CN114790443B - 一种间充质干细胞体外培养方法及其培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种间充质干细胞体外培养方法及其培养基。所述用于培养间充质干细胞的低血清浓度培养基，包括基础培养基，在基础培养基中，至少包含以下浓度的组分：胎牛血清10～50μl/ml和巴戟天寡糖1～15μg/ml。本发明提供了一种低血清浓度的间充质干细胞培养基，通过添加特定浓度的巴戟天寡糖、抗坏血酸磷酸酯钠协同淫羊藿多糖在较低的血清浓度条件下也可满足细胞在体外的快速扩增，且成骨、成脂分化潜能稳定，与现有技术相比取得了显著的进步。

Description

一种间充质干细胞体外培养方法及其培养基
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种间充质干细胞体外培养方法及其培养基。
背景技术
脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)属于一种围产期间充质干细胞，由于来源丰富，且低免疫原性，广泛应用于神经系统、心血管系统和骨骼肌、皮肤创面的再生和修复应用。hUCMSCs除具有向成脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞和上皮细胞分化功能外，它还通过分泌细胞因子参与多种疾病的治疗和修复过程[1-2]。
目前经典的干细胞体外培养方案是基础培养基加胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，其中FBS的作用是提供细胞生长所必需的生长因子和细胞因子等。虽然已有大量研究显示FBS能够支持体外培养细胞的增殖和分化，但是由于FB S中含有牛源性异种蛋白，使得经过其培养后的细胞再回植人体时可能带来传染疾病、过敏反应等多重风险，这也是干细胞治疗和组织工程技术应用于临床的主要障碍之一。因此，众多研究致力于建立不含有异种蛋白、成分可控、质量稳定的体外培养方案[3]。
目前，应用最广泛的方案是血小板裂解液(pooled human platelet lysate,pHPL)替代血清进行培养，研究表示，采用血小板裂解物替代血清，将从脐带组织中分离出的间充质干细胞进行传代培养，对培养获得的细胞进行表型检测和三系分化诱导。结果显示，采用5％血小板裂解物培养获得的细胞扩增效率明显优于对照组，细胞形态稳定，且P15代细胞的表型及分化潜能均保持稳定，显示血小板裂解物基本能够替代血清的功能，且较低添加浓度即可满足细胞长期的传代扩增所需，在较低接种密度条件下也可保证细胞的快速扩增，提高细胞的传代比例，在较长时间的连续传代下也能保持稳定[4]。
但是，采用血小板裂解物替代血清体外培养间充质干细胞还存在血小板来源少，难以形成规模，pHPL均一性难以保证，缺乏相关的制备及产品标准等问题。
综上所述，最有希望的研究方向是，在满足间充质干细胞体外扩增和分化的需求的前提下尽可能地添加较低浓度的血清。
[1]Li T，Xia M，Gao Y，et al.Human umbilical cord mesenchymal stemcells：an overview of their potential in cell-based therapy[J].Expert OpinBiol Ther，2015；15(9)：1293-1306.
[2]Sriramulu S，Banerjee A，Di Liddo R，et al.Concise review onclinic alapplications of conditioned medium derived from humanumbilical cord-mesenchymal stem cells UC-MSCs)[J].Int JHematol Oncol Stem Cell Res，2018，12(3)：230-234.
[3]Mendicino M,Bailey A M,Wonnacott K,et al.MSC-based product characterization for clinical trials:An FDA perspective[J].Cell Stem Cell,2014,14(2):141-145.
[4]韩颢.脐带间充质干细胞无血清培养方案的优化[D].天津医科大学,2019.DOI:10.27366/d.cnki.gtyku.2019.001154.
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有间充质干细胞的缺陷和不足，提供一种显著增加间充质干细胞体外增殖及分化能力的低血清浓度培养基；以及提供利用该培养基在体外培养获得间充质干细胞的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：用于培养间充质干细胞的低血清浓度培养基，在基础培养基中，至少包含以下浓度的组分：
胎牛血清10～50μl/ml；和
巴戟天寡糖1～15μg/ml。
目前临床上大规模建立的干细胞库主要是应用10％胎牛血清培养基进行培养，胎牛血清含有细胞生长及维持所需的营养物质，对细胞的代谢和发育具有很重要的作用。如若降低培养基中血清的浓度，势必要增加更多利于细胞生长的营养物质才能维持细胞的生长和分化。发明人在工作中发现，在含较低浓度的血清的培养体系中，加入巴戟天寡糖干预能够影响人脐带间充质干细胞的增殖，与不加入巴戟天寡糖干预相比，间充质干细胞增殖效率明显提高。进一步经试验证实，即使体系中血清浓度降低至10～50μl/ml范围内，加入特定浓度范围的巴戟天寡糖干预仍然能够使间充质干细胞的增殖速率保持在较高的水平。
其中，在基础培养基中，所述胎牛血清的浓度优选为10～30μl/ml。在添加了特定浓度的巴戟天寡糖的体系中，胎牛血清的浓度尽可能地低，优选为，10～30μl/ml、10～25μl/ml、10～20μl/ml或10～15μl/ml之间的任意值。更优选为，在满足扩增需求的前提下，体系中，胎牛血清的浓度可以低至30μl/ml、25μl/ml、20μl/ml或15μl/ml。
其中，在基础培养基中，所述巴戟天寡糖的浓度为5～15μg/ml。巴戟天寡糖在低血清浓度体系中发挥的作用与其浓度有一定的关系，浓度低于1μg/ml，对提高细胞增殖能力作用不明显；但是高于15μg/ml，细胞增殖效率明显下降，可能是因为较高浓度的巴戟天寡糖对间充质干细胞产生了毒性。
虽然试验证实，在低血清浓度的体系中，巴戟天寡糖干预对提高间充质干细胞的体外增殖效率具有积极的作用，但在成脂、成骨诱导分化试验中却发现，经巴戟天寡糖干预培养获得的细胞，染色阳性面积均较不干预明显减少，显示巴戟天寡糖可能存在对间充质干细胞成骨、成脂分化的抑制作用。
进一步地，在基础培养基中，还包含抗坏血酸磷酸酯钠5～50μg/ml和淫羊藿多糖0.01～0.1μg/ml。由于巴戟天寡糖的干预结果在某些方面是可喜的，只要降低巴戟天寡糖对间充质干细胞成骨、成脂分化的抑制，即有可能获得增殖与分化能力良好的间充质干细胞。通过研究发现，抗坏血酸磷酸酯钠和淫羊藿多糖协同可显著刺激成骨及成脂细胞的增殖，干预培养的细胞成骨成脂能力显著提高，这种增殖作用的机制可能是淫羊藿多糖和抗坏血酸磷酸酯钠能够促进碱性磷酸酶的分泌或抑制成骨细胞的凋亡或降低巴戟天寡糖干预产生的抑制分化的作用。且上述作用是在抗坏血酸磷酸酯钠和淫羊藿多糖的协同作用下产生的，因为抗坏血酸磷酸酯钠或淫羊藿多糖单独干预并不能产生相同的效果。
其中，在基础培养基中，所述抗坏血酸磷酸酯钠的浓度优选为10～40μg/ml。
其中，在基础培养基中，所述淫羊藿多糖的浓度优选为0.05～0.1μg/ml。淫羊藿多糖的浓度并不是越高越好，较高浓度的淫羊藿多糖可能产生对细胞的毒性，细胞的增殖效率和分化能力反而降低。
其中，所述基础培养基为DMEM或DMEM/F12。
本发明还提供所述低血清浓度培养基在体外培养间充质干细胞的用途。
在具体应用中，所述低血清浓度培养基能够显著刺激间充质干细胞在体外扩增；
在所述用途中，所述低血清浓度培养基能够显著刺激间充质干细胞成骨、成脂分化。
其中，所述间充质干细胞包括人脐带间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞和人脂肪干细胞。更进一步地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
本发明还提供一种间充质干细胞体外培养方法，所述方法包括：
分离获得间充质干细胞；
将分离的间充质干细胞采用上述低血清浓度培养基在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下进行培养，每隔2～3d换液，至细胞充分融合后进行传代。
上述培养方法中，具体操作为：取脐带，置于含有青霉素的Hank＇s液中，洗净血液，剔除血管后剪成1～3mm3的组织块；将上述组织块接种于低血清浓度培养基中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下进行培养，每隔3d补充新鲜培养基；待镜下观察到组织块周围有呈集落生长的成纤维状细胞时，去除组织块。
将获得的细胞接种于上述低血清浓度培养基在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下继续进行培养，待细胞融合至80～90％时，消化传代。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种低血清浓度的间充质干细胞培养基，通过添加巴戟天寡糖、抗坏血酸磷酸酯钠和淫羊藿多糖在较低的血清浓度条件下也可满足细胞在体外的快速扩增，且成骨、成脂分化潜能稳定，与现有技术相比取得了显著的进步。
附图说明
图1为不同浓度巴戟天寡糖对间充质干细胞体外增殖能力的影响；
图2为VC-Na和淫羊藿多糖联合巴戟天寡糖干预培养对间充质干细胞体外增殖能力的影响。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
研究(一)不同浓度的巴戟天寡糖干预对人脐带间充质增殖及分化能力的影响
1.1人脐带间充质干细胞的分离及传代扩增培养：
取脐带，置于含有青霉素的Hank＇s液中，洗净血液，剔除血管后剪成1～3mm3的组织块；将上述组织块分别接种于含不同浓度巴戟天寡糖的低血清浓度培养基(表1，1～7#)中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下进行培养，每隔3d补充新鲜培养基；待镜下观察到组织块周围有呈集落生长的成纤维状细胞时，去除组织块；
将获得的细胞接种于1～7#培养基在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下继续进行培养，待细胞融合至80～90％时，采用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液进行消化，将获得的间充质干细胞按1×104/cm2的密度接种于1～7#进行传代扩增培养基，每4天传代，每代接种密度为1×104/cm2，传至第5代。
1.2细胞免疫表型的测定：取P3代脐带间充质干细胞，采用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液进行消化，离心，弃去上清后，无菌PBS洗涤3次，采用流式细胞仪检测细胞表面抗原HLA-DR、CD34、CD105、CD90、CD44、CD45及CD73的表达情况，结果如表2所示。
1.3体外成骨诱导分化：取P5代脐带间充质干细胞，按2×104/cm2的密度接种于1～7#培养基中，待细胞融合至100％时，将培养基换成成骨诱导培养液(含10％FBS、100nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、100U/mL链霉素、100mg/L青霉素及0.2mmol/L吲哚美辛)，每隔3d半量更换成骨诱导培养液，诱导14天后行茜素红染色，在显微镜下观察染色结果，统计染色阳性面积，结果如表3所示。
1.4体外成脂诱导分化：取P5代脐带间充质干细胞，按2×104/cm2的密度接种于1～7#培养基中，待细胞融合至100％时，将培养基换成成脂诱导培养液(含10％FBS、10mg/L胰岛素、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、100U/mL链霉素、100mg/L青霉素及100μmol/L吲哚美辛)；每隔3d半量更换成脂诱导培养液，诱导14天后行油红O染色，在显微镜下观察染色结果，统计染色阳性面积，结果如表4所示。
1.5增殖速率检测：收集P5代细胞，分别采用1～7#培养基重悬并进行细胞计数，按3×103个/孔接种到96孔板中，每组设3个复孔，每天吸弃原培养液，加入CCK-8溶液，于37℃、5％CO2的培养箱下避光孵育1h后用酶标仪(490nm波长)检测各孔吸光度(A)值，重复3次，取平均值，连续检测7d。以细胞培养时间为横轴、吸光度A值为纵轴绘制细胞生长曲线，结果如图1所示。
表1:不同浓度巴戟天寡糖的低血清浓度培养基
Figure BDA0003575350790000061
2结果
2.1人脐带间充质干细胞表面抗原表达分析：由下表2可知，P3代脐带间充质干细胞流式细胞仪检测结果显示，经5～15μg/ml浓度的巴戟天寡糖干预培养的细胞表面高表达CD105、CD90、CD44及CD73，阳性表达率均在90％以上，同时低表达HLA-DR、CD34及CD45(表达率低于2％)，符合间充质干细胞鉴定标准；可见，加入特定浓度的巴戟天寡糖干预不会降低细胞表面抗原的表达水平。
表2：不同浓度的巴戟天寡糖对细胞表面抗原表达的影响
Figure BDA0003575350790000062
2.2成骨诱导分化：结果如下表3所示，显示，经5～20μg/ml巴戟天寡糖干预培养的细胞的P5代脐带间充质干细胞经茜素红染色后镜下观察可见产生了较少的红色钙化结节，染色阳性面积小，且相对于不加巴戟天寡糖干预的细胞产生的钙结节更少，染色面积更小，且随着浓度越高，产生的红色钙化结节越少，差异显著，显示巴戟天寡糖对脐带间充质干细胞的成骨分化存在一定的抑制作用，且这种抑制作用与浓度有关。
表3：不同浓度的巴戟天寡糖对细胞成骨分化的影响
Figure BDA0003575350790000071
注：与不加巴戟天寡糖干预相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
2.3成脂诱导分化：结果如表4所示，10％血清组及不加巴戟天寡糖干预培养的细胞在镜下可见胞浆内充满了红色的液滴，而加入了巴戟天寡糖干预后，红色液滴明显减少，阳性染色面积显著降低，显示，巴戟天寡糖脐带间充质干细胞的成骨分化亦存在一定的抑制作用。
表4：不同浓度的巴戟天寡糖对细胞成脂分化的影响
Figure BDA0003575350790000072
注：与不加巴戟天寡糖干预相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
2.4细胞增殖能力：从图1可看出，加入不同浓度的巴戟天寡糖进行干预后，细胞呈现快速增长的趋势，在第3天开始，加入5μg/ml、10μg/ml及15μg/ml巴戟天寡糖干预培养的细胞增殖速率明显高于其他浓度，显示细胞的增殖速率并不随着巴戟天寡糖浓度的增加而增加，反而是有所降低。
结论：在低血清浓度体系中，加入特定浓度范围的巴戟天寡糖干预培养能够显著提高脐带间充质干细胞的体外增殖能力，但是对细胞体外成骨、成脂分化能力存在一定的抑制作用，具体的抑制机制还需进一步的研究。
研究(二)VC-Na和淫羊藿多糖协同干预对间充质干细胞体外培养的影响
在3#培养基的基础上加入VC-Na/VC和/或淫羊藿多糖制备得到样品培养基3'#～6'#(表5)，按照研究一种1.1～1.5所述方法采用3'#～4'#培养基在体外对人脐带间充质干细胞进行培养，检测其对间充质干细胞体外增殖及分化能力的影响，同时采用CCK-8法检测各组干细胞的细胞毒性(取P3代细胞，PBS洗涤3次后，采用CCK-8试剂盒进行细胞毒性检测)，结果如下表6～8及图2所示。
表5：样品培养基3'#～6'#配方组成
Figure BDA0003575350790000081
2.1表面抗原分析：由表6可知，加入VC-Na和淫羊藿多糖协同干预后，对间充质干细胞表面抗原表达无明显影响；但是单独加入淫羊藿多糖干预后，细胞表面阳性抗原表达率较低且阴性抗原表达率提高。
表6：VC-Na/VC和/或淫羊藿多糖协同干预对间充质干细胞表面抗原表达的影响
Figure BDA0003575350790000082
2.2茜素红染色：由表7可知，同时加入VC-Na和淫羊藿多糖干预培养能够显著提高间充质干细胞的成骨分化能力，而单独加入淫羊藿多糖或VC-Na对细胞体外成骨分化能力无明显影响。
表7：VC-Na和淫羊藿多糖协同干预对间充质干细胞成骨分化的影响
Figure BDA0003575350790000091
注：与3#相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
2.3油红O染色：分析表8可知，同时加入VC-Na和淫羊藿多糖干预培养能够显著提高间充质干细胞的成脂分化能力，且效果优于VC和淫羊藿多糖干预。
表8：VC-Na和淫羊藿多糖协同干预对间充质干细胞成脂分化的影响
Figure BDA0003575350790000092
注：与3#相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
2.4CCK-8毒性检测：由下表可知，单独加入0.05μg/ml淫羊藿多糖干预培养对细胞可能存在毒性作用(P＜0.05)，但是加入VC-Na或VC均会减轻这种毒性作用。
表8：毒性检测
Figure BDA0003575350790000093
注：与对照组相比，*P＜0.05。
2.5细胞增殖能力：分析图2可知，同时加入VC-Na和淫羊藿多糖或者单独加入VC-Na干预培养均能够显著提高间充质干细胞的增殖速率，细胞在第3天开始呈现快速增长，到第6天开始进入平台期，生长趋势与10％血清组(7#)无明显差异。
实施例一、低血清浓度培养基
每1000ml DMEM/F12基础培养基含有：
胎牛血清20μl/ml；
巴戟天寡糖5μg/ml；
淫羊藿多糖0.05μg/ml；和
抗坏血酸磷酸酯钠10μg/ml。
制备方法：往DMEM/F12基础培养基中依次上述配方，混合均匀，得低血清浓度培养基。
实施例二、低血清浓度培养基
每1000ml DMEM/F12基础培养基含有：
胎牛血清25μl/ml；
巴戟天寡糖10μg/ml；
淫羊藿多糖0.01μg/ml；和
抗坏血酸磷酸酯钠25μg/ml。
制备方法参考实施例一。
实施例三、低血清浓度培养基
每1000ml DMEM/F12基础培养基含有：
胎牛血清15μl/ml；
巴戟天寡糖15μg/ml；
淫羊藿多糖0.1μg/ml；和
抗坏血酸磷酸酯钠30μg/ml。
制备方法参考实施例一。
实施例四、低血清浓度培养基
每1000ml DMEM/F12基础培养基含有：
胎牛血清30μl/ml；
巴戟天寡糖1μg/ml；
淫羊藿多糖0.08μg/ml；和
抗坏血酸磷酸酯钠5μg/ml。
制备方法参考实施例一。
实施例五、低血清浓度培养基
每1000ml DMEM/F12基础培养基含有：
胎牛血清10μl/ml；
巴戟天寡糖12μg/ml；
淫羊藿多糖0.02μg/ml；和
抗坏血酸磷酸酯钠50μg/ml。
制备方法参考实施例一。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.用于培养人脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于，在DMEM/F12基础培养基中，添加以下浓度的组分：
胎牛血清10~30μl/ml；
巴戟天寡糖5~15μg/ml；
抗坏血酸磷酸酯钠10~40μg/ml；
淫羊藿多糖0.05~0.1μg/ml。
2.根据权利要求1所述培养基在体外培养人脐带间充质干细胞的用途。
3.一种人脐带间充质干细胞体外培养方法，其特征在于，所述方法包括：
分离获得人脐带间充质干细胞；
将分离的人脐带间充质干细胞采用根据权利要求1所述培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下进行培养，每隔2~3d换液，至细胞充分融合后进行传代。
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