CN108795856B - 一种牙髓干细胞的分离培养方法 - Google Patents

一种牙髓干细胞的分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓干细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括如下步骤：采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；将牙髓干细胞接种至含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养。本发明采用I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶对牙髓组织进行消化，在维持细胞活力的同时，可充分消化牙髓组织，使牙髓干细胞游离出来，得到的牙髓干细胞数量多，且活力强。

Description

一种牙髓干细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓干细胞的分离培养方法。
背景技术
牙周炎是累及四种牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性感染性疾病，往往引发牙周支持组织的炎性破坏。在35岁以后较为多见。常见病因为菌斑、牙石、创伤性咬合、食物嵌塞、不良修复体、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁的炎症、牙槽骨吸收、牙齿逐渐松动。严重的牙周炎会造成牙齿脱落，从而导致咀嚼功能低下而引起消化不良及胃肠病，影响全身心的健康。治疗牙周炎的主要在于消除炎症，促进被破坏的牙周组织的再生，恢复牙齿的正常功能。临床常采用的牙周炎治疗方法包括：牙周基础治疗(洁治、刮治、根面平整)、牙周翻瓣术及牙周组织再生术。但这些方法无法修复损伤的牙周附着及牙槽组织，不能满足目前临床上对口腔颌面部组织缺损修复再生及功能、外形恢复的要求，其次牙周炎治疗通过抗生素来控制菌斑生长，进行全身和局部的药物治疗。但抗生素副作用较多，病原微生物也会产生耐药性。
牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。据报道，牙髓干细胞在牙周炎治疗中可起到很好的修复作用，作用机制为：通过植入局部并分化为缺损细胞，分泌细胞因子，趋化干细胞到局部，抑制局部炎症，促进局部血管新生。
目前，常用的牙髓干细胞提取方法为采用I型胶原酶或者I型胶原酶与中性蛋白酶(又称分散酶)消化牙髓组织。但该法得到的牙髓干细胞总数量少，细胞活率低。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种牙髓干细胞的分离培养方法。该方法得到的牙髓干细胞数量多，且活力强。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种牙髓干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；
将牙髓干细胞接种至含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养。
作为优选，I型胶原酶的质量百分浓度为0.1％～0.5％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.01％～0.2％，胰蛋白酶的质量百分浓度为0.01％～0.2％。
优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.2％～0.4％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～0.15％，胰蛋白酶的质量百分浓度为0.05％～0.15％。
更优选地，I型胶原酶的质量百分浓度为0.3％，III型胶原酶的质量百分浓度为0.1％，胰蛋白酶的质量百分浓度为0.1％。
作为优选，I型胶原酶、III型胶原酶与胰蛋白酶的质量比为4:3:3～8:1:1。
优选地，I型胶原酶、III型胶原酶与胰蛋白酶的质量比为3:1:1。
作为优选，过筛的孔径为60～80μm。
优选的，过筛的孔径为70μm。
作为优选，牙髓组织为0.3～0.5mm3块状牙髓组织。
作为优选，消化的温度为36～38℃，转速为180～220r/min，消化的时间为10～20min。
优选的，消化的温度为37℃，转速为200r/min，消化的时间为15min。
作为优选，含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基为含有8～12ng/mL FGF、8％～12％FBS的DMEM/F12培养基。
优选的，含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基为含有10ng/mL FGF、10％FBS的DMEM/F12培养基。
本发明提供了一种牙髓干细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括如下步骤：采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；将牙髓干细胞接种至含有FGF、FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养。本发明具有的技术效果为：
本发明采用I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶对牙髓组织进行消化，在维持细胞活力的同时，可充分消化牙髓组织，使牙髓干细胞游离出来，得到的牙髓干细胞数量多，且活力强。
具体实施方式
本发明公开了一种牙髓干细胞的分离培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
PBS：磷酸缓冲盐溶液；
FBS：胎牛血清；
FGF：成纤维细胞生长因子。
本发明提供的牙髓干细胞的分离培养方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1牙髓干细胞的分离培养和传代
1、分离和传代
选用普通级瞬目反射正常的健康大白兔为实验对象，雌雄随机，兔龄4-5个月。大白兔在局麻的状态下拔出一颗磨牙，在保证牙髓未被破坏的情况下，立即转移至预冷高浓度双抗中(双抗：链霉素及青霉素)，浸泡15min，用D-Hank’s液反复冲洗3次，在无菌操作台劈开牙齿，取出牙髓组织。用眼剪把牙髓组织剪成0.3-0.5mm3块状，置于含0.3％I型胶原酶、0.1％III型胶原酶和0.1％胰蛋白酶的消化液中，在37℃的温度下，200rpm消化15min，过70μm筛，用PBS清洗2次，用无血清培养基重悬，计算细胞总量及细胞活力；之后接种培养(DMEM/F12+10％FBS+10ng/ml FGF)，每3天换液，细胞汇合度75％-85％时进行传代培养。
牙髓干细胞传代到第3代，汇合度在85-90％时，用PBS清洗两遍后，加入3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置显微镜下观察，80％细胞皱缩变圆时，加入5mL含10％FBS的DMEM培养基终止酶解，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞全部脱落。把细胞悬液转移至50mL离心管中，600g离心5min。离心结束后倒弃上清液，往细胞沉淀中加入20-30mL的生理盐水重悬细胞，600g离心5min，弃上清液(该步骤重复一次)。
2、牙髓干细胞检测
牙髓干细胞收集前24h抽取培养液上清检测细菌、真菌、内毒素和支原体，结果均呈阴性，表明牙髓干细胞微生物量达标；
牙髓干细胞收集时对其直径和活力进行检测和观察，结果显示，牙髓干细胞在P3代时，细胞大小均匀、形态均为梭型，融合至85％时呈现漩涡状。消化收集时，97％以上的细胞拒染(死细胞被染成蓝色，活细胞拒染)，细胞直径在14-18μm之间，符合牙髓干细胞体积大小分布，说明了牙髓干细胞并没有出现体积变大等异常现象，活力较好。
牙髓干细胞表面抗原流式检测结果显示，牙髓干细胞高表达CD146和CD90，表达率分别为99.9％，100％；低表达CD34和CD45，表达率分别为0.1％、0.1％，符合间充质干细胞表面抗原特征，说明了牙髓干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。
实施例2牙髓干细胞的分离培养和传代
1、分离和传代
选用普通级瞬目反射正常的健康大白兔为实验对象，雌雄随机，兔龄4-5个月。大白兔在局麻的状态下拔出一颗磨牙，在保证牙髓未被破坏的情况下，立即转移至预冷高浓度双抗中(双抗：链霉素及青霉素)，浸泡15min，用D-Hank’s液反复冲洗3次，在无菌操作台劈开牙齿，取出牙髓组织。用眼剪把牙髓组织剪成0.3-0.5mm3块状，置于含0.2％I型胶原酶、0.15％III型胶原酶和0.15％胰蛋白酶的消化液中，在37℃的温度下，200rpm消化15min，过70μm筛，用PBS清洗2次，用无血清培养基重悬，计算细胞总量及细胞活力；之后接种培养(DMEM/F12+10％FBS+10ng/ml FGF)，每3天换液，细胞汇合度75％-85％时进行传代培养。
牙髓干细胞传代到第3代，汇合度在85-90％时，用PBS清洗两遍后，加入3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置显微镜下观察，80％细胞皱缩变圆时，加入5mL含10％FBS的DMEM培养基终止酶解，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞全部脱落。把细胞悬液转移至50mL离心管中，600g离心5min。离心结束后倒弃上清液，往细胞沉淀中加入20-30mL的生理盐水重悬细胞，600g离心5min，弃上清液(该步骤重复一次)。
2、牙髓干细胞检测
牙髓干细胞收集前24h抽取培养液上清检测细菌、真菌、内毒素和支原体，结果均呈阴性，表明牙髓干细胞微生物量达标；
牙髓干细胞收集时对其直径和活力进行检测和观察，结果与实施例1结果相近，获得的细胞符合牙髓干细胞体积大小分布，说明了牙髓干细胞并没有出现体积变大等异常现象，活力较好。
牙髓干细胞表面抗原流式检测结果与实施例1相近，牙髓干细胞高表达CD146和CD90，低表达CD34和CD45，符合间充质干细胞表面抗原特征，说明了牙髓干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。
实施例3牙髓干细胞的分离培养和传代
1、分离和传代
选用普通级瞬目反射正常的健康大白兔为实验对象，雌雄随机，兔龄4-5个月。大白兔在局麻的状态下拔出一颗磨牙，在保证牙髓未被破坏的情况下，立即转移至预冷高浓度双抗中(双抗：链霉素及青霉素)，浸泡15min，用D-Hank’s液反复冲洗3次，在无菌操作台劈开牙齿，取出牙髓组织。用眼剪把牙髓组织剪成0.3-0.5mm3块状，置于含0.4％I型胶原酶、0.05％III型胶原酶和0.05％胰蛋白酶的消化液中，在37℃的温度下，200rpm消化15min，过70μm筛，用PBS清洗2次，用无血清培养基重悬，计算细胞总量及细胞活力；之后接种培养(DMEM/F12+10％FBS+10ng/ml FGF)，每3天换液，细胞汇合度75％-85％时进行传代培养。
牙髓干细胞传代到第3代，汇合度在85-90％时，用PBS清洗两遍后，加入3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置显微镜下观察，80％细胞皱缩变圆时，加入5mL含10％FBS的DMEM培养基终止酶解，用移液枪反复吹打细胞，直至细胞全部脱落。把细胞悬液转移至50mL离心管中，600g离心5min。离心结束后倒弃上清液，往细胞沉淀中加入20-30mL的生理盐水重悬细胞，600g离心5min，弃上清液(该步骤重复一次)。
2、牙髓干细胞检测
牙髓干细胞收集前24h抽取培养液上清检测细菌、真菌、内毒素和支原体，结果均呈阴性，表明牙髓干细胞微生物量达标；
牙髓干细胞收集时对其直径和活力进行检测和观察，结果与实施例1结果相近，获得的细胞符合牙髓干细胞体积大小分布，说明了牙髓干细胞并没有出现体积变大等异常现象，活力较好。
牙髓干细胞表面抗原流式检测结果与实施例1相近，牙髓干细胞高表达CD146和CD90，低表达CD34和CD45，符合间充质干细胞表面抗原特征，说明了牙髓干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。
对比例1
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.5％的I型胶原酶替代实施例1中I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的混合液。
对比例2
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.5％的III型胶原酶替代实施例1中I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的混合液。
对比例3
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.5％的胰蛋白酶替代实施例1中I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的混合液。
对比例4
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.3％的I型胶原酶+0.2％III型胶原酶替代实施例1中I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的混合液。
对比例5
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.3％的I型胶原酶+0.2％胰蛋白酶替代实施例1中I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的混合液。
对比例6
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.25％的III型胶原酶+0.25％胰蛋白酶替代实施例1中I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的混合液。
对比例7
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.3％的I型胶原酶+0.4％分散酶替代实施例1中I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的混合液。
对比例8
除消化酶的种类外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.1％的胰蛋白酶+0.05％木瓜蛋白酶的D-Hanks液(pH值7.4)替代实施例1中I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的混合液。
对比例9
除消化酶的浓度配比外的其余条件与实施例1相同，本对比例采用0.45％I型胶原酶+0.025％III型胶原酶+0.025％III胰蛋白酶。
试验例1细胞活率检测
消化等重的牙髓组织5mg，取原代培养的牙髓干细胞进行台盼蓝染色，检测实施例1-3和对比例1-9的活细胞数量、总细胞数量，每组试验重复3次，取平均值，计算细胞活率，计算公式为：
细胞活率＝(活细胞数量/总细胞数量)×100％。
结果如下表所示：
表1细胞活率检测结果
组别 活细胞数量(×10<sup>5</sup>) 总细胞数量(×10<sup>5</sup>) 细胞活率％
实施例1 1.98 2.05 96.6
实施例2 1.87 2.01 93.0
实施例3 1.85 1.97 93.9
对比例1 1.70 2.03 83.7
对比例2 1.08 1.54 70.1
对比例3 0.78 1.27 61.4
对比例4 1.79 1.98 90.4
对比例5 1.60 1.93 82.9
对比例6 0.98 1.34 73.1
对比例7 1.71 2.10 81.4
对比例8 1.16 1.67 69.5
对比例9 1.56 1.98 78.8
根据实施例和对比例各组所提取出来细胞数量及活力来看，实施例1-3的活细胞数量及细胞活率显著高于对比例1-9。虽然对比例4的细胞活率也较高，但其活细胞数量及总细胞数量均较低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种牙髓干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用含有I型胶原酶、III型胶原酶和胰蛋白酶的溶液对牙髓组织进行消化，过筛，清洗后得到牙髓干细胞；
将牙髓干细胞接种至含有8～12ng/mL FGF、8％～12％FBS的DMEM/F12培养基进行细胞培养，每3天换液一次，当细胞汇合度为75％～85％时进行传代培养；
所述I型胶原酶的质量百分浓度为0.2％～0.4％，所述III型胶原酶的质量百分浓度为0.05％～0.15％，所述胰蛋白酶的质量百分浓度为0.05％～0.15％。
2.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶的质量百分浓度为0.3％，所述III型胶原酶的质量百分浓度为0.1％，所述胰蛋白酶的质量百分浓度为0.1％。
3.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶、所述III型胶原酶与所述胰蛋白酶的质量比为4:3:3～8:1:1。
4.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶、所述III型胶原酶与所述胰蛋白酶的质量比为3:1:1。
5.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述过筛的孔径为60～80μm。
6.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述牙髓组织为0.3～0.5mm3块状牙髓组织。
7.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述消化的温度为36～38℃，转速为180～220r/min，消化的时间为10～20min。
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