要说明的是，本文中“血小板裂解液0.1～3.5％”的单位是体积分数。
L-谷氨酰胺能够促进细胞的增殖，提高细胞的生长速率；维生素C衍生物可以促进细胞的生长，增殖，提高细胞存活率及抑制其衰老。
进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。需要说明的是，本发明中所述基础培养基不限于DMEM/F12培养基，其还可以是L-DMEM培养基或IMDM培养基，只是在本发明体系中，采用DMEM/F12培养基与其他成分配合可获得更好的培养效果。本发明DMEM/F12培养基购于武汉普诺赛生命科技有限公司。
进一步地，所述维生素C衍生物为2-O-乙醚抗坏血酸，其CAS号为：112894-37-8，化学结构式为：
需要说明的是，本发明中所述维生素C衍生物还可以是抗坏血酸钠或维生素C磷酸酯镁，本发明体系中，采用2-O-乙醚抗坏血酸与本发明培养体系中的其他成分配合更利于实现本发明发明目的。通过试验可以看出，加入2-O-乙醚抗坏血酸细胞培养及分化的效果是最好的，
进一步地，还包括香菇多糖。意外地发现，在含人血小板裂解液(hPL)体系中，在2-O-乙醚抗坏血酸的基础上复配香菇多糖能够极大的提升人血小板裂解液(hPL)的促增殖及分化效果，能够使人血小板裂解液在较低的添加浓度的情况下(0.1～3.5％)即可满足间充质干细胞的连续传代扩增培养，并很好的维持干细胞特性。特别说明的是，当体系中含有香菇多糖时，维生素C衍生物优选是2-O-乙醚抗坏血酸，次之是维生素C磷酸酯镁，但不能是抗坏血酸。因为抗坏血酸钠虽然也属于维生素C衍生物，但是试验发现，其与香菇多糖复配后对细胞增殖分化存在一定的拮抗作用。
进一步地，所述香菇多糖与2-O-乙醚抗坏血酸的重量比为0.1～0.6:2。在此比值内，香菇多糖与2-O-乙醚抗坏血酸的复配可以达到协同的作用。进一步地，所述香菇多糖与2-O-乙醚抗坏血酸的重量比为0.3:2。在两者比值为0.3:2时，人血小板裂解液的加入浓度为2.3％即可满足间充质干细胞在体外的连续传代扩增培养，并很好的维持干细胞的特性。
在本发明其中一个实施例，所述间充质干细胞无血清培养基，包括以下成分：人血小板裂解液0.1～3.5％、L-谷氨酰胺1～3mmol/L、2-O-乙醚抗坏血酸5～30μg/mL、香菇多糖0.25～9μg/mL、DMEM/F12培养基补足至1L。
在本发明其中一个实施例，所述间充质干细胞无血清培养基，包括以下成分：人血小板裂解液2.3％、L-谷氨酰胺1.5mmol/L、2-O-乙醚抗坏血酸20μg/mL、香菇多糖3μg/mL、DMEM/F12培养基补足至1L。
在本发明其中一个实施例，所述间充质干细胞无血清培养基，包括以下成分：人血小板裂解液2％、L-谷氨酰胺1mmol/L、2-O-乙醚抗坏血酸12μg/mL、香菇多糖0.6μg/mL、DMEM/F12培养基补足至1L。
在本发明其中一个实施例，所述间充质干细胞无血清培养基，包括以下成分：人血小板裂解液3.5％、L-谷氨酰胺3mmol/L、2-O-乙醚抗坏血酸16μg/mL、香菇多糖4μg/mL、DMEM/F12培养基补足至1L。
本发明另一目的在于提供所述间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的应用或在制备培养间充质干细胞产品中的应用。本发明培养基可以应用于间充质干细胞的原代分离培养和/或传代扩增培养。
上述间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的应用包括：
在提高间充质干细胞增殖能力中的应用；
在提高间充质干细胞分化能力中的应用；
在维持干细胞特性中的应用。
进一步地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。需要说明的是，原则上本发明所述“间充质干细胞”可包括人脂肪间充质干细胞或人骨髓间充质干细胞，只是在三种细胞中，本发明培养基尤其适合人脐带间充质干细胞的原代分离培养和/或传代扩增培养。
本发明另一目的在于提供一种人脐带间充质干细胞的无血清培养方法，包括以下步骤：
取清洗后的脐带，剥离脐带动静脉保留外膜；
将脐带剪碎成组织块；
将组织块接种于所述间充质干细胞无血清培养基中培养进行原代分离培养；于接种后第2天补液，以后每隔3天换液1次；
待贴壁细胞融合至80～90％时，消化，将其接种于所述间充质干细胞无血清培养基进行传代扩增培养。
进一步地，所述“取清洗后的脐带，剥离脐带动静脉保留外膜”步骤具体是：在无菌条件下，采用含有青链霉素混合液的生理盐水清洗脐带2次至无残留血液；剥离脐带动静脉保留外膜。
进一步地，所述“将脐带剪碎成组织块”步骤具体是：用剪刀将脐带剪成1cm3左右大小的组织块。
进一步地，“将组织块接种于所述间充质干细胞无血清培养基中培养进行原代分离培养”具体步骤是：将组织块以接种密度为1～5×104/cm2均匀接种于本发明所述间充质干细胞培养基中，放置于37℃、5％CO2的恒温箱内培养。
进一步地，所述“消化”具体步骤为：待贴壁细胞融合至80～90％时，吸出培养基，采用PBS缓冲液清洗2次后加入适量0.1～0.3％胰蛋白酶消化。
进一步地，所述“将其接种于所述间充质干细胞无血清培养基进行传代扩增培养”具体步骤是：吸出胰蛋白酶，加入DMEM/F12培养基，将细胞吹散后，收集，离心，弃上清，将获得的间充质干细胞以1～5×104/cm2的接种密度均匀接种于含本发明间充质干细胞无血清培养基的培养皿中，于37℃、5％CO2条件下进行连续传代扩增培养。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的无血清培养基，不含胎牛血清，能够大大减少临床应用的风险，安全性高，符合临床应用的要求。
(2)本发明无血清培养基可满足原代分离培养和传代扩增培养间充质干细胞的需求，全程替代血清培养，得到的间充质干细胞生物制品安全性更高。
(3)本发明无血清培养基通过添加了香菇多糖和2-O-乙醚抗坏血酸，实现了仅采用较低浓度的血小板裂解液即可满足间充质干细胞在体外连续扩增培养的需求，并且能够很好的维持间充质干细胞增殖高分化的性能，大大地降低了培养成本的同时降低了风险。
附图说明
图1为各组培养基中人脐带间充质干细胞增殖能力的比较。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例一、表1无血清培养基L1～L7
无血清培养基配制：
按照上表1配方，往DMEM/F12培养基中依次添加表格中的成分，得到无血清培养基L1～L7。
实施例二、脐带间充质干细胞培养方法
2.1脐带间充质干细胞原代分离培养：在无菌条件下，采用含有青链霉素混合液的生理盐水清洗脐带2次至无残留血液；剥离脐带动静脉保留外膜；用剪刀将脐带剪成1cm3左右大小的组织块；将组织块分别以接种密度为1×104/cm2均匀接种于间充质干细胞培养基L1～L7中，放置于37℃、5％CO2的恒温箱内培养，于接种后第2天补液，以后每隔3天换液1次。
2.2脐带干细胞传代扩增培养：待贴壁细胞融合至80～90％时，分别吸出培养基，采用PBS缓冲液清洗2次后加入适量0.2％胰蛋白酶消化；吸出胰蛋白酶，加入DMEM/F12培养基，将细胞吹散后，收集，离心，弃上清，将获得的间充质干细胞以1×104/cm2的接种密度均匀分别接种于间充质干细胞无血清培养基L1～L7培养皿中，于37℃、5％CO2条件下进行连续传代扩增培养。
同时以血清组作为对照组(下记为D1)按照方法2.1和2.2对脐带间充质干细胞进行原代分离培养和传达扩增培养，对上述组别获得的间充质干细胞进行鉴定。其中，D1组培养基为DMEM/F12培养基中添加10％的胎牛血清。
2.3鉴定
2.3.1细胞形态学观察：将各组培养基获得的间充质干细胞传代至第5代，采用倒置相差显微镜观察间充质干细胞的形态，比较各组培养基对间充质干细胞形态学的影响。
2.3.2细胞表面标志物检测：将各组培养基获得的间充质干细胞传代至第5代，流式检测各组间充质干细胞的表面标记物。具体方法为：取细胞经洗涤、过滤、固定、荧光抗体标记、洗涤，流式细胞仪上样，检测表面标记物CD105、CD44、CD90、CD73、CD34、CD45和HLA-DR的表达率，比较各组培养基对间充质干细胞表面标记物表达的影响，结果如表2。
2.3.3细胞诱导分化潜能检测：①将各组培养基获得的间充质干细胞传代至第3代，以1×104/cm2的接种密度接种于24孔板，待细胞融合度达到100％时，将培养基更换为成脂诱导试剂，每隔3天半量更换新的成脂诱导试剂，14d后采用油红O染色，在显微镜下观察油红O染色结果，统计油红O染色阳性面积，比较各培养基对间充质干细胞成脂诱导分化能力的影响，结果如表3所示；②将各组培养基获得的间充质干细胞传代至第5代，以1×104/cm2的接种密度接种于24孔板，待细胞融合度达到80％时，将培养基更换为成骨诱导试剂，每隔3天更换新的成骨诱导试剂，28d后采用茜素红染色，在显微镜下观察茜素红染色结果，统计茜素红染色阳性面积，比较各组培养基对间充质干细胞成骨诱导分化能力的影响，结果如表3所示。
2.3.4细胞增殖能力检测：将上述原代分离培养获得的间充质干细胞以1×104/cm2接种密度均匀分别接种于含各组培养基L1～L7的培养皿中进行传代扩增培养，每4天传代，每代均以1×104/cm2的接种密度接种，传至第5代。将每代中消化获得的细胞进行计数，比较各组培养基对脐带间充质干细胞增殖能力的影响，结果如下图1所示。
3.结果
3.1细胞形态学观察结果：传至第三代后，显微镜下观察到各组培养基获得的间充质干细胞大部分均能贴壁生长，其中，L1～L6组第三代细胞形态上均表现为长梭形，其中，L1～L3及L6组第三代细胞大小均一，L4～L5组第三代细胞大小不均；D1组和L7组第三代细胞形态较为扁平，但形态均一；将各组细胞传代至第5代后观察，L1～L3组细胞形态大小与第3代时无明显变化；D1组和L7组细胞形态较第三代时更为扁平；L4～L5组从第4代开始，细胞均出现不同程度的体积变大，形态与第3代相比均存在不同程度的变化。
3.2细胞表面标志物检测结果
表2各组无血清培养基对间充质干细胞表面标记物表达的影响
| 组别 | CD105 | CD44 | CD90 | CD73 | CD34 | CD45 | HLA-DR |
| L1 | 98.74％ | 99.72％ | 99.86％ | 99.67％ | 0.23％ | 0.16％ | 0.52％ |
| L2 | 98.21％ | 98.60％ | 99.74％ | 99.35％ | 0.61％ | 0.39％ | 0.55％ |
| L3 | 98.63％ | 98.11％ | 99.52％ | 99.02％ | 0.37％ | 0.33％ | 0.76％ |
| L4 | 96.42％ | 95.57％ | 96.13％ | 96.19％ | 0.95％ | 1.01％ | 1.42％ |
| L5 | 94.37％ | 95.02％ | 93.15％ | 94.46％ | 1.25％ | 1.64％ | 2.07％ |
| L6 | 97.33％ | 96.02％ | 96.72％ | 97.52％ | 0.82％ | 0.67 | 0.96％ |
| L7 | 98.34％ | 98.16％ | 99.78％ | 98.38％ | 0.49％ | 0.26％ | 0.63％ |
| D1 | 98.96％ | 98.92％ | 98.83％ | 98.95％ | 0.54％ | 0.50％ | 0.77％ |
由上表可看出，除L5组外，其余各组细胞在阳性表面标记物表达率均在95％以上，阴性表面标记物表达率均低于2％，符合间充质干细胞鉴定标准，且各组间表达率情况无明显差异，显示，在低浓度人血小板裂解液体系中加入香菇多糖及2-O-乙醚抗坏血酸用于间充质干细胞传代扩增培养能够达到10％血小板裂解液培养或10％胎牛血清培养同等的效果；而如果同时加入香菇多糖与抗坏血酸钠可能存在相互拮抗的作用。
3.3细胞诱导分化潜能检测
表3各组培养基对间充质干细胞成脂、成骨诱导分化能力的影响
注：与L1组相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
由上表可知，经无血清L1～L3培养基传代至第5代后，细胞成脂和成骨诱导率是最高的，着色最深，且着色稍深于10％血清组D1及10％人血小板裂解液组(L7)，显示，本发明无血清培养基能够显著提高人脐带间充质干细胞成脂和成骨定向分化能力。而从L4～L6组结果可看出，这种效果是由于香菇多糖以及2-O-乙醚抗坏血酸发挥协同实现的。
3.4细胞增殖能力检测.
从图1可看出(每个代次从左到右分别代表L1、L4～L7、D1)，无血清L1培养基传代能够显著提高间充质干细胞的扩增效率，各代次细胞扩增数量在各组别中均为最高，且效果稍稍优于10％人血小板裂解液组(L7)培养，但显著优于10％血清组培养效果。
综上所述，本发明无血清培养基虽然仅含有低浓度的人血小板裂解液，但是在传代扩增培养中能够最大化地维持间充质干细胞的干性，且扩增效率高于血清培养基，细胞分化潜能稳定，是非常适合临床大规模生成的脐带间充质干细胞培养体系。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，由以下成分组成：
人血小板裂解液2~3.5%、L-谷氨酰胺1~3mmol/L、2-O-乙醚抗坏血酸5~30μg/mL，基础培养基补足至1L；
其中，所述无血清培养基还包括香菇多糖，所述香菇多糖与2-O-乙醚抗坏血酸的重量比为0.1~0.6:2。
2.如权利要求1所述无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
3.如权利要求1所述无血清培养基，其特征在于，所述香菇多糖与2-O-乙醚抗坏血酸的重量比为0.3:2。
4.如权利要求1~3任一所述间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的应用或在制备培养间充质干细胞产品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞或人骨髓间充质干细胞。
6.一种人脐带间充质干细胞的无血清培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
取清洗后的脐带，剥离脐带动静脉保留外膜；
将脐带剪碎成组织块；
将组织块接种于如权利要求1~3任一所述间充质干细胞无血清培养基中培养进行原代分离培养；于接种后第2天补液，以后每隔3天换液1次；
待贴壁细胞融合至80~90%时，消化，将其接种于如权利要求1~3任一所述间充质干细胞无血清培养基进行传代扩增培养。
7.如权利要求6所述的人脐带间充质干细胞的无血清培养方法，其特征在于，所述原代分离培养及传代扩增培养中接种密度为1~5×104 /cm2；所述原代分离培养和传代扩增培养中培养条件为37℃、5%CO2。
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